Αφηρημένο

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι ένας από τους κορυφαίους κακοηθειών σε όλο τον κόσμο, αλλά ο ρυθμιστικός μηχανισμός της ανάπτυξης και της μετάστασης του εξακολουθεί να είναι ελάχιστα κατανοητή. Ερευνήσαμε την πιθανή έκφραση της ανοσοσφαιρίνης G (IgG) γονίδια στα καρκινώματα πλακωδών κυττάρων και αδενοκαρκινώματα του πνεύμονα και των συναφών καρκινικών κυτταρικών σειρών. Άφθονα mRNA της IgG και των βασικών ενζύμων για IgG σύνθεση, γονίδια ενεργοποίηση ανασυνδυασμό 1, 2 (RAG1, 2) και που προκαλείται από ενεργοποίηση απαμινάσης κυτιδίνης (AID) ανιχνεύθηκαν στα καρκινικά κύτταρα αλλά όχι σε παρακείμενο φυσιολογικό ιστό πνεύμονα ή φυσιολογικού πνεύμονα επιθηλιακή κυτταρική γραμμή . Οι εκτάσεις της έκφρασης IgG σε 86 καρκίνων του πνεύμονα βρέθηκαν να συνδέσει με το κλινικό στάδιο, παθολογικές βαθμός και η μετάσταση λεμφαδένα. Βρήκαμε ότι knockdown του IgG με siRNA οδήγησε σε μειώσεις του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, η μετανάστευση και προσκόλληση για καλλιεργημένα κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα. Μετάσταση σχετιζόμενη γονίδιο 1 (MTA1) φάνηκε να είναι συν-εκφράζεται με IgG σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Η στατιστική ανάλυση έδειξε ότι το ποσοστό της έκφρασης IgG συσχετίστηκε σημαντικά με αυτή των MTA1 και να λεμφαδενικές μεταστάσεις. Η αναστολή της γονιδιακής έκφρασης MTA1 με siRNA οδήγησε επίσης σε μείωση της κυτταρικής μετανάστευσης και της προσάρτησης για καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Αυτά τα αποδεικτικά στοιχεία που πρότειναν ότι η αναστολή της μετανάστευσης καρκίνου και την προσάρτηση προκαλείται από IgG κάτω ρύθμιση μπορεί να επιτευχθεί μέσω MTA1 ρυθμιστικών οδού. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι καρκίνο του πνεύμονα που παράγονται IgG είναι πιθανό να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου και μετάσταση με σημαντικές κλινικές επιπτώσεις

Παράθεση:. Jiang C, Huang Τ, Wang Υ, Huang G, Wan Χ, Gu J (2014) ανοσοσφαιρίνη G Έκφραση σε καρκίνο του πνεύμονα και των επιπτώσεών της στην μετάσταση. PLoS ONE 9 (5): e97359. doi: 10.1371 /journal.pone.0097359

Επιμέλεια: Oliver Schildgen, Kliniken der Stadt Köln gGmbH, Γερμανία

Ελήφθη: 19 Δεκ 2013? Αποδεκτές: 17 Απρίλη του 2014? Δημοσιεύθηκε: May 22, 2014

Copyright: © 2014 Jiang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις (30971150 έως JG, 81001199 έως ZC) από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι ένας από τους κορυφαίους κακοήθων όγκων σε όλο τον κόσμο με μια πολύ υψηλή θνησιμότητα [1], [2]. Η μετάσταση είναι η κύρια αιτία θανάτου και μέχρι σήμερα δεν υπάρχει αποτελεσματική θεραπεία για μεταστατικό καρκίνο του πνεύμονα. Ο καρκίνος του πνεύμονα μπορεί να διαιρεθεί σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) και μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (SCLC) με βάση παθολογικά χαρακτηριστικά τους και την κλινική συμπεριφορά [3]. NSCLC αντιπροσωπεύει το 84% των καρκίνων του πνεύμονα, των οποίων η πλειοψηφία είναι καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (LSCC) και το αδενοκαρκίνωμα (ΛΑΚ) [4]. LSCC και LAC επιλέχθηκαν ως τα αντικείμενα αυτής της μελέτης.

Πρόσφατα, αθροιστική ενδείξεις έχουν δείξει ότι τα κύτταρα ανθρώπινου όγκου συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων του μαστού, του πνεύμονα, του προστάτη, του παχέος εντέρου, του οισοφάγου, του θυρεοειδούς και του πλακούντα trophablast καθώς και σαρκώματα μπορεί συνθέσει ανοσοσφαιρίνη G (IgG) [5] – [19]. Τα βασικά ένζυμα συμπεριλαμβανομένων γονιδίων ενεργοποίησης ανασυνδυασμού 1, 2 (RAG1, 2) και που προκαλείται από ενεργοποίηση απαμινάσης κυτιδίνης (AID) για την σύνθεση IgG σε Β λεμφοκύτταρα και κύτταρα πλάσματος βρέθηκαν επίσης σε καρκινικά κύτταρα [20] – [22]. CA215, μια πρωτεΐνη υπεροικογένεια ανοσοσφαιρίνης αρχικά απομονώθηκε από τον καρκίνο των ωοθηκών ήταν πιθανά η IgG των καρκινικών προέλευσης [23] – [25]. Ο αποκλεισμός των καρκινικών IgG με αντιπληροφοριακό RNA ή αύξηση των καρκινικών κυττάρων κατέστειλε αντίσωμα IgG και αυξημένη απόπτωση [5], [26] – [28]. Με την ανίχνευση IgG έκφραση σε 142 οισοφάγο καρκίνους και 80 όγκους των μαλακών ιστών, και συγκριτική ανάλυση των IgG έκφρασης με παθολογικές παραμέτρους, καρκινικούς IgG βρέθηκε να συσχετίζεται με το βαθμό του όγκου και πολλαπλασιαστική δείκτες όπως PCNA και Ki-67 σε καρκίνους του μαστού, του οισοφάγου και των μαλακών ιστών [8], [11], [29]. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα καρκινικά IgG μπορεί να παίζει ένα ρόλο στην ρύθμιση της ανάπτυξης του καρκίνου. Ωστόσο, η επίδραση της IgG στον καρκίνο του πνεύμονα και ο πιθανός μηχανισμός που διέπει τις δράσεις της δεν έχουν διερευνηθεί.

Η μετάσταση είναι μία πολύπλοκη διαδικασία που περιλαμβάνει διάφορες πρωτεΐνες που δρουν σε αποκόλληση των καρκινικών κυττάρων από πρωτογενείς θέσεις, διεισδύοντας σε πλοία και λεμφαγγεία , αγκυροβόληση στο ενδοθήλιο, απρόσκλητος σε περιβάλλουσα ύλη, εξαγγείωσης, προκαλώντας αγγειογένεση, αποφεύγοντας ανοσία κατά του όγκου, και αυξάνεται σε μεταστατικές θέσεις. Μετάσταση σχετιζόμενη γονίδιο 1 (MTA1) αποτελεί αναπόσπαστο μέρος του νουκλεοσώματος αναδιαμόρφωσης και αποακετυλίωσης (NuRD) σύμπλοκο ιστόνης [30], [31]. MTA1 ρυθμίζει τη μεταγραφή των γονιδίων που σχετίζονται με τη μετάσταση, τροποποιώντας την κατάσταση ακετυλιώσεως χρωματίνη στόχου καθώς και συμπαράγοντας προσβασιμότητα στο DNA στόχο. Υψηλή έκφραση MTA1 έχει βρεθεί ότι σχετίζεται στενά με την εισβολή και τη μετάσταση του λεμφικού σε διάφορα καρκινώματα [32] – [34].

Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε το πρότυπο κατανομής των IgG, και τη σχέση μεταξύ της έκφρασης του και παθολογικών παραμέτρων σε 86 LSCC και LAC. Ερευνήσαμε περαιτέρω τις πιθανές επιπτώσεις του καρκίνου παραχθέντων IgG στην κυτταρική προσκόλληση και μετανάστευση, χρησιμοποιώντας την τεχνική του siRNA παρεμβολών σε μία δοκιμασία συνημμένο, μία δοκιμασία Transwell, και μια επουλωτική των πληγών δοκιμασία με καρκινικές κυτταρικές σειρές δύο πνευμόνων, καθώς και ένα φυσιολογικά επιθηλιακά πνεύμονα κυτταρική σειρά. Μελετήσαμε επίσης τη σχέση μεταξύ γονιδιακής έκφρασης IgG και ενός αριθμού γονιδίων που σχετίζονται με μεταστατικό. Βρήκαμε ότι τα καρκινικά IgG μπορεί να διαδραματίσει καίριο ρόλο στη μετάσταση του καρκίνου του πνεύμονα με τη ρύθμιση του γονιδίου μεταστατικού MTA1.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Αυτή η μελέτη διεξήχθη σε σύμφωνα με τη δήλωση του Ελσίνκι και έχει εγκριθεί από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Σάντου Medical College. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από τους ασθενείς και τις οικογένειές τους για τη χρήση των δειγμάτων για την έρευνα.

Οι κυτταρικές σειρές

Ανθρώπινο πνεύμονα πλακώδους καρκινώματος κυτταρική σειρά SK-MES-1, αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα κυτταρική σειρά Α549, φυσιολογικό πνεύμονα επιθηλιακή κυτταρική γραμμή Beas2B, και κυτταρική γραμμή λεμφώματος του Burkitt Raji αγοράσθηκαν από την ATCC (Manassas, VA, ΗΠΑ) και καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ με 10% FBS. Όλες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO

2 στους 37 ° C.

Δείγματα ιστών

Ογδόντα έξι μονιμοποίηση φορμαλίνης ενσωματωμένα σε παραφίνη δείγματα καρκίνου του πνεύμονα συμπεριλαμβανομένων παρακείμενο φυσιολογικό πνεύμονα ιστού ανακτήθηκαν από το Τμήμα Παθολογίας, Πανεπιστήμιο Σάντου Medical College συνδεδεμένες όγκων Νοσοκομείο και Τμήμα Παθολογίας, Xiangyang Κεντρικό Νοσοκομείο, επαρχία Hubei 2006-2011 με πλήρη κλινικές πληροφορίες της ηλικίας, του φύλου, ιστολογικό τύπο, παθολογικές βαθμό, κλινικό στάδιο και των λεμφαδένων μετάσταση. Δύο εξάσκηση παθολόγους επανεξέτασε το αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η & amp? Ε) διαφάνειες για να ελέγξουν τη διάγνωση ανεξάρτητα. Για ανοσοϊστοχημεία (IHC) και in situ υβριδισμού (ISH), τα δείγματα κόπηκαν σε 3 μm πάχους σειριακές τομές. Τέσσερις φρέσκα χειρουργικά δείγματα (δύο LSCCs και δύο LACs με παρακείμενο φυσιολογικό ιστό) ελήφθησαν από το Τμήμα Καρδιοχειρουργικής, Πανεπιστήμιο Σάντου Medical College συνδεδεμένες Νοσοκομείο του όγκου και διατηρείται στους -80 ° C πριν από την εκχύλιση RNA από κύτταρα που απομονώνονται με λέιζερ καθοδηγείται μικροδιατομής (LMD) .

η ανοσοϊστοχημεία

IHC διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [35]. Εν συντομία, 3.5 μm τομές αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο, ενυδατώνονται σε μειούμενες συγκεντρώσεις αιθανόλης και στη συνέχεια ξεπλένεται με τρεχούμενο νερό της βρύσης. Τα πλακίδια επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα σε 4 ° C όλη τη νύκτα. Στη συνέχεια, οι πλάκες επωάστηκαν με ένα δευτερογενές αντίσωμα (PV9000? Zymed Laboratory, South San Francisco) και οπτικοποιήθηκαν με 3-αμινο-9-αιθυλο-καρβαζόλη (AEC? Χρυσή Γέφυρα International). Τα πρωτογενή αντισώματα παρατίθενται στον Πίνακα S1. Βιοψιών υγιείς ιστούς αμυγδαλής χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί μάρτυρες για Igγ, Ιακ και Igλ ανοσοκηλιδώσεις. PBS αντί των πρωτογενών αντισωμάτων χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Για να διασφαλιστεί η εξειδίκευση του ανοσοχρώση, μία δοκιμή προ-απορρόφηση του αντισώματος διεξήχθη στο οποίο το πρωτογενές αντίσωμα έναντι Igγ προ-επωάστηκε με καθαρή ανθρώπινη IgG στη μοριακή αναλογία 1:01, 1:05 και 1:10. Το μικτό διάλυμα επωάσθηκε στους 4 ° C όλη τη νύκτα και στη συνέχεια χρησιμοποιείται στη θέση του πρωτογενούς αντισώματος.

Igγ και έκφραση MTA1 βαθμολόγησης

Βαθμολόγηση της ανοσοχρώσης Igγ διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως με ελάσσονες τροποποιήσεις [8]. Το ποσοστό και η ένταση των θετικών κυττάρων αποκτήθηκαν με μέτρηση των κυττάρων του όγκου από 10 τυχαία επιλεγμένα οπτικά πεδία κάτω από 400 χ μεγέθυνση. Η βαθμολόγηση του 0-3 για το ποσοστό των θετικών κυττάρων ήταν: 0 = & lt? 5%? 1 = 5-25%? 2 = 25-50%? και 3 = & gt? 50%. Η ένταση της χρώσης IHC βαθμολογήθηκε: 0, 1, 2, 3, που αντιπροσωπεύουν απουσία του σήματος, ασθενές σήμα (κόκκινο φως), μέτρια σήμα (κόκκινο) και ισχυρό σήμα (σκούρο κόκκινο), αντίστοιχα. Το τελικό αποτέλεσμα για την κάθε περίπτωση προσδιορίστηκε με την προσθήκη των δύο βαθμολογίες μαζί και τα συνολικά αποτελέσματα αποδόθηκαν αρνητικό (-) όταν το άθροισμα ήταν 0 ή 1, ασθενώς θετικό (+) όταν το ποσό ήταν 2 ή 3, μετρίως θετική (++ ) όταν το άθροισμα ήταν 4 ή 5, και ισχυρώς θετικά (+++) όταν το άθροισμα ήταν 6. για να μελετηθεί η σχέση μεταξύ Igγ και MTA1, τα δείγματα του καρκίνου του πνεύμονα χωρίστηκαν σε 2 ομάδες ανάλογα με τις βαθμολογίες των Igγ ανοσοχρώση. Περιπτώσεις με σκορ 0-3 θεωρήθηκαν ως «αδύναμη έκφραση» και 4-6 ως «ισχυρή έκφραση»

Η βαθμολόγηση της ανοσοχρώση MTA1 υπολογίστηκε με τη χρήση ενός δείκτη επισήμανσης (LI) ως εξής:. LI = 100 × (p /t)% ( «p» είναι ο αριθμός των MTA1-θετικών καρκινικών κυττάρων και «t» είναι ο αριθμός του συνόλου των καρκινικών κυττάρων). Περίπου 3.000 κύτταρα υπό × 400 μεγέθυνση μετρήθηκαν (10 τυχαία επιλεγμένα πεδία σε κάθε διαφάνεια).

Η in situ υβριδοποίηση

Οι ανιχνευτές σχεδιάστηκαν για την ανίχνευση σταθερή περιοχή βαριάς αλυσίδας ανθρώπινης ανοσοσφαιρίνης G1 (IGHG1) . PCR εναρκτήρες για IGHG1 ήταν ως εξής: sense, 5′-ACGGCGTGGAGGTGCATAATG-3 ‘? αντινόημα, 5’-CGGGAGGCGTGGTCTTGTAGTT-3 ‘. Η μέθοδος για να συντεθούν οι ειδικοί ανιχνευτές έχουν αναφερθεί προηγουμένως [6]. Εν ολίγοις, μια ρήξη σπλήνας που προκαλείται από τραύμα χρησιμοποιήθηκε για να διαχωριστούν τα λεμφοκύτταρα. Το προϊόν PCR υποκλωνοποιήθηκε σε pGEM-Τ φορέα (Tiangen Biotech, Πεκίνο, Κίνα). Στη συνέχεια, η ενδονουκλεάση

Nco

Ι ή

Sal

Ι χρησιμοποιήθηκε γιά την γραμμικοποίηση του νέου πλασμιδίου, και Τ7 ή SP6 RNA πολυμεράση χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία αντιπληροφοριακού ή ανιχνευτή με το νέο πλασμίδιο όπως ένα πρότυπο.

ISH διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [8]. Εν ολίγοις, αποπαραφινοποιήθηκαν, επανυδατώθηκαν πλάκες ιστού υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,1 Μ HCl για 10 λεπτά, θερμάνθηκε στους 100 ° C σε κιτρικό ρυθμιστικό (0.01 Μ, ρΗ 6.0) για 15 λεπτά, σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη για 10 λεπτά και στη συνέχεια αφυδατώνεται με 90 % αιθανόλη. Μέχρι να στεγνώσει εντελώς, πλακίδια επωάστηκαν με 20 μΙ μίγματος υβριδισμού που περιέχει 18 μΙ αραιωτικό και 2 μl ή αντιπληροφοριακού ανιχνευτή σε 50 ° C για 18~20 h. Μετά από πλύση με 5 χ SSC, 2 χ SSC συν 50% φορμαμίδιο και 2 χ SSC δύο φορές για 15 λεπτά στους 37 ° C, τα πλακίδια αποκλείσθηκαν με ορό αλόγου σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα, και επωάστηκαν με αντι-digoxigemin-Ap θραύσματα Fab (1:500, Roche Diagnostics, Rotkreuz, Ελβετία) σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Τα σλάϊντς χρωματισμένα με τη χρήση ΝΒΤ-ΒΟΙΡ (Promega, Madison, USA). Για καλλιεργημένα κύτταρα που αναπτύσσονται σε διαφάνειες, όλες οι διαδικασίες ήταν παρόμοιες με διαφάνειες ιστού εκτός deparaffin, ενυδάτωσης και ανάκτηση θέρμανσης. Πρόσθετες πλακίδια επωάστηκαν με τους ανιχνευτές αίσθηση ως αρνητικοί έλεγχοι.

ανοσοφθορισμού

Α549, SK-MES-1 και Beas2B αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε πλακίδια. Ανοσοφθορισμού διεξήχθη σύμφωνα με ένα πρωτόκολλο όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11]. Τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη δοκιμασία που περιγράφεται στον Πίνακα S1. Μετά την πλύση σε PBS, τα πλακίδια επωάστηκαν με FITC-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού /αντι-ποντικού κατσίκας IgG (Zhongshan Χρυσή Γέφυρα, Πεκίνο, Κίνα) σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. DAPI χρησιμοποιήθηκε αιματοξυλίνης πυρήνες. Οι διαφάνειες εξετάστηκαν και φωτογραφήθηκαν με ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Zeiss AxioImager Ζ1, Zeiss GmbH, Göttingen, Γερμανία).

Laser καθοδηγείται μικροδιατομής, εκχύλιση RNA και αντίστροφη μεταγραφή

Φρέσκα δείγματα κατεψυγμένου ιστού κόπηκαν σε 10 μm, τοποθετημένο σε -membrane διαφάνεια ναφθαλικό πολυαιθυλένιο (PEN) (Leica Microsystems, Wetzlar, Γερμανία) και στη συνέχεια να καθοριστεί αμέσως σε 75% αιθανόλη για 1 λεπτό. κυττάρων-στόχων σε τομές μικροτομή και συλλέγονται στο καπάκι του σωλήνα Eppendorf με τη δύναμη λέιζερ χρησιμοποιώντας τα μικροανατομίας Συστήματα Leica 6000 (Leica Microsystems, Wetzlar, Γερμανία). Ολικό RNA εξήχθη από απομονωμένα κύτταρα με ένα RNeasy Micro Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Target cDNAs συντέθηκαν με έναν εκθέτη III πρώτου κλώνου κιτ σύνθεσης (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

TRIZOL (Invitrogen), χλωροφόρμιο, ισοπροπανόλη και αιθανόλη χρησιμοποιήθηκαν για την εκχύλιση RNA από δείγματα ιστών σύμφωνα με ένα πρωτόκολλο που παρέχεται από την Invitrogen. RNase ελεύθερη DNase (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε για να απομακρυνθεί το δυνατόν γενωμικού DNA μόλυνση. Στόχου cDNA που δημιουργήθηκαν με το πρώτο σκέλος κιτ cDNA systhesis (Toyobo επιστημονική, Σαγκάη, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)

Όπως περιγράφηκε προηγουμένως, IGHG1, RAG1, RAG2 και AID ενισχύθηκαν με ένθετη PCR [8]. Οι εκκινητές (Sangon Biotech, Σαγκάη, Κίνα) που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη δοκιμασία παρατίθενται στον Πίνακα S2. Τα προϊόντα PCR εξετάστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 2%. Νερό αντί cDNA χρησιμοποιήθηκε ως PCR εκμαγεία ως αρνητικοί μάρτυρες για τα εν λόγω γονίδια των οποίων εκκινητές εκτείνεται σε δύο εξόνια. Για RAG1, RAG2 και Ιακ, των οποίων οι εκκινητές που βρίσκονται σε ένα εξόνιο, RNA επεξεργάστηκε με DNase χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. κυτταρική γραμμή Raji χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. γονίδιο καθαριότητας GAPDH χρησιμοποιήθηκε για να ομαλοποιήσει τα σχετικά επίπεδα έκφρασης.

αλληλουχίας DNA

prodocts PCR για νγ, νκ και νλ εκχυλίσθηκαν με γέλης αγαρόζης DNA Extraction Kit (Takara Biotech, Dalian, Κίνα) και στη συνέχεια να κλωνοποιηθεί σε έναν φορέα ρΟΕΜ-Τ (Tiangen Biotech, Πεκίνο, Κίνα). Μετά επιμολύνονται σε Αρμόδιες

Ε. coli

TOP10, νέα κλώνοι σχηματίστηκε που ενισχύθηκαν με βακτήρια αναπαραγωγής. Στη συνέχεια, νέα κλώνοι καθαρίστηκαν με την Οικουμενική DNA Καθαρισμός Kit (Tiangen Biotech) και εξετάστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 2%. Οι νέες κλώνοι χρησιμοποιήθηκαν στον προσδιορισμό της αλληλουχίας του DNA, η οποία διεξήχθη με BGI-Shenzhen, Κίνα. Οι αλληλουχίες των νέων κλώνων συγκρίθηκαν με γνωστές αλληλουχίες στην ιστοσελίδα GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).

Real-Time PCR και ποσοτική ανάλυση

Χρησιμοποιώντας ένα ΑΒΙ PRISM 7500 μέσου, σε πραγματικό χρόνο PCR πραγματοποιήθηκε με SYBR Προμίγματα Ex Taq II (Takara Bio, Inc., Dalian, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για την ανίχνευση κατάντη γονίδια που ενδεχομένως ρυθμίζονται από IgG, κοινή μεταστατικό γονίδια MTA1, CD44, E-cadherin, ΜΜΡ9, ΜΜΡ2 και β1 Intergrin εξετάστηκαν μετά από siRNA παρεμβολή (βλέπε «παρεμβολή RNA»). Οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται για PCR πραγματικού χρόνου που καταγράφονται στον Πίνακα S3. Η ενίσχυση του β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε για ομαλοποίηση. Οι σχετικές εκφράσεις του κάθε γονιδίου σε δοκιμαζόμενων κυτταρικών τύπων προσδιορίσθηκαν με την μέθοδο των 2

-ΔΔCt [36].

κηλίδος Western

κηλίδος Western έγινε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11 ]. Κλάσματα πρωτεΐνης 150 μg έτρεξε σε 10% δωδεκυλικού νατρίου ηλεκτροφόρηση πηκτής θειικού-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE). Η όλη μοριακή IgG ήταν μη-αναγωγικά πήγματα και άλλες πρωτεΐνες ήταν στη μείωση πηκτώματα. Τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη δοκιμασία που περιγράφεται στον Πίνακα S1. Για τον εντοπισμό των κατάντη γονιδίων ενδεχομένως ρυθμίζονται από IgG, κοινή μεταστατικό γονίδια MTA1, CD44, E-cadherin, ΜΜΡ9, ΜΜΡ2 και β1 Intergrin εξετάστηκαν μετά από siRNA παρέμβαση των γονιδίων IgG. Καθαρή ανθρώπινη IgG χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος και το γονίδιο housekeeping β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε για να ομαλοποιήσει τα σχετικά επίπεδα έκφρασης.

RNA

παρεμβολή

Το καλλιεργημένο Α549, SK-MES-1 και τα κύτταρα Beas2B χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες (siRNA-IGHG1 ή siRNA-MTA1, siRNA-κωδικοποιημένα και ο μη επεξεργασμένα). Κωδικοποιημένα siRNAs χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός μάρτυρας. Όλα τα siRNAs αγοράστηκαν από τη Σαγκάη GenePharma Inc. Οι αλληλουχίες siRNA IGHG1 ήταν νόημα: 5′-CCAAGGACACCCUCAUGAUTT-3 ‘και αντινόημα: 5′-AUCAUGAGGGUGUCCUUGGTT-3′? αλληλουχίες MTA1 siRNA ήταν αίσθηση 5’-GCUGAGAGCAAGUUAAAGCTT-3 ‘και 5′-αντινόημα GCUUUAACUUGCUCUCAGCTT-3′? κωδικοποιημένα αλληλουχίες siRNA ήταν νόημα: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘και αντινόημα: 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’. Για την επιμόλυνση siRNA, χρησιμοποιήθηκε το αντιδραστήριο Χ-tremeGENE (Roche Diagnostics). Η αναλογία του αντιδραστηρίου επιμόλυνσης να siRNA ήταν 10 μΐ: 2 μg ανά 3 χ 10

5 κύτταρα. Η διαδικασία επιμόλυνσης διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η αποτελεσματικότητα των siRNA παρέμβαση εξετάστηκε με Real-time PCR 48 ώρες αργότερα και με κηλίδα Western 72 ώρες αργότερα.

MTS δοκιμασία

Περίπου 1 × 10

4 καρκινικά κύτταρα (Α549 ή SK-MES-1) σπάρθηκαν και καλλιεργήθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων για 24 ώρες. Τα κύτταρα χωρίζονται στις ακόλουθες ομάδες: αγωγή ομάδες (siRNA-κωδικοποιημένα και siRNA-IGHG1), χωρίς αγωγή ομάδα και ομάδα κενό (πλήρες μέσο χωρίς καρκινικών κυττάρων). Η διαδικασία παρεμβολής RNA διεξήχθη και καλλιεργήθηκαν για μία περίοδο 48 ωρών. MTS (Jianchen Biosciences, Nanjing, Κίνα, 20 μΙ) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο, και μετά από επώαση σε 5% CO

2 ατμόσφαιρα στους 37 ° C για 1 ώρα, η τιμή OD κάθε πηγαδιού αναγνώστηκε στα 450 nm μήκος κύματος υπεριώδες. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων υπολογίστηκε ως εξής:

δοκιμασία

Συνημμένο

Λεπτομέρειες δοκιμασίες προσκόλλησης είχαν προηγουμένως περιγραφεί με μικρές τροποποιήσεις [37]. Εν συντομία, το καλλιεργημένο Α549, SK-MES-1 και τα κύτταρα Beas2B επιμολύνθηκαν με siRNA. Δύο ημέρες αργότερα, 1 χ 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων επικαλυμμένα με Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Μετά από 2 ώρες, οι πλάκες πλύθηκαν για να απομακρυνθεί μη-συγκολλητικό κύτταρα. Κάθε φρεάτιο επωάστηκε με 20 μΐ αντιδραστήρια MTS για 2 ώρες στους 37 ° C και η οπτική πυκνότητα ανιχνεύθηκε στα 450 nm μήκος κύματος υπεριώδους. Μάρτυρες με περιπλεγμένο siRNAs διεξήχθησαν με το ίδιο πρωτόκολλο που περιγράφεται παραπάνω. Η κυτταρική πυκνότητα σποράς είναι μια εμπειρική τιμή. Ο στόχος είναι να καθιερωθεί το 30% -50% συρροή κυττάρου μετά την κυτταρική προσκόλληση στην πλάκα καλλιέργειας για τη διευκόλυνση της ανάπτυξης. Μόλις γίνει η πυκνότητα σποράς ήταν πανομοιότυπη για όλες τις ομάδες για να εξασφαλιστεί δίκαιη σύγκριση.

Transwell δοκιμασία

Το τηκόμενο metrigel αναμίχθηκε με precolled ϋΜΕΜ σε τελική συγκέντρωση 0,8 μg /μl και στη συνέχεια επικαλύπτεται επί οι ανώτεροι θάλαμοι ενθέτων φρεατίων (Millipore, Billerica, ΜΑ) σε 100 μΙ /φρεάτιο μέχρι την πήξη σε θερμοκρασία 37 ° C. Μετά από 48 ώρες από την επιμόλυνση siRNA, περίπου 1 × 10

5 θρυψίνη κύτταρα σπάρθηκαν εντός του άνω θαλάμου χρησιμοποιώντας ϋΜΕΜ χωρίς ορό. Και πάλι, η πυκνότητα των κυττάρων σποράς ήταν πανομοιότυπη για όλες τις ομάδες. Τα ένθετα Transwell τοποθετήθηκαν σε φρεάτια πλάκας 24 φρεατίων στο οποίο είχε τοποθετηθεί 200 μΐ DMEM συν 10% FBS. Η πλάκα που ακόμη στους 37 ° C για 24 ώρες. Οι δοκιμασίες στη συνέχεια σταμάτησε με απομάκρυνση μη εισβάλλοντα κύτταρα στον άνω θάλαμο με μάκτρα. Τα κύτταρα στην κάτω πλευρά του ενθέματος χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη. Κύτταρα σε πέντε οπτικά πεδία κάτω από 400 χ μεγέθυνση ανά ένθετο μετρήθηκαν και φωτογραφήθηκαν.

επούλωσης τραυμάτων

δοκιμασία

Το καλλιεργημένο Α549, SK-MES-1 και τα κύτταρα Beas2B σπάρθηκαν σε πλάκες 12-φρεατίων ( 1 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο) διαμολύνθηκαν με siRNA όπως περιγράφεται παραπάνω. Όταν τα κύτταρα έφθασαν το 90% συρροή, διαγράφοντας την μονοστιβάδα κυττάρων με μια αποστειρωμένη πιπέτα 10 μl χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργήσει μια περιοχή του τραύματος. Στη συνέχεια, οι πλάκες πλύθηκαν με PBS για την απομάκρυνση αποσπασμένα κύτταρα, και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν με FBS ϋΜΕΜ ελεύθερο. Στη συνέχεια, η πλάκα τέθηκε ακόμη στους 37 ° C για 48 ώρες. Η περιοχή της πληγής παρακολουθήθηκε με ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο και φωτογραφήθηκαν.

Η στατιστική ανάλυση

Οι συσχετισμοί μεταξύ της έκφρασης Igγ σε καρκίνους του πνεύμονα και διαφορετικές κλινικές παθολογικές παραμέτρων πραγματοποιήθηκαν με τη δοκιμή Chi-square Pearson.

t-test του Student χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση των δεδομένων που λαμβάνονται με τις τρεις ομάδες, δηλαδή siRNA-IGHG1, siRNA-ομελέτα και το μη επεξεργασμένο σε δοκιμασίες της MTS, μεταξύ φρεατίων, κατάσχεση, Real-time PCR και κηλίδας Western. Οι συσχετίσεις μεταξύ Igγand εκφράσεων MTA1 και μεταξύ της έκφρασης MTA1 και κλινικές παθολογικές παράμετροι αξιολογήθηκαν με δοκιμασία t Student. Το επίπεδο σημαντικότητας ορίστηκε στο

σ

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Igγ, Ιακ και Igλ εκφράσεις σε LSCC και ΛΑΚ

Οι περισσότεροι καρκίνοι του πνεύμονα (& gt? 85%) που εξετάστηκαν εκφράζονται Igγ και Ιακ, ενώ ένας μικρός αριθμός (& lt? 15%) εξέφρασε επίσης Igλ ταυτόχρονα. Igγ, Ιακ και Igλ εκφράστηκαν στα ίδια κύτταρα όπως καταδεικνύεται με διαδοχικές τομές. Θετικά σήματα χρώση ήταν εντοπισμένες στο κυτταρόπλασμα και επί των κυτταρικών μεμβρανών. Η πλειοψηφία των θετικών καρκινικών κυττάρων διανεμήθηκαν στις περιφερειακές περιοχές των φωλιών καρκίνου σε LSCC ή με ασυνεχές στίγματα μοτίβο στις σωληνοειδείς δομές του LAC (Σχήμα 1, A-F). Πολλοί IgG postive καρκινικά κύτταρα είχαν άτυπα πυρήνες και πυρηνική συμπύκνωση. Βιοψιών αμυγδαλές περιείχαν Igγ, Ιακ και Igλ ανοσοαντιδραστικότητες σε Β λεμφοκύτταρα (Σχήμα 1, G-I). Χρησιμοποιήσαμε CD20 ως δείκτης για τα λεμφοκύτταρα Β και τηγάνι CK ως δείκτης για κύτταρα επιθηλιακής προέλευσης. Με διαδοχικές τομές, ανιχνεύσαμε δύο είδη κυττάρων που εκφράζουν Igγ. Το ένα είναι μεγάλο επιθηλιοειδή κύτταρα με θετικά CK τηγάνι, και το άλλο είναι μικρά στρογγυλά κύτταρα με θετικό CD20. Με βάση την μορφολογία και την κυτταρική δείκτες, εντοπίσαμε ότι οι πρώτες είναι καρκινικά κύτταρα και τα τελευταία είναι διεισδύουν Β λεμφοκύτταρα (Σχήμα 1, J-O). Κανονική πνευμονικού ιστού που γειτνιάζουν με τις φωλιές του καρκίνου δεν περιείχαν θετικά ανοσοαντιδραστικότητα IgG (Σχήμα 1, Ρ-Κ).

Α-Ο, Igγ (Α), Ιακ (Β) και Igλ (C) ανοσοκηλιδώσεις είναι θετικά σε το κυτταρόπλασμα και κυτταρική μεμβράνη των LSCC σε σειριακές τομές. Σημείωση: Οι IgG θετικά καρκινικά κύτταρα διανέμονται στην περιφέρεια της μάζας του όγκου. D-F, τα θετικά σήματα για Igγ (D), Ιακ (Ε) και Igλ (F) που φαίνεται στο κυτταρόπλασμα και κυτταρική μεμβράνη ενός LAC. G-I, Igγ (G), Ιακ (H) και Igλ είναι (i) εκφράσεις ανιχνεύεται σε λεμφοκύτταρα των ιστών αμυγδαλής ως θετικός έλεγχος. J-L, Igγ (J), τηγάνι CK (Κ) και CD20 (L) εκφράζονται σε LSCC σε σειριακές τομές. Μ-Ο, Igγ (Μ), CK τηγάνι (Ν) και CD20 (O) εκφράζονται σε σειριακά τμήματα της Λατινικής Αμερικής. Igγ (Ρ), Ιακ (Q) και Igλ (R) δεν εκφράζονται σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα παρακείμενα μάζα του όγκου σε σειριακές τομές. Μαύρα βέλη δείχνουν προς την ίδια καρκινικών κυττάρων σε διαδοχικές τομές. Μαύρα βέλη δείχνουν θετικά λεμφοκύτταρα. Με AEC χρωματισμού, οι θετικές ανοσοκηλιδώσεις με AEC είναι κόκκινα στο χρώμα. Σημείωση: IgG είναι θετική και στις δύο καρκινικά κύτταρα και λεμφοκύτταρα που διεισδύουν με το τελευταίο ισχυρότερο από το πρώτο. μπαρ κλίμακα:. 20 μm

Η

Στις δοκιμές προ-απορρόφηση του αντισώματος, αυξανόμενες συγκεντρώσεις του καθαρού ανθρώπινου αντιγόνου IgG οδήγησε στη μείωση της έντασης των ανοσοχρώση (Εικόνα 2, A-F). Τα διηθητικά λεμφοκύτταρα Β στο mesenchyma περιβάλλει τις φωλιές του καρκίνου ή των σωληνοειδών δομών που εκφράζονται IgG ισχυρότερη από εκείνη των καρκινικών κυττάρων. Για την περαιτέρω διάκριση καρκινικών κυττάρων από λεμφοκύτταρα, εξετάσαμε τις εκφράσεις του CD16, CD32, CD64 και FcRn σε LSCC και ΛΑΚ. Δεν καρκινικά κύτταρα βρέθηκαν να εκφράζουν αυτούς τους υποδοχείς (Σχήμα 3, A-H) και τα μόνα κύτταρα που εκφράζουν αυτά ήταν λεμφοκύτταρα (Σχήμα 3, I-L).

Α-C, το ποντικού αντι-ανθρώπου Igγ μονοκλωνικό αντίσωμα: καθαρή ανθρώπινη IgG = 1:01, 1:05 και 1:10 σε τμήματα LSCC. D-F, η παρόμοια αναλογία κλίση Igγ: καθαρή ανθρώπινη IgG στα τμήματα ΛΑΚ. Με την αύξηση της συγκέντρωσης αντιγόνου (καθαρή ανθρώπινη IgG), η θετική IgG σήμα εξασθενήσει. Bar: 20 μm

Η

CD16 (Ρογ υποδοχέα III) παρουσιάζεται στο LSCC (Α) και LAC (Ε) ιστούς.. CD32 (Ρογ υποδοχέα ΙΙ) εμφανίζεται στο LSCC (Β) και LAC (F) ιστούς. CD64 (υποδοχέας Ι Ρογ) φαίνεται στο LSCC (C) και LAC (G) ιστούς. FcRn (νεογέννητα Ρογ υποδοχέα) φαίνεται στο LSCC (D) και LAC (H) ιστούς. Σε αυτά τα τμήματα, τα θετικά σήματα εκφράζονται μόνο στο κυτταρόπλασμα και μεμβράνη των λεμφοκυττάρων, ενώ δεν βρέθηκαν θετικά σήματα σε καρκινικά κύτταρα. CD16 (Ι), CD32 (J), CD64 (Κ) και FcRn (L) εκφράζονται σε βιοψία ανθρώπινων ιστών αμυγδαλής ως θετικοί μάρτυρες. Bar:. 20 μm

Η

Σχεδόν όλα τα καρκινικά κύτταρα ήταν θετικά για IGHG1 mRNA. Σε διαδοχικές τομές, η πρωτεΐνη του Igγ και mRNA του IGHG1 ήταν εντοπισμένες στο κυτταρόπλασμα των ίδιων καρκινικών κυττάρων και διηθητικά λεμφοκύτταρα Β (Σχήμα 4, Α, Β, D και Ε). Θετικά σήματα του mRNA IgG βρέθηκαν επίσης σε Β λεμφοκύτταρα ανθρώπινων ιστών αμυγδαλής (Σχήμα 4, G και Η). Αριθ θετικό σήμα παρατηρήθηκε στα λεμφοκύτταρα και καρκίνους όταν ο ανιχνευτής αίσθηση χρησιμοποιήθηκε (Σχήμα 4, C, F και Ι). Κανονική πνευμονικού ιστού που γειτνιάζουν με τις φωλιές του καρκίνου δεν εκφράζουν πρωτεΐνη IgG και mRNA του IGHG1 (Σχήμα 4, J-L).

Κοινός εντοπισμός του mRNA IgG και πρωτεΐνη στα δείγματα LSCC και ιστών LAC καταδειχθεί με ISH και IHC . Α-Γ, Igγ ανοσοχρώση (Α, κόκκινο) και τα σήματα mRNA (Β, μοβ, με αντιπληροφοριακό ανιχνευτή) είναι θετικές για σειριακή τμήματα ενός LSCC. C είναι ένα αρνητικό έλεγχο με καθετήρα αίσθηση. D-F, Igγ ανοσοχρώση (D, κόκκινο) και mRNA σήματα (Ε, μοβ, με αντιπληροφοριακό ανιχνευτή) είναι θετικές για σειριακή τμήματα ενός ΛΑΚ. F είναι αρνητική με αισθητήρα αίσθηση. G-Ι, αμυγδαλής ιστών χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. G είναι για Igγ με IHC δείχνει θετικά λεμφοκύτταρα. H είναι για το αντιπληροφοριακό ανιχνευτή με ISH δείχνει θετικά λεμφοκύτταρα. Θα είναι με αισθητήρα αίσθηση στην ISH δείχνει κανένα θετικό μήνυμα. J-L, Igγ πρωτεΐνη (J) και mRNA (Κ, το αντιπληροφοριακό ανιχνευτή) δεν εκφράζονται σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα παρακείμενα μάζα του όγκου. L είναι ο ανιχνευτής αίσθηση. Μαύρο αιχμές βελών στα ίδια τα καρκινικά κύτταρα σε σειριακά τμήματα. Μαύρο βέλη δείχνουν προς θετικά λεμφοκύτταρα.

Η

Με φρέσκο ​​χειρουργικό ιστό καρκίνου του πνεύμονα, εκτελέσαμε LMD να συλλάβει τα καρκινικά κύτταρα και επιθηλιακά κύτταρα φυσιολογικού πνεύμονα γειτονικά στις φωλιές καρκίνο μόνο χωρίς λεμφοκύτταρα (Σχήμα 5, Α) για την ανίχνευση οι μεταγραφές mRNA της IgG, συμπεριλαμβανομένων IGHG1, κ σταθερό (Οκ), λ σταθερή (Ολ), γ μεταβλητή (νγ), κ μεταβλητή (νκ), λ μεταβλητή (νλ), αποστειρωμένο μεταγραφές βλαστικής (ΙΓ-Ογ) και τα βασικά ένζυμα συμπεριλαμβανομένων RAG1, RAG2 και ενισχύσεις για τη σύνθεση ανοσοσφαιρινών και αλλαγή τάξης. Θετικά σήματα αυτών των γονιδίων βρέθηκαν σε LSCC και τον καρκίνο LAC κύτταρα αντί των επιθηλιακών κυττάρων φυσιολογικού πνεύμονα (Σχήμα 5, Β). Τέσσερις περιπτώσεις καρκίνων του πνεύμονα έδειξαν πολύ υψηλή ομολογία με τις δημοσιευμένες αλληλουχίες του νγ, νκ, νλ και μόνο με λίγες μεταλλάξεις γονιδίων. Με την ευθυγράμμιση ακολουθίας, βρήκαμε επίσης ότι η V (D) J αναδιάταξη συνέβη όταν συντέθηκαν η βαριά αλυσίδα ή ελαφριές αλυσίδες, αλλά παρουσίασε ένα μονότονο μοτίβο (Σχήμα 6).

Α είναι οι αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες των τριών κύκλων στην LSCC, LAC και κανονικό πνεύμονα δίπλα στην μάζα του όγκου. Β, οι ζώνες που αντιπροσωπεύεται ότι IgG γονιδίων που σχετίζονται σύνθεση ανιχνεύθηκαν σε LSCC, LAC και κανονικό πνεύμονα με φωτόμετρο σε συνδυασμό με RT-PCR. Δεν CD19 ανιχνεύθηκε, αποκλείοντας έτσι την πιθανή μόλυνση των Β λεμφοκυττάρων. κυτταρική γραμμή Raji χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Το νερό χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος στη θέση των εκκινητών. RNA επεξεργάστηκε με DNase (συντομογραφία R) χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο για τον αποκλεισμό πιθανών εσφαλμένη θετικότητα σε 1R-6R. NL είναι η συντομογραφία του φυσιολογικού πνεύμονα.

Η

Ένα είναι για τις ακολουθίες της νγ, Β είναι για νκ, και C είναι για νλ.

Η

Ανίχνευση IgG και η ουσιαστικό ένζυμα για τη σύνθεση IgG στον Α549, SK-MES-1 και Beas2B κυτταρικές σειρές

LSCC κυτταρική σειρά (SK-MES-1) και κυτταρική ΛΑΚ γραμμή (Α549) βρέθηκαν να εκφράζουν Igγ, Ιακ και Igλ με ανοσοφθορισμό (Σχήμα 7, Α-Ρ). Το θετικό σήμα παρατηρήθηκε στο κυτταρόπλασμα και στην κυτταρική μεμβράνη. Ως θετικός έλεγχος, Igγ, Ιακ και Igλ ανιχνεύθηκαν επίσης στο κυτόπλασμα των κυττάρων Raji (Σχήμα 7, G-I). Κανονική πνευμονικά επιθηλιακά κυτταρική σειρά (Beas2B) δεν εκφράζουν Igγ, Ιακ και Igλ (Σχήμα 7, J-L). Άφθονα mRNA IGHG1 ανιχνεύθηκε σε Α549 και SK-MES-1 (Σχήμα 7, Μ και Ο) καθώς και κύτταρα Raji (Σχήμα 7, Q). Αριθ θετικό σήμα παρατηρήθηκε όταν ανιχνευτής αίσθηση χρησιμοποιήθηκε (Σχήμα 7, Ν, Ρ και R). IGHG1 mRNA δεν βρέθηκε σε Beas2B (Σχήμα 7, S και Τ).

Α-Ο, Igγ (Α), Ιακ (Β) και Igλ (C) εκφράζονται σε Α549 κύτταρα με ανοσοφθορισμό. D-F, Igγ (D), Ιακ (Ε) και Igλ (F) εκφράζονται σε SK-MES-1 κύτταρα. G-I, Igγ (G), Ιακ (H) και Igλ (Ι) είναι σε κύτταρα Raji ως θετικός έλεγχος. J-L, Igγ (J), Ιακ (Κ) και Igλ (L) δεν εκφράζονται σε κύτταρα Beas2B. Τα θετικά σήματα (μωβ) για IGHG1 αντιπληροφοριακό ανιχνευτή φαίνεται στο κυτταρόπλασμα του Α549 (Μ), SK-MES-1 (O) και κύτταρα Raji (Q). Ν, Ρ και Κ παρουσιάζουν αρνητικά αποτελέσματα (ανιχνευτής νόημα) σε Α549, SK-MES-1 και κύτταρα Raji. Δεν βρέθηκαν θετικά σήματα σε κύτταρα Beas2B (S, το αντιπληροφοριακό ανιχνευτή? και Τ, ο ανιχνευτής αίσθηση). Για να τονίσει τα κύτταρα χωρίς μωβ σήμα, μεθυλο πράσινο ήταν η χρήση της αιματοξυλίνης τους πυρήνες. Ράβδοι κλίμακας: 20 μm

Η

Ο mRNAs των IgG και τα βασικά ένζυμα για τη σύνθεση IgG ήταν όλα εκφράζονται σε Α549 και SK-MES-1 αντί Beas2B (Σχήμα 8, Α).. Το πλήρες μόριο της IgG καθώς επίσης και διαφορετικά θραύσματα, δηλ Igγ, Ιακ και Igλ ήταν όλα ανιχνεύσιμα σε Α549 και SK-MES-1 κύτταρα (Σχήμα 8, Β) με αντίστοιχο μοριακό βάρος παρόμοιο με IgG από Β λεμφοκύτταρα. Η παρουσία του RAG1, RAG2 και ενισχύσεις στον Α549 και SK-MES-1 επιβεβαιώθηκε επίσης με κηλίδα Western (Σχήμα 8, C). Σε αντίθεση με τα καρκινικά κύτταρα, Beas2B δεν εκφράζουν συστατικά IgG ή εκείνα τα ένζυμα για τη σύνθεση IgG (Σχήμα 8, Β και C).

Α, οι ζώνες που αντιπροσωπεύεται ότι η σύνθεση IgG που συνδέεται γονιδίων ανιχνεύθηκαν με RT-PCR σε Α549 και SK-MES-1, ενώ δεν είναι σε Beas2B. Β δείχνει ότι IgG ολόκληρο το μόριο, Igγ, Ιακ και Igλ ανιχνεύονται στο Α549, SK-MES-1, ενώ δεν είναι σε Beas2B με κηλίδα Western. Ανθρώπινα καθαρό IgG χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο μοριακό βάρος μπορεί να συγκριθεί με αυτό από καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα. Raji κυτταρική γραμμή ήταν ένας θετικός έλεγχος. C δείχνει ότι RAG1, RAG2 και AID εκφράζονται σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα, ενώ δεν είναι σε Beas2B. κυτταρική γραμμή Raji ήταν χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος.

Η

IgG και γονίδιο MTA1 εκφράσεις ανεστάλησαν από siRNA παρεμβολές σε IGHG1

Η έκφραση Igγ τόσο mRNA (Εικόνα 9, Α) και τα επίπεδα της πρωτεΐνης (Σχήμα 9, C και D) ήταν ειδικά κάτω-ρυθμίζονται από siRNA-IGHG1 σε Α549 και γραμμές SK-MES-1cell. Μαζί με IgG, η έκφραση MTA1 ήταν σημαντικά μειωμένη στο mRNA (Σχήμα 9, Β) και τα επίπεδα της πρωτεΐνης (Σχήμα 9, Γ και Δ) στις δύο κυτταρικές σειρές.