Αφηρημένο

Η φλεγμονή παίζει άμεσο ρόλο στην καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) εξέλιξη? Ωστόσο οι μοριακοί μηχανισμοί που είναι υπεύθυνοι για αυτή την επίδραση είναι ασαφείς. Η φλεγμονή που προκαλείται από κυκλοοξυγενάση 2 (COX-2) του ενζύμου που απαιτείται για την παραγωγή της προσταγλανδίνης Ε2 (PGE

2), μπορεί να προωθήσει ορθοκολικού καρκίνου με τη μείωση της έκφρασης του γονιδίου καταστολής του όγκου προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος 4 (PDCD4). Όπως PDCD4 είναι επίσης ένας άμεσος στόχος του ογκογονιδίου microRNA-21 (MIR-21) ερευνήσαμε τη σχέση μεταξύ του COX-2 και miR-21 περιόδων του παχέος εξέλιξης του καρκίνου. Gene προφίλ έκφρασης στον όγκο και αντιστοιχισμένο φυσιολογικό βλεννογόνο από 45 ασθενείς CRC έδειξε ότι πάνω ρύθμιση του COX-2 και miR-21 σε καρκινικά ιστό συσχετίζεται με το στάδιο χειρότερα Dukes ‘. In vitro μελέτες σε κολικό κύτταρα αδενοκαρκινώματος έδειξε ότι η θεραπεία με το εκλεκτικό αναστολέα της COX-2 NS398 μειώθηκε σημαντικά miR-21 επίπεδα (p = 0,0067) και αυξημένα επίπεδα πρωτεΐνης PDCD4 (ρ & lt? 0.001), ενώ η θεραπεία με PGE

2 ανάντη ρυθμίζεται miR-21 έκφραση (p = 0.019) και ρυθμισμένα προς τα κάτω πρωτεΐνη PDCD4 (ρ & lt? 0,05). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι miR-21 είναι ένα συστατικό του μονοπατιού φλεγμονής COX-2 και ότι αυτή η οδός προωθεί επιδείνωση του σταδίου της νόσου σε καρκίνο του παχέος εντέρου με επαγωγή συσσώρευσης PGE

2 και αυξάνοντας την έκφραση του miR-21 με επακόλουθη ρύθμιση προς τα κάτω της ογκοκατασταλτικό γονίδιο PDCD4

Παράθεση:. Peacock O, Lee AC, Cameron F, Tarbox R, Vafadar-Isfahani Ν, Tufarelli C, et al. (2014) Φλεγμονή και MiR-21 Pathways Λειτουργικά Αλληλεπίδρασης για να ρυθμίζουν προς τα κάτω PDCD4 στον Καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 9 (10): e110267. doi: 10.1371 /journal.pone.0110267

Επιμέλεια: Kalpana Ghoshal, το Ohio State University, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 15 Ιουλ, 2014? Αποδεκτές: 10, Σεπτεμβρίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 13 Οκτωβρίου 2014

Copyright: © 2014 Peacock et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού και δικαιολογητικά στοιχεία της

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίζεται από μια δωρεά από το ντέρμπι του παχέος Ταμείου Καρκίνου. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι η τρίτη πιο κοινή αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους παγκοσμίως [1]. Περίπου το ήμισυ του συνόλου των ασθενών που έχουν διαγνωστεί με καρκίνο του παχέος εντέρου, τελικά πεθαίνουν από την κατάσταση [2]. Το ποσοστό πενταετούς επιβίωσης έχει αυξηθεί σε περίπου 50-55%, η οποία οφείλεται κυρίως στην έγκαιρη διάγνωση και την καλύτερη προσαρμογή των θεραπειών [3]. Ο θάνατος από καρκίνο του παχέος εντέρου μπορεί να προληφθεί με την ανίχνευση πρώιμο στάδιο της νόσου, αλλά δυστυχώς συχνά ανιχνεύεται σε προχωρημένο στάδιο όταν πρόγνωση είναι χειρότερη [4]. Η πρόγνωση σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος σχετίζεται με το στάδιο της νόσου κατά τη στιγμή της διάγνωσης.

Η ακριβής «σκανδάλη» για την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου είναι ακόμα άγνωστη. Το 1990, προτάθηκε μια σειρά μορφολογικών σταδίων είναι γνωστή ως η κανονική αλληλουχία βλεννογόνο αδένωμα-αδενοκαρκίνωμα σε ορθοκολικό καρκίνο οφείλονται σε γενετικές αλλοιώσεις [5]. Ωστόσο, πολλοί γενετικά γεγονότα να οδηγήσει στην ανάπτυξη των σποραδικών ορθοκολικό καρκίνο? καμία μεμονωμένη γεγονός συμβαίνει σε όλους τους καρκίνους και ως εκ τούτου κανένα πρότυπο μπορεί να εφαρμοστεί σε κάθε όγκου [6]. Ως εκ τούτου, η κατανόηση συγκεκριμένες γενετικές γεγονότα που συμβαίνουν σε παχέος καρκινογένεση μπορεί να έχει σημαντικές επιπτώσεις για τη διάγνωση, πρόγνωση και ενδεχομένως γονιδιακή θεραπεία στο μέλλον.

Υπήρξε μια πρόσφατη αναζωπύρωση του ενδιαφέροντος στην αιτιώδη συνάφεια μεταξύ της φλεγμονής και του καρκίνου. Επιδημιολογικές μελέτες έχουν δείξει ότι η χρόνια φλεγμονή προδιαθέτει τα άτομα σε διάφορους τύπους καρκίνου [7]. Εκτιμάται ότι το 15% έως 20% όλων των θανάτων καρκίνου παγκοσμίως συνδέονται με χρόνιες μολύνσεις και φλεγμονώδεις αποκρίσεις εντός αυτών των ατόμων [7]. Υπάρχουν στοιχεία από μελέτες σε ζώα και παρατηρήσεις σε ανθρώπους ότι η ημερήσια ασπιρίνη μπορεί να είναι αποτελεσματικό στην πρόληψη αρκετών κοινούς καρκίνους [8], [9]. Αυτό έχει επιβεβαιωθεί πρόσφατα σε μελέτες παρακολούθησης των ασθενών που προσλαμβάνονται αρχικά για τυχαιοποιημένες μελέτες της καθημερινής ασπιρίνης έναντι του ελέγχου για την πρόληψη των αγγειακών επεισοδίων [10] – [12]. Σε αυτές τις μελέτες, η κατανομή στην ασπιρίνη οδήγησε σε μείωση κατά 40% των θανάτων από καρκίνο από 5 ετών και άνω [11] και σε συνεχή μείωση θανάτου από καρκίνο σχετίζονται σε 20 χρόνια παρακολούθησης [10], [12]. Μελέτες παρατήρησης έχουν δείξει επίσης ότι η χρήση ασπιρίνης συνδέεται με μειωμένη μακρινή μετάσταση και υποτροπή σε κοινή αδενοκαρκινώματα [13] – [15]., Γεγονός που υποδηλώνει ότι η φλεγμονή μπορεί να διαδραματίσει ένα ρόλο στην πρόοδο καθώς και στην ανάπτυξη του καρκίνου

Ένας από τους πιθανούς λόγους για τα παρατηρούμενα χημειο προληπτικά αποτελέσματα της ασπιρίνης σε καρκίνο του παχέος εντέρου είναι η ικανότητά της να μειώσει την ανάπτυξη του όγκου με αναστολή της κυκλοοξυγενάσης 2 (COX-2) [16]. Υπάρχουν αυξανόμενα στοιχεία που συνδέουν την προ-φλεγμονώδη ένζυμο COX-2 με την ανάπτυξη και την εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου. COX-2 επάγεται σε κολονικό επιθήλιο σε ενεργή φλεγμονώδη νόσο του εντέρου (IBD) [17] και ανοδική ρύθμιση του αποτελέσματα σε αυξημένα επίπεδα της προσταγλανδίνης (PG), και ιδίως PGE

2 που είναι μεταγενέστερος μεσολαβητής της COX-2 και προωθεί πολλές καρκινογόνες οδών συμπεριλαμβανομένων του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, η αναστολή της απόπτωσης και της αγγειογένεσης [18]. Αυτό συμβάλλει στη χρόνια φλεγμονώδη διαδικασία ενορχήστρωση ένα μικροπεριβάλλον του όγκου-υποστήριξη, την περαιτέρω σύνδεση της φλεγμονής με την καρκινογένεση.

Η μηχανιστική σύνδεση μεταξύ της φλεγμονής και του καρκίνου δεν είναι ακόμη απολύτως σαφής. Αύξηση στοιχεία δείχνουν ότι μικρο-RNAs (miRNAs) εμπλέκονται στη ρύθμιση των φλεγμονωδών διεργασιών και απορρυθμισμένη σε φλεγμονώδεις καταστάσεις [19], συμπεριλαμβανομένης της ελκώδους κολίτιδας [20]. Ως εκ τούτου miRNAs απορύθμιση αντιπροσωπεύει δυνητική μοριακός μηχανισμός για φλεγμονώδη μονοπάτια να μεσολαβήσουν την ανάπτυξη του καρκίνου και την εξέλιξη [21]. Ειδικότερα, τα επίπεδα έκφρασης του miR-21 αυξήθηκαν σε ενεργό φλεγμονή στην ελκώδη κολίτιδα, η οποία μπορεί να σχετίζεται με τον αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης του καρκίνου με την προϋπόθεση αυτή [22]. Up-ρύθμιση του miR-21 έχει επίσης αναφερθεί σε άλλες φλεγμονώδεις καταστάσεις συμπεριλαμβανομένης της αλλεργικής φλεγμονής των αεραγωγών [23], φλεγμονώδεις καταστάσεις του δέρματος [19] και

Helicobacter pylori

συνδέονται γαστρικού καρκίνου [24]. miR-21 έχει αποδειχθεί πρόσφατα ότι είναι μια πραγματική ογκογονίδιο σε προ-Β-κυττάρων λεμφώματος [25] και βρέθηκε να είναι υπερ-εκφράζεται στους περισσότερους τύπους όγκου [26]. miR-21 είναι ένας ισχυρός διεγέρτης του ιστού και των αγγειακών εισβολής σε καρκίνο του παχέος εντέρου και αυτά τα αποτελέσματα φαίνονται εν μέρει μεσολαβείται από την ικανότητά του να εμποδίζει τη μετάφραση ενός από τα γονίδια στόχους miR-21, προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο 4 (PDCD4) [27]. Πιο πρόσφατα, μια μελέτη έδειξε επίσης σημαντική προς τα κάτω ρύθμιση των PDCD4 στην ενεργό IBD σε σχέση με ανενεργό IBD, η οποία επίσης συσχετίζεται με τη ρύθμιση του miR-21 [28], υποστηρίζοντας περαιτέρω τη σχέση μεταξύ της φλεγμονής, miR-21 και καρκινογένεση.

Ο στόχος μας ήταν να διερευνηθεί κατά πόσον υφίσταται μια λειτουργική αλληλεπίδραση μεταξύ της COX-2 (προ-φλεγμονωδών ενζύμων με αυξημένη έκφραση σε CRC) και miR-21 (ογκογόνο miR υπερεκφράζεται σε CRC) μονοπάτια που οδηγούν σε ελάττωση του όγκου καταστολέα PDCD4 σε καρκίνο του παχέος εντέρου που δεν σχετίζεται με τα προηγούμενα χρόνια φλεγμονώδη νόσο.

Υλικά και Μέθοδοι

Ανθρώπινοι ιστοί

Αυτή η μελέτη έλαβαν ηθική έγκριση από την Επιτροπή Δεοντολογίας Derbyshire έρευνας για τη συλλογή των ορθοκολικό καρκινικό ιστό και συμφωνημένα φυσιολογικό βλεννογόνο από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χειρουργική εκτομή για καρκίνο του παχέος εντέρου μεταξύ Αυγούστου και Δεκεμβρίου του 2010 στο Royal Derby Hospital, Derby, UK.

Όλοι οι ασθενείς που διαγνώστηκαν με καρκίνο του παχέος εντέρου συζητήθηκαν στο Royal Derby Hospital παχέος Διεπιστημονική Συνάντηση ομάδας μετά την ακτινολογική σταδιοποίηση, και εκείνων που θεωρούνται κατάλληλα για εκτομή με θεραπευτική πρόθεση ήταν επιλέξιμα για να συμπεριληφθούν. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε και ασθενείς που δεν μπορούν ή δεν επιθυμούν να παράσχουν εν επιγνώσει συναίνεση αποκλείστηκαν από τη μελέτη, όπως ήταν εκείνοι απόσυρση της συγκατάθεσης σε οποιοδήποτε στάδιο.

Cell Culture

Η κυτταρική σειρά HCA-7 λήφθηκε από τον Οργανισμό Culture Collection Προστασίας της Υγείας (HPACC, Porton Down, Ηνωμένο Βασίλειο). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco τροποποιημένο Eagle Media (ϋΜΕΜ) (GIBCO, Paisley, UK) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Fisher Scientific, Loughborough, UK), 2 mM L-γλουταμίνη (Sigma-Aldrich, Poole, UK), πενικιλίνη ( 50 μονάδες /ml) και στρεπτομυκίνη (50 μg /ml) (Sigma-Aldrich). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 75 εκατοστά

3 αεριζόμενες φιάλες (ΠΖΑ Επιστημονική, Framingham, ΜΑ, USA) σε υγροποιημένη εκκολαπτήρια στους 37 ° C με 5% CO

2 (Sanyo, Osaka, Japan).

Κυτταρική Γραμμή Επιμολύνσεις και θεραπείες

τα κύτταρα σπάρθηκαν στα 500.000 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκα 6 φρεατίων και επωάστηκαν στους 37 ° C με 5% CO

2 έως ότου έφθασαν το 70% συρροή.

Για μελέτες miR-21 αναστολή, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με αναστολέα miR-21 (100 ηΜ) ή ένα αρνητικό κωδικοποιημένο ελέγχου (100 nm) (miRIDIAN, Dharmacon Lafayette, CO, USA), χρησιμοποιώντας Dharmafect 2 λιπίδιο αντιδραστηρίου επιμόλυνσης (Dharmacon Lafayette, CO, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

για την αναστολή της COX-2, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μέσο χωρίς ορό που περιέχει το στοιχείο ελέγχου (0,1% DMSO) ή 100 μΜ NS398 (εκλεκτικός αναστολέας COX-2, Cayman Chemical, Μίσιγκαν , USA) για 72 ώρες. Για Prostaglandin Ε

2 (PGE

2) θεραπεία, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν 24 ώρες με μέσο ελεύθερο ορού που περιείχε DMSO μόνο όχημα ή 1 μΜ PGE

2 έτσι ώστε η τελική συγκέντρωση του DMSO σε αμφότερες τις συνθήκες ήταν το ίδιο (0,1%). Για συνδυασμένη miR-21 αναστολή και PGE

2 θεραπεία, PGE

2 προστέθηκε στην καλλιέργεια 48 ώρες μετά την miR-21 διαμόλυνση αναστολέα και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν επί άλλες 24 ώρες.

αναλύσεις RNA

Σύνολο εκχύλιση RNA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο TRI ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Sigma-Aldrich) και ποσοτικά με τη χρήση Nanodrop φασματοφωτόμετρο (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA).

Για το miR -21 μελέτες, ένα σύνολο από 6 ng ολικού RNA χρησιμοποιήθηκε για την αντίστροφη μεταγραφή miR-21 και τον έλεγχο RNU44 σε cDNA ακολουθώντας το πρωτόκολλο TaqMan miRNA (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), χρησιμοποιώντας εκκινητές φουρκέτα κατευθύνεται σε miR-21 και RNU44 ως έλεγχος σε θερμοκυκλοποιητή (GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystems) για 30 λεπτά στους 16 ° C, 30 λεπτά στους 42 ° C, 5 λεπτά στους 85 ° C. Πραγματικού χρόνου ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης διεξήχθη στη συνέχεια χρησιμοποιώντας miRNAs δοκιμασίες ειδικές TaqMan ανιχνευτής (MIR-21, ID 000397? RNU44, ID 001094? Applied Biosystems) σε ένα Chromo4 θερμικό ανακυκλωτή (Bio-Rad Laboratories LTD, Hemel Hempstead, UK). miR-21 επίπεδα έκφρασης κανονικοποιούνται σε RNU44 και υπολογίζεται με βάση την 2

-ΔΔCt μέθοδο [29] χρησιμοποιώντας εμπορικά διαθέσιμα κανονικό RNA του παχέος εντέρου ως βαθμονομητή.

Για

COX-2

και

PDCD4

αναλύσεις, 30ng του ολικού RNA μετατράπηκε σε cDNA με τυχαία εξαμερή χρησιμοποιώντας το cDNA υψηλής χωρητικότητας TaqMan αντίστροφη μεταγραφή πρωτόκολλο (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). PCRs σε πραγματικό χρόνο πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή σε ένα πραγματικό χρόνο Chromo4 ανακυκλωτή (Bio-Rad Laboratories Ltd) χρησιμοποιώντας εμπορικά διαθέσιμα 20x ανιχνεύσεις TaqMan (Applied Biosystems) για

PDCD4

(Hs00377253_m1) και

COX- 2

(PTGS2 – Hs00153133_m1), μαζί με τα γονίδια ελέγχου

GAPDH

(Hs02258991_g1),

PGK1

(Hs00943178_g1) και

HPRT

(Hs01003267_m1). Για τα πειράματα σε κυτταρικές σειρές, ποσοτικοποίηση εκτελέστηκε σύμφωνα με MIQE (Ελάχιστες Πληροφορίες για Δημοσίευση Πειράματα ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR) κατευθυντήριες γραμμές [30] σχετικά με τη μέση γεωμετρική των γονιδίων αναφοράς

GAPDH

,

PGK1

,

HPRT

χρησιμοποιώντας το λογισμικό Genex (MultiD Ανάλυση? Γκέτεμποργκ, Σουηδία). Λόγω περιορισμένου ποσότητες δείγματος, στην έκφραση ανθρώπινους ιστούς προσδιορίστηκε ποσοτικά σε σχέση προς

GAPDH

μόνο του, όπως περιγράφεται παραπάνω για miR-21 αναλύσεις.

Protein αναλύσεις

εκχυλίσεις πρωτεΐνης και ποσοτικοποίηση ήταν πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [31]. Κηλίδωση Western διεξήχθη χρησιμοποιώντας το αντίσωμα αντι-ακτίνης βήτα ελέγχου φόρτωσης (1:1000 αραίωση? Abcam, Cambridge, UK) σε συνδυασμό με αντι-PDCD4 αντίσωμα (αραίωση 1:500? Sigma-Aldrich) ή αντι-COX-2 (1 :1000 αραίωση? Abcam). αντίσωμα IgG αντι-κουνελιού συζευγμένο με αλκαλική φωσφατάση χρησιμοποιήθηκε σαν δεύτερο αντίσωμα (αραίωση 1:30,000? ϋΑΚΟ, Ely, Ηνωμένο Βασίλειο) για την ανίχνευση του πρωτογενούς αντισώματος δέσμευσης. Ανοσοσύμπλοκα οπτικοποιήθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια χρησιμοποιώντας το κιτ ECL (Bio-Rad) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το σύστημα chemidoc χρησιμοποιήθηκε για να συλλάβει τις εικόνες και να Ποσότητα One (Bio-Rad) λογισμικό χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση των εντάσεων ζωνών ».

Elisa Ανάλυση

PGE

2 επίπεδα μετρήθηκαν στο μέσων του HCA-7 επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένα κύτταρα χρησιμοποιώντας το κιτ ανίχνευσης PGE

2 ELISA (Cayman Chemical, Αηη Arbor, Michigan USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι πλάκες διαβάστηκαν με photocytometer πλάκα στα 450 nm (Wallac 1420 Victor? Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA).

Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση GraphPad Prism έκδοση 5.03 ( GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Η δοκιμή Kolmogorov-Smirnov επέδειξε όλα τα δεδομένα του δείγματος του ιστού να είναι μη παραμετρική και όλα τα δεδομένα κυτταρική γραμμή να είναι παραμετρικές. Ως εκ τούτου, τα δεδομένα του ασθενούς εκφράζονται ως διάμεσοι και εύρος, ενώ τα δεδομένα κυτταρική γραμμή εκφράζονται ως μέσος όρος και τυπικό σφάλμα του μέσου όρου. Η Wilcoxon signed-rank test (ζεύγη δεδομένων)? η Mann-Whitney U (ασύζευκτα) και η δοκιμή Kruskall-Wallis χρησιμοποιήθηκαν για τη συγκριτική ανάλυση των δεδομένων του ασθενούς. Το paired t-test (ζεύγη δεδομένων)? ο t-test (unpaired) και η δοκιμή ANOVA χρησιμοποιήθηκαν για τη συγκριτική ανάλυση των δεδομένων κυτταρικής γραμμής.

Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε σε p ≤ 0,05 για τα δεδομένα και τα δύο κυτταρική γραμμή ασθενούς και του.

Αποτελέσματα

Αύξηση του miR-21 σχετίζεται άμεσα με την αύξηση των επιπέδων της COX-2 mRNA σε ασθενείς CRC

Πραγματοποιήσαμε τη μελέτη μας για την πρωτοβάθμια ορθοκολικό καρκινικό ιστό και σε συνδυασμό φυσιολογικό βλεννογόνο συλλέγονται μεταξύ Αυγούστου και Δεκεμβρίου 2010 από τις 45 εκλεκτική ασθενείς με σποραδικές περιπτώσεις της CRC. Μια μελλοντική διατήρηση της βάσης δεδομένων ήταν γεμάτη με δημογραφικά στοιχεία του ασθενούς, εισαγωγική θεραπείες και τα χαρακτηριστικά του όγκου. Η ιστοπαθολογική εξέταση των όγκων που ταξινομούνται σύμφωνα με το εθνικό ελάχιστο σύνολο δεδομένων για καρκίνο του παχέος εντέρου που σχεδιάστηκε από το Royal College of Παθολόγοι, του Ηνωμένου Βασιλείου [32]. Δεν ασθενείς αποκλείστηκαν ή είχαν αποσυρθεί από τη μελέτη και κανένας δεν είχε καλοήθη νόσο. Η μέση ηλικία ήταν 69 (εύρος 51-88) έτη και η πλειονότητα ήταν άνδρες ασθενείς. Τέσσερις ασθενείς με καρκίνο του ορθού οι οποίοι έλαβαν νεο-επικουρική χημειο-ακτινοθεραπεία συμπεριλήφθηκαν επίσης βασίζεται σε προηγούμενες μελέτες που αποδεικνύουν ότι η έκφραση του miR-21 είναι ισοδύναμη μεταξύ ακτινοβολούμενης και μη-ακτινοβολούμενη ιστό [33]. Όλοι οι ασθενείς είχαν πλήρη εκτομή και ιστολογική εξέταση επιβεβαίωσε όλες οι όγκοι ήταν αδενοκαρκινώματα. (Πίνακας S1 και S2 σε S1 File)

Χρησιμοποιώντας με πραγματικού χρόνου RT-PCR μελετήσαμε την έκφραση του

COX-2

και miR-21 σε ιστούς όγκων, σε σύγκριση με την κανονική βλεννογόνο σε ομάδα μας των ασθενών CRC. Σχετική έκφραση του miR-21 ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα στον ιστό CRC σε σύγκριση με την κανονική συμφωνημένα βλεννογόνο (ρ & lt? 0,0001, Wilcoxon συνδυασμένα ζεύγη υπογραφεί δοκιμή rank? Εικ. 1Α). Επιπλέον, τα επίπεδα έκφρασης του miR-21 συσχετίστηκαν με τα συνήθως χρησιμοποιούμενα κλινικά-παθολογικά χαρακτηριστικά για CRC (Πίνακας 1). Υψηλότερη έκφραση του miR-21 σε ιστούς όγκων συσχετίζεται σημαντικά με το στάδιο χειρότερη Dukes »(σ & lt? 0,0001, δοκιμασία Kruskall-Wallis? Εικ. 1Β), λεμφαδένα μετάσταση (p & lt? 0,0001, Mann-Whitney U test? Εικ. 1Γ) , και το βάθος της εισβολής των όγκων (στάδιο ρΤ? ρ & lt? 0,0001, Mann-Whitney U test? Σχ. 1D). Τα ευρήματα αυτά είναι σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές [34], [35], και να επιβεβαιώσετε ότι το miR-21 είναι up-ρυθμίζεται σε CRC με την αύξηση των επιπέδων έκφρασης συσχετίζεται με αυξημένη βαρύτητα της νόσου.

ιστογράμματα Στήλη δείχνουν το μεσαίο και μουστάκια αποδεικνύουν την IQR του miR-21 έκφρασης. Σημειώστε ότι σημαντική αύξηση στην έκφραση miR-21 παρατηρείται σε όγκους, και αυτό αυξάνει περαιτέρω με επιδείνωση στάδιο, συμμετοχή λεμφαδένων και το βάθος της εισβολής. Η στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το signed-rank test Wilcoxon στην Α, τη δοκιμή Kruskall-Wallis στη Β, και το Mann-Whitney U σε C και D.

Η

Σχετική έκφραση

PDCD4

ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα κάτω σε ιστούς CRC σε σύγκριση με συμφωνημένα φυσιολογικό βλεννογόνο (ρ & lt? 0,0001, Wilcoxon συνδυασμένα ζεύγη υπογραφεί δοκιμή rank? Εικ. 2Α). Ωστόσο, δεν υπήρχε συσχέτιση μεταξύ

PDCD4

έκφρασης σε ιστούς όγκων και το στάδιο του Dukes », με την έκφραση στο στάδιο Dukes’A είναι ήδη μειωθεί σημαντικά σε σύγκριση με το φυσιολογικό ιστό και καμία περαιτέρω μείωση δει σε πιο προχωρημένα στάδια ( Σχ. 2Β). Είναι απίθανο ότι η παρατηρούμενη προς τα κάτω ρύθμιση του

PDCD4

στο επίπεδο RNA προκαλείται από miR-21, δεδομένου ότι αυτό το μικρο-RNA δρα για να εμποδίσει τη μετάφραση του mRNA PDCD4 αντί επάγει αποικοδόμηση του ή μεταγραφική καταστολή [27]. Δεδομένου ότι όλοι οι ασθενείς που μελετήθηκαν πραγματοποιείται κακοήθεις όγκους με το στάδιο εκχωρημένο Dukes », τα στοιχεία δείχνουν ότι κατά τη διάρκεια της εξέλιξης της κακοήθειας αυξανόμενες ποσότητες του miR-21 οδηγούν σε αναστολή της μετάφρασης του ήδη μειωμένα επίπεδα του

PDCD4

mRNA. περιορισμούς ηθικής μας εμπόδισε από την ανάλυση των επιπέδων της πρωτεΐνης PDCD4 σε αυτούς τους ασθενείς να επιβεβαιώσουν αυτή την υπόθεση και θα επανεμφανίστηκαν στο

in vitro μελέτες

να αποκτήσουν μηχανιστικές γνώσεις (βλέπε επόμενη ενότητα).

Σε συνδυασμό σχετική έκφραση PDCD4 και COX-2 αναλύθηκε σε πρωτογενή όγκο έναντι συμφωνημένα παρακείμενο φυσιολογικό βλεννογόνο (η = 45? Α και C αντίστοιχα), και στην κανονική (Ν) και του όγκου (Τ) ιστών από Dukes ‘A (n = 9), Β (η = 23) και C (n = 13) τα στάδια (Β και D αντίστοιχα). Το ραβδόγραμμα στήλη δείχνει τη μέση και τα μουστάκια αποδεικνύουν την IQR της έκφρασης του mRNA. Η στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το signed-rank test Wilcoxon στην Α και Γ? η δοκιμή Kruskall-Wallis στη Β και D. Σημειώστε ότι

PDCD4

είναι μειωτικά στον όγκο σε σχέση με την κανονική, αλλά οι διαφορές δει στο υπόλοιπο έκφραση σε όγκους των διαφόρων σταδίων Dukes ». Αντίθετα

COX-2

επίπεδα αυξάνουν σε όγκο και με το στάδιο της νόσου.

Η

Είναι ενδιαφέρον ότι, σχετική έκφραση

COX-2 mRNA

ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε ιστούς όγκου σε σύγκριση με συμφωνημένα φυσιολογικό βλεννογόνο τους (p & lt? 0,0001, Wilcoxon ταιριάζουν ζεύγη υπέγραψε τεστ rank? Σχ. 2C). Επιπλέον, παρόμοια με αυτό που παρατηρήθηκε με miR-21, σε σχέση με την έκφραση του

COX-2

mRNA σε ιστούς όγκων συσχετίστηκε σημαντικά με το στάδιο χειρότερη Dukes »(σ & lt? 0,0001, δοκιμασία Kruskall-Wallis? Σχ. 2D) . Δεδομένου ότι το miR-21 και η φλεγμονή και οι δύο έχουν αποδειχθεί ότι μειώνουν τα επίπεδα της πρωτεΐνης PDCD4 [27], [36], μια πιθανή ερμηνεία των ευρημάτων αυτών είναι η αύξηση στο miR-21 και

COX-2

μπορεί να είναι λειτουργικά σχετίζονται και ότι θα μπορούσαν να οδηγήσουν σε αρνητική ρύθμιση των PDCD4 μέσω μιας κοινής πορείας.

HCA-7 κύτταρα είναι ένα κατάλληλο σύστημα για την ανάλυση της σχέσης μεταξύ miR-21 και COX-2 υπερέκφραση σε CRC

για να διερευνηθεί περαιτέρω το δυναμικό μιας λειτουργικής σχέσης μεταξύ της COX-2 και miR-21 στο κάτω ρύθμιση PDCD4 σε CRC που επανεμφανίστηκαν σε ένα

in vitro

σύστημα κυτταρικής καλλιέργειας. Επιλέξαμε το ανθρώπινο κυτταρική σειρά αδενοκαρκινώματος κόλου HCA-7 απομονώθηκε από καρκινικά Β ενός Dukes ‘[37], επειδή έχει υψηλή ενδογενή επίπεδα της COX-2 [38] και μετά από θεραπεία με τον αναστολέα της COX-2 NS398 αυξάνει την έκφραση του

PDCD4

[39]. Προκειμένου να προσδιοριστεί αν HCA-7 κύτταρα είναι ένα καλό σύστημα για να μελετηθεί η λειτουργική σχέση μεταξύ του miR-21 και COX-2 οδών, πρέπει πρώτα για να καθοριστεί αν miR-21 εκφράζεται και είναι υπεύθυνη για το

PDCD4

ρύθμιση προς τα κάτω σε αυτά τα κύτταρα. Για την επίτευξη αυτών χρησιμοποιήσαμε RT-PCR για τη μελέτη των επιπέδων του miR-21 σε κύτταρα χωρίς θεραπεία HCA-7 ή σε κύτταρα επεξεργασμένα με 100 ηΜ ενός αναστολέα ή σκαρφάλωμα ελέγχου miR-21 με βάση την δημοσιευμένη εργασία που δείχνει ότι η συγκέντρωση αυτή είναι μη-κυτταροτοξικές και αποτελεσματικό στην ανασταλτική μελέτες [40]

Βρήκαμε ότι το miR-21 εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα σε κύτταρα HCA-7 και τα επίπεδα αυτά δεν επηρεάζονται από τη θεραπεία με αγωνίζομαι μικρά RNAs, αλλά μειώθηκαν σημαντικά (p & lt?. 0.0001 , μη ζευγαρωμένο t-test) μετά από 72 ώρες επίδρασης μιας συγκεκριμένης miR-21 μικρά αναστολέα RNA (Εικ. 3Α). Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στα επίπεδα mRNA PDCD4 παρατηρήθηκαν με ποσοτική RT-PCR σε οποιαδήποτε από τις καταστάσεις θεραπείας (Σχήμα 3Β).? Αντιθέτως, μια σημαντική αύξηση (p = 0.002, unpaired t-test) σε PDCD4 παρατηρήθηκε στο επίπεδο πρωτεΐνης με στύπωμα western στο ΜΙΚ-21 αναστολέα κατεργασμένα κύτταρα σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα ή σκαρφάλωμα κύτταρα επεξεργασμένα ελέγχου. Αυτά τα ευρήματα είναι συνεπή με miR-21 δρα για την αναστολή της μετάφρασης του mRNA PDCD4 αντί να κατευθύνει την υποβάθμιση της και να επιβεβαιώσει ότι το miR-21 παίζει ένα ρόλο στην αρνητική ρύθμιση PDCD4 στα κύτταρα HCA-7. Ως εκ τούτου, τόσο οι COX-2 και miR-21 μονοπάτια συμβάλλουν στην αρνητική ρύθμιση της PDCD4 στα κύτταρα HCA-7, που τους καθιστά ένα κατάλληλο σύστημα στο οποίο να μελετήσει αν υπάρχει μια λειτουργική σχέση μεταξύ των δύο οδών.

Μετά από 72 ώρες από διαμόλυνση σημαντική μείωση στα επίπεδα miR-21 παρατηρείται μόνο σε κύτταρα επιμολυσμένα με miR-21 αναστολέα (Α).

PDCD4

επίπεδα mRNA δεν επηρεάζονται από την αναστολή του miR-21 (Β). Η ανάλυση στυπώματος Western των PDCD4 (C πινάκιο κορυφής για ένα αντιπροσωπευτικό κηλίδα) αποκαλύπτει μια σημαντική αύξηση στα επίπεδα της πρωτεΐνης σε κύτταρα επιμολυσμένα με τον αναστολέα σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα ή σκαρφάλωμα κύτταρα κατεργασμένα ελέγχου, όταν ποσοτικοποιηθεί σχετικά με την πρωτεΐνη βήτα ακτίνης (BACT) ως φόρτωση ελέγχου (κάτω πάνελ C). Το ραβδόγραμμα στήλη δείχνει τη μέση τιμή και οι θύσανοι επιδεικνύουν το τυπικό σφάλμα του μέσου (SEM). Η στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το ζευγαρωμένο t-test. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές και αναλύθηκαν εις διπλούν. Ανεπεξέργαστα = κύτταρα της καλλιέργειας σε μέσα μαζικής ενημέρωσης? αγωνίζομαι = κύτταρα επιμολυσμένα με αναστολείς αγωνίζομαι RNA? αναστολέας miR-21 = κύτταρα που κατεργάζονται με αναστολέα RNA miR-21.

Η

Σχέση μεταξύ miR-21 και COX-2 στην ρύθμιση προς τα κάτω του PDCD4 σε κύτταρα HCA-7

Για περαιτέρω διερεύνηση της λειτουργικής αλληλεπίδρασης μεταξύ των οδών miR-21 και COX-2, πρέπει πρώτα αναλύθηκαν COX-2 mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης σε κύτταρα HCA-7 μετά από 72 ώρες αγωγή με ΜΙΚ-21 αναστολέα σε σύγκριση με τον έλεγχο σκαρφάλωμα και μη επεξεργασμένα κύτταρα. Δεν παρατηρήθηκε διαφορά στην COX-2 έκφραση παρατηρήθηκε ούτε στο mRNA ούτε στα επίπεδα πρωτεΐνης (ρ = 0,62 και ρ = 0,83 αντίστοιχα, ζευγαρωμένο t τεστ), που δείχνει ότι η COX-2 δεν αποτελεί στόχο του miR-21 (Εικ. S1 σε S1 File).

επόμενο αγωγή HCA-7 κυττάρων με 100 μΜ NS398, ένας ειδικός αναστολέας της COX-2 αναφέρεται να είναι μη-κυτταροτοξικές και αποτελεσματική σε αυτή τη συγκέντρωση, σε κυτταρική καλλιέργεια [41], ή με όχημα μόνη (0,1% DMSO). COX-2 παίζει έναν κρίσιμο ρόλο κατά τη διάρκεια της φλεγμονής στα αρχικά στάδια της μετατροπής του αραχιδονικού οξέος σε προσταγλανδίνες, συμπεριλαμβανομένων προσταγλανδίνης Ε (PGE

2) και προς τα πάνω ρύθμιση του COX-2 σε καρκίνο του παχέος εντέρου έχει δειχθεί να συνδέσει με σημαντική αύξηση στον τομέα της παραγωγής PGE

2 [42]. Χρησιμοποιώντας Elisa να μετρήσει τα επίπεδα της PGE

2 βρήκαμε μια σημαντική μείωση (ρ = 0.006, ζευγαρωμένο t τεστ) στο μέσο των κυττάρων σε επεξεργασία με NS398 σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ή κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με όχημα μόνο, συνεπής με την αναστολή της COX- 2 καταλυτική δραστηριότητα (Εικ. S2 σε File S1).

Έχοντας καθιερωμένη αποτελεσματικότητα της θεραπείας που κατόπιν μετρήθηκε η σχετική έκφραση του miR-21 και θα μπορούσαμε να ανιχνεύσει μια σημαντική μείωση στην miR-21 μετά από θεραπεία για 72 NS398 ώρα (ρ & lt? 0,01, ζευγαρωμένο t τεστ? Εικ. 4Α). Αντίθετα, η θεραπεία του HCA-7 κυττάρων με NS398 δεν μετέβαλε την έκφραση των PDCD4 mRNA (ρ = 0,74, ζευγαρωμένο t τεστ) (Εικ. 4Β), μια παρατήρηση η οποία είναι σε αντίθεση με το προηγουμένως αναφερθεί 1,5 φορές προς τα πάνω ρύθμιση PDCD4 mRNA μετά επεξεργασία των κυττάρων HCA-7 με NS398 [39]. Η διαφορά μπορεί να οφείλεται στις μεθόδους που χρησιμοποιήθηκαν: η τελευταία μελέτη ανέλυσε έκφραση PDCD4 mRNA με κηλίδα northern και ποσοτικοποιούνται σχετικά προς GAPDH, ενώ στη μελέτη μας έχουμε μετρήσει τα επίπεδα mRNA χρησιμοποιώντας ποσοτική RT-PCR και ομαλοποιούνται τα δεδομένα χρησιμοποιώντας το γεωμετρικό μέσο όρο του τρία γονίδια αναφοράς (GAPDH, PGK και HPRT), σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές MIQE [30] (βλέπε μεθόδους). πραγματικού χρόνου δεδομένα PCR μας δείχνει ότι η θεραπεία NS398 οδηγεί σε μείωση των επιπέδων GAPDH (Εικ. S3 σε S1 File) και αυτή η αλλαγή θα έχει ως αποτέλεσμα μια προφανή αύξηση στα επίπεδα PDCD4 αν GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως το μοναδικό γονίδιο αναφοράς. Ως εκ τούτου, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η θεραπεία NS398 δεν μεταβάλλουν το ρυθμό μεταγραφής PDCD4 ή mRNA σταθερότητα? Ωστόσο, σύμφωνα με την παρατηρούμενη μείωση στην miR-21, σημαντική αυξητική ρύθμιση στην έκφραση πρωτεϊνών PDCD4 (ρ & lt? 0.001, ζευγαρωμένο t τεστ) παρατηρήθηκε σε NS398 κατεργασμένα κύτταρα σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα ή φορέα μόνο κύτταρα (Σχ 4C.). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι τα κάτω ρύθμιση PDCD4 από COX-2 δεν είναι συνέπεια της μειωμένης σύνθεσης ή σταθερότητα PDCD4 mRNA, αλλά μάλλον ότι η COX-2 μπορεί να δρα μέσω της προώθησης αύξηση του miR-21 η οποία με τη σειρά της αναστέλλει την μετάφραση του PDCD4 mRNA.

Μετά 72 ώρες επίδρασης σημαντική μείωση στα επίπεδα miR-21 παρατηρείται σε NS398 κατεργασμένα κύτταρα (Α).

PDCD4

επίπεδα mRNA δεν επηρεάζονται από την επεξεργασία NS398 (Β). Η ανάλυση στυπώματος Western των PDCD4 (C πινάκιο κορυφής για ένα αντιπροσωπευτικό κηλίδα) αποκαλύπτει μια σημαντική αύξηση στα επίπεδα της πρωτεΐνης σε NS398 κύτταρα που κατεργάζονται σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα ή μόνο όχημα (DMSO) επεξεργασμένων κυττάρων, όταν ποσοτικοποιούνται σχετικά με την πρωτεΐνη βήτα ακτίνης (BACT) ως ελέγχου φόρτωσης (C κάτω πίνακα). Το ραβδόγραμμα στήλη δείχνει τη μέση τιμή και οι θύσανοι επιδεικνύουν το τυπικό σφάλμα του μέσου (SEM). Η στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το ζευγαρωμένο t-test. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές και αναλύονται εις τριπλούν. Ανεπεξέργαστα = κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσα μαζικής ενημέρωσης? DMSO = κύτταρα που καλλιεργήθηκαν σε μέσα συμπληρωμένα με 0.1% DMSO όχημα? NS398 = κύτταρα που καλλιεργήθηκαν σε μέσα συμπληρωμένα με NS398 παρασκευασμένα σε DMSO προς τελική συγκέντρωση 100 μΜ NS398 και 0.1% DMSO.

Η

COX-2 ενεργοποίηση του miR-21 σε κύτταρα HCA-7 διαμεσολαβείται από PGE

2

Δεδομένου του ρόλου της COX-2 στην παραγωγή προσταγλανδινών, για τη διερεύνηση του μηχανισμού υποκείμενων ενεργοποίηση του miR-21 από την COX-2 που αντιμετωπίζονται HCA-7 κυττάρων με 1 μΜ PGE

2 για 24 ώρες καθώς αυτή η συγκέντρωση έδειξε να λειτουργήσει αποτελεσματικά σε αυτά τα κύτταρα [38]. Βρήκαμε ότι miR-21 έκφραση ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα (ρ = 0.019, ζευγαρωμένο t τεστ) σε PGE

2 κύτταρα που κατεργάζονται σε σύγκριση με το όχημα (0,1% DMSO) κατεργασμένα ή μη κατεργασμένα κύτταρα (Σχ. 5Α). Δεν υπάρχουν αλλαγές στα επίπεδα PDCD4 mRNA παρατηρήθηκαν σε PGE

2 κύτταρα κατεργασμένα (Εικ. 5Β)? ωστόσο, μια σημαντική μείωση (ρ & lt? 0,05, ζευγαρωμένο t τεστ) σε επίπεδα πρωτεΐνης PDCD4 παρατηρήθηκε οποία παράλληλα με την αύξηση του miR-21 (Σχήμα 5C).. Συνδυασμένη θεραπεία με PGE

2 και αναστολέα miR-21 έφερε τα επίπεδα του miR-21 σε επίπεδα συγκρίσιμα με αυτά των μη επεξεργασμένα κύτταρα (Εικ. S4 στο S1 File), και η θεραπεία με ασπιρίνη οδήγησε επίσης σε μείωση ΜΙΚ 21 επίπεδα (Εικ. S5 στο αρχείο S1). Αυτά τα δεδομένα προτείνουν ότι η COX-2 οδηγείται προς τα κάτω ρύθμιση του PDCD4 σε αυτό το σύστημα μοντέλου οφείλεται κυρίως στην PGE

2 επάγεται προς τα πάνω ρύθμιση του miR-21.

Μετά από 24 ώρες θεραπείας σημαντική αύξηση στα επίπεδα miR-21 φαίνεται σε PGE

2 κατεργασμένα κύτταρα (Α).

PDCD4

επίπεδα mRNA δεν επηρεάζονται από PGE

2 θεραπεία (Β). Η ανάλυση στυπώματος Western των PDCD4 (C πινάκιο κορυφής για ένα αντιπροσωπευτικό κηλίδα) αποκαλύπτει μια σημαντική μείωση στα επίπεδα της πρωτεΐνης σε PGE

2 κύτταρα που κατεργάζονται σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα ή μόνο όχημα (DMSO) επεξεργασμένων κυττάρων, όταν ποσοτικοποιούνται σχετικά με την πρωτεΐνη βήτα ακτίνης ( BACT) ως έλεγχος φόρτωσης (C κάτω πίνακας). Το ραβδόγραμμα στήλη δείχνει τη μέση τιμή και οι θύσανοι επιδεικνύουν το τυπικό σφάλμα του μέσου (SEM). Η στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το ζευγαρωμένο t-test. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές και αναλύθηκαν εις διπλούν. Ανεπεξέργαστα = κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσα μαζικής ενημέρωσης? DMSO = κύτταρα που καλλιεργήθηκαν σε μέσα συμπληρωμένα με 0.1% DMSO όχημα? PGE

2 = τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσα συμπληρωμένα με PGE

2 παρασκευάζεται σε DMSO προς τελική συγκέντρωση 1 μΜ PGE

2 και 0,1% DMSO.

Η

Συζήτηση

Δυσλειτουργία του miRNAs είναι ένας αναγνωρισμένος βήμα στην παθογένεση πολλών τύπων καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου CRC. miR-21 είναι ένα miRNA συχνά ρυθμίζεται προς τα πάνω στην CRC, των οποίων η αυξημένη έκφραση επίπεδα σχετίζονται με φτωχότερη θεραπευτικά αποτελέσματα σε CRC [34]. Έχουμε επιβεβαιώσει ότι η υπερέκφραση του miR-21 συσχετίζεται σημαντικά με την χειρότερη παθολογική στάσης στην ομάδα CRC ασθενών μας (Εικ. 1), που αποτελείται από ασθενείς που παρουσιάζονται με όγκους ενός αποδίδεται στάδιο Dukes ‘, γεγονός που υποδηλώνει ένα σημαντικό ρόλο του miR-21 στην εισβολή και τη διάδοση του καρκίνου.

Λίγες από τις δυνατότητες των κατάντη στόχους που ρυθμίζονται από το miR-21 έχουν επιβεβαιωθεί, και σε αυτά περιλαμβάνονται το προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο 4 (PDCD4) ογκοκατασταλτικό γονίδιο που αναστέλλει νεοπλασματικό μετασχηματισμό [43]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει μία προοδευτική μείωση στην έκφραση PDCD4 από φυσιολογικό βλεννογόνο, να πολύποδα, για ορθοκολικό όγκο [33]. Είναι ενδιαφέρον ότι μία σημαντική αύξηση στην miR-21 παρατηρήθηκε σε CRC σύγκριση με τα φυσιολογικά, αλλά όχι μεταξύ αδενωματώδεις πολύποδες και φυσιολογικό, αν και μια μείωση της έκφρασης PDCD4 ήταν εμφανής σε αυτό το μεταβατικό στάδιο [33]. Στην ομάδα μας παρατηρήσαμε μία μείωση στα επίπεδα PDCD4 mRNA στους όγκους σε σχέση με φυσιολογικούς ιστούς, αλλά καμία αλλαγή ως ασθένεια προχωρούσε με το στάδιο Dukes ‘(Εικ. 2Α). Λαμβανόμενες μαζί αυτές οι παρατηρήσεις υποδηλώνουν ότι κατά τη μετάβαση από κανονική σε υπερπολλαπλασιασμό αρνητική ρύθμιση του PDCD4 μπορεί να οφείλεται στην ρύθμιση στο επίπεδο της μεταγραφής και /ή RNA και πρωτεϊνική σταθερότητα. Ωστόσο, κατά τη μετάβαση προς κακοήθεια miR-21 μεσολάβηση αναστολή της μετάφρασης των επιπέδων της πρωτεΐνης PDCD4 της ήδη μειωμένα επίπεδα του

PDCD4

mRNA γίνεται κυρίαρχη, προωθώντας έτσι την περαιτέρω πρόοδο της κακοήθειας. Ως εκ τούτου, για τον καθορισμό των ανάντη παράγοντες που επηρεάζουν miR-21 έκφρασης είναι αποφασιστικής σημασίας για να διαπιστωθεί κατά πόσον και πώς miR-21 συμβάλλει στην εξέλιξη της κακοήθειας και να παρέχει στους δυνητικούς θεραπευτικούς στόχους.

Δεδομένου ότι στην ομάδα μας CRC ασθενών προς τα πάνω ρύθμιση ΜΙΚ 21 σχετίζεται θετικά με εκείνη του COX-2 mRNA και με χειρότερη παθολογική στάσης (Εικ. 1 και 2Β), υποθέσαμε ότι miR-21 προς τα πάνω ρύθμιση σε CRC μπορεί να συνδέεται με μια φλεγμονώδη απόκριση.