Αφηρημένο

Ιστορικό

Honokiol, ένα μικρό μοριακό βάρος φυσικά προϊόν, έχει δειχθεί ότι διαθέτουν ισχυρή αντι-νεοπλασματική και αντι-αγγειογενετικές ιδιότητες. μοριακοί μηχανισμοί της και η ικανότητα των καρκινικών αντι-γαστρικού παραμένουν άγνωστα. Έχει δειχθεί ότι η αντι-αποπτωτική λειτουργία των γλυκόζη-ρυθμιζόμενες πρωτείνες (GRPs) προβλέπει ότι η επαγωγή τους σε νεοπλασματικά κύτταρα μπορεί να οδηγήσει σε πρόοδο του καρκίνου και της αντίστασης στα φάρμακα. Ερευνήσαμε τις επιδράσεις του Honokiol για τη ρύθμιση των GRPs και απόπτωση σε ανθρώπινα γαστρικά καρκινικά κύτταρα και την ανάπτυξη του όγκου.

Μεθοδολογία και Principal Ευρήματα

Θεραπεία των διαφόρων ανθρώπινων γαστρικών καρκινικών κυττάρων με Honokiol οδήγησε στην επαγωγή της διάσπασης GRP94, αλλά δεν επηρέασε GRP78. Αποσιώπηση των GRP94 από μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) θα μπορούσε να προκαλέσει κυτταρική απόπτωση. Η επεξεργασία των κυττάρων με ετοποσίδη Honokiol ή χημειοθεραπευτικά παράγοντα ενίσχυσε την αύξηση στην απόπτωση και GRP94 αποικοδόμηση. Η δραστηριότητα καλπαΐνη και καλπαΐνη-ΙΙ (μ-καλπαΐνη) πρωτεΐνη (αλλά όχι καλπαΐνη Ι μ-καλπαΐνη) () επίπεδο θα μπορούσε επίσης να αυξηθεί με Honokiol. Honokiol επαγόμενη GRP94 κάτω ρύθμιση και την απόπτωση σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα θα μπορούσε να αναστραφεί με siRNA που στοχεύει καλπαΐνη-ΙΙ και αναστολείς καλπαΐνης. Επιπλέον, τα αποτελέσματα της χρώσης ανοσοφθορισμού και ανοσοκαταβυθίσεως αποκάλυψε ειδική αλληλεπίδραση του GRP94 με καλπαΐνη-ΙΙ σε κύτταρα εξής Honokiol θεραπεία. Έχουμε παρατηρήσει ότι το επόμενο όγκου GRP94 υπερ-έκφραση και την ανάπτυξη του όγκου σε BALB /c γυμνά ποντίκια, τα οποία εμβολιάστηκαν με ανθρώπινο γαστρικό καρκίνο κύτταρα ΜΚΝ45, είναι εμφανώς μειωμένα κατά Honokiol θεραπεία.

Συμπεράσματα και Σημασία

τα αποτελέσματα αυτά παρέχουν την πρώτη απόδειξη ότι Honokiol επαγόμενη καλπαΐνη II-διαμεσολαβούμενη διάσπαση GRP94 προκαλεί απόπτωση ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου του κυττάρου. Εμείς περαιτέρω δείχνουν ότι Honokiol μπορεί να είναι μια πιθανή θεραπευτικός παράγοντας για τη βελτίωση της κλινικής έκβασης του καρκίνου του στομάχου

Παράθεση:. Sheu ML, Liu SH, Lan KH (2007) Honokiol Προκαλεί καλπαΐνη διαμεσολαβείται γλυκόζης-Ρυθμιζόμενη Πρωτεΐνη-94 Διάσπαση και τα κύτταρα σε απόπτωση ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου και μειώνει την ανάπτυξη όγκων. PLoS ONE 2 (10): E1096. doi: 10.1371 /journal.pone.0001096

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Hany El-Shemy, Πανεπιστήμιο του Καΐρου, Αίγυπτος

Ελήφθη: 26 Ιουν 2007? Αποδεκτές: 10 Οκτώβρη του 2007? Δημοσιεύθηκε: 31 Οκτώβρη 2007

Copyright: © 2007 Sheu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από ερευνητικές επιχορηγήσεις από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο της Ταϊβάν (NSC95-2320-B040-005). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνο του στομάχου είναι η δεύτερη πιο κοινή αιτία θανάτου από καρκίνο στον κόσμο [1]. Σχεδόν τα δύο τρίτα των περιπτώσεων συμβαίνουν σε αναπτυσσόμενες χώρες και το 42% μόνο στην Κίνα [1], [2]. Οι μοριακοί στόχοι και οι μηχανισμοί που διέπουν κακή πρόγνωση δεν είναι καλά κατανοητοί. Η θεραπεία του τοπικά προχωρημένου γαστρικού καρκίνου εξακολουθεί να αποτελεί σημαντική πρόκληση. Παρά τις πρόσφατες προόδους στη θεραπεία, η κλινική έκβαση για ασθενείς με καρκίνο του στομάχου παραμένει φτωχή. Εκτός από τη χειρουργική επέμβαση, ο ρόλος της επικουρικής θεραπείας παραμένει αναπόδεικτη [2], [3]. Έτσι, η ανάγκη για τον εντοπισμό πιθανών νέων θεραπευτικών και chemopreventive παράγοντες είναι προφανής.

Honokiol, ένα ενεργό συστατικό απομονώνονται και καθαρίζονται από το

Magnolia officinalis

, έχει αποδειχθεί ότι διαθέτει τις επιδράσεις της αντι-οξείδωση [4], κατά την υπεροξείδωση των λιπιδίων [5] και αντι-φλεγμονώδη

in vitro

και

in vivo

[6], [7]. Honokiol έχει επίσης δειχθεί ότι είναι ένας συστημικώς διαθέσιμη και μη τοξικά αναστολέας της αγγειογένεσης [8]. Οι πρόσφατες μελέτες ανέφεραν ότι Honokiol επάγει κασπάσης-εξαρτώμενη απόπτωση σε κύτταρα χρόνιας λεμφοκυτταρικής λευχαιμίας Β-κυττάρων και υπερνικά τα συμβατικά αντοχή φαρμάκου σε ανθρώπινα πολλαπλό μυέλωμα με επαγωγή της κασπάσης-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από την απόπτωση [9], [10]. Αν και μια πλήρης αξιολόγηση της κλινικής δυναμικό των ενώσεων δεν είναι ακόμη δυνατή, η φαρμακοκινητική της Honokiol έχει διερευνηθεί διεξοδικά, αποκαλύπτοντας ότι Honokiol είναι διαθέσιμη κατόπιν θεραπείας των κλινικών του καρκίνου. Πιο φυσικά προϊόντα που περιέχουν μια ποικιλία θεραπευτικών ενώσεων που είναι χρήσιμες στην πρόληψη της ανάπτυξης των κακοηθειών συνεχίζουν να ανακαλύπτονται? Ωστόσο, πολύ λίγα είναι γνωστά σχετικά με υποκείμενη τους μηχανισμούς δράσης ή μοριακών στόχων τους.

Γλυκόζη-ρυθμιζόμενη πρωτεΐνη (GRP) 94 είναι μια πιο άφθονη γλυκοπρωτεΐνη στο ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) και να προσδιορίζονται μόνο σε σπονδυλωτά. Υπερ-έκφραση antisense και ριβοενζύμου προσεγγίσεις σε συστήματα ιστών καλλιέργειας άμεσα αποδειχθεί ότι GRP78 και GRP94 θα μπορούσε να προστατεύσει τα κύτταρα από τον θάνατο [11] – [13]. Η προστατευτική λειτουργία των GRPs έχει επίσης παρατηρηθεί σε αντοχή στην ακτινοβολία σε καρκίνο του τραχήλου [14]. Η αντι-αποπτωτική λειτουργία του GRPs επίσης προβλέπει ότι η επαγωγή τους σε νεοπλασματικά κύτταρα μπορεί να οδηγήσει σε πρόοδο του καρκίνου και της αντίστασης στα φάρμακα [15] – [18]. Οι παθολογικές καταστάσεις όπως ανάπτυξη όγκου και κακοήθειας προταθεί ότι συσχετίζονται με κυτταροπροστατευτικών πρωτεΐνη GRP94 υπερέκφραση [19]. Σε μεταστατικό μοντέλο κακοήθειες, μια σημαντική αποτελεσματικότητα του γονιδίου στρατηγικής /ανοσοθεραπεία GRP94 που βασίζεται δείχθηκε όταν συνδυάζεται με θεραπεία με ακτινοβολία [20]. Το ER παίζει άμεσο ρόλο στην ενεργοποίηση ενός υποσυνόλου κασπάσης κατά την ενεργοποίηση της απόπτωσης που εμφανίζεται κατά τη διάρκεια της ER στρες [21]. Από την άλλη πλευρά, καλπαΐνες είναι μία οικογένεια Ca

2 + -εξαρτώμενη ενδοκυτταρικών πρωτεασών κυστεΐνης. Εκφράζεται παντού οι καλπαΐνης-Ι (μ-καλπαΐνη) και καλπαΐνη-ΙΙ (μ-καλπαΐνη) πρωτεάσες που εμπλέκονται στην ανάπτυξη της απόπτωσης. Μια πρόσφατη μελέτη έχει δείξει ότι πανταχού παρούσα καλπαΐνες προώθηση κασπάσης-12 και την ενεργοποίηση ΙΝΚ διάρκεια ER στρες απόπτωση [22]. Έχει επίσης αναφερθεί ότι GRP94 με Ca

2 + -σύνδεση και αντι-αποπτωτική ιδιότητες είναι ένα πρωτεολυτικό στόχο της καλπαΐνης διάρκεια ετοποσίδης επαγόμενη απόπτωση [23]. Επιπλέον, σε διάφορα πειραματικά μοντέλα της απόπτωσης, έχει δειχθεί ότι η αμινο-τερματική καλπαΐνη ανασταλτική μονάδα καλπαστατίνη μπορεί να διασπαστεί με κασπάσες, γεγονός που υποδηλώνει την διάσπαση είναι απαραίτητη για την ρύθμιση της δραστικότητας της καλπαΐνης κατά τη διάρκεια του κυτταρικού θανάτου [24] – [28] . Caspase-7, το οποίο προσλαμβάνεται με την ER σε ακραίες κύτταρα, μπορεί παρομοίως διασπούν και να ενεργοποιήσει κασπάση-12 [29] – [31]. Τα αποτελέσματα της Honokiol στην GRPs που σχετίζονται με τη σηματοδότηση και την απόπτωση εξακολουθούν να παραμένουν άγνωστα. Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε των μοριακών μηχανισμών της Honokiol στην ανθρώπινη γαστρικού καρκίνου κυτταρική απόπτωση και την ανάπτυξη του όγκου

in vitro

και

in vivo

. Απροσδόκητα, βρήκαμε ότι GRP94 ακολουθούν ειδική πρωτεολυτική διάσπαση από καλπαΐνη διάρκεια Honokiol επαγόμενη απόπτωση. Αυτές οι παρατηρήσεις μπορεί να δώσει ενδείξεις ότι Honokiol είναι μια πιθανή θεραπευτικός παράγοντας για τη βελτίωση της κλινικής έκβασης του καρκίνου του στομάχου.

Αποτελέσματα

Κινητική GRP94 πρωτεολυτική διάσπαση σε ανθρώπινη γαστρικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές που έλαβαν θεραπεία με Honokiol

Εξετάσαμε πρώτον τις επιδράσεις των Honokiol στις εκφράσεις του GRP94 και GRP78 σε διάφορες ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου. Honokiol μειώνεται σημαντικά τα επίπεδα της GRP94 σε μια δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο, αλλά τα επίπεδα GRP78 δεν επηρεάζονται (Σχ. 1 και 2). Κινητική Honokiol-επαγόμενη διάσπαση GRP94 σε διάφορα ανθρώπινα γαστρικά καρκινικά κύτταρα που φαίνεται στο Σχ. 2. ΜΚΝ45 ή SCM-1 κύτταρα ήταν περισσότερο ανθεκτικά σε αποκρίσεις Honokiol επαγόμενη από κύτταρα AGS ή Ν87? τα επίπεδα της GRP94 μειώθηκαν σε περίπου 50% για διπλάσιο χρόνο. Τα επίπεδα των πρωτεϊνών GRP78 παραμένουν αμετάβλητα σε όλες τέσσερις κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου. Επιπλέον, υπάρχουν λίγο εκφράσεις πρωτεΐνης GRP94 σε φυσιολογικό ιστό ποντικού γαστρικό επιθήλιο και ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα σε σύγκριση με γαστρικό καρκίνο κύτταρα (Σχ. 1C).

(Α) αναλύσεις κηλίδος Western για GRP94 και GRP78 σε ΜΚΝ45 κύτταρα επεξεργασμένα με Honokiol για 8 ώρες κατά τρόπο δόσης-απόκρισης. (Β) στύπωμα Western αναλύσεις για GRP94 και GRP78 σε ΜΚΝ45 κύτταρα κατεργασμένα με Honokiol (α, 20μΜ? B, 40 μΜ) με τρόπο χρόνου-απόκρισης. (C) Σύγκριση της πρωτεϊνικής έκφρασης GRP94 μεταξύ των ανθρώπινων κυτταρικών γραμμών γαστρικού καρκίνου (SCM-1, AGS, Ν87, και ΜΚΝ45), όγκος που απομονώνεται από ΜΚΝ45 ποντίκια κύτταρα-εμβολιάστηκαν (Τ), η κανονική ποντίκι γαστρικό επιθήλιο ιστό (Ν), και της ανθρώπινης ενδοθηλιακά κύτταρα ομφαλικής φλέβας (HUVEC). Όλα τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα.

Η

κηλίδας Western αναλύσεις για GRP94 και GRP78 στα κύτταρα (Ν87 (Α), AGS (Β), ΜΚΝ45 (C) και SCM-1 ( Δ)) που έλαβαν θεραπεία με 40 μΜ Honokiol για διάφορα μαθήματα χρόνο όπως υποδεικνύεται. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM (n = 5).

Η

Honokiol επάγει GRP94 διάσπασης που σχετίζονται με απόκριση αποπτωτικών

Όπως φαίνεται στο Σχ. 3, Honokiol αύξησε την πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) διάσπαση και επαγώγιμο γονίδιο βλάβη του DNA CHOP /GADD153 (μια πρωτεΐνη έχει ταυτοποιηθεί ότι μεσολαβεί ER στρες που προκαλείται από απόπτωση) επίπεδα σε ΜΚΝ45 κύτταρα σε ένα δόση και το χρόνο-εξαρτώμενη τρόπος. Honokiol 20 και 40 M προκάλεσε επίσης τις εκφράσεις του διασπασμένη κασπάση-12 και κασπάση-7 (ρ20), το οποίο το μέγεθος της αύξησης ήταν ανάλογη με το χρόνο (εικ. 3Β). Επιπλέον, για να καταλάβουμε αν διάσπαση GRP94 συμμετείχε στην ανθρώπινη γαστρικού καρκίνου κυτταρική απόπτωση, η απόπτωση ανιχνεύθηκε σε GRP94-siRNA επιμολυσμένα κύτταρα. Αποσιώπηση του GRP94 με siRNA που επάγεται κυτταρικής απόπτωσης (Σχ. 4Α) και μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης GRP94 (Σχ. 4Β-α). Συγκρίναμε επίσης τα αποτελέσματα της Honokiol στην απόπτωση και την υποβάθμιση GRP94 σε ανθρώπινο γαστρικό καρκίνο κυττάρων με ετοποσίδη παράγοντα χημειοθεραπευτικά. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία των κυττάρων με Honokiol ή ετοποσίδη ενίσχυσε την αύξηση στην απόπτωση (Σχ. 4Α) και της υποβάθμισης GRP94 (Σχ. 4Β-b). Όταν τα κύτταρα ταυτόχρονα αγωγή με 40 Μ ετοποσίδη και 20 Μ Honokiol, μια μεγαλύτερη αύξηση στην υποβάθμιση GRP94 από ό, τι φάνηκε (Σχήμα 4Β-β.)? Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ο συνδυασμός του Honokiol με άλλα αντικαρκινικά φάρμακα μπορεί να είναι μια δυνητική θεραπευτική στρατηγική.

(Α) αναλύσεις κηλίδος Western για PARP και GADD153 σε ΜΚΝ45 κύτταρα κατεργασμένα με Honokiol για 8 ώρες κατά τρόπο δόσης-απόκρισης . (Β) Χρόνος αποκρίσεις πορεία για PARP, GADD153, κασπάση-7 και κασπάσης-12 σε κύτταρα ΜΚΝ45 σε επεξεργασία με Honokiol (20 μΜ). Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα.

Η

(Α) Απόπτωση σε GRP94-siRNA επιμολυσμένα κύτταρα ΜΚΝ45 αναλύθηκε με χρώση αννεξίνης V /PI, όπως περιγράφεται υπό Υλικά και Μέθοδοι, το οποίο συγκρίθηκε με κύτταρα κατεργασμένα με Honokiol (40 μΜ) ή ετοποσίδη (40 μΜ). (Β-a) επίπεδα πρωτεΐνης GRP94 ανιχνεύθηκαν με ανάλυση κηλίδας Western σε έλεγχο και GRP94-siRNA επιμολυσμένα ΜΚΝ45 κύτταρα. (Β-β) Honokiol και ετοποσίδη επάγουν διάσπαση GRP94 σε ΜΚΝ45 κύτταρα. Τα κύτταρα επεξεργάστηκαν με 20 μΜ Honokiol και 40 μΜ ετοποσίδη (Etopo.) Όπως υποδεικνύεται για 4 ώρες. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα.

Η

καλπαΐνη απαιτείται για Honokiol μεσολάβηση κυτταρικής απόπτωσης

επόμενο καθοριστεί αν η δραστηριότητα της καλπαΐνης (ασβέστιο-εξαρτώμενων πρωτεασών θειόλης) θα επάγεται από Honokiol σε τέσσερις κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α, Honokiol 20 Μ αυξημένη δραστικότητα καλπαΐνης σε χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο, το οποίο άρχισε να αυξάνεται στα 15 λεπτά, και κορυφώθηκε σε 60 λεπτά, και στη συνέχεια έπεσε κάτω σε ένα χαμηλότερο επίπεδο σε 4 ώρες. Τα κύτταρα παρέμειναν προσκολλημένα πάνω από την χρονική πορεία, χωρίς απώλεια της βιωσιμότητας (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στο Σχ. 5Β, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η αύξηση της δραστηριότητας καλπαΐνης σε απόκριση προς Honokiol (20 και 40 Μ) για 60 λεπτά σε τέσσερις κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου. Επιπλέον, η καλπαΐνη αναστολείς, Ν-ακετυλο-Leu-Leu-νορλευκινάλης (ΑΙΧΝ), Ν-ακετυλο-Leu-Leu-methioninal (ALLM), και Ζ-Leu-Leu-CHO, ανέστειλε αποτελεσματικά την αύξηση της δραστηριότητας καλπαΐνης που επάγεται από Honokiol σε Ν87 και τα κύτταρα SCM-1 (Σχ. 5C).

δραστικότητα καλπαΐνης μετρήθηκε με το φθορίζον υπόστρωμα καλπαΐνης Suc-LLVY-AMC σε Ν87, AGS, ΜΚΝ45 και των κυττάρων SCM-1. απαντήσεις πορεία (Α) Ώρα να Honokiol (20 μΜ) θεραπεία. Τα δεδομένα εκφράζονται σε όρους φορές των συνθηκών ελέγχου. (Β) Honokiol (20 και 40 μΜ) αυξάνει δραστικότητα καλπαΐνης σε 60 λεπτά θεραπείας. (Γ) Η καλπαΐνη αναστολείς ΑΙΧΝ, ALLM, και Ζ-Leu-Leu-CHO? 25 και 50 μΜ) ανέστειλε σημαντικά τη δραστικότητα καλπάίνης Honokiol-αυξηθεί. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM (n = 4).

Η

Έχουμε δοκιμαστεί περαιτέρω εάν μειωμένη δραστικότητα καλπάίνης θα μπορούσε να θέσει σε κίνδυνο την ικανότητα των Honokiol στην επαγωγή της απόπτωσης. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Α, Honokiol (40 Μ) προκάλεσε κυτταρική απόπτωση σε SCM-1 κυττάρων, η οποία θα μπορούσε να αναστραφεί από αναστολείς καλπαΐνης (ΑΙΧΝ ή ALLM). Επιπλέον, Honokiol ενισχυμένη πρωτεΐνη καλπαΐνη-ΙΙ αλλά δεν καλπαΐνη Ι εκφράσεις πρωτεΐνης σε κύτταρα SCM-1 (Εικ. 7Α). Χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση siRNA να knockdown δραστικότητα καλπάίνης-ΙΙ οδήγησε σε μια σημαντική μείωση του Honokiol (20 Μ) προκληθείσα απόπτωση σε ανθρώπινα γαστρικά καρκινικά κύτταρα μετά από 4 ώρες αγωγής (Σχ. 6Β). SiRNA-καλπαΐνης-Ι δεν επηρέασε Honokiol επαγόμενη απόπτωση (Σχ. 6Β).

ανθρώπινο γαστρικό καρκίνο κύτταρα αναλύθηκαν για απόπτωση με χρώση V /ΡΙ Annexin όπως περιγράφεται υπό το Υλικά και Μέθοδοι. (Α) SCM-1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Honokiol (HK, 40 μΜ) για 4 ώρες παρουσία ή απουσία αναστολέων καλπαΐνης (ΑΙΧΝ και ALLM, 50 μΜ). (Β) AGS κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA-καλπαΐνης-Ι- ή siRNA-καλπαΐνης-ΙΙ υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Honokiol (HK, 20 μΜ) για 4 ώρες. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Εντοπισμός και την αλληλεπίδραση των καλπαΐνη II και GRP94 παρακάτω Honokiol θεραπεία

Το επόμενο βήμα ήταν να διαλευκανθεί ο ρόλος της καλπαΐνης-II σε Honokiol που προκαλείται υποβάθμιση GRP94. Σε λέιζερ συνεστιακή μικροσκοπική μελέτη, ο εντοπισμός της πρωτεΐνης καλπαΐνη II προσδιορίστηκε με πράσινο φθορισμό, ενώ ο εντοπισμός των GRP94 καθορίστηκε με κόκκινο φθορισμό. Όπως φαίνεται στο Σχ. 7Β, τόσο καλπαΐνη-ΙΙ και GRP94 ανιχνεύθηκαν σε κυτόπλασμα με συν-εντοπισμό σε ανθρώπινο γαστρικό καρκινικά κύτταρα. Ο φθορισμός της καλπαΐνης-ΙΙ αυξήθηκε βαθμιαία, αλλά φθορισμός του GRP94 σταδιακά μειώθηκε σε ανθρώπινο γαστρικό καρκίνο κυττάρων υπό θεραπεία Honokiol. Για την περαιτέρω επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων από ανοσοκυτταροχημική χρώση ότι καλπαΐνη-ΙΙ αλληλεπιδρά με GRP94, διεξήχθησαν οι δοκιμές συν-ανοσοκαταβύθιση και κηλίδωση Western σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 7C, καλπαΐνη-ΙΙ ήταν ειδικά σχετίζεται με GRP94 σε διάφορα γαστρικά καρκινικά κύτταρα με την παρουσία του Honokiol (20 και 40 Μ) σε σύγκριση με τον έλεγχο IgG. Επιπλέον, ελέγξαμε το εάν τα πρωτεολυτικά δραστηριότητες της κασπάσης, πρωτεασώματος ή καθεψίνη συμμετείχαν στην διάσπαση GRP94. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η θεραπεία των κυττάρων με αναστολείς κασπάσης (Ac-DEVD-CHO, Z-VAD-FMK και Ζ-DEVD-FMK, 50 Μ) σε υψηλή δόση μπλοκάρει εν μέρει τη διάσπαση του GRP94 διάρκεια Honokiol επαγόμενη απόπτωση (Σχ. 8Α ) σε σύγκριση με τον αναστολέα καλπάίνης ALLM 25 Μ, η οποία θα μπορούσε να μπλοκάρει εντελώς διάσπαση GRP94. Προκατεργασία των κυττάρων με τον αναστολέα αναστολέα καθεψίνης L αναστολέας καθεψίνης Β CA-074-Me 25 και 50 Μ και η καθεψίνη L II 25 και 50 Μ και πρωτεασώματος αναστολέα MG132 0,1-10 Μ δεν ήταν σε θέση να εμποδίσει τη διάσπαση GRP94 (Σχ. 8Β και 8C) . Επιπλέον, η ειδική διάσπαση του GRP94 με καλπαΐνης θα μπορούσε να παρατηρηθεί χρησιμοποιώντας κυτταρολύματα παρασκευάζονται από ανθρώπινο γαστρικό καρκινικά κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Honokiol (20-60 μΜ) για διάφορες χρονικές πορείες όπως υποδεικνύεται . (Α) Τα επίπεδα πρωτεΐνης καλπαΐνης Ι και II ανιχνεύθηκαν με ανάλυση κηλίδας Western σε κύτταρα Honokiol επεξεργασμένα SCM-1. (Β) την πρωτογενή αντισώματα για καλπαΐνη-ΙΙ και GRP94 εφαρμόστηκαν στα κύτταρα (ΜΚΝ45 και SCM-1) ακολουθούμενη από δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με FITC-συζευγμένο ή TRITC-συζευγμένο, αντίστοιχα. Συν-εντοπισμό των δύο επισημασμένα αντιγόνα ανιχνεύθηκε ως μία εικόνα όταν επικαλύφθηκαν οι εικόνες από τα δύο κανάλια. (C) Αλληλεπίδραση της καλπαΐνης και GRP94 ανιχνεύθηκαν σε Ν87, AGS, ΜΚΝ45 και των κυττάρων SCM-1. Ανοσοκαταβυθισμένες πρωτεΐνες συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και ανοσοκηλίδωση με αντι-καλπαΐνης-ΙΙ ή αντι-GRP94 αντισώματα. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Τα κύτταρα είτε μη επεξεργασμένα ή προκατεργασμένο με αναστολείς για 1 ώρα, ακολουθούμενο από 40 μΜ κατεργασία Honokiol για άλλες 24 ώρες. (Α) αναστολέα κασπάσης (Ζ VAD-FMK-25 και 50 μΜ) ή αναστολέα καλπαΐνης (ΑΙΧΝ, 25 μΜ)? (Β) αναστολέα καθεψίνης Β (CA-074-Me, 25 και 50 μΜ) ή αναστολέα καθεψίνης L (αναστολέας καθεψίνης L II, 25 και 50 μΜ)? (Γ) αναστολέα πρωτεασώματος (MG132, 0.1-10 μΜ) ή αναστολέα καλπαΐνης (ΑΙΧΝ, 25 μΜ). Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα.

Η

επόμενο διερευνηθεί αν η ενεργοποίηση καλπαΐνης απαιτείται για Honokiol επαγόμενη κυτταρική απόπτωση. Στο Σχ. 9, οι αυξήσεις της έκφρασης καλπαΐνης-ΙΙ πρωτεΐνη και την υποβάθμιση GRP94 και κασπάση-7 και κασπάσης-12 ενεργοποιήσεως που επάγεται από Honokiol (40 Μ) εμποδίστηκαν με φαρμακολογικά αναστολείς καλπαΐνης και παροδική επιμόλυνση του siRNA-καλπαΐνης-ΙΙ σε κύτταρα SCM-1.

κηλίδωση Western για τον προσδιορισμό της αποικοδόμησης GRP94 και καλπαΐνη-Ι και έκφραση II και ενεργοποίηση της κασπάσης-7 και κασπάσης-12 σε SCM-1 κύτταρα 24 ώρες μετά Honokiol (40 μΜ) κατεργασία παρουσία ή απουσία ανιχνεύθηκε αναστολείς καλπαΐνης (ΑΙΧΝ και ALLM, 25 και 50 μΜ). Σε μερικά πειράματα, τα κύτταρα SCM-1 επιμολύνθηκαν με καλπαΐνη-ΙΙ-siRNA ή ελέγχου siRNA. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Honokiol εξασθενεί GRP94 όγκου υπερ-έκφραση και την ανάπτυξη του όγκου σε άτριχα ποντίκια

Γυμνά ποντίκια εμβολιάστηκαν με 4 × 10

6 αδιαφοροποίητα κύτταρα αδενοκαρκινώματος ΜΚΝ45 και κατεργάζεται με Honokiol 0,5 και 1,5 mg /kg ή όχημα όταν όγκου έγινε εμφανής. Ανοσοϊστολογική και κηλίδωση Western ανάλυση έδειξε ότι GRP94 υπερέκφραση και συσσωρευμένη στην περιοχή του όγκου, αλλά όχι σε φυσιολογικό γαστρικό ιστό (Σχ. 10Α-α και 10Α-Β). Honokiol μείωσε σημαντικά τη συσσώρευση GRP94 σε όγκους σε σύγκριση με έκδοχο ελέγχου (Σχ. 10Α-α και 10Α-Β). Η έκφραση του GRP78 δεν επηρεάστηκε (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Για να καθοριστεί εάν Honokiol θα μπορούσε να καταστείλει την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

, συμπαγείς όγκους καθορίστηκαν σε ποντίκια και η επίδραση κατά των όγκων των κατ ‘επανάληψη εγχέεται Honokiol μελετήθηκε. Όπως φαίνεται στο Σχ. 10Β, η χορήγηση Honokiol 0,5 και 1,5 mg /kg έδειξαν σημαντική δραστικότητα κατά του όγκου.

Οι όγκοι σε γυμνά ποντίκια καθορίστηκαν για 14 ημέρες μετά την ένεση ΜΚΝ45 κύτταρα και που ακολουθείται από κατεργασία με 0,5 και 1,5 mg /kg Honokiol κάθε μέρα για 10 ημέρες. εκφράσεις (Α-Α) GRP94 σε όγκους ή φυσιολογικό γαστρικό ιστούς προσδιορίστηκαν με ανοσοϊστοχημεία. Οι τομές χρωματίστηκαν με GRP94 αντίσωμα όπως περιγράφεται υπό Υλικά και Μέθοδοι. Οι εκφράσεις των πρωτεϊνών GRP94 στο κυτταρόπλασμα βάφτηκαν σε σκούρο καφέ. (Α-Β) Κηλίδωση Western για τον προσδιορισμό των πρωτεϊνών GRP94 σε όγκους με ή χωρίς θεραπεία Honokiol ανιχνεύθηκε. (Α-Ο) Η ανίχνευση της πρωτεϊνικής έκφρασης GRP94 με κηλίδωση Western σε ΜΚΝ45 κύτταρα με ή χωρίς Honokiol (40 μΜ) αγωγή ή σε φυσιολογικούς ιστούς γαστρικό δείχθηκε. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα. αξιολογήθηκε όγκος (Β) του όγκου. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM (n = 7).

Η

Συζήτηση

Έχουμε αναφερθεί εδώ για πρώτη φορά ότι η καλπαΐνη, ένα μη λυσοσωμικό Ca

2 + -ενεργοποιημένου κυστεΐνη πρωτεάσης, ειδικά καλπαΐνη-ΙΙ, παίζει καθοριστικό ρόλο στην διάσπαση του GRP94, αλλά GRP78 δεν επηρεάζεται, και στη ρύθμιση της απόπτωσης που επάγεται από Honokiol σε ανθρώπινο γαστρικό καρκινικά κύτταρα. Συγκεκριμένα, υπό τον όρο λειτουργική αποδείξεις ότι η διάσπαση του GRP94 κατόπιν Honokiol αγωγή δρα ως θεραπευτικό όφελος, αναστολή ανάπτυξης όγκου σε μοντέλο ποντικού του ανθρώπινου γαστρικού καρκινώματος. Για τις γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη έκθεση για να δείξει ότι Honokiol μπορεί να χειριστεί την υποβάθμιση GRP94 πρωτεΐνη συνοδός καλπάίνης επαγόμενο είναι ο στόχος κατά τη διάρκεια της απόπτωσης.

Οι μελέτες από πολλαπλά εργαστήρια επεσήμανε την ER ως διαμέρισμα στόχο με θεραπευτικούς παράγοντες που εμπλέκονται σε εκτέλεση της απόπτωσης. Κυτοσολίου Ca

2+ έχει ενοχοποιηθεί ως ένας δεύτερος αγγελιαφόρος του proapoptosis εμπλέκονται τόσο πυροδότηση αποπτώσεως και τη ρύθμιση κασπάσες ή καλπαΐνες [32] – [34]. Μια πρόσφατη μελέτη έχει δείξει ότι η καλπαΐνη είναι ένας σημαντικός μεσολαβητής της ρεσβερατρόλης (ένα φυσικό φυτό πολυφαινόλη) επαγόμενη απόπτωση στον καρκίνο του μαστού [35]. Βρήκαν ότι η ρεσβερατρόλη μπορεί να προκαλέσει μια αύξηση του ενδοκυτταρικού Ca

2+, και ενεργοποιεί καλπαΐνη απόπτωση που διαμεσολαβείται, που οδηγεί στην υποβάθμιση των πλασματικής μεμβράνης Ca

2 + -ΑΤΡάσης ισομορφή 1 και φοδρίνη σε κασπάσης-3 με ανεπάρκεια MCF- 7 κύτταρα. Honokiol έχει επίσης αναφερθεί ότι επάγει Ca

2+ κινητοποίηση σε αρουραίους νευρώνες του φλοιού και των ανθρωπίνων κυττάρων νευροβλαστώματος SH-SY5Y, πιθανώς μέσω της ενεργοποίησης της φωσφολιπάσης C και IP

3 υποδοχείς [36]. Στην παρούσα μελέτη, βρήκαμε ότι Honokiol είναι ικανό να αυξάνει δραστηριότητας καλπαΐνης και η έκφραση πρωτεΐνης καλπαΐνης-ΙΙ αλλά δεν καλπαΐνη Ι κατά Honokiol επαγόμενη γαστρικού καρκίνου κυτταρική απόπτωση. Επιπλέον, οι αναστολείς καλπαΐνης και αποσιώπηση της καλπαΐνης-II από siRNA αντιστραφεί σημαντικά την Honokiol επαγόμενη απόπτωση. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι Ca

2 + -triggered ενεργοποίηση καλπάίνης-II μπορεί να διαδραματίσει έναν δυναμικό ρόλο στην Honokiol απόπτωση.

GRP94 /gp96 είναι το μέλος κάτοικος ER της οικογένειας HSP90. GRP94 παίζει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της κυτταρικής ομοιόστασης. Αυτή η συμβατική έννοια της GRP94 ως αναδίπλωσης των πρωτεϊνών συνοδού ενημερώνεται από τις ανακαλύψεις που GRPS προάγουν τον πολλαπλασιασμό όγκου, μετάσταση, αντοχή φαρμάκου, και ανοσοθεραπεία, τα οποία έχουν σημαντικές κλινικές επιπτώσεις στην πρόγνωση και θεραπεία του καρκίνου [3]. GRP94 έχει αποδειχθεί ότι σχετίζεται με ογκογονικότητα σε καρκινικές κυτταρικές σειρές, τα μοντέλα τρωκτικών όγκων και των ανθρωπίνων βιοψίες του καρκίνου [37] – [39]. Αυτό είναι συνεπές με τα ευρήματα ότι η επαγωγή του GRPs προκαλεί προστατευτική λειτουργία ως οι αποκρίσεις επιβίωσης σε θρεπτικά συστατικά πείνα, οξέωση, και οι συνθήκες υποξίας, οι οποίες είναι κοινές σε φτωχά αγγειοποιημένου στερεούς όγκους [11], [40]. Έχει επίσης φάνηκε ότι τα περισσότερα από τα GRPs σε κύτταρα όγκου ασχολείται με σύμπλοκα πολυ-συνοδός, ενώ δεν είναι σε φυσιολογικά κύτταρα [41]. Ο εμβολιασμός ποντικών με όγκους που προέρχονται από πρωτεΐνες του στρες, GRP94, μπορούν να προκαλέσουν αντικαρκινικές ανοσοαποκρίσεις, αποδίδοντας μια αισθητή καταστολή της ανάπτυξης του όγκου και της μετάστασης. Η δραστικότητα των αναστολέων Hsp90 έχει καλά επικυρωθεί σε προκλινικά μοντέλα καρκίνου του μαστού, τόσο σε μελέτες μονοθεραπείας και σε συνδυασμό με τη συμβατική χημειοθεραπεία [41]. Επιπλέον, έχει προταθεί ότι GRP94 είναι ένα φυσιολογικό υπόστρωμα για καλπαΐνη [23]. Η καλπαΐνη έχει αποδειχθεί ότι ενεργοποιείται στην μεμβράνη ER, όπου αλληλεπιδρά με GRP94, καταλήγοντας σε ειδική πρωτεολυτική διάσπαση του καθώς τα κύτταρα υφίστανται απόπτωση προκαλείται από ετοποσίδη [23]. Στην τρέχουσα μελέτη, βρήκαμε ότι η διάσπαση GRP94 Honokiol επαγόμενη και απόπτωση σε ανθρώπινα γαστρικά καρκινικά κύτταρα μπορεί να αντιστραφεί πλήρως από παρεμποδισταί καλπαΐνης και αποσιώπηση της καλπαΐνης-ΙΙ με siRNA. αναστολείς της κασπάσης σε υψηλή δόση αντιστραφεί μερικώς τη διάσπαση GRP94 Honokiol που προκαλείται. Προκατεργασία των κυττάρων με την καθεψίνη Β και αναστολείς L και αναστολέα πρωτεασώματος δεν ήταν σε θέση να εμποδίσει Honokiol-επαγόμενη διάσπαση GRP94. Δείξαμε επίσης ότι η αποσιώπηση των GRP94 από siRNA μπορεί να προκαλέσει γαστρική απόπτωση των καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, τα αποτελέσματα των ανοσοκυτταροχημική χρώση και ανοσοκαταβύθιση απεκάλυψε μία ειδική αλληλεπίδραση του GRP94 με καλπαΐνη-ΙΙ σε γαστρικό καρκίνο κύτταρα μετά Honokiol θεραπεία. Η ειδική διάσπαση του GRP94 με καλπαΐνης θα μπορούσαν επίσης να παρατηρηθεί χρησιμοποιώντας κυτταρολύματα παρασκευάζονται από ανθρώπινο γαστρικό καρκινικά κύτταρα. Τα ευρήματα αυτά, ως εκ τούτου, υποδεικνύουν ότι καλπαΐνη II-διαμεσολαβούμενη διάσπαση GRP94 παίζει σημαντικό ρόλο στην Honokiol ενεργοποιούνται γαστρικού καρκίνου κυτταρική απόπτωση.

καλπαΐνες και κασπάσες είναι δύο οικογένειες πρωτεασών κυστεΐνης που εμπλέκονται στην ρύθμιση παθολογικής κυτταρικής θάνατος [22], [31]. Αυτές οι πρωτεάσες μοιράζονται πολλά υποστρώματα θανάτου που σχετίζονται συμπεριλαμβανομένων κασπάσες οι ίδιοι, κυτταροσκελετικών πρωτεϊνών, Bax και προσφοράς [42]. Η καλπαΐνη μεσολάβηση προχωρά πρωτεόλυση κατά περιορισμένο τρόπο, αλλά δεν απαιτεί ειδική υπόλειμμα αμινοξέος όπως αυτή των κασπασών. Παρά το γεγονός ότι τόσο καλπαΐνη και κασπάσης έχουν προταθεί να παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της παθολογικής κυτταρικό θάνατο, οι αλληλεπιδράσεις των δύο αυτών οικογενειών πρωτεασών υπό παθολογικών καταστάσεων δεν είναι σαφείς. Στην παρούσα μελέτη, knockdown και φαρμακολογικές αναστολείς προσεγγίσεις έχουν συμβάλει σημαντικά στη γνώση μας για καλπαΐνης βιολογίας, ιδίως όσον αφορά την ειδική λειτουργία της για την κυτταρική απόπτωση, η οποία είναι πιθανό ότι κασπάσες 7 και 12 είναι προς τα κάτω από την καλπαΐνη στη μεσολάβηση Honokiol επαγόμενη γαστρικό καρκίνο κυτταρική απόπτωση.

φαρμάκων Φυσικό προϊόν έχει προταθεί να παίζει κυρίαρχο ρόλο στη φαρμακευτική περίθαλψη [43]. Φυσικά προϊόντα αποτελούν μία από τις σημαντικότερες πηγές δυναμικού χημειοθεραπευτικών του καρκίνου και chemopreventive παράγοντες [43]. Honokiol έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως στην παραδοσιακή κινεζική ιατρική και την ιαπωνική για αρκετές χιλιάδες χρόνια, κυρίως, για τη θεραπεία των αντι-θρομβοπενική, αντι-βακτηριακή, αντι-φλεγμονώδη, και αγχολυτικά αποτελέσματα. Προηγούμενες αναφορές έχουν δείξει ότι Honokiol επίσης διαθέτει ισχυρή αντι-νεοπλασματική και αντι-αγγειογενετικές ιδιότητες [6], [19], [38]. Ωστόσο, ο ακριβής μοριακός μηχανισμός παρουσίασαν δραστικότητα κατά του όγκου με Honokiol δεν είναι καλά κατανοητός. Έτσι, τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης παρέχουν ενδείξεις για την αντικαρκινική δραστικότητα του Honokiol σε γαστρικό καρκίνο, και το πιο σημαντικό, τη μοριακή βάση για την επίδρασή του. Βρήκαμε ότι Honokiol επάγει την ενεργοποίηση της καλπαΐνης, η διάσπαση GRP94, και την απόπτωση σε ανθρώπινα γαστρικά καρκινικά κύτταρα. Επιπλέον, μετά τη χορήγηση του Honokiol σε γυμνά ωραίο εμφυτευθεί γαστρικά καρκινικά κύτταρα ΜΚΝ45 έδειξαν σημαντική δραστικότητα κατά του όγκου. Αυτή η προκλινική μελέτη μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα πλαίσιο και αποτελεί μια πολλά υποσχόμενη νέα στοχευμένη προσέγγιση. Επιπλέον, οι φυσικές ενώσεις έχουν δειχθεί ότι συνδυάζονται με συμβατικούς κυτταροτοξικούς παράγοντες μπορεί να είναι κλινικά επωφελής με αντικαρκινικά φάρμακα. Αυτό το πλεονέκτημα καθώς η αναδυόμενη απόδειξη των μηχανισμών κατά των όγκων της, την καθιστούν Honokiol συνεχή κλινική εφαρμογή για να είναι ένας αποτελεσματικός και ασφαλής παράγοντας αντι-όγκου.

Υλικά και Μέθοδοι

Cells, Πολιτισμού συνθήκες και τα αντιδραστήρια

κυτταρικές σειρές ανθρώπινου συμπεριλαμβανομένων Καυκάσιος γαστρικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (AGS, μια μέτρια-πτωχά διαφοροποιημένη κυτταρική σειρά αδενοκαρκινώματος, και Ν87, μια καλά διαφοροποιημένη κυτταρική γραμμή καρκινώματος) και της Ασίας κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου (ΜΚΝ45 και SCM-1, η αδιαφοροποίητα κύτταρα αδενοκαρκινώματος) ελήφθησαν από την τράπεζα κυττάρων στο κέντρο του καρκίνου του Ταϊπέι γενικού νοσοκομείου βετεράνων (Ταϊβάν). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 που περιέχει 10% θερμο-απενεργοποιημένο FCS (Life Technologies) και στρεπτομυκίνη /πενικιλίνη (Life Technologies) σε υγροποιημένη 5% CO

2 ατμόσφαιρα. Honokiol ελήφθη από την Wako Chemical Company (Japan), και η καθαρότητα του προσδιορίσθηκε να είναι τουλάχιστον 99% με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης.

ανάλυση κηλίδος Western και ανοσοκαθιζήσεις

ολόκληρου κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [44]. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση πρόχυτα 8-20% SDS-πολυακρυλαμιδίου, και έπειτα μεταφέρθηκαν ηλεκτροφορητικά από την πηκτή πάνω σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου. Μετά τον αποκλεισμό, οι κηλίδες επωάστηκαν με αντι-GRP94, αντι-GRP78, αντι-κασπάση 12, αντι-κασπάση 7, αντι-PARP, αντι-GADD153 (Santa Cruz Biotechnology), αντι-καλπαΐνης-Ι (μ-καλπαΐνη), αντι-καλπαΐνης-ΙΙ (μ-καλπαΐνη) (Santa Cruz Biotechnology), και αντι-β ακτίνης (Sigma) αντισώματα σε PBS εντός 0,1% Tween 20 για 1 ώρα και ακολούθησαν τρεις 10 λεπτών πλύσεις σε PBS εντός 0,1% Tween 20. Το μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με συζευγμένη με υπεροξειδάση χρόνου δευτερογενή αντισώματα για 60 λεπτά. Στην ανοσοκαθίζηση, οι πρωτεΐνες (500 g) επωάστηκαν με ειδικά αντισώματα και ακινητοποιήθηκε σε σφαιρίδια πρωτεΐνης Α-Sepharose. Χάντρες πλύθηκαν εκτεταμένα με immunoprecipitative ρυθμιστικό Bacco, το βραστό, και μικροφυγοκέντρηση. Είσοδος 10% του κυτταρολύματος για ΙΡ και 50 g πρωτεΐνες αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. Η ανίχνευση πραγματοποιήθηκε με κηλίδωση Western αντιδραστήριο ECL (Amersham), και χημειοφωταύγεια εκτέθηκε από τις ταινίες Kodak X-Omat.

καλπαΐνη Δοκιμασίες Δραστηριότητας

Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC είναι ένα υπόστρωμα πρωτεάσης καλπαΐνης. Η ποσοτικοποίηση του 7-αμινο-4-μεθυλοκουμαρίνη φθορισμού (AMC) επιτρέπει την παρακολούθηση των ενζύμων υδρόλυση του προϊόντος σύζευξης πεπτιδίου-AMC και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη μέτρηση της δραστικότητας του ενζύμου. Τα κύτταρα παρασκευάστηκαν και αντιμετωπίζονται επί 24 φρεατίων Corning /Costar. Πριν από την προσθήκη αναστολέων κύτταρα φορτώθηκαν με 40 Μ Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC (Biomol) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με Honokiol για ενδεικνυόμενο χρονισμού στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 θερμοκοιτίδα. Η πρωτεόλυση του φθορίζοντος ανιχνευτή παρακολουθήθηκε χρησιμοποιώντας ένα φθορίζον σύστημα ανάγνωσης πλάκας (HTS-7000 Plus Series βιοδοκιμασία, Perkin Elmer) με τις ρυθμίσεις φίλτρου 360 ± 20 nm για διέγερση και 460 ± 20 nm για εκπομπή.

siRNA και Η επιμόλυνση Δοκιμασίες

το siRNA δίπολα ειδικό για την αναστολή της καλπαΐνης-Ι (μ-καλπαΐνη) και καλπαΐνη-ΙΙ (μ-καλπαΐνη) εκφράσεις σε ανθρώπινα κύτταρα ελήφθησαν από την Santa Cruz Biotechnology: καλπαΐνη-Ι, Κατάλογος Νο . SC-29885, μια πισίνα 3 ειδικού στόχου 20-25 nt siRNAs? καλπαΐνη-ΙΙ, Κατάλογος Νο. SC-41459, ένας στόχος-συγκεκριμένο 20-25 nt siRNA. Τα siRNA ελέγχου (αρ. Καταλόγου sc-37007) είναι ένας μη-στόχευσης 20-25 nt siRNA σχεδιαστεί ως αρνητικός έλεγχος. Επιπλέον, το siRNA δίπολα ειδικό για την αναστολή της έκφρασης GRP94 συντέθηκε από εμπορικώς MWG Biotech (Γερμανία). Η αίσθηση (επάνω) και αντινόημα (κάτω) αλληλουχίες του διπλού GRP94 siRNA ήταν ως εξής: 5′-GAAGAAGCAUCUGAUUACCTT-3 ‘? 3’-TTCUUCUUCGUAGACUAAUGG-5 ‘. Ως μη ειδικό έλεγχο, μια αμφίδρομη NC siRNA με τυχαίες αλληλουχίες σχεδιάστηκε ως εξής: 5’-AGUUCAACGAGUAUCAGCATT-3 ‘? 3’-TTUCAAGUUGCUCAUAGUCGU-5 ‘. Τα siRNAs χρησιμοποιήθηκαν σε μια συγκέντρωση της τάξης των 100-200 ηΜ για παροδική επιμόλυνση των κυττάρων με Lipofectin (Invitrogen) ανά φρεάτιο σε ένα πλακίδιο 6 φρεάτων με φρέσκο ​​μέσο. Μετά από 24 ώρες από την αρχική επιμόλυνση και 24-36 h θεραπεία, κύτταρα ή κυτταρολύματα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν για απόπτωση ή έκφραση πρωτεΐνης, αντίστοιχα.

Ανοσοφθορισμός και Laser Scanning Microscopy Ομοεστιακή

Τα κύτταρα πλύθηκε δύο φορές με PBS, σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη για 30 λεπτά και στη συνέχεια δεσμεύθηκαν με επώαση σε 1% αλβουμίνη βόειου ορού σε PBS. Πρωτογενή αντισώματα όπως υποδεικνύεται εφαρμόστηκαν στις πλάκες σε αραίωση 1:500 και επωάστηκαν στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με συζευγμένο με FITC ή TRITC-συζευγμένα δευτερογενή αντισώματα (Sigma).