Αφηρημένο

Πρόσφατες μελέτες εφαρμογή τεχνολογιών αλληλουχίας υψηλής απόδοσης έχουν εντοπίσει αρκετά περιοδικά μεταλλαγμένα γονίδια και τα μονοπάτια σε πολλές γονιδιώματα του καρκίνου. Ωστόσο, μεταγραφική συνέπειες από αυτές τις γονιδιωματικές μεταβολές στο γονιδίωμα του καρκίνου παραμένουν ασαφή. Σε αυτή τη μελέτη, πραγματοποιήσαμε ολοκληρωμένη και συγκριτικές αναλύσεις των ολόκληρων γονιδιωμάτων και transcriptomes 22 του ιού της ηπατίτιδας Β (HBV) φύσης που ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (ΕΑΣ) και μάρτυρες τους. Σύγκριση της αλληλουχίας του γονιδιώματος ολόκληρο (WGS) και RNA-Seq αποκάλυψε πολλά στοιχεία ότι διάφοροι τύποι γενετικών μεταλλάξεων προκάλεσε ποικίλες μεταγραφική αλλαγές. Δεν είναι μόνο οι μεταλλάξεις ματίσματος του ξενοδοχείου, αλλά και σιωπηλές μεταλλάξεις στις περιοχές κωδικοποίησης, βαθιά ιντρονικές μεταλλάξεις και τις διαρθρωτικές αλλαγές που προκαλούνται εκτροπές μάτισμα. ολοκληρώσεις HBV δημιουργούνται διάφορα πρότυπα των μεταγραφών σύντηξης ιό ανθρώπινης ανάλογα με τη νόσο γονίδιο, όπως

TERT

,

CDK15

,

FN1

και

MLL4

. Δομικές παραλλαγές θα μπορούσε να οδηγήσει υπερέκφραση των γονιδίων όπως WNT συνδέτες, με /χωρίς τη δημιουργία συντήξεων γονιδίου. Επιπλέον, λαμβάνοντας υπόψη γενετικών μεταλλάξεων που προκαλούν μεταγραφική εκτροπές, θα μπορούσαμε να βελτιώσουμε την ευαισθησία επιβλαβή ανίχνευσης μετάλλαξης σε γνωστά γονίδια του οδηγού του καρκίνου (

TP53, AXIN1, ARID2, RPS6KA3

), και προσδιορίζονται επαναλαμβανόμενες διαταραχές στο υποτιθέμενο οδηγό του καρκίνου γονίδια όπως

HNF4A

,

CPS1

,

TSC1

και

THRAP3

στην ΕΑΣ. Τα ευρήματα αυτά δείχνουν γονιδιωματική αλλαγές στο γονιδίωμα του καρκίνου έχουν διαφορετικές transcriptomic αποτελέσματα και ολοκληρωμένη ανάλυση των WGS και RNA-Seq μπορεί να διευκολύνει την ερμηνεία ενός μεγάλου αριθμού γονιδιωματικής αλλοιώσεις ανιχνεύονται σε γονιδιώματος του καρκίνου

Παράθεση:. Shiraishi Υ, Fujimoto Α, Furuta Μ, Tanaka Η, Chiba Ki, Boroevich ΚΑ, et al. (2014) Ολοκληρωμένη Ανάλυση ολόκληρο το γονιδίωμα και μεταγραφικό αλληλουχίας αποκαλύπτει ποικίλες Transcriptomic Παρεκκλίσεις Καθοδηγείται από σωματικά Γονιδιωματική Αλλαγές στη καρκίνων του ήπατος. PLoS ONE 9 (12): e114263. doi: 10.1371 /journal.pone.0114263

Συντάκτης: Τσαντ Creighton, Baylor College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 28, 2014? Αποδεκτές: 5, Νοεμβρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 19η Δεκεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 Shiraishi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Σωματικών δεδομένων μετάλλαξη κατατέθηκε στη βάση δεδομένων ICGC (https://dcc.icgc.org/), το οποίο είναι ελεύθερα διαθέσιμο. Τα αρχεία ακολουθία των πρώτων στοιχείων της WGS και RNA-Seq έχουν κατατεθεί στην Ευρωπαϊκή Γονιδιώματος-Phenome Αρχείο υπό τον κωδικό ένταξη EGAD00001001035, και η πρόσβασή τους ελέγχεται από ICGC DACO

Χρηματοδότηση:. Η χρηματοδότηση για το έργο αυτό προήλθε από το RIKEN Πρόεδρος του Ταμείου το 2011, η πριγκίπισσα Takamatsu Cancer Research Fund, Ίδρυμα Takeda Science, το Grand-in ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα για τα καινοτόμα Περιοχές (ενσωματωμένων συστημάτων κατανόηση του καρκίνου προηγμένων Διάγνωση, θεραπεία και πρόληψη), και Grant-in-ενισχύσεις για Νέους επιστήμονες ( Β) 24700272. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν αντικρουόμενα συμφέροντα

Εισαγωγή

Κάθε χρόνο, περισσότεροι από μισό εκατομμύριο άνθρωποι σε όλο τον κόσμο έχουν διαγνωσθεί με ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC), η πέμπτη και η έβδομη πιο κοινός καρκίνος στους άνδρες και τις γυναίκες, αντίστοιχα [1]. Στις περισσότερες περιπτώσεις, ΕΑΣ αναπτυχθεί μετά από ηπατίτιδα ή κίρρωση που προκαλείται από τον ιό της ηπατίτιδας Β (HBV), λοίμωξη από τον ιό της ηπατίτιδας C, ο αλκοολισμός, ή μεταβολικές ασθένειες, των οποίων HBV είναι ο πιο σημαντικός παράγοντας, ειδικά στη Νοτιοανατολική Ασία και την υποσαχάρια Αφρική [1]. Αν και διάφορες γενετικές εναλλαγές έχουν ανιχνευθεί σε HCCs, όπως οι μεταλλάξεις του

ΤΡ53

και

CTNNB1

κωδικοποιεί β-κατενίνης [2], περαιτέρω λεπτομερή χαρακτηρισμό του γονιδιώματος του καρκίνου του ήπατος είναι απαραίτητη για την αναγνώριση των βιοδεικτών για την εξατομικευμένη ιατρική και πιο αποτελεσματική ανάπτυξη θεραπευτικών φαρμάκων.

οι πρόσφατες εξελίξεις στις τεχνολογίες αλληλουχίας υψηλής απόδοσης μας επιτρέπουν ολοκληρωμένη ανίχνευση σωματικών μεταλλάξεων στο γονιδίωμα του καρκίνου [3] και η αλληλούχιση υψηλής απόδοσης του HCC γονιδιωμάτων έχει αποκαλύψει αρκετές μυθιστόρημα γονίδια του οδηγού του καρκίνου, όπως ρυθμιστές της χρωματίνης [4], [5] και επαναλαμβανόμενες ολοκληρώσεις ιού στο

TERT

και

MLL4

τόπους [4], [6] – [8]. Τρέχουσα γονιδιωματικής μελέτες επικεντρώνονται κυρίως σε μεταλλάξεις σε περιοχές κωδικοποίησης, και οι άλλοι τύποι μεταλλάξεων όπως αντικαταστάσεις βάση ή indels σε μη κωδικές περιοχές, και οι διαρθρωτικές μεταβολές (SVS) συνήθως αγνοείται, δεδομένου ότι οι επιπτώσεις τους στην ανάπτυξη του καρκίνου είναι δύσκολο να αξιολογηθεί και να ερμηνεύσει μέχρι τώρα. Μία προσέγγιση για την αξιολόγηση της deleteriousness από αυτές τις μεταλλάξεις είναι να ελέγξετε τις μεταγραφικές συνέπειες αυτών των γονιδιωματικών μεταβολών. Για το σκοπό αυτό, η ευρύτερη κατανόηση των σχέσεων μεταξύ γενετικών μεταλλάξεων και μεταγραφικές εκτροπές στο γονιδίωμά του καρκίνου είναι απαραίτητες. Αρκετά παραδείγματα ανωμαλιών ματίσματος [9], [10] και συντήξεις γονιδίου [11] που προκαλούνται από γονιδιωματικές μεταλλάξεις είναι γνωστές, και μελέτες που χρησιμοποιούν πρόσφατα δεδομένα αλληλούχισης υψηλής απόδοσης προσδιορίζονται ειδική για τον καρκίνο μεταγραφική εκτροπές σε διάφορους τύπους καρκίνου [12], [13 ]. Ωστόσο, εξακολουθούν να υπάρχουν λίγες μελέτες που συγκρίνουν συστηματικά γενετικών μεταλλάξεων και μεταγραφική εκτροπές από ολόκληρη την γονιδιώματος (ΠΓΣ) και αλληλουχίας μεταγραφικό (RNA-Seq) δεδομένων. Ως εκ τούτου, έχουμε ακόμα λίγη γνώση σχετικά με το τοπίο της μεταγραφικό καρκίνο και τις σχέσεις της με σωματικές μεταλλάξεις.

Προηγουμένως, η αλληλουχία και αναλύθηκαν WGS 27 διαφορετικών τύπων καρκίνων του ήπατος [4], αλλά οι επιπτώσεις της μεγάλο μέρος των διαφορετικών σωματικών μεταλλάξεων, συμπεριλαμβανομένων των μη-κωδικοποίησης μεταλλάξεων και βαλβίδων διακοπής, ήταν μετά βίας να ερμηνεύσει μόνο χρησιμοποιώντας τα δεδομένα WGS. Ως εκ τούτου, στην παρούσα μελέτη, έχουμε προσθέσει περισσότερα WGS και αντίστοιχα δεδομένα RNA-Seq τους, τελείως από 22 HBV που σχετίζονται με δείγματα HCC, για τον προσδιορισμό των γενετικών αλλοιώσεων μαζί με μεταγραφική συνέπεια τους. και πραγματοποιήσαμε συγκριτική και ολοκληρωμένη ανάλυση των WGS τους και τα στοιχεία του RNA-Seq (βλ. Σχήμα 1Α για την επισκόπηση της μελέτης). Πρώτον, έχουμε εντοπίσει μια ποικιλία σωματικών γονιδιωματικής εκδηλώσεις όπως σημειακές μεταλλάξεις, μικρή indels, βαλβίδων διακοπής, και ολοκληρώσεις HBV από τα δεδομένα WGS. Στη συνέχεια, μετά τη συστηματική χαρακτηρίζει ειδική για τον καρκίνο transcriptomic εκτροπές, όπως διάφοροι τύποι ματίσματος αλλοιώσεις (κάδους εξόνιο, ματίσματος τόπου γλιστρά, εγκλείσματα ψευδο-εξονίου και κατακρατήσεις ιντρόνιο, βλέπε Σχ. 1Β), συντήξεις γονιδίου συμπεριλαμβανομένων αυτών που αφορούν τις αλληλουχίες HBV, πάνω γεγονότα -έκφραση και νουκλεοτιδικές αλλαγές σε επίπεδο RNA, ερευνήσαμε τις σχέσεις μεταξύ ανιχνευθεί γονιδιωματική και transcriptomic αλλαγές. Τέλος, παρέχει ένα προφίλ των γενετικών μεταλλάξεων και μεταγραφική εκτροπές, θα συζητήσουμε τα οφέλη της ολοκληρωμένης ανάλυσης των WGS και ΣΙΞ για την ακριβή ανίχνευση των γονιδίων του οδηγού του καρκίνου.

(Α) Πρώτον, ανιχνεύονται διάφοροι τύποι γονιδιωματικής και transcriptomic αλλαγές από την RNA-Seq δεδομένων των 22 HCCs. Οι χαρακτηριζόμενη αλλαγές ανιχνεύονται από κάθε ανάλυση συγκρίθηκαν για να αποκαλύψουν τις επιδράσεις των σωματικών γονιδιωματικών μεταβολών επί transcriptomic εκτροπές. (Β) Οι τέσσερις τύποι των ανωμαλιών ματίσματος που ορίζονται στην παρούσα μελέτη. Πράσινες γραμμές και βέλη δείχνουν κανονική μεταγραφή, ενώ κόκκινες γραμμές και βέλη δείχνουν παρεκκλίνουσα μεταγραφές.

Η

Αποτελέσματα

σωματικά γεγονότα ανιχνεύονται από WGS

Εμείς εξάγεται DNA από 22 κατεψυγμένα HBV φύσης που ιστούς HCC και να συνδυαστούν φυσιολογικά λεμφοκύτταρα τους, και η αλληλουχία ολόκληρων γονιδιωμάτων τους από μαζική παράλληλη αλληλουχίας. Κλινικά και παθολογικά πληροφορίες φαίνεται στον Πίνακα S1 στο S1 αρχείου. Μέσος όρος βάθη αλληλούχιση του καρκίνου και ελέγχου (λεμφοκύτταρα) γονιδιώματα ήσαν 36,8 × και 29.9x, αντίστοιχα, μετά την απομάκρυνση του επαναλήψεις PCR (Πίνακας S2 σε S1 File). Συνολικά, 209.055 (3,597-19,063) σωματικών αντικαταστάσεις ανιχνεύθηκαν (Πίνακας S4 στο S1 αρχείου). Μεταξύ αυτών, 1096 εσφαλμένου νοήματος, 32 ανοησίες και 35 μεταλλάξεις ματίσματος επιτόπια στις περιοχές κωδικοποίησης πρωτεΐνης, ταυτοποιήθηκαν, όπου ορίστηκαν οι μεταλλάξεις ματίσματος τόπου για να είναι εκείνες που επηρεάζουν δέκτη ματίσματος και του δότη τοποθεσίες που βρίσκονται στην πρώτη και τελευταία δύο βάσεις ενός ιντρονίου ακολουθία (ουσιαστικό συναρμογής-sites). Από τους 5725 indels προσδιορίζονται στις ολόκληρων γονιδιωμάτων, 105 βρίσκονταν σε περιοχές που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη και 6 επηρεάζεται ουσιαστικό ματίσματος-sites. Οι τεκμαιρόμενη γονίδια οδηγού με τη σειρά της στατιστικής σημαντικότητας της υποτροπής ήταν

TP53

,

ARID2

,

BRD7

,

HNF4A

και

RPS6KA3

(

P

-τιμή & lt? 0.001, Πίνακας S5 στο S1 αρχείου). Επιπλέον, 2.254 βαλβίδων διακοπής (15-577 ανά όγκο) ανιχνεύθηκαν, 1.168 εκ των οποίων επηρεάζονται με σημειώσεις, τα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Επιπλέον, 86 (0-12 ανά όγκο) εντάξεις HBV ταυτοποιήθηκαν με 2 και 5 επαναλαμβανόμενες ολοκληρώσεις στο

TERT

και

MLL4

τόπους, αντίστοιχα, το οποίο είναι σύμφωνο με προηγούμενες μελέτες [4] [6], [7], [8].

εκτροπές Συγκόλληση που σχετίζονται με γενετικών μεταλλάξεων

Σύνολο RNAs που εξάγονται από τις παγωμένες 22 ΕΑΣ και τις παρακείμενες μη-καρκινικούς ιστούς στο ήπαρ τους, υπόκεινται σε RNA-Seq, και περίληψη της παρουσιάζεται στον πίνακα S3 στο S1 αρχείου.

Κατ ‘αρχάς, ερευνήσαμε το καθεστώς των μεταγραφών γύρω απαραίτητη μεταλλάξεις ματίσματος τόπου με το χέρι τον έλεγχο των ευθυγραμμίσεις της αλληλουχίας διαβάζει. Μετά τον αποκλεισμό μεταγραφές χωρίς έκφραση, παρατηρήσαμε μία ή πολλαπλές εκτροπές μάτισμα για 19 από τις υπόλοιπες 24 ουσιώδεις μεταλλάξεις ματίσματος του ξενοδοχείου (3 ματίσματος τόπου γλιστρά, 6 κάδους εξόνιο, και 13 παρακρατήσεις ιντρόνιο, το σχήμα S1 στο S2 αρχείου, Πίνακας S6 σε S1 File), υποδεικνύοντας ότι οι σωματικές μεταλλάξεις στο ουσιαστικό ματίσματος-sites έδειξε ισχυρές επιδράσεις στις εκτροπές μάτισμα όπως αναμενόταν. Επηρεάζονται τα γονίδια που περιλαμβάνονται περιοδικά μεταλλαγμένα γονίδια από την ανάλυση WGS (

TP53, ARID2, HNF4A

και

RPS6KA3

) καθώς και

AXIN1

.

Για να αποκτήσετε μια ολοκληρωμένη λίστα με καρκίνο συγκεκριμένες εκτροπές μάτισμα, εντοπίσαμε συστηματικά τέσσερις τύπους των ανωμαλιών ματίσματος (slip συναρμογής του ξενοδοχείου, εξόνιο skip, ψευδο-εξόνιο ένταξης και διατήρησης εσωνίου, Εικ. 1Β) με τη χρήση εσωτερικά αναπτύξει αλγορίθμους (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι ). Συνολικά, 292 εκτροπές μάτισμα γεγονότα (26 συναρμογής τόπου γλιστρά, 41 κάδους εξόνιο, 77 εγκλείσματα ψευδο-εξόνιο και 148 κατακρατήσεις ιντρόνιο) ανιχνεύθηκαν (Πίνακας S7 στο S1 αρχείου). Από τη στιγμή που εκτελείται μη-κατευθυντικό RNA-Seq, διακρίσεις μεταξύ κατακράτησης ιντρόνιο και ειδική για τον καρκίνο αντιπληροφοριακό μεταγραφή ήταν δύσκολη, και έτσι τα αποτελέσματα των παρακρατήσεων ιντρονίου θα πρέπει να ερμηνεύονται με προσοχή. Αυτή η λίστα περιλαμβάνονται τα γεγονότα εκτροπή που αντιστοιχεί στα 10 απαραίτητα ματίσματος-sites διερευνηθεί παραπάνω. PCR και αλληλούχιση Sanger επικυρωθεί 154 υψηλά καρκίνο συγκεκριμένα γεγονότα συνένωσης από το 239 ανιχνεύονται. Για 72 εκδηλώσεις, επιβεβαιώσαμε εκτροπές μάτισμα στόχο τόσο για τον καρκίνο και μη-καρκινικούς ιστούς στο ήπαρ.

Εκτός από την απαραίτητη μεταλλάξεις ματίσματος του ξενοδοχείου, εντοπίσαμε διάφορα είδη των μεταλλάξεων και σύντομη indels που φαίνεται να είναι οι άμεσες αιτίες των παρατηρούμενων ανωμαλιών ματίσματος, μέσα από την αλλαγή των αποστάσεων επεξεργασία του ματίσματος δότη ή μοτίβα δέκτη. Τρεις μεταλλάξεις κοντά κόμβους εξονίων-ιντρονίων (& lt? 10 bp), αλλά όχι στην ουσιαστική ματίσματος του χώρου του εκτροπές ματίσματος (σχήμα 2Α, Β, και Γ.). Τρεις μεταλλάξεις σε περιοχές κωδικοποίησης, το οποίο πιθανόν δημιουργείται νέα μοτίβα δότη ματίσματος τόπου, προκάλεσε ματίσματος τόπου γλιστρά (Σχ. 2D, Ε και F). Μια μετάλλαξη που επηρεάζει το

LAMB2

γονιδίου ήταν συνώνυμο. Δύο ψευδο-εξόνιο περίπτωση ένταξης που επηρεάζουν

THRAP3

και

TSC1

φάνηκε να προκληθεί από σωματικές μεταλλάξεις βαθιά μέσα ιντρονίων κοντά στο νέο κομβικό σημείο συναρμογής (Σχ. 2G και H). Επιπλέον, επτά κάδους εξόνιο, του οποίου επηρεάζονται τα γονίδια που περιλαμβάνονται αρκετές ογκοκατασταλτικά γονίδια, όπως

IQGAP2

,

ST7

και

TP53

, είχε μακρά διαγραφές μεταξύ των σημείων σύνδεσης (Εικ. 2Θ, J και Κ). Επιπλέον, οκτώ συγκρατήσεις ιντρονίου είχαν ανακατατάξεις εντός των αντίστοιχων εσώνια, για παράδειγμα

RB1 ​​

(Εικ. 2 λίτρα). Αναφέρουν ότι οι διάφοροι τύποι των ανωμαλιών ματίσματος οδηγείται συχνά από απαραίτητη όχι μόνο μεταλλάξεις ματίσματος του ξενοδοχείου, αλλά και μεταλλάξεις σε περιοχές κωδικοποίησης, συμπεριλαμβανομένης συνώνυμο σιωπηλές μεταλλάξεις, βαθιά ιντρονικές μεταλλάξεις, και βαλβίδων διακοπής. Από την άλλη πλευρά, ένα μεγάλο μέρος των εκτροπών ματίσματος (239/292 = 81,8%) δεν είχαν εγγύς μεταλλάξεων (εντός 1 kb) ή βαλβίδων διακοπής (σε απόσταση 500 kb). Μερικά από αυτά είναι πιθανό φαίνεται να προκαλείται από επιγενετικές αλλαγές [14], ή εκφραστική αλλαγές στις μεταγραφές αντι-νόημα, όπως προαναφέρθηκε.

εξονικό και ιντρονικές αλληλουχίες που ορίζονται από κεφαλαίων και μικρών γραμμάτων, αντίστοιχα. Red αλληλουχίες είναι σωματικές μεταλλάξεις σε HCCs. Μπλε και πράσινο αριθμοί στην πλευρά των ακολουθιών είναι edit αποστάσεις από μοτίβο δότη συρραφής (AG