Αφηρημένο

microRNAs Ορός υπόσχονται πολλά, όπως εύκολα προσβάσιμα και μετρήσιμα βιοδείκτες της νόσου. Στον καρκίνο του προστάτη, οι υπογραφές miRNA ορό έχουν συσχετιστεί με την ύπαρξη της νόσου, καθώς και συσχετισμένες με τα μοντέλα που έχουν επικυρωθεί προηγουμένως κινδύνου. Ωστόσο, δεν είναι σαφές αν miRNAs μπορούν να παρέχουν ανεξάρτητες προγνωστικές πληροφορίες πέρα ​​από τα σημερινά μοντέλα κινδύνου. Εδώ, έχουμε επικεντρωθεί σε μια ομάδα ασθενών με καρκίνο του προστάτη χαμηλού κινδύνου που ήταν επιλέξιμες για την ενεργό επιτήρηση, αλλά επέλεξε τη χειρουργική επέμβαση. Μια κύρια κριτήρια για την κατηγορία χαμηλού κινδύνου είναι ένα σκορ Gleason 6 ή χαμηλότερη με βάση την προ-χειρουργική βιοψία. Ωστόσο, το ένα τρίτο από αυτούς τους ασθενείς έχουν αναβαθμιστεί σε Gleason 7 για μετεγχειρητική παθολογική ανάλυση. Τόσο στην ανακάλυψη και μια ομάδα επικύρωσης, διαπιστώνουμε ότι οι προ-χειρουργική επίπεδα του miR-19 στον ορό, miR-345 και miR-519c-5P μπορεί να βοηθήσει στον εντοπισμό αυτών των ασθενών ανεξάρτητα από τους προ-χειρουργική ηλικία, PSA, το στάδιο, και τοις εκατό βιοψία συμμετοχή. Ένας συνδυασμός των τριών miRNAs αύξησε την περιοχή κάτω από την καμπύλη χαρακτηριστικά χειριστή δέκτη 0,77 – 0,94 (

σ

& lt? 0,01). Επίσης, όταν συνδυάζεται με το μοντέλο κινδύνου CAPRA η υπογραφή miRNA ενισχύεται σημαντικά πρόβλεψη των ασθενών με Gleason 7 ασθένεια. In-situ υβριδισμοί του ταιριάζουν όγκων έδειξε miR-19 προς τα πάνω ρύθμιση σε μεταμορφωμένα σε σχέση με την κανονική-εμφανίζονται επιθηλιακών όγκων, αλλά ανεξάρτητα από βαθμό όγκου προτείνοντας μια εναλλακτική πηγή για την αύξηση των επιπέδων /b ορό 19α miR ή την απελευθέρωση της προϋπάρχουσας ενδοκυτταρική miR -19a /β κατά την εξέλιξη. Μαζί, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι miRNAs ορού μπορεί να προβλέψει σχετικώς μικρά βήματα στην πρόοδο του όγκου βελτίωση της ικανότητας για την πρόβλεψη του κινδύνου της νόσου και, ως εκ τούτου, ενδεχομένως να οδηγούν κλινικές αποφάσεις σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη. Θα είναι σημαντικό να επικυρώσει αυτά τα ευρήματα σε ένα μεγαλύτερο πολυ-θεσμική μελέτη, καθώς και με ανεξάρτητους μεθοδολογίες

Παράθεση:. Wang SY, Shiboski S, Belair CD, Cooperberg MR, Simko JP, Stoppler H, et al . (2014) miR-19, miR-345, miR-519c-5P Επίπεδα ορού Προβλέψτε ανεπιθύμητες Παθολογίας στον καρκίνο του προστάτη ασθενείς Επιλέξιμες για ενεργητική επιτήρηση. PLoS ONE 9 (6): e98597. doi: 10.1371 /journal.pone.0098597

Συντάκτης: Fabio Martelli, IRCCS-Policlinico San Donato, Ιταλία

Ελήφθη: 12 του Αυγούστου του 2013? Αποδεκτές: 5 Μάη 2014? Δημοσιεύθηκε: 3 Ιούνη του 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα χρηματοδοτήθηκε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας R21 CA161615 και ιδιωτικό δωρεά από τον John και Donna Shoemaker. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

αν και το ειδικό προστατικό αντιγόνο (PSA): Προβολή μειώθηκε ποσοστά θνησιμότητας προστάτη στις ΗΠΑ, το έπραξε σε βάρος της ανίχνευσης πρώιμο στάδιο /βαθμός προστάτη που μπορεί να μην επηρεάσει τη ζωή ενός ασθενούς εάν δεν αντιμετωπιστεί (υπερδιάγνωσης) [1] – [4]. Κατάρριψη εκείνους με τα αποτελέσματα της νόσου χαμηλού κινδύνου σε περιττές νοσημάτων που συνδέονται με ριζικές επεμβάσεις, όπως η χειρουργική επέμβαση ή ακτινοβολία (υπερθεραπεία) [5].

Η ενεργητική επιτήρηση (AS) είναι μια στρατηγική που αναπτύχθηκε για να μειώσει την θεραπεία των ασθενών με χαμηλό κίνδυνο ΣΕΣΣ. Τέτοιοι ασθενείς παρακολουθούνται με φυσικές εξετάσεις, επιλεκτική απεικόνιση, σειριακή εκτιμήσεις PSA, και επαναλάβετε βιοψίες. Η θεραπεία τότε προσφέρεται σε αυτούς με σημάδια εξέλιξης. Οι υποψήφιοι για τα πρωτόκολλα ενεργό επιτήρηση περιλαμβάνουν εκείνους με βιοψία Gleason βαθμού 6 ή λιγότερο (χωρίς μοτίβο 4 ή 5), PSA 10 ng /ml ή λιγότερο, και το στάδιο Τ1 ή Τ2 νόσο [6]. Αν και τα στοιχεία από πολλαπλές ιδρύματα υποδεικνύει ότι AS είναι μια βιώσιμη επιλογή για τους άνδρες με χαμηλού κινδύνου προστάτη, υπάρχουν σημαντικές ποσοστά εσφαλμένης ταξινόμησης κατά τον προσδιορισμό των υποψηφίων για AS [6], [7]. Σε μια μελέτη σε ασθενείς κριτήρια συνάντηση για AS αλλά υπέστη άμεση ριζική προστατεκτομή 28% βρέθηκαν να έχουν υψηλότερο βαθμό Gleason και το 21% βρέθηκαν να έχουν νόσο του Τ3 σε χειρουργική παθολογία [8].

Πολλά μοντέλα κινδύνου που προορίζονται να προβλέψει μετεγχειρητική παθολογία σε ασθενείς χαμηλού κινδύνου χρησιμοποιώντας κλινικά χαρακτηριστικά όπως η ηλικία, PSA, στάδιο, την έκταση της εμπλοκής του όγκου εντός βιοψίες έχουν αναπτυχθεί. Ωστόσο, καταδεικνύουν ακρίβεια μόνο 61-79% περιπλέκει τη λήψη αποφάσεων [9]. Λόγω των περιορισμών του PSA ως υποκατάστατο για την εξέλιξη της νόσου και σημαντικές θεμιτές ανησυχίες σχετικά με τα σφάλματα δειγματοληψίας βιοψίας, και οι ασθενείς και οι κλινικοί γιατροί ανησυχούν ότι η καθυστερημένη θεραπεία θέτει σε κίνδυνο την ικανότητα να θεραπεύει τη νόσο [10]. Μυθιστόρημα δείκτες που αξιοπιστία διάκριση μεταξύ χαμηλού κινδύνου έναντι της νόσου ενδιάμεσου /υψηλού κινδύνου θα ήταν μια λύση για τη βελτιστοποίηση AS πρωτόκολλα.

Growing στοιχεία δείχνουν microRNAs (miRNAs) ως ελπιδοφόρων δείκτες για διάφορες κακοήθειες [11]. Αυτά τα μικρά, μονόκλωνο, μη-κωδικοποίησης των μορίων RNA που εμπλέκονται στη ρύθμιση των γονιδίων μετα-μεταγραφικές και έχουν ένα αλλαγμένο προφίλ έκφρασης σε προστάτη ιστό [12] – [14]. Επιπλέον, miRNAs ανιχνευθεί σε ορό έχουν χρησιμοποιηθεί για τον εντοπισμό ασθενών με προστάτη, γεγονός που υποδηλώνει το δυναμικό τους ως μέρος ενός πίνακα δεικτών ορού που βασίζεται [15], [16]. Προηγουμένως, χρησιμοποιήσαμε ένα microfluidic που βασίζεται multiplex ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης αντίστροφης μεταγραφάσης πολυμεράσης (qRT-PCR) μέθοδος για τον εντοπισμό υπογραφές miRNA ορού σε άνδρες με προστάτη που συνδέουν με την επικυρωμένη Καρκίνος του Αξιολόγησης Κινδύνου προστάτη (Capra) βαθμολογία για την αξιολόγηση του κινδύνου [17 ]. Ωστόσο, αυτή η προηγούμενη μελέτη δεν διαπιστωθεί αν κάποιο από αυτά τα miRNAs θα μπορούσε να παρέχει ανεξάρτητη προγνωστική αξία. Ως εκ τούτου, εδώ έχουμε ως στόχο να προσδιορίσει μια miRNA υπογραφή του ορού που θα μπορούσε να subcategorize προ-χειρουργικών ασθενών με βαθμολογίες αξιολόγησης χαμηλού κινδύνου σε εκείνους με μεγαλύτερο ή μικρότερο κίνδυνο εξέλιξης. Λόγω της μακράς παρακολούθησης που απαιτούνται για τον εντοπισμό των ασθενών που κλινικά πρόοδο και σχετικά σύντομο χρονικό διάστημα στο οποίο AS έχει στην πράξη, θα αξιολογηθεί η μετεγχειρητική παθολογία ως υποκατάστατο δείκτη. Βρήκαμε ένα τριών miRNA υπογραφή που θα μπορούσε να προβλέψει χειρότερη παθολογική νόσο από ό, τι υποτίθεται ότι βασίζεται σε προ-χειρουργική βιοψία. Προτείνουμε ότι μια τέτοια υπογραφή έχει τη δυνατότητα να εντοπίσει ένα μεγάλο αριθμό ασθενών που είναι απίθανο να ωφεληθούν από την άμεση χειρουργική επέμβαση (π.χ. χαμηλή κλινική βαθμολογία σε συνδυασμό με την απουσία ενός θετικού υπογραφή miRNA), αν και ένα τέτοιο συμπέρασμα περιμένει ένα μεγαλύτερο cross-θεσμική μελέτη με μακροχρόνια παρακολούθηση.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

ορού και δείγματα ιστών καθώς και κλινικά δεδομένα συλλέχθηκαν μεταξύ 2002 και 2012. Όλοι οι ασθενείς που παρέχονται γραπτή συγκατάθεση για να έχουν τα δείγματα τους και συνδέονται κλινικά δεδομένα αποθηκευμένα για ερευνητικούς σκοπούς κλινικές και τα βασικά. Η Επιτροπή UCSF Ανθρωπίνων Έρευνας ενέκρινε τη διαδικασία συναίνεσης. Για τη μελέτη αυτή, όλα τα δείγματα και τα δεδομένα de-εντοπίστηκαν και, ως εκ τούτου, δεν απαιτείται καμία πρόσθετη IRB έγκριση.

Μελέτη

Ο σχεδιασμός της μελέτης ακολούθησε την αρχή της προοπτική συλλογής δείγματος και αναδρομική τύφλωσε αξιολόγηση (Probe) σχεδιασμό [18] και ανέφερε ακολουθώντας τις κατευθυντήριες γραμμές ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ [19]. Όλα τα δείγματα ορού συλλέχθηκαν ρουτίνας κατά το χρόνο της χειρουργικής επέμβασης μετά την επαγωγή της αναισθησίας, αλλά πριν από οποιαδήποτε διαδικαστική παρέμβαση και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Φορμόλη σταθερό, έχει εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) τμήματα ιστού ριζική προστατεκτομή είχαν αρχειοθετηθεί και είναι διαθέσιμη για ανάλυση.

Οι ασθενείς που συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη ήταν εκείνοι που επιλέγουν για άμεση ριζική προστατεκτομή που πληρούσαν τα κριτήρια χαμηλού κινδύνου UCSF για AS συμπεριλαμβανομένων βιοψία Gleason 2-6 (χωρίς μοτίβο 4 ή 5), PSA λιγότερο από 10 ng /ml, λιγότερο από το 34% των πυρήνων βιοψίας που εμπλέκονται, λιγότερο από 50% συμμετοχή σε οποιαδήποτε ενιαίο πυρήνα, και κλινικό στάδιο της νόσου Τ1-Τ2. Μια παθολογική σκορ Gleason 7 της τριτοβάθμιας συνδέεται με αυξημένο κίνδυνο θνησιμότητας προστάτη [20] και, ως εκ τούτου, χρησιμοποιήθηκε για να καθορίσει δυσμενείς παθολογία. Η ομάδα ανακάλυψη αποτελούνταν από 48 ασθενείς με μετεγχειρητικό παθολογική σκορ Gleason 7 ή νεότερη έκδοση (υπόθεση ομάδα) και 48 ασθενείς με παθολογική σκορ Gleason 6 (ομάδα ελέγχου). Μια ομάδα επικύρωση αποτελούνταν από 25 περιπτώσεις και 35 ελέγχους. Οι ασθενείς επιλέχθηκαν από διαθέσιμα δείγματα διατηρούνται σε τράπεζα ιστών UCSF. Οι ασθενείς τοποθέτηση κριτήρια επιλέχθηκαν πάνω από τη διαθέσιμη πισίνα με βάση ένα τυχαίο ακέραιο γεννήτρια. Μία σχηματική του σχεδιασμού της μελέτης απεικονίζεται στο Σχήμα 1.

Η

Microfluidics βασίζονται multiplex qRT-PCR προφίλ των miRNAs

Μια μέθοδος μικροροής που βασίζεται multiplex qRT-PCR χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση miRNAs όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. χρησιμοποιήθηκαν βιβλιοθήκες για αστάρια 672 στελέχους-βρόχου, εμπρόσθια εναύσματα και ανιχνευτές Taqman αντιπροσωπεύει πιο γνωστά ανθρώπινα miRNAs ακολουθίες (ακολουθίες σε https://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols/miRNAqPCRsequences.txt). Κάθε μικρορευστονικής σειρά αξιολόγησε την έκφραση των miRNAs 96 για 96 δείγματα. Ένα σύνολο 7 συστοιχίες διεξήχθησαν στην ανακάλυψη κοόρτη (672 δοκιμασίες miRNA). Μια σειρά έγινε για την ομάδα επικύρωση εστιάζει μόνο σε εκείνα τα miRNAs ανιχνεύθηκε (βλέπε παρακάτω) στην ομάδα ανακάλυψη.

οικόπεδα ενίσχυση και τον κύκλο κατωφλίου (Ct) τιμές, ένα μέτρο του αριθμού των κύκλων PCR για να φτάσει ένα γραμμή κατώτατο όριο που ορίζεται εντός της εκθετικής φάσης της ενίσχυσης, ελήφθησαν από το ιδιόκτητο λογισμικό για το σύστημα BioMark (Fluidigm). Ένα υψηλότερο Ct αντανακλά χαμηλότερη είσοδο των μετρούμενων miRNA. Οι τιμές Ct επιβεβαιώθηκαν μέσω της ανάλυσης της ποιότητας των γραφικών παραστάσεων ενίσχυσης. MiRNAs με υψηλή τιμή Ct (Ct & gt? 30) & gt? 70% των δειγμάτων κρίθηκαν απαρατήρητα και εξαιρούνται από την ανάλυση. Η κανονικοποίηση διεξήχθη με τη διάμεση τιμή Ct όλων ανιχνεύεται miRNAs εντός μιας συστοιχίας για κάθε ασθενή ξεχωριστά, με αποτέλεσμα μια τιμή ΔCt (Πίνακες S1-2). Η κανονικοποίηση πραγματοποιήθηκε με το λογαριασμό για τη συστηματική μεταβολές στα επίπεδα έκφρασης miRNA απέναντι πρόσωπα και συστοιχίες, έτσι ώστε βιολογικές διαφορές μπορεί να είναι πιο εύκολα διακρίνονται [21]. Ωστόσο, η ανάλυση των δεδομένων un-κανονικοποιούνται, ελέγχονται για την ποσότητα του ορού εισροών οδήγησε σε ανάλογες διαπιστώσεις. Η ταυτότητα των δειγμάτων ήταν καλυμμένη μέχρι να ληφθούν οι τιμές ΔCt.

Στατιστική Ανάλυση

Οι αρχικές αναλύσεις σε σύγκριση κατανομές των κανονικοποιημένων τιμών ΔCt από miRNAs μεταξύ των περιπτώσεων και των ελέγχων στο δείγμα ανακάλυψη με τη χρήση γραφικών περιλήψεις και τα Wilcoxon τεστ rank-sum για την αξιολόγηση σημασία. Μοντέλα λογιστικής παλινδρόμησης στη συνέχεια τοποθετούνται σε υποψήφιες miRNAs μεμονωμένα, προσαρμογή για την ηλικία, το PSA, το στάδιο, και βαθμός συμμετοχής βιοψίας συμπεριλαμβανομένων τοις εκατό πυρήνες των όγκων θετικά και το ποσοστό του συνολικού μήκους των πυρήνων που εμπλέκονται. Υποψήφιος miRNAs συμπεριλήφθηκαν σε μοντέλα τόσο ως συνεχή μέτρα, και ως δυαδικά κατηγορικές μεταβλητές. Τιμές αποκοπής για το τελευταίο προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ξεχωριστά μοντέλα δέντρο ταξινόμησης ή η διάμεση τιμή για κάθε miRNA. Και οι δύο cut-offs έδωσε παρόμοια αποτελέσματα.

απόδοσης Πρόβλεψη των μοντέλων διακρίθηκε με τη χρήση λειτουργικού χαρακτηριστικού δέκτη περιοχής (ROC) κάτω από την καμπύλη (AUC). Μια ξεχωριστή ανάλυση βασίζεται σε ένα μοντέλο κατάταξης τυχαία δάσος [22] πραγματοποιήθηκε επίσης συμπεριλαμβανομένων όλων των ανιχνεύσιμο miRNAs καθώς και η ηλικία, το PSA, το στάδιο, και βαθμός συμμετοχής βιοψίας ως προγνωστικοί παράγοντες. Τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης χρησιμοποιήθηκαν για να παρέχει μια ανεξάρτητη αξιολόγηση της μεταβλητής σημασίας, καθώς και για την επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων από τα απλούστερα μοντέλα λογιστικής

Για την ομάδα επικύρωσης, μόνο εκείνα τα miRNAs που ανιχνεύθηκαν σε & gt?. 30% μετρήθηκαν τα δείγματα στην κοόρτη ανακάλυψη. Ομαλοποίηση σε όλα ανιχνεύονται miRNAs τρέξει σε μια ενιαία συστοιχία άλλαξε το εύρος ofΔCt τιμές για ένα συγκεκριμένο miRNA, συχνά βελτιώνοντας διαφορές μεταξύ ασθενών και μαρτύρων. Αναλυτική προσεγγίσεις που περιγράφονται παραπάνω για την ανακάλυψη ομοίως εφαρμόζεται στην κοόρτη επικύρωσης. Τελική ανάλυση επικεντρώθηκε στην miRNAs ανιχνεύεται ως σημαντικοί προγνωστικοί στην ομάδα ανακάλυψη που επίσης ήταν σημαντική στο σύνολο επικύρωσης. Μόνο δεικτών με αναπροσαρμοσμένη

θεωρήθηκαν σ

-τιμές (που βασίζονται σε ψευδείς μεθόδους ρυθμό ανακάλυψης) το πολύ 0,1 σε αναλύσεις ανακάλυψη. Αυτά πρότυπο μεμονωμένα και από κοινού σε μοντέλα λογιστικής παλινδρόμησης και τον έλεγχο για τα ίδια χαρακτηριστικά θεωρείται σε αναλύσεις για την ομάδα ανακάλυψη. Επιπλέον, διερευνήθηκε η χρήση επιλεγμένων miRNAs να συμπληρώσει το καλά επικυρωμένη CAPRA σκοράρει [23] ως δείκτης του κινδύνου εκδήλωσης ασθένειας, όπως περιγράφεται με περισσότερες λεπτομέρειες στα αποτελέσματα.

Επιπλέον περιγραφικές αναλύσεις διεξήχθησαν σε σύγκριση επιλεγμένο ασθενή χαρακτηριστικών μεταξύ των κλάσεων ανακάλυψη και την επικύρωση. Επίσημη δοκιμή βασίστηκε στην ακριβή δοκιμή του Fisher (για κατηγορικά χαρακτηριστικά) και τη δοκιμή rank-sum Wilcoxon (ποσοτικά χαρακτηριστικά).

Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση R (έκδοση 3.02) και Stata (version 13.1).

In-situ υβριδοποιήσεις

Διαφάνειες με τα τμήματα (5 μm) των δειγμάτων όγκων FFPE από την ομάδα των ασθενών αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο και ενυδατωμένο μέσω της μείωσης των συγκεντρώσεων αιθανόλης σε PBS. Οι πλάκες στη συνέχεια κατεργάζεται με 300 μΐ πρωτεϊνάσης-Κ (15 μg /ml σε ρυθμιστικό PK, 5 mM Tris-HCl ρΗ 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM NaCl) στους 37 ° C σε ένα hybridizer (Dako) για 10 λεπτά . Μετά από δύο πλύσεις με PBS, οι τομές αφυδατώθηκαν μέσω αυξανόμενες συγκεντρώσεις αιθανόλης και ξηραίνεται στον αέρα για 15 λεπτά. Διπλό DIG-επισημασμένο κλειδωμένο νουκλεϊκό οξύ (LNA) ανιχνευτές (Exiqon) για μεμονωμένες miRNAs μετουσιώθηκαν με θέρμανση στους 90 ° C επί 4 λεπτά και στη συνέχεια αραιώνεται στα 40 nm με τη χρήση σε ρυθμιστικό διάλυμα υβριδοποίησης situ (Enzo Life Sciences). Οι τομές υβριδοποιήθηκαν με 50 μΙ αραιωμένου ανιχνευτή σε 54 ° C όλη τη νύκτα, στη συνέχεια πλένονται σε μειούμενες συγκεντρώσεις SSC σε θερμοκρασία υβριδισμού. Μετά από επώαση 5 λεπτών σε 0.2 χ SSC σε θερμοκρασία δωματίου, οι πλάκες πλύθηκαν σε PBS και αποκλείστηκαν με 2% διάλυμα φραγμού (Roche) για 15 λεπτά. Οι τομές στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με αλκαλική φωσφατάση (ΑΡ), συζευγμένης αντι-DIG (Roche) αραιωμένο 1:800 σε διάλυμα αποκλεισμού που περιέχει 2% ορού προβάτου για 60 λεπτά. Μετά από δύο πλύσεις σε ρυθμιστικό ΑΡ (100 mM Tris ρΗ 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween-20, 2 mM Λεβαμισόλη), οι τομές επωάστηκαν σε ΒΜ Purple AP υποστρώματος (Roche) στο σκοτάδι στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Οι πλάκες στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές σε PBS που περιέχει 0.1% Tween-20 και πλύθηκαν δύο φορές σε νερό. Μετά από μια δεύτερη θεραπεία 30 με Πυρηνικών Fast Red (Vector), τα πλακίδια αφυδατώνονται και αν αυξανόμενες συγκεντρώσεις αιθανόλης, στη συνέχεια συναρμολογείται. Τα χρωματισμένα πλακίδια αξιολογήθηκαν και βαθμολογήθηκαν τυφλά.

Αποτελέσματα

miRNA προφίλ στο Discovery Cohort

Εμείς ως στόχο να προσδιορίσει αν miRNAs από δείγματα προ-χειρουργική ορό θα μπορούσε να προβλέψει μετεγχειρητικών παθολογική αναβάθμιση. Τα κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών στην ανακάλυψη ομάδα μας συνοψίζονται στον Πίνακα 1. υπόθεση (μετεγχειρητική Gleason 7) και ελέγχου (μετεγχειρητική Gleason 6) ομάδες είχαν παρόμοιες κατανομές της φυλής και κλινικά χαρακτηριστικά. Περιπτώσεις ήταν σημαντικά μεγαλύτερα από τους ελέγχους (

σ

= 0,005). επίπεδα PSA ήταν ελαφρώς υψηλότερο στις περιπτώσεις (

σ

= 0,07). Από τους 672 miRNAs ελέγχθηκαν, 36 είχαν Ct & lt? 30 σε τουλάχιστον 30% των ασθενών, το οποίο καθιερώθηκε ως αποκοπής ανίχνευσης (Πίνακας 2). Πολλοί miRNAs υπάρχουν ως συστάδες, όπου δύο ή περισσότερα miRNAs παράγονται από ένα απλό αντίγραφο. Εννέα από τα 36 miRNAs είναι μέλη ενός ενιαίου συμπλέγματος, το σύμπλεγμα miR17-92. MiRNAs είναι επίσης ομαδοποιούνται σε οικογένειες με βάση μια κοινή αλληλουχία στο 5 ‘άκρο τους, που ονομάζεται την ακολουθία των σπόρων, η οποία καθορίζει σε μεγάλο βαθμό προς τα κάτω τους στόχους [24]. miR-17, miR-20a, miR-92a, και miR-106a, για παράδειγμα, είναι όλα μέρος μιας οικογένειας. Ως εκ τούτου, σε όλους αυτούς τους ασθενείς του προστάτη, υπήρξε μια εμφανής εμπλουτισμού για συγκεκριμένες συστάδες και τις οικογένειες των miRNAs.

Η

επόμενο συνέκριναν τα επίπεδα ορού της 36 ανιχνεύεται miRNAs μεταξύ της υπόθεσης και των ομάδων ελέγχου της κλάσης ανακάλυψη. Τέσσερα από τα ανιχνεύεται miRNAs κατέδειξε διαφορές στα επίπεδα ορού μεταξύ των περιπτώσεων και των ελέγχων. MiR-19α και miR-19b εμφανίζονται χαμηλότερες τιμές ΔCt στην ομάδα περίπτωση σε σύγκριση με τους μάρτυρες (Εικόνα 2α,

σ

= 0,06 και

σ

= 0,07, αντίστοιχα), σύμφωνα με τα υψηλότερα επίπεδα στον ορό περιπτώσεις. Αντίθετα, miR-345 και miR-519c-5P είχαν σημαντικά υψηλότερες τιμές ΔCt στην ομάδα περίπτωση σε σύγκριση με τους μάρτυρες (Εικόνα 2α,

σ

= 0,04 και

σ

= 0.02 αντίστοιχα) , συνεπής με χαμηλότερα επίπεδα ορού στην ομάδα υπόθεση. Λογιστικής παλινδρόμησης για την πρόβλεψη της κατάστασης υπόθεση /έλεγχος βασίζεται σε ενιαίο miRNAs εκπροσωπήθηκαν ως δυαδικό δείκτες (με τιμές αποκοπής επιλέγεται με τα δέντρα ταξινόμησης) παρουσίασε τα τέσσερα miRNAs ως ιδιαίτερα σημαντική πρόβλεψης της κατάστασης αποτελεσμάτων (λόγος πιθανοτήτων), ακόμη και κατά τον έλεγχο για την ηλικία, το PSA , κλινικό στάδιο, και βαθμός συμμετοχής βιοψία (Πίνακας 3). Τα αποτελέσματα δεν ήταν ευαίσθητα προς το εάν miRNAs συμπεριλήφθηκαν σε μοντέλα πρόβλεψης ως συνεχείς μεταβλητές ή ως δυαδικά δείκτες που βασίζονται στις διάμεσος ανιχνεύσιμα επίπεδα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μια μη παραμετρική τυχαία δάσος ταξινομητή συμπεριλαμβανομένων όλων των ανιχνεύσιμη miRNAs (απεικονίζεται ως συνεχής μέτρα) καθώς και η ηλικία, το PSA, το στάδιο, και η συμμετοχή της βιοψίας κατατάσσονται στις ακόλουθες μεταβλητές πρόβλεψης, όπως τα έξι πιο σημαντικά (κατά φθίνουσα σειρά): ηλικία, miR-519c-5P , miR_19b, miR-345, PSA και miR_19a (Σχήμα 3). Κανένα από τα άλλα μετρημένη miRNAs συσχετίστηκαν σε σημαντικό βαθμό με την κατάσταση αποτέλεσμα.

Δέλτα Ct αντιπροσωπεύει τη διαφορά μεταξύ της Ct των επιμέρους miRNA και η διάμεση τιμή Ct μεταξύ ανιχνεύεται miRNAs σε κάθε ασθενή. Οριζόντιες γραμμές αντιπροσωπεύουν μέση τιμή +/- SEM.

Η

περιλαμβάνονται μεταβλητές που παρατίθενται στον κάθετο άξονα, με αντίστοιχη μεταβλητή σημασίας για κάθε στον οριζόντιο άξονα, σημασία προσδιορίζεται με τη χρήση «υπό όρους ακρίβεια μετάθεση», υπολογίζεται ως α η μέση διαφορά στην ακρίβεια μοντέλο μεταξύ του εντοιχισμένη μοντέλο και εναλλακτικές εκδόσεις λαμβάνονται μέσω τυχαίων συνδυασμών των μεταβλητών τιμών. Οι μεταβλητές που θεωρήθηκαν σημαντικοί προγνωστικοί στην τυχαία δάσος, αν μεταβλητή τιμή η σημασία τους είναι πάνω από την απόλυτη τιμή της μεταβλητής χαμηλότερο αρνητικής βαθμολόγησης [43].

Η

Εκκαθάριση των miRNA υπογραφής σε ανεξάρτητη ομάδα

για να επιβεβαιώσετε τις ενώσεις miRNA μας, πραγματοποιήσαμε μια μελέτη επικύρωσης εστιάζει μόνο σε εκείνα τα miRNAs που ήταν μέτρο σε τουλάχιστον 30% των δειγμάτων ορού ασθενών (Πίνακας 2). Τα χαρακτηριστικά των ασθενών για την κοόρτη επικύρωση συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Παρόμοια με την ομάδα ανακάλυψη, δεν υπήρχαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στη φυλή, ή κλινικό στάδιο μεταξύ των περιπτώσεων και ελέγχων, ενώ οι διαφορές στην ηλικία και PSA ήταν σημαντικές (

ρ

= 0,002 και 0,04 αντίστοιχα). Όπως φαίνεται στην ομάδα ανακάλυψη, miR-19b και miR-19a έδειξαν σημαντικά χαμηλότερες τιμές ΔCt στην ομάδα περίπτωση σε σύγκριση με τους μάρτυρες (Σχήμα 2β). Πράγματι, οι διαφορές ήταν ακόμα πιο εντυπωσιακή στην ομάδα επικύρωσης (

σ

& lt? 0.001 και για τα δύο), πιθανόν να οφείλεται σε εξομάλυνση, με βάση όλες τις ανιχνεύονται miRNAs σε μια απλή συστοιχία (έναντι εξάπλωση σε πολλές συστοιχίες στην ανακάλυψη ομάδα) . Σε αντίθεση με miR-19b και miR-19a, οι διαφορές στις τιμές ΔCt για το miR-345 και miR-519c-5P μεταξύ των περιπτώσεων και οι έλεγχοι δεν ήταν στατιστικά σημαντική (Σχήμα 2β,

σ

= 0.333 και

σ

= 0,154, αντίστοιχα). Ωστόσο, σε μοντέλα προσαρμογή για την ηλικία και την PSA, miR-345 και miR-519c-5P παρέμεινε σημαντική όταν περιλαμβάνονται ως δυαδικά προγνωστικοί παράγοντες (βλέπε παρακάτω). Τα αποτελέσματα για τις αναλύσεις, συμπεριλαμβανομένων miR-519c-5P βασίστηκαν σε 55 ασθενείς (24 περιπτώσεις και 31 ελέγχους), λόγω ελλιπών τιμών για τη μεταβλητή αυτή προκύπτει από απέτυχαν οι αντιδράσεις PCR σε 5 ασθενείς.

προγνωστική αξία της τρεις-miRNA υπογραφή

για να αξιολογηθεί η ικανότητα των επιβεβαιωθεί miRNAs να διακρίνει τους ασθενείς με δυσμενείς παθολογία στο σύνολο επικύρωσης, ήταν καταχωρημένα στα λογιστικά μοντέλα παλινδρόμησης επίσης την προσαρμογή για την ηλικία, το στάδιο, PSA, και η έκταση της συμμετοχής βιοψία. Όταν εξετάζονται μεμονωμένα, και οι τέσσερις miRNAs έδειξαν ισχυρές ενώσεις με την ιδιότητα περίπτωση, με απόδοση αναλογίες 9.22, 12.67, 0.03 και 0.06 (

σ

τιμές & lt? 0,01) (Πίνακας 3), αν και λόγω του σχετικά μικρού δείγματος μέγεθος, διαστήματα εμπιστοσύνης για τις εκτιμώμενες αναλογίες πιθανοτήτων έδειξε χαμηλή ακρίβεια. Αυτά τα miRNAs ξεχωριστά επίσης έδειξαν βελτιωμένη διακριτική ικανότητα με AUCs 0,85, 0,86, 0,84 και 0,83 σε σχέση με την AUC του 0,77 για ένα μοντέλο περιλαμβάνει μόνο την ηλικία, το PSA, το στάδιο, και η συμμετοχή βιοψία (Πίνακας 3). Αυτές οι βελτιώσεις δεν επιτευχθεί σημαντικότητα σε επίπεδο 5% (αν και τα αποτελέσματα για το miR-19b και miR-345 ήταν σημαντικές στο επίπεδο του 10%). Στη συνέχεια αξιολογήθηκαν τα μοντέλα χρησιμοποιώντας διαφορετικούς συνδυασμούς των miRNAs (Πίνακας 4). Αξιοσημείωτα, miR-19a και miR-19b φάνηκε να είναι συν-εξαρτώμενη, συνάδει με το γεγονός ότι εκφράζονται από μία κοινή μεταγραφή, miR-17-92. Μοντέλα που αποτελείται από ένα συνδυασμό είτε miR-19a ή miR-19b μαζί με το miR-345 και miR-519c-5P έδειξαν AUC του 0,94, φθάνοντας υψηλής σημαντικότητας (

σ

= 0,02 και 0,017 αντίστοιχα) (Πίνακας 4 και Σχήμα 4α).

Α) ROC καμπύλες για την ηλικία, το PSA, και το στάδιο συν /πλην μεμονωμένων miRNAs ή συνδυασμό και των 3 miRNAs. Β) Ποσοστό των ασθενών είτε με Gleason 6 (ανοιχτό γκρι) ή Gleason 7 (σκούρο γκρι) μετά τη χειρουργική επέμβαση σε σχέση με την προ-χειρουργική επέμβαση CAPRA βαθμολογίας. Γ) Ίδιο με το Β, αλλά με την προσθήκη των miRNAs. Η τιμή 1 δίνεται για κάθε θετικό miRNA και προστίθενται στο σκορ CAPRA. CAPRA νομογράφημα συνδυάζει τις ακόλουθες μεταβλητές: ηλικία κατά τη διάγνωση, PSA κατά τη διάγνωση, σκορ Gleason της προ-χειρουργική βιοψία, κλινικό στάδιο, και το ποσοστό των εμπλεκόμενων βιοψίες

Η

Για να προσδιορίσει μια βαθμολόγησης. μηχανισμού πρόσβαση σε γιατρούς και τους ασθενείς τους, αξιολογήσαμε τη χρησιμότητα της προσθήκης τιμές των miRNAs σε ένα καθιερωμένο μοντέλο κινδύνου, η CAPRA σκοράρει [23]. Συγκεκριμένα, ομάδα μας είχε χαμηλό σκορ CAPRA (που κυμαίνονται από 0-2 από τα 10), όπως αναμένεται για AS-επιλέξιμες ασθενείς. Με την προσθήκη το ένα σημείο στο σκορ για κάθε ένα από τα τρία miRNAs (MIR-19α ή 19b, miR-345, και miR-519c-5P), που παρατηρήθηκε να υπερβαίνει την δυαδική τιμή αποκοπής, οι ασθενείς θα μπορούσαν να διαχωριστούν σε εκείνες που ενδέχεται να έχουν Gleason 7-και ως εκ τούτου ενδιάμεσου κινδύνου της νόσου σε σχέση με εκείνους που δεν το έκανε (σχήματα 4β-c). Η γραμμική τάση ήταν ιδιαίτερα σημαντική (

σ

& lt? 0.001). Πράγματι, το 100% των ασθενών με σκορ 4 ή 5 είχαν Gleason 7 νόσου μετεγχειρητικά έναντι 7 από 24 ασθενείς με σκορ 1 ή 2.

Καταγωγή των miRNAs ορού

οι ακάλυπτες miRNAs ορού μπορεί να προκύψουν άμεσα από τον όγκο ή από την αντίδραση του οργανισμού στον όγκο. Προκειμένου να καθοριστεί αν οι πρόβλεψης miRNAs είναι παρούσες σε όγκους του προστάτη, πραγματοποιήσαμε in situ υβριδισμούς με ανιχνευτές για miR-19b σε δείγματα όγκων FFPE από ασθενείς στην ομάδα μας (

n

= 10). Εστιάσαμε στην miR-19b, δεδομένου ότι έφθασε σημασία τόσο την ανακάλυψη και την επικύρωση συνόλων. Σημειώστε ότι ο ανιχνευτής miR-19b είναι απίθανο να γίνει διάκριση μεταξύ miR-19a και miR-19b, λόγω της εξαιρετικά όμοιες αλληλουχίες τους. Η χρώση για miR-19b ήταν ισχυρή σε περιοχές του ΡΙΝ υψηλής ποιότητας, Gleason πρότυπο 3, και Gleason μοτίβο 4, αλλά απουσιάζει σε φυσιολογικά εμφανίζονται επιθήλιο (Εικόνα 5). Ωστόσο, δεν υπήρχε εμφανής διαφορά στην ένταση της χρώσης με αυξανόμενη βαθμό από το ΡΙΝ να Gleason προτύπου 4. Ως εκ τούτου, ενώ miR-19 κυτταρικά επίπεδα σαφώς αυξημένη με μετασχηματισμό, δεν ήταν σαφές αν υπήρχε οποιαδήποτε περαιτέρω αύξηση εντός των κυττάρων με παθολογικά εξέλιξη.

Εικόνες δείχνουν in situ χρώση υβριδισμού για miR-19b (αριστερά και πάνελ κέντρο) και αρνητικό μάρτυρα, miR-295 (δεξιά πάνελ). Κορυφαία πάνελ δείχνουν περιοχή του προστάτη ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (ΡΙΝ). Μέση πάνελ δείχνουν περιοχή του Gleason 3. Κάτω πάνελ δείχνουν περιοχή του Gleason 4. Τομείς PIN, Gleason 3, και Gleason 4 όλα χρωματίζονται έντονα για ανιχνευτή miR-19b (μπλε χρώση). Σημείωση κάθε πίνακας διαθέτει χώρο της κανονικής-εμφανίζονται επιθήλιο, φαίνεται πιο καθαρά στα αριστερά του κάθε κέντρου πίνακα. Οι περιοχές αυτές παρουσιάζουν πολύ χαμηλότερα χρώση. Δεξιά και αριστερά πάνελ, 100 × μεγέθυνση. πάνελ κέντρο, 400 × μεγέθυνση. πάνελ κέντρο αντιπροσωπεύουν εγκλωβιστούμε περιοχές στο αριστερό πάνελ.

Η

Συζήτηση

Όπως μετα-μεταγραφική ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης, miRNAs πράξη τόσο ως ογκογονίδια και καταστολείς όγκων [25], [26]. έχουν ανώμαλη miRNA υπογραφές καταδειχθεί σε δείγματα όγκων του προστάτη και έχουν ανιχνευθεί στον ορό ανδρών με προστάτη [12] – [16], [27], [28]. Έχουμε ήδη εντοπιστεί μια υπογραφή miRNA που σχετίζονται με τον κίνδυνο των ασθενών, όπως υπολογίζεται από CAPRA βαθμολογίες, οι οποίες προβλέπουν μεταστάσεις, η θνησιμότητα του προστάτη, και όλα τα αίτια θνησιμότητας [17]. Ωστόσο, καμία από αυτές τις προηγούμενες μελέτες που απευθύνονται είτε miRNAs θα μπορούσε να παράσχει πρόσθετες πληροφορίες πέραν των όσων μπορεί να προβλεφθεί από τις τρέχουσες παραμέτρους, συμπεριλαμβανομένων PSA, απεικόνισης και βιοψία. Εδώ, ανακαλύψαμε και επικυρώνονται τέσσερις miRNAs ορού, miR-19a, miR-19b, miR-345 και miR-519c-5P που σε συνδυασμό και όταν προστίθενται στις τρέχουσες παραμέτρους, βελτίωσε σημαντικά την πρόβλεψη των αρνητικών παθολογίας εντός του προστάτη. Ξεχωριστά, μόνο miR-19a /b έφτασε σημασία τόσο την ανακάλυψη και την επικύρωση συνόλων.

Ένα μοντέλο πρόβλεψης όπως η ηλικία, το PSA, το στάδιο, και η συμμετοχή βιοψία έδειξε μια τιμή AUC του 0,77 για τον εντοπισμό δυσμενών παθολογία στην μετά χειρουργικά δείγματα, η προσθήκη 3 miRNAs (miR-19a ή miR-19b συν miR-345 και miR-519c-5P) έδειξε τιμή AUC του 0,94. Επιπλέον, η συμπερίληψη της υπογραφής miRNA σε ένα που χρησιμοποιούνται σήμερα βαθμολόγηση κινδύνου (Capra) βελτιωμένη πρόβλεψη του μετεγχειρητικού αναβάθμιση υποστηρίζουν την κλινική χρησιμότητα της. Οι βελτιώσεις αυτές είναι η πρώτη επίδειξη στη γνώση μας για την ανεξάρτητη προγνωστική αξία για miRNAs ορού πάνω από το παρόν διαθέσιμο κλινικοπαθολογοανατομικές μέτρα σε μια εξαιρετικά σχετικό σενάριο. Ενώ σχεδόν το 50% των νεοδιαγνωσθέντων ασθενών πληρούν πλέον τα κριτήρια χαμηλού κινδύνου για τα πρωτόκολλα AS, μόνο το 10% αυτών των ασθενών υποβάλλονται AS [29], [30]. Έχοντας επιπλέον δείκτες που μπορούν να διαχωρίσουν περαιτέρω ασθενείς θα είναι κρίσιμης σημασίας για τη βελτίωση αυτών των αριθμών.

δείκτες με βάση ορό είναι πλεονεκτικές ως τέτοιες δοκιμές είναι σχετικώς μη επεμβατική και μπορεί να χρησιμοποιηθεί εύκολα για την παρακολούθηση ασθενών. Δείκτες που λαμβάνεται από τον ορό αποφεύγονται προβλήματα σφάλματος δειγματοληψίας βιοψίας, η οποία είναι ένας σημαντικός περιορισμός του προσδιορισμούς με βάση το χαρτί [31], [32]. Η προέλευση των miRNAs σε ανθρώπινο ορό παραμένουν σε μεγάλο βαθμό ασαφής. In situ υβριδισμού σε δείγματα προστάτη από ασθενείς στην ομάδα μας έδειξε την παρουσία του miR-19b σε όλους τους τομείς της μεταμορφωθεί επιθηλίου από το PIN υψηλής ποιότητας με Gleason 4 μοτίβο. Σε αντίθεση λίγο έως καθόλου χρώση παρατηρήθηκε στο στρώμα ή κανονικό εμφανίζονται επιθήλιο. Η παρουσία του miR-19b εντός του ιστού του όγκου χαμηλού βαθμού, αλλά μειωμένα επίπεδα σε αντίστοιχες ορού εγείρει το ερώτημα της πηγής miRNA στον ορό των ασθενών με όγκους ανώτερης ποιότητας. Μία συναρπαστική πιθανότητα είναι ότι η miR-19b εκκρίνεται μόνο κατόπιν εξέλιξη, ακόμη και αν αυτό εκφράζεται μέσα στα μετασχηματισμένα κύτταρα νωρίς στην ανάπτυξη του όγκου. Εναλλακτικά, τα κύτταρα μπορεί να χρειαστεί να παραβιάσει δομικά στοιχεία μέσα στον ιστό για miR-19b για να φτάσετε στο αίμα. Τέλος, τα miRNAs μπορεί να προκύψει από την αντίδραση του οργανισμού προς τον όγκο (π.χ. η ανοσολογική απόκριση). Εν ολίγοις, οι κυτταρικές προέλευση για τις αλλαγές στα επίπεδα miRNA στον ορό με παθολογική εξέλιξη μένει να καθοριστεί.

miR-19 είναι ένα μέρος της ομάδας των miRNAs σε επεξεργασία από ένα απλό αντίγραφο, miR-17-92 σύμπλεγμα [9]. Αυτή η ομάδα αποδίδει έξι ώριμη miRNAs (miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, miR-19b, miR-92) και βρίσκεται σε 13q31.3, μια περιοχή ενισχύθηκαν σε πολλαπλές αιμοποιητικών και συμπαγών όγκων του όγκου [ ,,,0],33] – [35]. Σε ένα μοντέλο λεμφώματος Β-κυττάρου, υπερ-έκφραση του

miR-17-92

με

c-myc

προάγει τον σχηματισμό όγκων, αποδεικνύοντας την ογκογόνο δραστικότητα του συμπλέγματος [35]. miR-19 φαίνεται να είναι ένα ουσιαστικό συστατικό της ογκογόνος

miR-17-92

στοχεύοντας το ογκοκατασταλτικό,

ΡΤΕΝ

, με αποτέλεσμα ενεργοποίηση του μονοπατιού Akt-mTOR [36], [ ,,,0],37]. Δεδομένης της καλά τεκμηριωμένη ρόλο του

ΡΤΕΝ

στον καρκίνο του προστάτη και ότι μεταβολή βρίσκεται στο 30-70% των ασθενών κατά το χρόνο της διάγνωσης, φαίνεται πολύ πιθανό ότι η αύξηση του miR-19a & amp? miR-19b φαίνεται στον ιστό συνδέεται λειτουργικά με την ανάπτυξη του όγκου [38] – [40]

Άλλα miRNAs ορού που διαφέρουν από αυτές που αποκαλύφθηκαν εδώ έχουν βρεθεί να είναι αυξημένα σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη.. Ένα ιδιαίτερα συναρπαστικό παράδειγμα είναι Mir-141, το οποίο έχει αποδειχθεί ότι είναι αυξημένα σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη με προχωρημένη νόσο, όπως σε άτομα με λεμφαδένα ή μετάσταση στα οστά [15], [27], [28]. Στη μελέτη μας, miR-141 δεν ανιχνεύτηκε σε ασθενείς που πληρούν τα κριτήρια χαμηλού κινδύνου για AS. Ως εκ τούτου, αν και miR-141 μπορεί να είναι ένας πιθανός δείκτης για ασθενείς με πιο προηγμένες προστάτη, είναι απίθανο να έχει αξία για τους υποψηφίους των AS αποφασίσει εάν πρόκειται να υποβληθούν σε ριζική θεραπεία. Εκτός από την κατάσταση της νόσου, αντικρουόμενα αποτελέσματα μεταξύ των μελετών μπορεί επίσης να οφείλεται σε διαφορές μεταξύ των μεθόδων του προφίλ των miRNAs ορού. Ατομική πρωτόκολλα qRT-PCR-based και αναλύσεις μικροσυστοιχιών μπορεί να δώσει διαφορετικές υπογραφές miRNA. Παρά το γεγονός ότι σήμερα δεν υπάρχει χρυσός κανόνας για την ανίχνευση των miRNAs ορού, έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι multiplex μέθοδος qRT-PCR μας είναι ακριβής από τη μέτρηση των επιπέδων των miRNAs σε συστήματα νοκ-άουτ έλλειψη κανονική ή και τα δύο κανονικών και μη κανονικών miRNAs [17].

σε αυτή τη μελέτη, οι δυσμενείς παθολογία ορίστηκε ως αποτέλεσμα Gleason 7 για τη μετα-χειρουργικό δείγμα. Ένα σκορ Gleason 7 συνδέεται με αυξημένο κίνδυνο θνησιμότητας συγκεκριμένες ασθένειες και παραμένει η καλύτερη ενιαία προγνωστικός δείκτης για τη συμπεριφορά της νόσου [20]. Ωστόσο, ένα σκορ Gleason 7 δεν αποτελεί εγγύηση για το μέλλον κλινικής εξέλιξης. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι ακόμη και ασθενείς ενδιάμεσου κινδύνου με σκορ Gleason 7 επιδεικνύουν εξαιρετική επιβίωσης στην AS με κοντό στο ενδιάμεσο παρακολούθησης [41]. Καθώς όλο και περισσότεροι ασθενείς να εγγραφούν στο AS και τα δεδομένα από συνεχιζόμενες μελέτες ωριμάζουν, οι μελέτες θα πρέπει να διεξαχθούν για να διαπιστωθεί αν οι miRNAs προβλέψουμε το μέλλον μετάσταση ή θνησιμότητα συγκεκριμένες ασθένειες. Επιπλέον, θα χρειαστεί προοπτικές μελέτες για να διαπιστωθεί εάν είναι πολύτιμα εργαλεία για την παρακολούθηση ασθενών, ενώ υποβάλλονται AS.

Εν κατακλείδι, η μελέτη αυτή εντοπίζει miRNA υπογραφή του ορού που μπορεί να ενεργεί ως ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης στην ΣΕΣΣ. Επιπλέον, δείχνει πώς ορού miRNAs μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ταυτοποίηση σχετικώς μικρά βήματα στην πρόοδο του όγκου επιτρέπει την αύξηση της κλινικής βελτίωσης της κατάστασης της νόσου. Μελλοντικές μελέτες θα απαιτηθούν για την επικύρωση αυτών των δεικτών σε μια μεγάλη ομάδα από όλα τα ιδρύματα, καθώς και να συνδέσει με μακροπρόθεσμα αποτελέσματα, ιδιαίτερα τη νοσηρότητα και τη θνησιμότητα των ασθενών.