Αφηρημένο

Ιστορικό

Notch και Wnt μονοπάτια αποτελούν βασικούς ρυθμιστές της ομοιόστασης του εντέρου και τροποποιήσεις αυτών των οδών μπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC). Σε CRC ο

Αρο /β-κατενίνης

γονίδια στο μονοπάτι σηματοδότησης Wnt μεταλλάσσονται συχνά και ενεργή σηματοδότηση Notch συμβάλλει στην ογκογένεση, κρατώντας τα επιθηλιακά κύτταρα σε μία πολλαπλασιαστική κατάσταση. Αυτά τα μονοπάτια είναι ταυτόχρονα ενεργά στην πολλαπλασιαστική κύτταρα αδενώματος και μία λογομαχία μεταξύ τους έχει ήδη προταθεί στην κανονική ανάπτυξη, καθώς και στον καρκίνο.

Κύρια Ευρήματα

Σε αυτή τη μελέτη,

in silico

ανάλυση των υποθετικών υποκινητών που εμπλέκονται σε μεταγραφική ρύθμιση των γονιδίων που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες στο μονοπάτι σηματοδότησης Notch αποκάλυψε διάφορες υποθετικές-1 LEF /TCF περιοχές ως πιθανοί στόχοι για β-κατενίνης και κανονική σηματοδότηση Wnt. Περαιτέρω αποτελέσματα του προσδιορισμού της κινητικότητας μετατόπισης ανταγωνιστική ηλεκτροφορητική (EMSA) μελέτες δείχνουν δέσμευσης αρκετών πιθανές θέσεις σε υποκινητές γονιδίων μονοπάτι Notch να

in vitro

μεταφραστεί β-κατενίνης /Λεφ-1. Άγριου τύπου (wt) -APC ρυθμίζει αρνητικά β-κατενίνης. Με επαγωγή του wt-APC ή β-κατενίνης σίγηση σε κύτταρα ΗΤ29, παρατηρήσαμε ότι αρκετά γονίδια στο μονοπάτι Notch, περιλαμβανομένων

Notch-2

, ρυθμίστηκαν προς τα κάτω. Τέλος, ενεργό σηματοδότησης Notch επαληθεύτηκε στο

Αρο

Min /

μοντέλο ποντικού + όπου

Hes-1

επίπεδα mRNA βρέθηκαν σημαντικά υπερεκφράζεται στην εντερική όγκους σε σύγκριση με την κανονική εντερική βλεννογόνο. δοκιμασίες λουσιφεράσης έδειξαν αυξημένη δραστικότητα για τον πυρήνα και το εγγύς

Notch-2

υποκινητή κατόπιν συν-επιμόλυνση των κυττάρων HCT116 με υψηλή έκφραση ανασυνδυασμένης από TCF 4, Lef-1 ή β-κατενίνης.

συμπεράσματα

Στην εργασία αυτή, εντοπίσαμε

Notch-2

ως νέο στόχο για σηματοδότηση Wnt β-κατενίνης-εξαρτώμενη. Επιπλέον τα δεδομένα μας υποστηρίζει την ιδέα ότι επιπρόσθετα γονίδια στο μονοπάτι Notch θα μπορούσε να ρυθμίζεται μεταγραφικά από σηματοδότηση Wnt σε καρκίνο του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Ungerbäck J, Elander Ν, Grünberg J, Sigvardsson Μ, Söderkvist Ρ (2011) Η

Notch-2

γονιδίου ρυθμίζεται από σηματοδότηση Wnt σε καλλιεργημένα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 6 (3): e17957. doi: 10.1371 /journal.pone.0017957

Επιμέλεια: Kerstin Borgmann, Ιατρικό Κέντρο του Πανεπιστημίου του Αμβούργου-Eppendorf, Γερμανία

Ελήφθη: 28 Ιούλη 2010? Αποδεκτές: 21 του Φεβρουαρίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 18, Μάρ 2011

Copyright: © 2011 Ungerbäck et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από το σουηδικό Συμβούλιο Έρευνας και Östergötland County Council. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο επιθήλιο της γαστρεντερικής οδού αντικαθίσταται συνεχώς με ένα ρυθμό στροφή-over δύο έως επτά ημέρες. Για να διατηρηθεί ομοιόσταση του εντερικού επιθηλίου, επεξεργάζεται τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση, τη μετανάστευση και τον θάνατο πρέπει να ρυθμίζεται αυστηρά [1] – [3]. Μερικά αλλά εξαιρετικά διατηρημένη μονοπάτια σηματοδότησης σκέφτηκε να οδηγούν αυτές τις διαδικασίες (αναθεωρηθεί [4], [5] και [6]). Η κανονική μονοπάτι σηματοδότησης Wnt ήταν το πρώτο που ανακαλύφθηκε ως ουσιαστικής σημασίας για την εντερική πολλαπλασιασμό κρύπτης των κυττάρων και την ομοιόσταση [7] – [10]. Ένα βασικό συστατικό της οδού αυτής είναι η κυτταροπλασματική πρωτεΐνη β-κατενίνης, η οποία όταν μετατοπίζεται στον πυρήνα ως αποτέλεσμα της Wnt σήματα, χρησιμεύει ως συν-παράγοντας για παράγοντες μεταγραφής του ΦΝΟ-1 /η TCF (ενισχυτής Λεμφοειδής παράγοντα-1 /Τ Cell Factor) της οικογένειας να επιτρέπουν την ενεργοποίηση μιας κατάντη γενετικό πρόγραμμα [11]. Το επίπεδο της β-κατενίνης στο επιθήλιο του παχέος εντέρου ρυθμίζεται από το σύστημα ubiquitinin-πρωτεασώματος [12]. Ένα από τα κρίσιμα συστατικά του συμπλόκου καταστροφή β-κατενίνης είναι η αδενωματώδη πολυποδίαση coli (APC) πρωτεΐνη [11]. Μεταλλακτικές αδρανοποίηση του γονιδίου αυτού προκαλεί την σταθεροποίηση του β-κατενίνης [13] και την αύξηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και αποτελεί ένα από τα πιο κοινά γενετικές αλλοιώσεις σε καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) [14]. Αυτό οδηγεί σε αυξημένα επίπεδα και πυρηνική μετατόπιση του β-κατενίνης και την επακόλουθη ενεργοποίηση των απορυθμισμένη LEF-1 /TCF γονίδια στόχους [5].

Η ωρίμανση του εντερικού βλαστικών κυττάρων ρυθμίζεται επίσης από την οδό σηματοδότησης του Notch αντιπροσωπεύει μια άλλη εξελικτικό σύστημα συντηρημένες σηματοδότησης που εμπλέκονται στη διατήρηση της ομοιόστασης επιθήλιο του παχέος εντέρου [2] – [4], [15] – [17]. Βασικά στοιχεία σε αυτό το μονοπάτι σηματοδότησης είναι οι μονομερείς δεσμεύονται διαμεμβρανικών υποδοχέων Notch (Notch1-4 στα θηλαστικά), η οποία κατά την σύνδεση προς συνδετήρα (Deltalike-1, -3, -4, Jagged-1 ή -2) απελευθερώνουν μία ενδοκυτταρική περιοχή (NICD ) που χρησιμεύει ως μεταγραφικός συν-παράγοντας. Η ειδικότητα της αλληλεπίδρασης συνδέτη /υποδοχέα προσδιορίζεται μέσω της προσθήκης των τμημάτων σακχάρου από τις γλυκοζυλοτρανσφεράσες από το Fringe

οικογένεια γονιδίων (

Lunatic Fringe

,

Lfng

?

μανιακός περιθωριακοί

,

Mfng

και

Ριζική περιθώριο

,

Rfng

) [18] – [20]. NICD μετατοπίζεται στον πυρήνα για να σχηματίσει ένα μεταγραφικό σύμπλοκο ενεργοποίησης με την CSL δέσμευσης DNA παράγοντα (Rbp-Ικ) και συν-ενεργοποιητών που ανήκουν στο

Εγκέφαλος-όπως

οικογένεια (

Maml

) [ ,,,0],15], [21], [22]. Μερικά από τα καλύτερα χαρακτηρισμένα στόχους αυτού του μεταγραφικού συμπλόκου ενεργοποίηση ανήκουν στο

Hes

-και

Hey

οικογένεια γονιδίων, τα οποία λειτουργούν ως μεταγραφικοί καταστολείς της περαιτέρω κατάντη στόχους όπως

μαθη- 1

(ομόλογο ποντικού του ανθρώπινου

Hath-1

) [23] – [25]. Έχει προταθεί ότι η λειτουργία της Notch-1 και Notch-2 πλεονασμό στο έντερο, και ότι κανονική ενεργοποίηση μονοπατιού είτε μέσω αυτών των υποδοχέων είναι αρκετή για να αποτρέψει τη διαφοροποίηση των πολλαπλασιαστικών κρύπτης προγονικών κυττάρων σε μετα-μιτωτικά κύτταρα λαγηνοειδών, υποδεικνύοντας ότι η σηματοδότηση Notch θα μπορούσε να προδιαθέτουν για κακοήθη εξαλλαγή [2]. Αυτό έχει συσχετισθεί με αποκαταστολή του αναστολείς κινάσης εξαρτώμενης από κυκλίνη ρ27

Kip1 και p57

Kip2 [2], καθώς και προς τα πάνω ρύθμιση του

Math-1

mRNA και η πρωτεΐνη [2], [26 ], [27]. Ωστόσο,

Notch-2

έχει επίσης προταθεί να έχουν ένα αποτέλεσμα καταστολής όγκου σε CRC [28], υποδηλώνοντας συγκρότημα, πιθανώς στάδιο σχετίζεται, λειτουργίες σηματοδότησης Notch στο έντερο.

Εκτός στους ανεξάρτητους ρόλους του Wnt και Notch οδών σε ογκογένεση σηματοδότησης στο κόλον, τα ευρήματα ότι η ανάπτυξη του όγκου σε ΑΡΟ-ανεπαρκή ποντίκια ενισχύεται κατά την ταυτόχρονη ενεργοποίηση των Notch και Wnt σήματα [29] και ότι πολλά εντερικά όγκοι εμφανίζουν ανώμαλη ενεργοποίηση και των δύο οδών [3] προτείνουν μια μοριακή αλληλεπίδραση μεταξύ των Notch και σηματοδότηση Wnt στο σχηματισμό CRC. Παρά την προφανή σημασία αυτού του crosstalk και ότι οι συντονισμένες δράσεις έχουν αναφερθεί σε διάφορα επίπεδα [30], λίγα είναι γνωστά για τους μοριακούς μηχανισμούς που συνδέουν αυτά τα μονοπάτια στο εντερικό επιθήλιο. Έχει δειχθεί ότι

Hath-1

έκφραση αυξάνεται όταν η οδός Wnt αναστέλλεται [26] και ότι

ΗΕδ-1

είναι άμεσος στόχος του κανονικού σηματοδότηση Wnt σε ορθοκολικό αδενωμάτων και καρκινωμάτων [29], [31] Επιπλέον, Jagged-1 έχει αποδειχθεί ότι αντιπροσωπεύουν μια μοριακή σύνδεση μεταξύ της Wnt και Notch στη CRC, όπου ο

Jagged-1

γονίδιο άμεσα ρυθμίζεται από β-κατενίνης /Tcf-4 [32]. Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ Wnt και Notch στη CRC, και τα αποτελέσματά τους, δεν είναι πλήρως κατανοητοί και τα αποτελέσματα από διάφορες μελέτες συχνά αποκλίνουσες [3], [31]. Αυτό υπογραμμίζει την πολυπλοκότητα της λογομαχίας και προτείνει ότι δεν μπορεί να είναι απλώς ένα θέμα κοινής κατάντη στόχους των οδών.

Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε τις δυνατότητες του μονοπατιού σηματοδότησης Wnt για άμεση ρύθμιση των γονιδίων που εμπλέκονται στη σηματοδότηση Notch. Αυτό αποκάλυψε ότι αρκετές από τις υποθετικές περιοχές υποκινητή σε Notch γονιδίων που σχετίζονται οδού περιέχουν Lef-1 /περιοχές από TCF δεσμευτική. Ορισμένα από αυτά τα γονίδια ρυθμίστηκαν προς τα κάτω κατά την έκφραση ενός λειτουργικού APC γονιδίου στην κυτταρική γραμμή ΗΤ29 CRC, υποστηρίζοντας την ιδέα ότι η ανώμαλη σηματοδότηση Wnt έχει άμεση επίπτωση επί της έκφρασης των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη σηματοδότηση Notch. Έτσι, προτείνουμε ότι οι κρίσιμες συνιστώσες του μονοπατιού σηματοδότησης Notch επηρεάζεται άμεσα από Wnt σηματοδότησης με την επίπτωση που ακόμη και ένα γενετικά κανονικό μονοπάτι Notch μπορεί να συμβάλει στην ογκογένεση οφείλεται στην ανταπόκριση σε β-κατενίνης ή

Αρο

μεταλλάξεις.

Αποτελέσματα

σύνολα Ανάδοχος και

in silico

εντοπισμό πιθανών LEF-1 /TCF-sites στο μονοπάτι Notch υποστηρικτές

για τον εντοπισμό πιθανών στόχων για αλληλεπιδράσεις μεταξύ του Notch και οδών σηματοδότησης Wnt, 65 γονίδια, είναι γνωστό ότι είναι σημαντικό για την Notch και σηματοδότηση Wnt, επιλέχθηκαν bioinformatically χρησιμοποιώντας την εφευρετικότητα Pathways Ανάλυση (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com), σε συνδυασμό με εκτεταμένες αναζητήσεις βιβλιογραφίας. γονιδιακές αλληλουχίες προαγωγού εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Genomatix Gene2Promoter και το μέσο μήκος του θεωρούμενου πυρήνα, εγγύς και μέρη των άπω υποκινητές ρυθμίστηκαν σε περίπου 2500 bp (λεπτομέρειες διαθέσιμο κατόπιν αιτήματος). Με τη βοήθεια του λογισμικού MatInspector [33] τα σετ υποκινητή για putatitve LEF-1 /TCF θέσεις ταυτοποιήθηκαν με τις υποθετικές αλληλουχίες συναίνεσης: 5 ‘- (Α /Τ) (Α /Τ) CAA (A /T) G-3 «[34]. Είκοσι τέσσερα από τα γονίδια που ερευνήθηκαν στην οδό Notch βρέθηκαν να περιέχουν ένα ή περισσότερα υποθετική LEF-1 /TCF θέσεις (Εικ. 1 και συμπληρωματικές πληροφορίες S1).

Σε silico

ανάλυση των γενετικών δικτύων που εμπλέκονται άμεσα στην Notch και σηματοδότηση Wnt προτείνουν επικάλυψη και άμεση στιχομυθία μέσω ενεργοποίησης του γονιδίου-στόχου Notch μέσω κανονική σηματοδότηση Wnt. Μέσω MatInspector, [33] υποκινητές γονιδίων στο μονοπάτι Notch βρέθηκαν να περιέχουν τουλάχιστον ένα υποθετικό LEF-1 /TCF-θέση (αριθμός των θέσεων σε κάθε γονιδίου περιγράφεται σε αγκύλες). Γονίδια σε γκρι κουτιά υποβλήθηκαν για περαιτέρω ημι ποσοτική ανάλυση RT-PCR.

Η

Έτσι,

in silico

ανάλυση των γενετικών δικτύων που εμπλέκονται στην Notch και σηματοδότηση Wnt υποστηρίζει τα προηγούμενα φαίνεται αλληλεπιδράσεις με

ΗΕδ-1

[31] και

Jagged-1

[32] και, επιπλέον, προτείνει μια άμεση αλληλοπαρεμβολών μέσω ενεργοποίησης του γονιδίου-στόχου σε διάφορες πρόσθετες επίπεδα στο μονοπάτι Notch.

η β-κατενίνης /Λεφ-1-συγκρότημα δεσμεύεται in vitro σε Notch υποκινητές γονιδίων οδού

για να προσδιορίσετε αν αλληλουχίες σύνδεσης η

in silico

προσδιορίζονται LEF-1 /TCF φυσικά συνδέονται με η β-κατενίνης /Λεφ-1 συγκρότημα

in vitro

, πραγματοποιήσαμε μια ανταγωνιστική δοκιμασία ηλεκτροφορητική κινητικότητα μετατόπισης (EMSA) με ραδιενεργά σημασμένο συναίνεση LEF-1 /TCF ισχυρό ανιχνευτή δέσμευσης (CD1TOP [35]) και διπλά ολιγονουκλεοτίδια που καλύπτουν τις πιθανές τοποθεσίες σε υποστηρικτές του στόχου. Notch μονοπατιού ανιχνευτές EMSA υποκινητή (Πίνακας S1) ελέγχθηκαν έναντι ενός

in vitro

μεταφραστεί συγκρότημα Λεφ-1 /β-κατενίνης.

Για να επιβεβαιώσετε ότι ραδιενεργά σημασμένη CD1TOP δεσμεύει Λεφ-1 συγκεκριμένα, το πλασμίδιο -δωρεάν κυτταρολύματα δικτυοκυττάρων υπέκειντο σε

in vitro

μετάφραση και επωάστηκε με ραδιοεπισημασμένο ανιχνευτή. Όπως αναμενόταν, δεν πρόσδεσης παρατηρήθηκε (Εικ. 2). Όλα τα διερευνώνται

Notch

υποκινητές γονιδίων,

Notch-2

,

Jagged-1

,

Maml-1

,

Hes-1

,

Rfng

,

Lfng

και

Numbl

, έδειξε δέσμευση του τουλάχιστον μία πιθανή θέση /TCF-1 LEF σε περιοχές υποκινητή τους προσδιορίζονται

στο silico

(Εικ. 2) (πρόσθετα ανταγωνιστικά αποτελέσματα EMSA βρίσκονται σε). Για τις γνώσεις μας

Notch-2

,

Maml-1

,

Rfng

και

Lfng

είναι νέες δυνατότητες γονιδίων στόχων Wnt που δεν περιγράφονται προηγουμένως. Δύο από τις ισχυρότερες θέσεις πρόσδεσης βρέθηκαν στο

Jagged-1

υποκινητή σε -1,933 και -1,635 σε σχέση με τη θέση έναρξης της μετάφρασης, η οποία είναι σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες όπου

Jagged-1

έχει δειχθεί ότι είναι ένας β-κατενίνης /από TCF 4 ρυθμίζονται γονίδιο στο ανθρώπινο CRC [32], καθώς και στους θύλακες των τριχών ποντικού [36].

Hes-1

έχει πρόσφατα επίσης εντοπιστεί ως άμεση μεταγραφική στόχο της β-κατενίνης /Tcf-4-εξαρτώμενη σηματοδότηση Wnt στο CRC [31] και τα δεδομένα μας EMSA υποστηρίζει αυτή την ιδέα με σαφή προσδιορισμό του

Hes -1

-528 ως θέση δέσμευσης για τη β-κατενίνης /Lef-1 σύμπλοκο (Εικ. S1).

ανταγωνιστική δοκιμασία ηλεκτρο κινητικότητα μετατόπισης του εγγύς

Notch-2

υποκινητή. Duplex CD1TOP ανιχνευτές «τέλος φέρει την ένδειξη» με το [

32Ρ] dATP, επωάζονται με

in vitro

μεταφραστεί β-κατενίνης /Λεφ-1 και εκτεθειμένες στον ανταγωνισμό με την αφθονία των κρύο ή κρύο μεταλλαγμένα duplex υποστηρικτής ολιγονουκλεοτίδια ( × 300 και 900 ×, αντίστοιχα). Τα σύμπλοκα πρωτεΐνης-ΟΝΑ διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση και οπτικοποιήθηκαν με αυτοραδιογραφία. Ως μάρτυρας του ανταγωνισμού κρύο CD1TOP και κρύο μεταλλαγμένα CD1FOP ανταγωνίστηκε με ραδιοσημασμένο CD1TOP και να επιβεβαιώσει ότι τα ραδιενεργά σημασμένο CD1TOP δεσμεύει Λεφ-1 συγκεκριμένα, το πλασμίδιο χωρίς λύμα δικτυοερυθροκυττάρων υποβλήθηκαν σε

in vitro

μετάφραση και επωάστηκαν με ραδιοσημασμένο ανιχνευτή. αρίθμηση γονίδιο περιγράψει τη θέση του LEF-1 /TCF-ιστοσελίδα σχετική η θέση έναρξης του γονιδίου της μετάφρασης. Προσαρμογές στο σύνολό επίπεδα αντίθεσης εικόνα πραγματοποιήθηκαν στο Adobe Photoshop CS4.

Η

Τα αποτελέσματα τόσο από το

in silico

και αναλύσεις δέσμευσης του DNA δείχνουν ότι η μεταγραφική δίκτυο συνδέει το μονοπάτι Wnt και Notch , υπονοώντας μια λειτουργική ρύθμιση των κανονικών σηματοδότησης Wnt σε διάφορα επίπεδα του μονοπατιού Notch.

Canonical σηματοδότηση Wnt ρυθμίζει γονίδια μονοπατιού Notch σε καρκίνο του παχέος εντέρου ΗΤ29 κυτταρική σειρά και εντερικών αδενωμάτων ποντικού

μεταλλάξεων αδρανοποίηση του

Αρο

γονίδιο είναι ένα βασικό γεγονός στην καρκινογένεση του παχέος εντέρου και καθιστά συστατική ενεργή σηματοδότηση Wnt [13], [14]. Για την ανάπτυξη των

in silico

και DNA δέσμευσης αναλύσεων και λειτουργικά διερευνηθούν οι επιδράσεις των ενεργοποιημένων σηματοδότηση Wnt σε γονίδια Notch μονοπάτι, δεκαεννέα γονίδια στο μονοπάτι Notch, είναι γνωστό ότι είναι σημαντικό για τα κανονικά σηματοδότηση Notch (Σχ. 1 και Πίνακας S1), που περιέχει υποτιθέμενο LEF-1 /TCF-sites, επιλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτες με ημι-ποσοτική RT-PCR. Για να ενεργοποιήσετε WT-APC και με τον τρόπο αυτό τον περιορισμό των επιπέδων πυρηνικής β-κατενίνης, χρησιμοποιήθηκε μια κυτταρική γραμμή ΗΤ29 που φέρει Ζη-επαγώγιμο φορέα wt-APC. Όπως ήταν αναμενόμενο, υπήρξε μια αύξηση των επιπέδων WT-APC σε ΗΤ29-APC, 6-24 ώρες μετά Ζη

2 + -stimulation, αλλά όχι σε κύτταρα ΗΤ29-β-gal (Σχ. 3Α). Τα γονίδια της οδού 19 Notch αναλύθηκαν με ημι-ποσοτική RT-PCR και

ΗΕδ-1

,

ΗΕδ-7

,

Notch-2

,

Maml- 1

,

Lfng

,

Rfng

,

Numb

και

Numbl

βρέθηκαν να ρυθμίζεται προς τα κάτω μεταγραφικά, ενώ η αρνητική ρύθμιση του γονιδίου

Hath-1

σαφώς ρυθμίζεται αυξητικά 18-24 ώρες μετά κβ-Αρο επαγωγής (Σχ. 3Β). Ως θετικός μάρτυρας, ο

κυκλίνη D1

-γονίδιο έκφρασης, που προκαλείται από β-κατενίνης [37], ήταν μειωτικά 6-24 ώρες μετά την επαγωγή Ζη, επιβεβαιώνοντας αναστολή της οδού Wnt μέσω έκφραση του wt-Αρο και μειωμένα επίπεδα β-κατενίνης. Τα αποτελέσματα είναι σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες όπου τα επίπεδα της πρωτεΐνης β-κατενίνης έχουν βρεθεί να ρυθμίζεται προς τα κάτω [38] και το β-κατενίνης /hTcf-4 πυρηνικό συγκρότημα μειωμένη [39] κατόπιν Ζη-διέγερση σε κύτταρα ΗΤ29-APC υποδεικνύοντας, μειώθηκε επιπέδων πυρηνικής β-κατενίνης. Είναι ενδιαφέρον, δεν θα μπορούσαμε να ανιχνεύσουν οποιαδήποτε επίδραση της Wnt σηματοδότησης και κβ-Αρο έκφραση στο

Jagged-1

στα κύτταρα ΗΤ29, ακόμη και αν επιβεβαιωθεί η ειδική δέσμευση της CD1TOP να

in vitro

μεταφραστεί Λεφ-1 εκτοπίστηκε με ένα 300-πλάσια περίσσεια ψυχρού

Jagged-1

-1933 και -1635 ανιχνευτές αλλά όχι με μεταλλαγμένες παραλλαγές τους (Εικ. 2). Για να καθοριστεί εάν αρνητική ρύθμιση των γονιδίων Notch μονοπατιού, κατά βάρος-της APC, είναι ακριβώς κάτω από τον έλεγχο του β-κατενίνης, εκτελέσαμε αντι-β-κατενίνης siRNA αποσιώπηση πειράματα (Σχ. S2), χρησιμοποιώντας μια ομάδα από τέσσερα διαφορετικά siRNAs που στοχεύουν β- κατενίνης. Σε γενικές γραμμές, προς τα κάτω ρύθμιση ήταν λιγότερο σημαντική από ό, τι Zn προκαλούμενη μείωση του

Notch-2

,

Numb και Numbl

(Εικ. 2Α), εμφανίζοντας μια αδύναμη αλλά σταθερή μείωση στα αντίστοιχα επίπεδα mRNA τους.

Hes-1

σαφώς μειωτικά 72-96 ώρες μετά την επιμόλυνση, επιβεβαιώνοντας τα ευρήματα από Peignon

et al

. [31].

Rfng

και

Lfng

δεν επηρεάστηκαν από τη β-κατενίνης αποσιώπηση υποδεικνύοντας ότι ρύθμιση προς τα κάτω τους με σηματοδότηση Wnt παρατηρείται στο Σχ. 3Β δεν μπορεί να είναι ένα άμεσο αποτέλεσμα των επαγόμενων β-κατενίνης μεταγραφή που χρησιμοποιούνται σε αυτή την πειραματική διάταξη.

Κυκλίνη D1

χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για τα πειράματα siRNA και ήταν σαφώς μειωτικά 72-96 ώρες μετά την επιμόλυνση. Για να ελέγξετε πιο μακροπρόθεσμες επιπτώσεις της απελευθερωμένης σηματοδότησης Wnt στο εντερικό επιθήλιο αναλύσαμε

Notch-1

,

Notch-2

και

Hes-1 επίπεδα έκφρασης

mRNA σε Αρο

Min /+ ποντίκια (Σχ. 3C) που φέρουν μια βλαστικής γραμμής περικοπή ετερόζυγη μετάλλαξη στο κωδικόνιο 850. Τα επίπεδα του mRNA της

βρέθηκαν να απορυθμίζεται σημαντικά σε αδενώματα (διάμεση σχετική έκφραση = 2,0 mHes-1

, διατεταρτημοριακό εύρος = 1/5 – 2/4) σε σύγκριση με την κανονική εντερικό βλεννογόνο (διάμεση σχετική έκφραση = 1,5, διατεταρτημοριακό εύρος = 0.9-1.7) (Mann-Whitney U-test,

σ

= 0,013), υποδεικνύοντας υπερενεργοποιημένος σηματοδότηση Notch σε τα αδενώματα του ποντικιού.

Μια

τάση προς τα άνω ρύθμιση παρατηρήθηκε για

mNotch-2

στον ιστό του όγκου (διάμεση σχετική έκφραση = 1,6, διατεταρτημοριακό εύρος = 1,0-2,0), σε σύγκριση με το φυσιολογικό εντερικό βλεννογόνο (διάμεση σχετική έκφραση = 1.3 , διατεταρτημοριακό εύρος = 0,9 – 1,8) (Mann-Whitney U-test,

σ

= 0.14), ενώ δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές θα μπορούσαν να ανιχνευθούν για

mNotch-1

(διάμεση σχετική έκφραση = 3.9, διατεταρτημοριακό εύρος = 2.5 – 5.7 (καρκινικός ιστός)) έναντι (διάμεση σχετική έκφραση = 3,8, διατεταρτημοριακό εύρος = 2.4 – 5.3 (φυσιολογικός ιστός)) (Mann-Whitney

U

-test,

p

= 0.9).

Wt-Αρο προκλήθηκε σε κύτταρα ΗΤ29-APC μέσω της προσθήκης 100 μΜ ΖηΟ

2 στο μέσο ανάπτυξης. Ημι-ποσοτική RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε cDNA αντίστροφα μεταγραμμένο από 200 ng ολικού RNA από κάθε χρονικό σημείο (0-24 ώρες μετά wt-Αρο επαγωγή). Μπαρ περιγράφουν την σχετική έκφραση του

Notch-2

σε κύτταρα ΗΤ29-APC (*) έναντι κυττάρων ΗΤ29-β-γαλακτοσιδάσης (**) κανονικοποιημένη έναντι

GAPDH

έκφρασης.

Κυκλίνη D1

χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για Wnt αδρανοποίηση. (Β) Η πρωτεΐνη έκφραση του Αρο (~310 kDa), Notch-2 (~265 kDa), κβ και φόρτωση ελέγχου, GAPDH, προσδιορίστηκε με στύπωμα Western εξής 0-24 h διέγερσης ψευδαργύρου. Προσαρμογές στο σύνολό επίπεδα αντίθεσης εικόνα πραγματοποιήθηκαν στο Adobe Photoshop CS4. (C) Σχετική έκφραση του mRNA του ποντικού

Notch-1

,

Notch-2

και

ΗΕδ-1

σε όγκους και αντίστοιχα μη-καρκινική κανονικό εντερικό βλεννογόνο της aPC

Min /+ ποντίκια. mRNA έκφραση ήταν συνδεδεμένη με το ενδογενές γονίδιο GAPDH ελέγχου. Λευκό στήλες (n = 16), μαύρες στήλες (n = 22). Οι μπάρες που παρουσιάζονται ως μέσες τιμές έκφρασης. Οι ράβδοι σφάλματος περιγράφουν διατεταρτημοριακό εύρος.

Η

Εν κατακλείδι, η αδρανοποίηση του μονοπάτι Wnt μέσω της ενεργοποίησης του wt-Αρο σε κύτταρα ΗΤ29 CRC ρυθμίζει προς τα κάτω αρκετά γονίδια στόχου στο μονοπάτι Notch ενώ mRNA επιπέδων του στόχου Notch

mHes-1

σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω σε εντερικό όγκους από ποντίκια με έλλειψη APC. Αυτό περαιτέρω υποστηρίζει μια άμεση μεταγραφική στιχομυθία που πρότεινε το

in silico

και

in vitro

αναλύσεις δέσμευσης του DNA.

Η

in silico

προσδιορίζονται τετράθυρες 2 υποκινητής περιέχει τέσσερις υποθετικές LEF1 /TCF-sites και συμβάλλει σε μια δραστηριότητα γονίδιο υψηλής λουσιφεράσης

Notch-2 λειτουργίες πλεονασμό με Notch-1 σε επιθηλιακά κύτταρα του παχέος εντέρου, όπου και τα δύο γονίδια είναι σημαντικά για τη διατήρηση των κυττάρων στο διαμέρισμα της κρύπτης σε μια πολλαπλασιαστική και αδιαφοροποίητη κατάσταση [2]. Ωστόσο, σχετικά λίγα είναι γνωστά για μεταγραφική ρύθμιση των γονιδίων

Notch

και μια πιθανή ρύθμιση του

Notch-2

μέσω σηματοδότηση Wnt μπορεί να είναι σημαντική για την ανάπτυξη ή /και την πρόοδο της CRC και ενδεχομένως σε άλλες κακοήθειες, καθώς και. Προηγουμένως, έχει δειχθεί ότι τόσο η

Hes-1

και

Jagged-1

είναι άμεσοι στόχοι της κανονικής σηματοδότησης Wnt στο CRC [31], [32]. Τα αποτελέσματά μας από το

in silico

,

in vitro

DNA-δεσμευτικές αναλύσεις και ενεργοποίηση των κβ-Αρο, υποδεικνύουν έντονα ότι υπάρχει μια άμεση θετική ρύθμιση του

Notch-2

μέσω Wnt σηματοδότησης. Επομένως θέλαμε να διευκρινίσει περαιτέρω την β-κατενίνης /Lef-1 /Tcfs ρυθμίζει το δυναμικό της

Notch-2

προαγωγό στις κυτταρικές σειρές CRC ΗΤ29 και HCT116.

Όπως περιγράφεται ανωτέρω,

in silico

αναλύσεις χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιορίσει την ανθρώπινη

Notch-2

υποκινητή και μια πιθανή θέση έναρξης της μεταγραφής (TSS) βρέθηκε 256 bp ανοδικά την θέση έναρξης μετάφρασης, επιβεβαιώνοντας το αποτέλεσμα από την ανάλυση Gene2Promoter. Τέσσερις υποθετικές θέσεις συμφωνίας LEF-1 /TCF ταυτοποιήθηκαν στον πυρήνα και την περιοχή εγγύς υποκινητή στις θέσεις -2261, -869, -689 και -110 σε σχέση με τη θέση έναρξης μετάφρασης (Σχ. 4Α). Η ιστοσελίδα -110 έδειξε ισχυρή σύνδεση με Λεφ-1 στη σύνδεση

in vitro

DNA ανταγωνιστική δοκιμασία EMSA, ενώ sites -2261 και -689 έδειξε αδύναμο δεσμευτική (Εικ. 2).

(Α ) Σχηματική αναπαράσταση του εγγύς

Notch-2

υποκινητή με τις τέσσερις υποθετικές LEF-1 /TCF δέσμευσης θέσεις συμφωνίας, τα οποία προσδιορίζονται με Genomatix MatInspector, στις θέσεις -2261, -869, -110 και 0.689 σχετική μεταφραστική θέση έναρξης (ATG). Μια πιθανή θέση έναρξης της μεταγραφής χαρτογραφήθηκε στη θέση -256 χρησιμοποιώντας το λογισμικό PromoterInspector Genomatix Gene2Promoter και. Κεφαλαία γράμματα υποδεικνύουν την συναινετική αλληλουχία πυρήνα. (Β) N2PR -2327 /-99, -110 N2PR σε pGL3-ΤΑΤΑ καθώς και κενών pGL3-ΤΑΤΑ (Smith

κ.ά.

, 2002 [40]) επιμολύνθηκαν σε HCT116 και και συν-επιμολύνθηκαν με pSV-β-γαλακτοσιδάσης φορέα ελέγχου. Το προϊόν λύσης κυττάρου 24 ώρες μετά την επιμόλυνση υποβλήθηκε σε λουσιφεράσης προσδιορισμούς ρεπόρτερ και σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε. Οι ράβδοι σφάλματος περιγράψτε SEM.

Η

Για να αναλύσουμε το

Notch-2

υποκινητή, που επικεντρώθηκε στην περιοχή 2200 νουκλεοτιδίων που εκτείνεται τόσο το 5 ‘και 3’ περιοχές του

Notch -2 υποθετική

θέση έναρξης μεταγραφής. Δύο ξεχωριστές κατασκευές δημιουργήθηκαν, μία που εκτείνεται από τη θέση -2327 έως -99 (N2PR -2327 /-99) (οι αριθμοί σε σχέση με την θέση έναρξης της μετάφρασης), καλύπτοντας έτσι και τις τέσσερις υποθετικές LEF-1 /TCF-sites και ένας καλύπτει υποθετική LEF- 1 /TCF-ιστοσελίδα -110. Είχαν κλωνοποιήθηκε σε ένα φορέα πυγολαμπίδας αναφοράς λουσιφεράσης (pGL3 φορέα αναφοράς λουσιφεράσης, Promega) που περιέχει ένα κουτί ΤΑΤΑ για την ανίχνευση πιθανών ενισχυτή και καταστολέα

cis-δράσης

στοιχεία (που περιγράφηκε προηγουμένως [40]). Τα κατασκευάσματα επιμολύνθηκαν παροδικά σε HCT116 ή ΗΤ29 κύτταρα και δραστηριότητες γονιδίου αναφοράς μετρήθηκαν σε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. δραστηριότητα υποστηρικτής ενισχύθηκε 13-φορές για N2PR -2327 /-99 έναντι 1,7 φορές για το κατασκεύασμα υποκινητή N2PR -110 σε σχέση με το υπόβαθρο σε κυτταρικές σειρές HCT116 (ρ & lt? 0.007 vs. ρ = 0,04, η = 6 (Εικόνα 4Β. )). Η δοκιμασία λουσιφεράσης δείχνει ότι η κλωνοποιημένη περιοχή του υποτιθέμενου

Notch-2

προαγωγέα περιέχει στοιχεία ενισχυτή που οδηγεί σε ενισχυμένη μεταγραφή του γονιδίου λουσιφεράσης. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν έντονα τη θέση του πυρήνα, το εγγύτερο τμήμα και τμήματα του περιφερικού

Notch-2

προαγωγέα όπως προσδιορίζονται από την

in silico

ανάλυση.

Η υπερέκφραση του β-κατενίνης, Lef-1 ή από TCF 4 αποτέλεσμα αυξημένη δραστικότητα προαγωγού Notch-2

Notch-2

επίπεδα mRNA και η πρωτεΐνη μειωτικά σαφώς 18-24 h μετά Ζη-επαγωγή wT-APC σε ΗΤ29 κύτταρα (Εικ. 3Β και Β).

έκφραση Notch-2

mRNA αναλύθηκε επίσης παρακάτω

RNAi

αποσιώπηση της β-κατενίνης σε κύτταρα ΗΤ29 όπου μια ασθενέστερη επίδραση παρατηρήθηκε παρόμοια με την άλλη wt-Αρο /β-κατενίνης ρυθμίζεται μονοπάτι Notch γονίδια (Εικ. S2).

Τα αποτελέσματα από την κυτταρική γραμμή ΗΤ29-APC όπου Apc ενεργοποιήθηκε ή β-κατενίνης σιγήσει, να συνεπάγεται ενεργοποίησης ρόλος του μονοπάτι Wnt στο

Notch-2

και ο μεταγενέστερος του γονιδίου-στόχου

Hes-1

[31].