Αφηρημένο

Τρισδιάστατο (3D)

δοκιμασίες με βάση in vitro

κυττάρων του καρκίνου του προστάτη (PCA) έρευνα γίνονται γρήγορα η προτιμώμενη εναλλακτική λύση σε εκείνη των συμβατικών καλλιεργειών 2D μονοστιβάδας. 3D δοκιμασίες μιμούνται ακριβέστερα το μικροπεριβάλλον που βρέθηκαν

in vivo

, και ως εκ τούτου είναι ιδανικά για την αξιολόγηση ενώσεων και την καταλληλότητά τους για την πρόοδο στον αγωγό ανακάλυψη φαρμάκων. Για να επιτευχθεί η επιθυμητή υψηλή απόδοση που απαιτείται για τα περισσότερα προγράμματα προσυμπτωματικού ελέγχου, απαιτείται αυτοματοποιημένη ποσοτικοποίηση των 3D καλλιέργειες. Προς το σκοπό αυτό, αυτό το χαρτί εκθέσεις σχετικά με την ανάπτυξη μιας μονάδας πρωτότυπο ανάλυση για μια αυτοματοποιημένη υψηλή περιεκτικότητα σε ανάλυση του συστήματος (HCA), το οποίο επιτρέπει την ακριβή και γρήγορη διερεύνηση των

in vitro

3D μοντέλα κυτταρικής καλλιέργειας για την PCA . Το πρόγραμμα βασίζεται σε Java, το οποίο έχουμε ονομάσει PCaAnalyser, χρησιμοποιεί μυθιστόρημα αλγόριθμους που επιτρέπουν την ακριβή και ταχεία ποσοτικοποίηση της έκφρασης πρωτεϊνών σε καλλιέργεια κυττάρων 3D. Όπως διαμορφώνεται σήμερα, η PCaAnalyser μπορεί να ποσοτικοποιήσει μια σειρά βιολογικών παραμέτρων όπως: πυρήνες-καταμέτρηση, πρόβλεψη των μελών πυρήνες-σφαιροειδές, διάφορες λειτουργίες με βάση την ταξινόμηση των περιφερειακών και μη περιφερειακών περιοχών για τη μέτρηση της έκφρασης των βιοδεικτών και των συστατικών πρωτεΐνης που είναι γνωστό ότι σχετίζονται με προστάτη εξέλιξη, καθώς και ορίζουν αποτελεσματικά Απομονώστε κυψελοειδή αντικειμένων για μια σειρά σήματος προς θόρυβο αναλογίες. Επιπλέον, η αρχιτεκτονική PCaAnalyser είναι εξαιρετικά ευέλικτο, λειτουργώντας ως ενιαία ανεξάρτητη ανάλυση, καθώς επίσης και σε λειτουργία δέσμης? απαραίτητη για High-Throughput-Screening (HTS). Χρησιμοποιώντας την PCaAnalyser, ακριβή και ταχεία ανάλυση με αυτοματοποιημένο υψηλή τρόπο απόδοσης παρέχεται, και επαναλήψιμη ανάλυση της κατανομής και της έντασης της καθιερωμένης δεικτών που σχετίζονται με την εξέλιξη της PCA σε μια σειρά μεταστατικών κυτταρικών σειρών προστάτη (DU145 και PC3) σε ένα 3D μοντέλο αποδεικνύεται

Παράθεση:. Hoque MT, Windus LCE, Lovitt CJ, Avery VM (2013) PCaAnalyser: Μια 2D-Εικόνα Ενότητα Βασισμένο Ανάλυσης για την αποτελεσματική Προσδιορισμός του καρκίνου του προστάτη εξέλιξη σε 3D Πολιτισμού. PLoS ONE 8 (11): e79865. doi: 10.1371 /journal.pone.0079865

Επιμέλεια: Gajendra Π Σ Raghava, CSIR-Ινστιτούτο Μικροβιακή Τεχνολογία, την Ινδία

Ελήφθη: 24 του Μαρτίου, 2013? Αποδεκτές: 26η Σεπτεμβρίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 20 του Νοέμβρη του 2013

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή υποστηρίζεται από μια επιχορήγηση από το Ίδρυμα Καρκίνου του Προστάτη της Αυστραλίας απονέμεται σε VMA. Θ αναγνωρίζει τη Λουιζιάνα Διοικητικό Συμβούλιο της Regents μέσω του Διοικητικό Συμβούλιο της Regents Ταμείο Στήριξης, LEQSF (2013-16)-RD-Α-19 εν μέρει για την προετοιμασία του τελικού κειμένου. CJL υποστηρίχθηκε από μια αυστραλιανή Βραβείο Μεταπτυχιακών Σπουδών. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη (PCA) έχει την υψηλότερη συχνότητα του καρκίνου στην Αυστραλία, με σχεδόν 20.000 νέες περιπτώσεις διαγιγνώσκονται κάθε χρόνο [1]. Κατά την έναρξη της προστάτη, η θεραπεία περιλαμβάνει ανδρογόνων, η οποία επιβραδύνει την εξέλιξη προσωρινά, ωστόσο υποτροπή του καρκίνου σε ένα ανδρογόνο ανεξάρτητη μορφή είναι κοινή [2]. Σε αυτό το στάδιο, η PCA δεν μπορεί πλέον να ελεγχθεί με πρότυπο θεραπείες, λαμβάνει χώρα μετάσταση, η οποία είναι η κύρια αιτία θνησιμότητας. Ως εκ τούτου, οι νέες θεραπείες που απαιτούνται για την καταπολέμηση της νόσου πριν από την μεταστατική εξέλιξη.

Η σημασία της χρήσης μοντέλα 3D στην αξιολόγηση της ανάπτυξης του όγκου έχει περιγραφεί προηγουμένως [3], [4]. Εμείς, και άλλοι, έχουν δείξει ότι 3D καλλιέργειες δώσει μια καλύτερη πλατφόρμα για τη μελέτη των στερεών καρκινικών μαζών όπως καρκινικά κύτταρα σε αυτό το μικροπεριβάλλον διακρίνουμε αντιγονικά προφίλ και τη συμπεριφορά φαινοτυπική που μιμούνται ακριβέστερα τα καρκινικά κύτταρα, όπως διαπιστώθηκε

in vivo

[ ,,,0],3], [4]. 3D κυτταρική καλλιέργεια επιτρέπει την λεπτή αλληλεπίδραση των κυττάρων των ίδιων ή διαφορετικών προελεύσεων εντός μιας μήτρας, μιμούμενη κυττάρου-κυττάρου και των αλληλεπιδράσεων κυττάρου-μήτρας είναι παρόμοια με εκείνα που βρέθηκαν

in vivo

. Επιπλέον, η σωστή ευθυγράμμιση και χωροταξική οργάνωση σε 3D είναι απαραίτητη για την εξέλιξη του όγκου [5]. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η 3D καλλιέργειες μπορεί να χρησιμεύσει ως μια πιο βιολογικώς σχετικό μοντέλο στον αγωγό ανακάλυψη φαρμάκων.

αντιγονικά προφίλ των όγκων αποκόπηκε από ασθενείς με προχωρημένο προστάτη έχουν εντοπίσει μεταβολές στην έκφραση πολυάριθμων πρωτεϊνών. Από αυτούς, ο υποδοχέας ανδρογόνου (AR) [6], α6 [7], [8] και β1 ιντεγκρίνης υπομονάδες [9], και πιο πρόσφατα υποδοχέα χημειοκινών CXCR4 [10] έκφρασης έχουν συνδεθεί με αυξημένο βαθμό Gleason και μεταστατικό διάδοση ΣΕΣΣ. όγκους των ασθενών παρουσιάζουν σταθερά ένα up-ρύθμιση του β1 ιντεγκρίνης υπομονάδα [11] και του υποδοχέα χημειοκινών CXCR4 [12], η οποία συνοδεύεται από μια αναδιανομή και προς τα κάτω ρύθμιση των α6 ιντεγκρίνης [7], [8].

Βαριά εμπλέκονται στην PCa οστικές μεταστάσεις ανάπτυξη και εξέλιξη είναι η ιντεγκρίνη β1 υπομονάδα [13] – [15]. Η έκφραση του α5β1 και α2β1 σε κύτταρα προστάτη έχει αναφερθεί για τη διευκόλυνση των αλληλεπιδράσεων με τα κύτταρα των οστών στρωματικά [15] και να προωθήσουν ενεργά εισβολή και προσκόλληση των κυττάρων προστάτη στο στρώμα οστού

in vitro

[14] και την πειραματική οστικές μεταστάσεις

in vivo

[13]. Παρομοίως, η λαμινίνη δέσμευσης ιντεγκρίνης α6β1 έχει αποδειχθεί ότι επιτρέπει την εξαγγείωση των ανθρώπινων κυττάρων προστάτη από την κυκλοφορία στο στρώμα οστού

in vivo

[16] – [18].

Ομοίως, οι μελέτες έχουν δείξει ότι η χημειοκινών, CXCL12, παίζει ρόλο στο λαθρεμπόριο κύτταρα του προστάτη μέχρι το κόκαλο. CXCL12 εκφράζεται από στρωματικά κύτταρα σε όργανα στόχους του προστάτη μετάστασης (οστό, εγκέφαλος, λέμφο), αλλά όχι σε άλλους ιστούς [19] και του υποδοχέα του, CXCR4, εκφράζεται έντονα από τα οστά μεταστατικά κύτταρα προστάτη [20], [21]. Ήταν στόχος της παρούσας μελέτης για την αξιολόγηση και την ανάλυση των προτύπων έκφρασης και διανομή αυτών των καθιερωμένων δεικτών που σχετίζονται με την εξέλιξη προστάτη, χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο 3D, σε συνδυασμό με ανάλυση απεικόνισης υψηλής απόδοσης.

Μια άλλη μεγάλη επιρροή πρωτεΐνη που συμβάλλει στην ανάπτυξη του προστάτη είναι η AR [6]. Η AR ανήκει σε μία υπεροικογένεια των πυρηνικών υποδοχέων και προκαλεί την δράση των ανδρογόνων όπως η 5-α-διυδροτεστοστερόνη (DHT). Η AR και συνδέτες ενεργοποίηση της παίζουν σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη της PCa μεσολαβώντας τις απαντήσεις των ανδρογόνων και ενεργοποίηση μεταγραφής γονιδίου. Παρά το γεγονός ότι πολλά από τα καλά χαρακτηρισμένα επιδράσεις των AR σε κύτταρα προστάτη εξαρτώνται από την γονιδιωματικών επιδράσεων που περιλαμβάνουν την μεταγραφή των γονιδίων στόχων, μη γονιδιωματικών επιδράσεων των ανδρογόνων επηρεάζουν επίσης τη συμπεριφορά των κυττάρων. Αυτές περιλαμβάνουν την ενεργοποίηση των κινασών και κυτταροσκελετική αναδιάταξη η οποία μπορεί να διεγείρει την κυτταρική κινητικότητα [22] – [24]

Προηγουμένως, έχουν αναφέρει ότι PCa PC3 μεταστατικά κύτταρα εκ νέου εκφράζουν μη μεταγραφικά ενεργή AR η οποία είναι σε. μέρος διαμεσολαβείται από την οδό Src [4]. Χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο 3D, σε συνδυασμό με ανάλυση απεικόνισης υψηλής απόδοσης, ήταν ένας περαιτέρω στόχος της τρέχουσας χαρτιού για την αξιολόγηση του δυναμικού λειτουργική συνάφεια του ενδογενούς AR ρύθμιση προς τα πάνω σε αυτή την κυτταρική γραμμή και πώς μπορεί να επηρεάσει άλλα συστατικά σημαντική πρωτεΐνη που είναι γνωστό ότι μεσολαβούν PCa εξέλιξης συμπεριλαμβανομένων β1 ιντεγκρίνης.

Η ικανότητα να αναλύσει με ακρίβεια πολλαπλών παραμέτρων απεικόνισης που προέρχονται από καλλιέργεια 3D κυττάρων είναι σήμερα εξαρτώνται από την άκρως εξειδικευμένα προγράμματα που είναι με κανένα τρόπο αυτοματοποιημένο. Το υπάρχον λογισμικό απεικόνισης υποφέρει σε μεγάλο βαθμό από το εγγενές πρόβλημα της αδυναμίας να γρήγορα προσαρμοστούν και να φιλοξενήσει μεταβαλλόμενες απαιτήσεις αποτελεσματικά [25]. Εδώ, έχουμε αναπτύξει ένα λογισμικό που βασίζεται αυτοματοποιημένη ανάλυση εικόνας με το όνομα «PCaAnalyser» που είναι σε θέση να αναλύει μια σειρά από παραμέτρους που μετρήθηκαν σε καλλιέργεια κυττάρων 3D βασίζονται σε εικόνες 2D.

PCaAnalyser έχει αναπτυχθεί ως ένα ImageJ [26 ] – [28] plugin, ως εκ τούτου, έχει τη δυνατότητα να μοιραστούν και να ενισχύσει αρκετές βασικές λειτουργίες που παρέχονται στο ImageJ. Η ανάλυση που πραγματοποιήθηκε από PCaAnalyser είναι μια σύνθεση των δύο μεγάλων αλγοριθμική-διεπαφών. Στο πρώτο στάδιο, το όριο της κυτταρικής 3D σφαιροειδές ανιχνεύεται και οι απαιτούμενες μάσκες δημιουργούνται. Στο δεύτερο στάδιο, οι πυρήνες ανιχνεύονται και σφαιροειδή συνδρομές τότε προβλεφθεί χρησιμοποιώντας τις μάσκες και τα όρια. Παρόμοιες προσεγγίσεις ακολουθούνται για τον εντοπισμό και τη μελέτη κυτταροπλασματικών περιοχών με διαχωρισμό τους από κρίσιμες θόρυβο.

Το παράδειγμα της PCaAnalyser, συμπεριλαμβανομένου και του στοιχείου αναφοράς, έχει σχεδιαστεί για να είναι ευέλικτο ώστε να επιτρέπει στο χρήστη να χειραγωγήσουν εύκολα σχετική ανάλυση σε ένα διάφορους τρόπους, εκτός από τις προεπιλεγμένες επιλογές.

Όσον αφορά την αποτελεσματικότητα της PCaAnalyser, έχουμε ενσωματώσει έναν αλγόριθμο που βασίζεται υποψήφιο-μελών να επιταχυνθεί η διαδικασία εντοπισμού πυρήνα-σφαιροειδές, κάνοντας τον συνολικό χρόνο επεξεργασίας πολύ πιο γρήγορα. Χρόνος ανάλυση πολυπλοκότητας έχει παρασχεθεί σε αυτό το άρθρο, για να βοηθήσει με τις εκτιμήσεις του χρόνου επεξεργασίας, η οποία βασίζεται στα διαθέσιμα δεδομένα, οι παράμετροι, όπως ο αριθμός των σφαιροειδή ανά εικόνα, ο αριθμός των πυρήνων ανά σφαιροειδές και την περίμετρο του πυρήνα. Το χαρακτηριστικό αυτό παρέχει επίσης μια βάση για σύγκριση της PCaAnalyser με άλλες δημοσιευμένες αλγόριθμους.

Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε ένα Perkin Elmer Opera ™ [29], ένα σύστημα συνεστιακής απεικόνισης υψηλής απόδοσης, για να δημιουργήσει την έξοδο από ένα μοντέλο καλλιέργειας κυττάρων του προστάτη 3D σε μορφή πλάκας μικροτιτλοδότησης κατάλληλο για HTS. Πλήρης ανακατασκευή των σφαιριδίων σε 3D ήταν μνήμη και χρονοβόρα, έτσι εξαγορά 2D-εικόνα των 3D αντικειμένων, κατά μήκος του

xy

-επίπεδο, εφαρμόστηκε ως εναλλακτική λύση. Σε αυτό τον πληθυσμό των σφαιριδίων, η 2D-εικόνα του 3D αντικειμένων πλούσιο σε ανάλυση της εικόνας και την ευκρίνεια λόγω των διαφορετικών εστιακών επιπέδων, έτσι φυσική βάθη, καθώς και τη σύνθεση των διαφορετικών κυτταρικών συστατικών των 3D αντικειμένων, τα οποία συλλογικά έκανε κατακερματισμού και ανίχνευσης προκλητική. Ανίχνευση διαφόρων συν-εντοπισμένη και πολλαπλών συμφραζόμενα αντικειμένων στο ίδιο κανάλι-image θέτει επίσης σημαντικές προκλήσεις. PCaAnalyser έχει σχεδιαστεί για να αντιμετωπίσει με επιτυχία τις προκλήσεις αυτές. Έτσι, η PCaAnalyser παρουσιάζονται εδώ παρέχει μια πολύτιμη πηγή για τις έρευνες, χρησιμοποιώντας 3D μοντέλα που βασίζονται κυττάρων, ιδιαίτερα για χρήση σε υψηλές αυτοματοποιημένα συστήματα απόδοσης.

Χρησιμοποιούν PCaAnalyser, αναφέρουμε εδώ την επιτυχή ανάλυση της κατανομής και της έντασης της καλά εγκατεστημένος δείκτες που σχετίζονται με την εξέλιξη της PCA σε μια σειρά μεταστατικών κυτταρικών σειρών προστάτη (DU145 και PC3) σε ένα 3D μοντέλο. Συγκεκριμένα, έχουμε δείξει ότι σε απάντηση προς το συνδετήρα, SDF-1α, διανομή CXCR4 και έκφραση αλλάξει, ενδεικτικό ενός λειτουργικού υποδοχέα. Επιπλέον, παρουσιάζουμε εδώ τα νέα δεδομένα που αφορούν την προς τα κάτω ρύθμιση των β1 ιντεγκρίνης μετά τη θεραπεία με DHT. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι σε κύτταρα PC3, μη μεταγραφικά ενεργή AR μπορούν να μεσολαβήσουν άλλες σημαντικές πρωτεΐνες που συνδέονται με την εξέλιξη προστάτη. Τα αποτελέσματα αυτά έχουν σημαντικές συνέπειες όσον αφορά την AR στοχευμένων θεραπευτικών στο τελευταίο στάδιο της θεραπείας του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

1. Καρκινικές κυτταρικές σειρές

Το κυτταρικές σειρές MDA-MB-231 DU145, PC3 και αγοράστηκαν από

American Tissue Culture Centre

(ATCC). Οι κυτταρικές σειρές προστάτη Du145 και PC3, διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 (Invitrogen), συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS, Gibco). Ο καρκίνος του μαστού (BCA) κυτταρική σειρά MDA-MB-231 διατηρήθηκε σε DMEM-F12 (Invitrogen), συμπληρωμένο με 10% FBS. Όλα τα κύτταρα πολλαπλασιάστηκαν σε 37 ° C σε πρότυπες συνθήκες καλλιέργειας κυττάρων (5% CO

2, 37 ° C) σε Τ75 φιάλες. Τα μέσα αναπληρώνονται κάθε 3 ημέρες. Μόλις τα κύτταρα έφθασαν 80-90% συρροή είχαν ανακαλλιεργήθηκαν (1/10) σε φιάλες Τ75. Μετά από 10-12 περάσματα, τα κύτταρα διακόπηκαν.

2. Μικρογραφικά 3D κυττάρων Καλλιέργειες

Για τις κυτταρικές γραμμές PCa, κύτταρα απλώθηκαν πάνω σε ένα 3D κλίνης γέλης μήτρα (Matrigel: BD Bioscience) σε πλάκες 96 φρεατίων με γυάλινο πυθμένα (Matrical: PerkinElmer). Για μικρογραφία 3D καλλιέργειες, τα φρεάτια γεμίστηκαν με 60 μΙ μέσου Matrigel ™ /καλλιέργειας (70%) και πολυμερίζονται στους 37 ° C με 5% CO

2 για 1 ώρα. Τα κύτταρα στη συνέχεια σπείρονται σε περίπου 5000 κύτταρα ανά φρεάτιο και διατηρήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως ανωτέρω. Media απομακρύνθηκε προσεκτικά και αναπληρώνονται κάθε τρεις ημέρες. Οι καλλιέργειες διατηρήθηκαν για μέχρι 12 ημέρες. Για την κυτταρική σειρά BCA MDA-MB-231, 1.000 κύτταρα ανά φρεάτιο απλώθηκαν πάνω σε 15 μΙ αυξητικού παράγοντα Μειωμένη Matrigel (GFR Matrigel) σε μια πλάκα CellCarrier 384 φρεατίων (PerkinElmer).

3. Ligand and Drug Θεραπεία Δοκιμασίες

Χρησιμοποιώντας 96-φρεατίων κυττάρων PC3 μορφή πλάκας αναπτύχθηκαν σε 3D Matrigel καλλιέργειες όπως περιγράφηκε παραπάνω. Μετά από 9 ημέρες σε καλλιέργεια, 3D κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένα φυσικό ανδρογόνων διυδροτεστοστερόνη (DHT, Sigma-Aldrich) για 30 ώρες σε μέσο ελεύθερο ορού σε 0, 1, 5 και 10 ηΜ συγκεντρώσεις. Εναλλακτικά, 3D καλλιέργειες στερήθηκαν τον ορό για 16 ώρες και στη συνέχεια κατεργάζεται με ένα συνδετήρα CXCR4: SDF-1α: (30 ng /ml, R &? D Systems) για 0, 20 και 40 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιείται και υφίσταται επεξεργασία για ανοσοκυτταροχημεία.

Στην περίπτωση του MDA-MB-231, τα κύτταρα επωάστηκαν για 3 ημέρες πριν από την εφαρμογή του 720 ηΜ δοξορουβικίνη (Sigma-Aldrich) για 72 ώρες. Για να δείτε τον πυρήνα σε αυτά τα κύτταρα Hoechst (1:500, Invitrogen) εφαρμόστηκε για 2 ώρες πριν αναλάβει την απεικόνιση ζωντανών κυττάρων. Η δοξορουβικίνη εκπέμπει ενδογενή φθορισμό (μήκος κύματος διέγερσης 480 nm, μήκος κύματος εκπομπής 530 nm).

4. Ανοσοϊστοχημεία

Ο προσδιορισμός βασίζεται εικόνα έγινε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [4] με μικρές τροποποιήσεις. Εν συντομία, μετά από 10 ημέρες σε καλλιέργεια, 3D καλλιέργειες κυττάρων προστάτη DU145 πλύθηκαν με PBS και σταθεροποιήθηκαν με PFA (4%, 10 λεπτά για 2D, 20 λεπτά για το 3D), πλύθηκαν δύο φορές με PBS και αποκλείστηκαν για 2 ώρες με 2% BSA , 0,1% Triton-X, 0,05% Tween. αντι-α6 και αντι-β1 αντισώματα Primary ποντικού ιντεγκρίνης υπομονάδα (5 μg /ml, R &? D Systems) ή ποντικού αντι-CXCR4 (5 μg /ml, R &? D Systems) προστέθηκαν στη συνέχεια για 24 ώρες στους 4 ° C σε ρυθμιστικό διάλυμα δεσμεύσεως. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS (3 χ 5 λεπτά) και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου (RT) επί 4 ώρες με δευτερογενή αντισώματα (5 μg /mL 488 κατσίκας αντι-ποντικού) και Hoechst πυρηνική χρώση (1/1000, Invitrogen).

5. Εξαγορά της εικόνας

Όλα τα σταθεροποιημένα κύτταρα απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας το Imager τηλέφωνα PerkinElmer Opera ™ Τετράκλινο διέγερσης υψηλής ευαισθησίας Ομοεστιακή με PerkinElmer 20 /.75 ίριδας νερό. Οι εικόνες ελήφθησαν με τη χρήση του φάσματος 488 και 405 εκπομπής. απεικόνιση ζωντανών κυττάρων ολοκληρώθηκε με τη χρήση της PerkinElmer Opera χρησιμοποιώντας τον στόχο 10 × αέρα με διέγερση από τις nm λέιζερ 405 και 561. Οι εικόνων που χρησιμοποιήθηκαν ως είσοδος για το λογισμικό PCaAnalyser για την αναλυτική μελέτη που περιγράφεται στο παρόν.

Αποτελέσματα

1. Κανάλι της Πληροφορίας και Προκλήσεις

Σε αυτήν την περίπτωση, οι εικόνες μέσω δύο φθορίζουσες κανάλια διερευνήθηκαν: (1) Χ-1, για την ανίχνευση του πυρήνα (Hoerchst: εκπομπή 405) και (2) Χ-2, για την ανίχνευση έκφραση της πρωτεΐνης του ενδιαφέροντος, (CXCR4, αΒ ή β1 ιντεγκρίνης υπομονάδες) και τη διανομή.

CH-1 χρησιμοποιείται για να προσδιορίσει (α) τον πυρήνα, και (β) την περιοχή του σφαιροειδούς. Για την εξαγωγή πληροφοριών που αφορούν είτε τον πυρήνα ή /και την περιοχή του σφαιροειδούς οι εικόνες από αυτό το κανάλι υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως εικόνες φωτεινού-πεδίου, οι οποίες επιτρέπουν δύο διαφορετικά πλαίσια της εικόνας που πρόκειται να εξαχθεί από το ίδιο σήμα.

το περιεχόμενο της εικόνας έχει τη δική της πολυπλοκότητάς της, καθώς: ακόμα κι αν ένα συνεστιακό σύστημα απεικόνισης χρησιμοποιείται, τα σφαιροειδή έχουν μια δομή 3D η οποία ενσωματώνει το βάθος και την παραλλαγή, με αποτέλεσμα την άνιση φωτισμό του εστιακού επιπέδου. Οι 3D σφαιροειδή αναπτύσσονται σε ένα ημι-στερεό πήγμα, και ως τέτοια κάθονται σε ένα πλήθος διαφορετικών z-αεροπλάνα. Έτσι, υπάρχουν ένας σχετικά μικρός αριθμός των κυττάρων που απεικονίστηκαν σε εστίαση εντός του εν λόγω εστιακό επίπεδο. Αυτές οι εικόνες αποτελούνται από ένα συνδυασμό και των δύο σαφώς καθορισμένες και ασαφή δομές και θολή ασαφή συστατικά, παρέχοντας έτσι μία σημαντική πρόκληση για την ανίχνευση με ακρίβεια τον πυρήνα του κάθε κυττάρου. Αυτό γίνεται ακόμα πιο προβληματική κατά τη χρήση αυτοματοποιημένων ανάλυση, καθώς αυτά τα σήματα συχνά ενσωματώνονται στο τελικό προϊόν ή την ένταση. Έτσι, μεγαλύτερο έλεγχο των επιπέδων κατωφλίου και την ικανότητα να φιλτράρει παράμετροι εντός του λογισμικού που απαιτείται για την απόκτηση ακριβών αντιπροσωπευτικά δεδομένα.

CH-2 παρέχει τις εικόνες που καθορίζουν τη μεμβράνη κυττάρου και στο κυτταρόπλασμα των μεμονωμένων κυττάρων του σφαιροειδές μάζα. Εικόνες που αποκτήθηκαν μέσω αυτού του καναλιού έχουν χαμηλό λόγο σήματος προς θόρυβο (SNR). Οι προκλήσεις με αυτές τις συγκεκριμένες εικόνες είναι (α) με το τμήμα, να εντοπίσει και να διαβάσετε την περιοχή ένταση μηδενικό ή χαμηλό σε συνδυασμό με την υψηλότερη περιοχή ένταση του κυτταροπλάσματος, (β) να αναπτύξουν και να καθορίσουν τις κατάλληλες λειτουργίες για να ταξινομήσει διάφορες περιοχές του κυτταροπλάσματος, και ( γ) για την αποφυγή θορύβου. Η χρώση του κάθε δεδομένη ετικέτα ανοσοφθορισμού έχει μαζί του ένα εύρος τιμών SNR. Οι πυρηνικοί λεκέδες (CH-1 εικόνες) που μετράται γενικά εντός του εύρους φάσματος του μήκους κύματος 405 nm, η οποία σε σύγκριση με την 488 nm (πράσινο) ή 594 nm (κόκκινο) φάσματα, είναι πολύ διαπερατά λεκέδες. Έτσι, CH-1 εικόνες έχουν λιγότερο θόρυβο σε σύγκριση με εκείνα που λαμβάνονται με CH-2. Επιπλέον, το σύστημα Opera ™ είναι ένα αυτοματοποιημένο υψηλής απόδοσης συνεστιακή εικονοληψίας, σύμφωνα με την οποία δεν θα μπορούσε να οριστεί μεταβλητών παραμέτρων για μεμονωμένες εικόνες, έτσι μια συγκεκριμένη ρύθμιση λειτουργεί μερικές φορές καλύτερα για 6 έως 10 εικόνες, αλλά όχι για το υπόλοιπο. Ως εκ τούτου, το λογισμικό μας είχε προσαρμοστεί για να αντιμετωπίσει τα προβλήματα αυτά, καθώς και στη μείωση των ανεπιθύμητων θορύβων.

2. Ανάλυση της Εικόνας

PCaAnalyser μας αναπτύχθηκε ως ένα plug-in του ImageJ [26] – [28], η οποία παρέχει ένα εξαιρετικό περιβάλλον για την προσαρμογή, καθώς και εύκολη πρόσβαση σε πολλά διαφορετικά εικόνα-αρχείο-μορφές λόγω σε τόπους plug-in και βιβλιοθήκη Bio-Μορφές Java [30], [31]. Μια συμπιεσμένη έκδοση των σχετικών αρχείων FLEX έχει δημιουργηθεί, η οποία είναι η μορφή των αρχείων κύρια εικόνα που λήφθηκε στο. FLEX αρχείο είναι το προεπιλεγμένο αρχείο μορφής που παράγεται από το σύστημα PerkinElmer Opera ™ που έχουμε χρησιμοποιήσει για να συλλάβει τις πρώτες εικόνες. Αυτά είναι συμβατές με MBF_ImageJ [32] (έκδοση του ImageJ) μέσω της εκτεταμένης στήριξης των ΤΟΠΩΝ Bio-Μορφές (https://loci.wisc.edu/bio-formats/imagej).

Επιπλέον, μια ανεξάρτητη FLEX σε μετατροπέα TIFF αναπτύχθηκε για να παρέχει εικόνες σε μια πιο γενική μορφή. Πολλές παράμετροι στο

GenericDialog

του ImageJ που απαιτούνται για να φιλοξενηθούν για να επιτευχθεί αυτό. Δυστυχώς,

GenericDialog

περιορίστηκε στο χειρισμό περισσότερο από μερικές παραμέτρους, έτσι ήταν απαραίτητο να συνδυάσει περαιτέρω ImageJ και NetBean (έκδοση 6.8) [33] για να αναπτύξει μια προσαρμοσμένη καρτέλες τζάμι διαλόγου (Σχήμα 1) για PCaAnalyser . Αυτό καρτέλες τζάμι Dialog εύκολα και αποτελεσματικά να φιλοξενήσουν περίπου 30 παραμέτρους διαφορετικών τύπων. Η καρδιά του λογισμικού είναι

ParticleAnalyzer

από ImageJ [26] – [28]? Ωστόσο, έχουμε επεκταθεί το περαιτέρω να χρησιμοποιηθεί σε

παρτίδα-mode

να συμπληρώσει το

single-mode

επιλογή. ImageJ έχει ενημερωθεί αναλόγως και έτσι να χρησιμοποιήσει PCaAnalyser μας ως ελάχιστο, ImageJ έκδοση 1.44d απαιτείται.

Ένα από τα πέντε καρτέλες που σχετίζονται με τη «μάσκα γενιάς» είναι ορατή.

σε γενικές γραμμές, οι αλγόριθμοι της PCaAnalyser μπορούν να χωριστούν στις εξής σειρές:

i

) της συνολικής παραγωγής ανίχνευσης σφαιροειδές και μάσκα,

ii

) πυρήνα και των μελών ανίχνευσης,

iii

) ανίχνευση και κυτταρόπλασμα διαβάσει και

iv

) την υποβολή εκθέσεων.

2.1 ανίχνευση σφαιροειδές και Μάσκα γενιάς

Χ-1 έχει την εικόνα των πυρήνων, ομαδοποιούνται ανά σφαιροειδές . CH-1 με το τμήμα υποβάλλεται σε επεξεργασία για να ανιχνεύσει την πλήρη έκταση σφαιροειδές και τα όρια, επιτρέποντας το σχηματισμό του οριακού μάσκα χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο 1 (Σχήμα 2) και τα αντίστοιχα μεγάλα βήματα που φαίνονται στο σχήμα 3. Το σύνορο-μάσκα χρησιμοποιείται για τη μεταποίηση εικόνες των Ch-2 για: (α) αφαίρεση του θορύβου και (β) για να διαβάσει εντάσεις κυτταρόπλασμα και μεμβράνη περιοχές, που κυμαίνονται από μηδέν έως υψηλές τιμές. Ch-2 έχει πολύ άνιση εντάσεις, συμπεριλαμβανομένων των τιμών και μηδενική για τη μεμβράνη και κυτόπλασμα περιοχή του σφαιροειδούς, και επίσης περιλαμβάνει πολλές υψηλότερη ένταση και χαμηλότερα επίπεδα του SNR. Ως εκ τούτου, CH-2 δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανίχνευση όριο του σφαιροειδούς αξιόπιστα.

Σημαντικά βήματα του αλγορίθμου ανίχνευσης σφαιροειδές. Οι μεταβλητές με τιμές δείγμα τοποθετείται μέσα στις αγκύλες γωνίας (δηλαδή & lt? … & gt?).

Η

Τα σημαντικά βήματα που εμπλέκονται στην σφαιροειδές ανίχνευσης απεικονίζονται

Η

Κατά την επεξεργασία Χρ. -1, οι δυσκολίες που συνδέονται με τα σήματα που προκύπτουν από άνιση φωτισμό βιώσει. Χρησιμοποιώντας την αφαίρεση φόντο με ένα κατάλληλο ακτίνα του κυλιόμενου-ball-αλγόριθμος, ήμασταν σε θέση να εξαλείψει αυτό το σχετικό τεχνούργημα εικόνας. Υποθέτοντας, το ύψος ως 3η διάσταση σε 2D επιφάνεια μια εικόνα φόντου, παρέχει το pixel-ένταση αναλογικά αυτής της εικόνας. Με σκοπό την με λεία φόντο, ο αλγόριθμος κύλισης μπάλα να υποθέσουμε μια μπάλα του επιλεγεί ακτίνα τυλίγεται πάνω από την επιφάνεια 2D και το κύτος του όγκου που επετεύχθη από το μπάλας είναι η αναμενόμενη smoothened φόντο. Για να επιτευχθεί αυτό, αρχικά η σφαιροειδές-όριο ανιχνεύθηκε με την ενίσχυση της αντίθεσης σημαντικά (6 φορές) για το διαχωρισμό των χαμηλών σημάτων από το φόντο. Στο επόμενο βήμα, δύο δυνατοί τρόποι δόθηκαν για τον χρήστη να προχωρήσει: (α) αυτόματη ή (β) οδηγίες για τον εντοπισμό της κατάλληλης περίγραμμα με βάση το βάθος του αρχικού σήματος κλίση των 3D αντικειμένων και άλλων μορφολογικών παραμέτρων, όπως κυκλικότητα και το μέγεθος (περιοχή). Επιλογές για να μετατρέψετε τις εικόνες σε χαμηλότερα επίπεδα λίγο δόθηκαν επίσης, το οποίο βοηθά να διαχωριστεί το ανεπιθύμητο κομμάτι στην εικόνα που προκύπτει από την άνιση φωτισμό που προκαλείται από την πειραματική διάταξη.

Με τα προ-επεξεργασμένα και με την προϋπόθεση παραμέτρους, η ParticleAnalyzer αναπτύχθηκε για την ανίχνευση των σφαιροειδή – ο αλγόριθμος εφαρμόστηκε σε περίπου 1.000 εικόνες και το προκύπτον ανίχνευση εκτελέστηκε με ακρίβεια μεγαλύτερη από 90%, σε σύγκριση με χειροκίνητη ανάλυση μικροσκοπία και απλά προγράμματα αναγνώρισης αντικειμένου. Ανά εικόνα, υπήρχαν γενικά 10 σφαιροειδή κατά μέσο όρο

2.2 πυρήνα και Ανίχνευση Μέλους

Το σήμα από Χ-1 χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση πυρήνα.? Ωστόσο, η αντίστοιχη εικόνα είχε άνιση φωτισμού που επηρεάζονται από την αποτελεσματικότητα του προγράμματος ανάλυσης (βλέπε «Original Image» στο Σχήμα 3). Έτσι, ήταν απαραίτητο για την κατασκευή και την ενσωμάτωση τουλάχιστον 10 πρόσθετες παραμέτρους για να είναι δυνατή η ακριβής και αξιόπιστη πυρήνα-ανίχνευσης. Ο τελικός αλγόριθμος ανίχνευσης πυρήνα (Αλγόριθμος 2) ανέπτυξε αυτή περιγράφεται με λεπτομέρεια στο σχήμα 4.

Τα σημαντικά βήματα που απαιτούνται για τον αλγόριθμο ανίχνευσης πυρήνα. Οι μεταβλητές με τιμές δείγμα τοποθετείται μέσα στις αγκύλες γωνίας (δηλαδή & lt? … & gt?).

Η

Ο πυρήνας-εικόνα, που διατίθεται στο Ch-1 έχει επίσης χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση σφαιροειδές. Όπως φαίνεται στον Αλγόριθμο 2, σε πρώτη φάση, αφαίρεση φόντο χρησιμοποιήθηκε για να μειωθεί άνιση φωτισμό, και η ανάλυση της εικόνας ακολούθως ακονισμένα (στάδιο 3). Μέσα σε μία δεδομένη εικόνα, δεν είναι όλοι οι πυρήνες βρέθηκαν να έχουν το ίδιο ύψος κατά μήκος του άξονα Ζ, με αποτέλεσμα σε ορισμένες από τις οποίες είναι εκτός εστίασης καθώς διέμεναν σε μία εναλλακτική εστιακού επιπέδου εντός του 3D σφαιροειδές. Εφαρμόζοντας την ενότητα «ενίσχυση της ευκρίνειας» (λειτουργία ImageJ), ήμασταν σε θέση να μειώσει τον αριθμό των pixels και έτσι να βελτιώσει την ανίχνευση του συγκεκριμένου σήματος. Εφαρμόσαμε επίσης την «ομαλή λειτουργία» (λειτουργία ImageJ) ενότητα για να αποφευχθεί η μη ομαλή ή ζιγκ-ζαγκ τύπου όριο ανίχνευσης του πυρήνα. Ένα κατάλληλο κατώφλι-αλγορίθμου (βήμα 5) εφαρμόστηκε στη συνέχεια για τον τεμαχισμό και την ανίχνευση του πυρήνα. Επιπλέον, η μορφολογική φίλτρο εφαρμόστηκε για να φιλτράρει τον ανεπιθύμητο θόρυβο. Τα βήματα αυτής της ανάλυσης παρουσιάζονται στην Εικόνα 5.

Τα κρίσιμα στάδια που εμπλέκονται στον πυρήνα-ανίχνευση, εκτός από την εκτέλεση της αποστολής του υπέρθεση προηγουμένως δημιουργείται αντίστοιχη όρια σφαιροειδές.

Η

Εκτός από τα σημαντικά βήματα στην ανίχνευση σφαιροειδές-μελών του πυρήνα ποιοτικά (Σχήμα 5), έχουμε ανιχνεύονται ταυτόχρονα ποσοτικά την ιδιότητα του μέλους. Για το λόγο αυτό, έχουμε αναπτύξει και υλοποιήσει Αλγόριθμος 3 (Σχήμα 6). Για να εκτελέσετε τον υποψήφιο έλεγχος στον Αλγόριθμο 3, χρησιμοποιήσαμε την προσέγγιση φανφαρόνος-πλαίσιο για να εξακριβώσουμε αν το αντικείμενο Υ είναι ενδεχομένως μέσα αντικειμένου Χ ή όχι (Εικόνα 7).

Τα σημαντικά βήματα στην ανίχνευση σφαιροειδές-μελών του α πυρήνα φαίνονται.

η

για να εκτελέσετε τον υποψήφιο έλεγχος στον Αλγόριθμο 3 έως κυρίως ανιχνεύσει αν το αντικείμενο Υ είναι ενδεχομένως μέσα αντικειμένου Χ ή όχι, χρησιμοποιώντας την προσέγγιση φανφαρόνος-box. Στην περίπτωση των (Α), το Υ είναι αντικείμενο μέσα αντικείμενο Χ, ως εκ τούτου, τουλάχιστον μία γωνία του φανφαρόνος-box του Υ πρέπει να είναι εσωτερικό του φανφαρόνος-box του X. Ωστόσο, ακόμη και αν κάποια από τις γωνίες του φανφαρόνος -κουτί του Υ είναι μέσα Χ, Υ δεν μπορεί να είναι πράγματι στο εσωτερικό του Χ, όπως, περίπτωση (Β).

η

2.3 ανίχνευση και τη μέτρηση των εντάσεων της μεμβράνης και το κυτταρόπλασμα Περιοχές

Οι πληροφορίες που διατίθενται μέσω Ch-2 αναμένεται να έχει διάφορα επίπεδα έντασης (σήματα) γύρω από τη μεμβράνη και κυτταροπλασματική περιοχή του σφαιροειδούς. Σχετικούς τομείς ήταν κατά διαστήματα δημιουργώντας το όριο-μάσκα του σφαιροειδούς στα προηγούμενα βήματα (ενότητα 2.1). Αυτό μας επέτρεψε να διαβάσει αξιόπιστα την χαμηλότερη ένταση της περιοχής μη υπόβαθρο και να αποφύγει τις θορυβώδεις περιοχές.

Ένας στόχος ήταν να αναλύσει τα κύτταρα που βασίζεται όχι μόνο στις μέσες εντάσεις, αλλά και σχετικά με την κατανομή της δεδομένης πρωτεϊνών. Εξετάζεται αν η έκφραση των πρωτεϊνών βρίσκονται κυρίως στις κυττάρου-κυττάρου διασταυρώσεις, ή στο κυτταρόπλασμα, θα βοηθήσει να επιβεβαιώσει τόσο τα βασικά επίπεδα έκφρασης σε καρκινικούς και μη-καρκινικά κύτταρα, και σε ποιο βαθμό ορισμένες θεραπείες έχουν επί της έκφρασης πρωτεΐνης. Ο αλγόριθμος που συμμετέχουν στη μέτρηση εντάσεων και την ταξινόμηση κατανομή της έντασης παρέχει 4 πιθανές μεγάλες συνδυασμούς (Σχήμα 8) επιτρέπει ένα βαθμό ελευθερίας για να μελετήσει διάφορες μορφές κατανομής της έντασης, ιδιαίτερα σημαντικό για την ταξινόμηση απομακρυσμένες και μη περιφερειακή περιοχή. Ορίζουμε το διαχωρισμό των περιοχών σε μια αυτοματοποιημένη και να αναπαραχθούν μόδας σε τέσσερις πιθανούς τρόπους. Αυτές περιγράφονται ως εξής:.

Μέτρηση εντάσεις και ταξινόμηση της κατανομής έντασης

Η

i) Καθορισμός σταθερό πλάτος από όριο και η περιοχή που ορίζεται από το όριο-μάσκα. Αυτός ο συνδυασμός θα διαβάσει ολόκληρη την περιοχή εντός της μάσκας και θα κατατάξει τη μετρούμενη περιοχή σε δύο διαφορετικούς τομείς: «περιφερειακή ζώνη» του πλάτους

x

(μεταβλητή) pixels μέσα από το όριο και το υπόλοιπο μη περιφερειακή περιοχή (Σχήμα 9).

Σημαντικά βήματα που εμπλέκονται στη δημιουργία του ταξινομηθεί για ανάγνωση χάρτη.

η

ii) Καθορισμός σταθερό πλάτος από όρια και την κοινή περιοχή της μάσκας και το παραπάνω όριο. Αυτοί οι συνδυασμοί είναι παρόμοια με την προαναφερθείσα επιλογή, η οποία είναι

αριθμός

– (

i

), εκτός αντί της ανάγνωσης σε ολόκληρη την περιοχή εντός της μάσκας, που θα λαμβάνει υπόψη τις εντάσεις που βρίσκονται πάνω η εκχωρηθεί όριο αξίας. Τα κύρια στάδια που φαίνονται στο Σχήμα 10. Το κατώφλι μπορεί να εκχωρείται αυτόματα καθώς χειροκίνητα χρησιμοποιώντας το παράθυρο διαλόγου που φαίνεται στο Σχήμα 11. Είναι επίσης δυνατόν να ελεγχθεί η επίδραση οπτικά. Μια παρόμοια διαλόγου είναι διαθέσιμο σε ImageJ, ωστόσο η έκδοση ImageJ του διαλόγου περιορίζεται στο πέρασμα επιλεγμένες τιμές κατωφλίου με τις προσαρμοσμένες plug-ins του PCaAnalyser. Έτσι, έχουμε αναπτύξει μια παρόμοια αλλά παρατεταμένη διαλόγου (Εικόνα 11) για PCaAnalyser.

Τα σημαντικά βήματα που εμπλέκονται στη δημιουργία του ταξινομηθεί για ανάγνωση χαρτών μέσω του οριακού μάσκα και το όριο-μάσκα. Εικόνες απεικονίζουν ένα σφαιροειδές DU145 μεγαλώσει σε μια μήτρα 3D μετά από ανοσο-επισήμανση για την υπομονάδα α6 ιντεγκρίνης. Πάνελ στην εικόνα αυτή αναφέρονται στην ένταση του αντισώματος και της διανομής της υπομονάδας α6 ιντεγκρίνης. Επισήμανση ήταν παρούσα κατά κύριο λόγο στην περιφερειακή περιοχή του σφαιροειδούς δομής.

Η

iii) Αναλογική πλάτος από το κέντρο του σφαιροειδούς (αντικείμενο) κατά έναν παράγοντα y (όπου,) και η περιοχή που ορίζεται από το σύνορο-μάσκα. Σε αντίθεση με το σταθερό πλάτος, η επιλογή αυτή καθορίζει πρώτα το κέντρο του αντικειμένου και στη συνέχεια εφαρμόζει ανάλογο πλάτος να χαρακτηρίσει ένα pixel με βάση το εάν ανήκει σε περιφερειακές ή στη μη περιφερειακή περιοχή. Η διαδικασία φαίνεται στο Σχήμα 12Α.

Α) Βήματα που εμπλέκονται στην επεξεργασία ταξινομήσεις ανάγνωσης χάρτη με τις επιλογές που καθορίζονται για ανάλογες πλάτος και το όριο-μάσκα. Εικόνες απεικονίζουν ένα σφαιροειδές DU145 σε μια μήτρα 3D μετά από ανοσο-επισήμανση για υπομονάδα β1 ιντεγκρίνης. Πάνελ στην εικόνα αυτή αναφέρονται στην ένταση του αντισώματος και την κατανομή του β1 ιντεγκρίνης υπομονάδας. Η κατανομή των β1 παρέμεινε κατά κύριο λόγο γύρω από την εξωτερική μεμβράνη /περιφερειακή περιοχή του σφαιροειδούς. Β) Αρχική εικόνα του DU145 σφαιροειδές Β ‘) Εφαρμογή της PCaAnalyser αξιοποιώντας τις λειτουργίες συστάδα-σπάσιμο, μετά από μεγεθυντικό το σήμα του λογισμικού που βρέθηκαν μη μηδενική σημάτων μεταξύ των δύο σφαιριδίων όπως μάζες και ανιχνεύονται ως ένα ενιαίο σφαιροειδές.

Η περιφερειακή έναντι μη περιφερική λειτουργία (Σχήμα. 12Α) ήταν ιδιαίτερα χρήσιμη για τη διερεύνηση ο υποδοχέας χημειοκίνης, CXCR4, της έκφρασης και της διανομής σε απόκριση προς πρόσδεμα θεραπεία. Στόχος μας ήταν να αξιολογηθεί κατά πόσον υπήρχαν διαφορές στην έκφραση τόσο στην απουσία και παρουσία συνδέτη, SDF-1α. Σε περίπτωση απουσίας του SDF1α, η πρωτεΐνη CXCR4 εκφράστηκε μόνο επί των περιφερειακών περιοχών των σφαιροειδών. Μετά τη θεραπεία, ωστόσο, τις αλλαγές έκφραση CXCR4 και μεταναστεύει περαιτέρω στη μέση του σφαιροειδούς και βρέθηκε εντός των μη-περιφερειακές περιοχές. Επομένως, αυτή η ανάλυση επιτρέπει την επικύρωση ως προς το εάν ή όχι μία πρωτεΐνη είναι λειτουργική στο πρότυπο σύστημα κυτταρικής καλλιέργειας 3D, ή όχι.

iv) Αναλογική πλάτος από το κέντρο του σφαιροειδούς (αντικείμενο) κατά ένα συντελεστή y (όπου ,) και η περιοχή που ορίζεται από το όριο-μάσκα και το όριο-μάσκα. Αυτό είναι το ίδιο με το αμέσως προηγούμενο συνδυασμό (

αριθμός

– (

iii

)), με την εξαίρεση ότι η ανάγνωση χάρτη Εξαιρούνται οι εικονοστοιχεία που βρίσκονται κάτω από την (ανώτερη) τιμή του εκχωρηθεί κατώφλι-μάσκα.

οπτικά, η εικόνα που απεικονίζεται στο Σχήμα 12Α θα μπορούσε ενδεχομένως να θεωρηθεί ως δύο ξεχωριστές σφαιροειδή κοντά το ένα στο άλλο. Ωστόσο, είναι γνωστό ότι με το χρόνο σε καλλιέργεια, σφαιροειδή μπορούν να συγχωνευθούν και να συντήκονται μεταξύ τους για να σχηματίσουν μεγαλύτερες μάζες [3]. Ήταν, επομένως, επιτακτική ανάγκη να διατυπώσει μια διαδικασία που θα μπορούσε να ελέγξει ένα ενιαίο vs λιωμένο αντικείμενο. Έχουμε καταφέρει αυτό μέσω χαρακτηριστικό που ονομάζεται «ψευδή συστάδα-σπάσιμο» υποψήφιο. Αυτό το χαρακτηριστικό βοηθάει το λογισμικό PCaAnalyser να καθοριστεί αν σφαιροειδή είναι πραγματικά συνδεδεμένοι ή όχι. Η ψεύτικη συστάδα-σπάσιμο είναι δύσκολο να εντοπιστεί οπτικά, ωστόσο, η PCaAnalyser λύνει αυτό το πρόβλημα με την ενίσχυση του σήματος για να καθορίσει σαφέστερα την κατάσταση όπου χαμηλό σήμα υπάρχει (δηλαδή, ψευδή συστάδα-σπάζοντας υποψήφιο) έναντι υπάρχει κανένα σήμα (δηλαδή, αλήθεια clump- σπάζοντας υποψήφιο). Η αρχή είναι ότι η ενίσχυση της «χωρίς σήμα» θα παραμείνει μηδέν.