Αφηρημένο

Στόχος

Πρόσφατα, Next Generation Sequencing (NGS) έχει αρχίσει να αντικαταστήσει άλλες τεχνολογίες για τη δοκιμή γονιδιακής μετάλλαξης ότι απαιτείται τώρα για στοχευμένες θεραπείες. Ωστόσο, η μεταφορά τεχνολογίας NGS με την κλινική καθημερινή πρακτική απαιτεί επικύρωση.

Μέθοδοι

Εμείς επικυρωθεί το Ion Torrent AmpliSeq του παχέος εντέρου και του καρκίνου του πνεύμονα πίνακα ανακρίνει 1850 hotspots σε 22 γονίδια με τη χρήση του μηχανήματος Ion Torrent Personal Genome . Πρώτον, χρησιμοποιήσαμε εμπορικά πρότυπα αναφοράς που φέρουν μεταλλάξεις σε καθορισμένα αλληλομόρφων συχνότητα (AF). Στη συνέχεια, 51 παχέος αδενοκαρκινώματα (CRC) και 39 μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) έχουν αναδρομική ανάλυση

Αποτελέσματα

Η ευαισθησία και η ακρίβεια για την ανίχνευση παραλλαγών σε AF & gt?. 4% ήταν 100 % για εμπορικούς πρότυπα αναφοράς. Μεταξύ των 90 περιπτώσεων, 89 (98,9%) είχαν επιτυχία αλληλουχία. Μεταξύ των 86 δειγμάτων για τα οποία NGS και η δοκιμή αναφοράς ήταν τόσο κατατοπιστική, 83 έδειξε σύμφωνη αποτελέσματα μεταξύ NGS και τη δοκιμή αναφοράς? δηλαδή

KRAS

και

BRAF

για CRC και

EGFR

για NSCLC, με τις 3 ασύμφωνα περιπτώσεις κάθε χαρακτηρίζεται από AF & lt?. 10%

συμπεράσματα

σε γενικές γραμμές, η AmpliSeq παχέος εντέρου /πνεύμονα πίνακα του καρκίνου ήταν ειδική και ευαίσθητη για ανάλυση μετάλλαξης του πάνελ γονιδίων και μπορεί να ενσωματωθεί σε κλινική καθημερινή πρακτική

Παράθεση:. D’Haene Ν, Le Mercier Μ, De Nève Ν, Blanchard O, Delaunoy Μ, El Housni H, et al. (2015) Κλινική Επικύρωση της Στοχευμένης Next Generation Sequencing για Colon και καρκίνοι του πνεύμονα. PLoS ONE 10 (9): e0138245. doi: 10.1371 /journal.pone.0138245

Επιμέλεια: Aldo Scarpa, το Πανεπιστήμιο της Βερόνα, Ιταλία

Ελήφθη: 4 Μαρτίου, 2015? Αποδεκτές: 27 Αυγ 2015? Δημοσιεύθηκε: 14 Σεπτεμβρίου 2015

Copyright: © 2015 D’Haene et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

χρηματοδότηση:. το έργο υποστηρίχθηκε από τη χρηματοδότηση από το «Fonds Yvonne Boël» (Βρυξέλλες, Βέλγιο). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

οι πρόσφατες εξελίξεις στην τεχνολογία αλληλουχίας επέτρεψαν ολοκληρωμένο προφίλ των γενετικών αλλοιώσεων στον καρκίνο [1]. Η ανάπτυξη θεραπειών αναστολέα τυροσινικής κινάσης κατέστησε σημαντικό να δοκιμαστεί ασθενείς με καρκίνο για κλινικά σημαντικές μεταλλάξεις γονιδίων που επηρεάζουν το όφελος της θεραπείας. Αναγνώριση του καρκίνου που σχετίζονται με μεταλλάξεις έχει γίνει πρότυπο φροντίδας για τη θεραπεία του καρκίνου? Παραδείγματα τέτοιων περιλαμβάνουν

RAS

μεταλλάξεις στο μεταστατικό ορθοκολικό καρκίνωμα ή

EGFR

μεταλλάξεις στον καρκίνο του πνεύμονα. Ρουτίνα

EGFR

σωματικών δοκιμή μετάλλαξης συνιστάται τώρα στην Ευρώπη και τις Ηνωμένες Πολιτείες για τη μη πλακώδους μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) [2, 3]. Νέες ευρωπαϊκές κατευθυντήριες γραμμές για να ενθαρρύνει σθεναρά την ευρεία κάλυψη από τα εξώνια 18-21 [2]. Επιπλέον, οι νέες κατευθυντήριες γραμμές NCCN για NSCLC υποστηρίζει σθεναρά ευρύτερη μοριακό προφίλ με στόχο τον εντοπισμό σπάνιων μεταλλάξεων οδηγός για τα οποία μπορεί να είναι ήδη διαθέσιμα αποτελεσματικά φάρμακα, ή σε κατάλληλα συμβουλεύουν τους ασθενείς σχετικά με τη διαθεσιμότητα των κλινικών δοκιμών (κατευθυντήριες γραμμές NCCN http: //www.nccn .org /επαγγελματίες /physician_gls /pdf /nscl.pdf). Μέχρι πρόσφατα, οι ενδείξεις για το πρότυπο-of-care μοριακών δοκιμών σε ορθοκολικό καρκίνωμα που περιλαμβάνονται δοκιμών για

KRAS

κατάστασης μεταλλάξεων ως προγνωστικός δείκτης της απόκρισης σε αντι-υποδοχέα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα παραγόντων (EGFR) όπως cetuximab [4]. Τώρα, οδηγίες συνιστούν ότι τουλάχιστον, εξόνιο 2

θα πρέπει να καθορίζεται KRAS

κατάσταση μετάλλαξης και όποτε είναι δυνατόν, μη-εξόνιο 2

KRAS

και

NRAS

κατάσταση, τις μετάλλαξης θα πρέπει να να καθορίζεται επίσης (NCCN κατευθυντήριες γραμμές https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/colon.pdf). Αυτό υπογραμμίζει ότι ο αριθμός (ή η έκταση) των βιοδεικτών που θα πρέπει να αξιολογηθούν σε κλινικές καθημερινή πρακτική στη μοριακή παθολογία αυξάνεται με ταχείς ρυθμούς. Αυτό απαιτεί για την εφαρμογή των μεθόδων ανίχνευσης της κατάστασης μεταλλάξεων πολλαπλών γονιδίων. Επιπλέον, αυτή η αύξηση του αριθμού των γονιδίων για τη δοκιμή συνδέεται με μια μείωση του μεγέθους του δείγματος. Ο παθολόγος αντιμετωπίζει μια νέα πρόκληση: τη βελτιστοποίηση των διαθέσιμων ιστό του όγκου. Δεδομένου ότι ο αριθμός των κλινικά σημαντικών γενετικών παραλλαγών έχει αυξηθεί, κλινικές δοκιμές έχει εξελιχθεί, κινείται από μόνο μεταλλάξεις σε multiplex αξιολογήσεις hotspot σε πολλαπλά γονίδια του καρκίνου. Τα τελευταία χρόνια, Next Generation Sequencing (NGS) έχει αρχίσει να αντικαταστήσει άλλες τεχνολογίες για τη δοκιμή γονιδιακής μετάλλαξης [5-8]. Targeted, αμπλικόνιο που βασίζεται NGS προσφέρει ταυτόχρονη αλληλούχιση χιλιάδες μικρή αλληλουχία DNA σε ένα μαζικά παράλληλο τρόπο και μπορεί να προσφέρει μια οικονομικώς αποδοτική προσέγγιση για την ανίχνευση πολλαπλών γενετικών αλλοιώσεων με ένα ελάχιστο ποσό του DNA [5, 9, 10]. Επιπλέον, NGS μπορεί να διεξαχθεί χρησιμοποιώντας DNA από, μπλοκ μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) ιστός [11-16]. Η κλινική εφαρμογή της NGS στον καρκίνο είναι η ανίχνευση των κλινικά προσφυγής γενετικής /γονιδιωματικής αλλοιώσεις που είναι κρίσιμες για την φροντίδα του καρκίνου [6]. Αυτές οι μεταβολές μπορεί να είναι διαγνωστική, προγνωστική, θεραπευτική ή σημασία. Ωστόσο, η μεταφορά τεχνολογίας NGS με την κλινική καθημερινή πρακτική απαιτεί επικύρωση.

Στην παρούσα μελέτη αξιολόγησε την κλινική εφαρμογή του παχέος εντέρου Ion Ampliseq και ο πίνακας του καρκίνου του πνεύμονα στις Ion Torrent Personal Genome Machine (Τεχνολογίες PGM-Life) για τη διαλογή του πνεύμονα και του παχέος εντέρου. Το κόλον Ion Ampliseq και πάνελ Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι μια multiplex μέθοδος παρασκευής βιβλιοθήκης που βασίζεται σε PCR, με την οποία το 90 αμπλικόνια που καλύπτουν 1.825 μεταλλακτική εστίες 22 γονίδια που σχετίζονται με του παχέος εντέρου και του καρκίνου του πνεύμονα επιλεκτικά ενισχυμένα [14, 15, 17, 18].

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

το έργο αυτό έχει εγκριθεί από την επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Erasme (Βρυξέλλες, Βέλγιο-ref: P2013 /174). Σύμφωνα με τον βελγικό νόμο του Δεκεμβρίου του 2008 «Loi σχετική à l’απόκτηση et à l’αξιοποίηση de υλικού καθώς corporel humain destiné à des εφαρμογές médicales Humaines ou à des πτερύγια de Recherche Scientifique», δεν απαιτείται γραπτή συγκατάθεση. Η επιτροπή δεοντολογίας ως εκ τούτου έχει παραιτηθεί από την ανάγκη για γραπτή συγκατάθεση από τον συμμετέχοντα.

Επιλογή

Δείγματα

δείγματα όγκων από 90 ασθενείς εκ των υστέρων αναλύθηκαν, συμπεριλαμβανομένων 51 παχέος αδενοκαρκινώματα (CRC) και 39 μη μικροκυτταρικό καρκινώματα του πνεύμονα (NSCLC περιλαμβάνουν 37 αδενοκαρκινώματα και 2 πλακωδών καρκινωμάτων). Η μεταλλαξιογόνος κατάσταση του

KRAS

και

BRAF

στο CRC και του

EGFR

στον NSCLC είχε εκτιμηθεί προηγουμένως στο πλαίσιο της καθημερινής πρακτικής. Οι βασικοί τύποι δειγμάτων ήταν είτε χειρουργικές εκτομές (n = 57, 44 και 13 CRC NSCLC), βιοψίες (n = 23, 7 και 16 CRC NSCLC) ή μπλοκ κυττάρων (η = 10, όλες NSCLC). Επιπλέον, χρησιμοποιήσαμε 12 μη νεοπλασματικά δείγματα (6 πνεύμονες και 6 παχύ έντερο) και 5 εμπορικά πρότυπα αναφοράς FFPE (Horizon Diagnostics, Cambridge, UK) που φέρουν μετάλλαξη στο

NRAS

,

KRAS

,

ΑΚΤ

και

EGFR

σε 50% τη συχνότητα αλληλομόρφων (AF) και 1 FFPE multiplex πρότυπο αναφοράς (Horizon Diagnostics, Cambridge, UK) που μεταφέρουν 11 διαφορετικές μεταλλάξεις σε διάφορα καθορισμένα AF (0,9 έως 24,4% ).

DNA εξόρυξη

το DNA που εξάγεται από τα δείγματα όγκων FFPE χρησιμοποιώντας το κιτ ιστού QIAamp FFPE (Qiagen, Αμβέρσα, Βέλγιο). Εν συντομία, μη εχρωσμένων 10 μm τομές παραφίνης κόπηκαν και επωάστηκαν στους 37 ° C σε ένα φούρνο ξήρανσης για όλη τη νύχτα. Η παραφίνη αφαιρέθηκε με επώαση τα πλακίδια σε 2 διαδοχικά λουτρά ξυλολίου και καρκινικού ιστού ήταν χειροκίνητα macrodissected, ξύνεται το κλείστρο με ένα νυστέρι και μεταφέρθηκαν σε ένα σωλήνα 1.5 ml. DNA στη συνέχεια εκχυλίζεται σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η H & amp? Ε βάφονται διαφάνεια από το ίδιο μπλοκ, είχαν προηγουμένως ελεγχθεί από έναν παθολόγο που περιέβαλε την περιοχή του όγκου και αξιολογήθηκε το ποσοστό του όγκου, χρησιμοποιήθηκε ως οδηγός για την macrodissection. Το ποσοστό των καρκινικών κυττάρων από τα δείγματα κυμαινόταν από 5 έως 90%. Το DNA που ελήφθη ποσοτικά με τη χρήση του φθορισμού Qubit® σε συνδυασμό με το κιτ προσδιορισμού Qubit® dsDNA ΕΣ (Life Technologies, Gent, Βέλγιο).

Ανίχνευση

KRAS

,

BRAF

και

EGFR

μεταλλάξεις

Ανίχνευση

KRAS

,

BRAF

και

EGFR

μεταλλάξεις πραγματοποιήθηκαν στο πλαίσιο της κλινικής καθημερινή πρακτική σε μια ISO15189 πιστοποιημένο εργαστήριο με ποσοτική PCR. Αυτές οι μέθοδοι περιγράφονται στο S1 αρχείου. Η ευαισθησία αυτών των δοκιμασιών είναι ποικίλη μεταξύ 3 και 20% του μεταλλαγμένου DNA για τη δοκιμή KRAS, το 10% των μεταλλαγμένο DNA για τη δοκιμή BRAF, 0,5% του μεταλλαγμένου DNA για τη δοκιμή EGFR p.L858R, 1% του μεταλλαγμένου DNA για το εξόνιο EGFR 19 διαγραφή και 5% του μεταλλαγμένου DNA για τον έλεγχο EGFR p.T790M,

σταγονιδίων ψηφιακή PCR

Μερικές μεταλλάξεις που ανιχνεύονται από NGS επικυρώθηκαν από σταγονίδιο ψηφιακή PCR (ddPCR), όπως αναφέρεται λεπτομερώς στο S1 αρχείου.

η επόμενη γενιά αλληλουχίας

Για την κατασκευή της βιβλιοθήκης, 10 ng του DNA (που μετράται με τη χρήση του φθορισμού Qubit® σε συνδυασμό με το κιτ προσδιορισμού Qubit® dsDNA ΕΣ) ενισχύθηκε με τη χρήση του παχέος εντέρου και του πίνακα Καρκίνο του πνεύμονα (Ampliseq ™, Life Technologies), μια επιτροπή επικυρωμένο πρόσφατα [15] και ο Ion Ampliseq ™ HiFi Master Mix (σετ Ion Ampliseq ™ Library 2.0). Μια βιβλιοθήκη αμπλικόνιο έτσι δημιουργήθηκε για αλληλούχιση 1825 μεταλλάξεις hotspot σε 22 γονίδια συμπεριλαμβανομένων των

ΑΚΤ1 (NM_05163)

,

ALK

(

NM_004304)

,

BRAF (NM_004333)

,

CTNNB1 (NM_001904)

,

DDR2 (

NM_001014796),

EGFR (

ΝΜ_005228),

ΕΚΒΒ2 (

NM_004448),

erbB4 (

NM_005235),

FBXW7 (

NM_033632),

FGFR1 (

NM_023110),

FGFR2 (

NM_022970),

FGFR3 (

NM_000142),

KRAS (

NM_033360),

MAP2K1 (

NM_002755),

ΚΟΑ (

NM_001127500),

Notch1 (

NM_017617),

NRAS (

NM_002524),

PIK3CA (

NM_006218),

PTEN (

NM_000314),

Smad4 (

NM_005359),

STK11 (

NM_000455 ),

TP53 (

NM_000546). Τα αμπλικόνια στη συνέχεια υπέστησαν πέψη, γραμμικό κώδικα και ενισχύεται χρησιμοποιώντας το κιτ Ion Ampliseq ™ Library 2.0 και Ion Xpress ™ κιτ προσαρμογέων barcode (τεχνολογίες Life) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η βιβλιοθήκη ποσοτικά με τη χρήση του φθορομέτρου Qubit® και το κιτ δοκιμασίας Qubit® dsDNA ΕΣ (τεχνολογίες ζωής). 20:00 κάθε βιβλιοθήκης ήταν πολυπλεξίας και κλωνικά ενισχυμένο σε σωματίδια Ion σφαίρα ™ (ISP) από γαλάκτωμα PCR πραγματοποιείται στο Ion One Touch 2 οργάνων με τις Ion PGM πρότυπο ™ OT2 200 kit (τεχνολογίες ζωής) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ποιοτικός έλεγχος εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ Ion Sphere ™ Ποιοτικού Ελέγχου (Life Technologies) για να εξασφαλιστεί ότι 10-30% του προτύπου θετικών ISP παρήχθησαν στο γαλάκτωμα PCR. Τέλος, ο ISP πρότυπο εμπλουτίστηκαν, φορτώθηκαν σε ένα ιόν 316 ™ ή σε ένα ιόν 318 ™ τσιπ και προσδιορίστηκε η αλληλουχία επί αλληλουχητή PGM ™ με το ιόν PGM ™ αλληλούχισης 200 κιτ v2 σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Δεδομένα ανάλυση

Τα ανεπεξέργαστα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό v3.6.2 torrent σουίτα (τεχνολογίες ζωής). Η ανάλυση κάλυψη έγινε με τη χρήση του plug-in v3.6 ανάλυση κάλυψης. Περιπτώσεις για τις οποίες ο αριθμός των χαρτογραφηθεί διαβάζει WAS & lt? 100000 ή /και η μέση κάλυψη βάση ήταν & lt? 500x θεωρήθηκαν ως μη κατατοπιστική. Μεταλλάξεις ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας το plug-in v3.6 Παραλλαγή καλούντος με χαμηλές ρυθμίσεις έντασης (Life Technologies). Στη λίστα παραλλαγή που λαμβάνονται, κάθε μετάλλαξη επιβεβαιώθηκε στο Integrative θεατή γονιδίωμα (IGV) από το Ινστιτούτο Broad (https://www.broadinstitute.org/igv/) [19]. λήφθηκαν υπόψη μόνο οι μεταλλάξεις που αναφέρθηκαν στο κοσμικό (Sanger Institute Κατάλογος των σωματικών μεταλλάξεων στον Καρκίνο) βάση δεδομένων (https://www.sanger.ac.uk/cosmic) και σιωπηλή ή ιντρονικές μεταλλάξεις δεν έχουν αναφερθεί.

Στατιστικές αναλύσεις

Τα μη παραμετρικά τεστ Mann-Whitney και Kruskal-Wallis χρησιμοποιήθηκαν για τη σύγκριση δύο, ή πολλαπλές, ανεξάρτητες ομάδες των αριθμητικών δεδομένων, αντίστοιχα. Εάν η δοκιμή Kruskal-Wallis ήταν σημαντική, εφαρμόστηκαν δοκιμασίες post-hoc χρησιμοποιώντας είτε την τυπική διαδικασία Dunn να συγκρίνετε όλα τα ζεύγη ομάδα ή την προσαρμογή του να συγκρίνει κάθε πειραματική συνθήκη για τον έλεγχο, αποφεύγοντας πολλαπλά αποτελέσματα σύγκρισης (όπως αναφέρεται λεπτομερώς στο Zar [20] )

Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση Statistica (Statsoft, Tulsa, OK, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής) και p-τιμές & lt.? 0.05 θεωρήθηκαν σημαντικές.

Αποτελέσματα

NGS επικύρωση του πίνακα

Η απόδοση του παχέος εντέρου AmpliSeq και πάνελ καρκίνο του πνεύμονα για πρώτη φορά αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας 12 μη νεοπλασματικών ιστών (6 πνεύμονες και 6 παχύ έντερο) και 6 εμπορικά πρότυπα αναφοράς FFPE (5 πρότυπα αναφοράς με μια μετάλλαξη στο 50% τη συχνότητα αλληλομόρφων και ένα multiplex πρότυπο αναφοράς που μεταφέρουν 11 διαφορετικές μεταλλάξεις σε διάφορα καθορισμένα αλληλομόρφων συχνότητες, οι οποίες ποικίλλουν 0,9 έως 24,4%).

Όχι μετάλλαξη ανιχνεύθηκε στα 12 μη νεοπλασματικών ιστών. Τα 5 μεταλλάξεις που υπάρχουν στα 5 πρότυπα αναφοράς σε 50% συχνότητα αλληλόμορφων ανιχνεύθηκαν όλα σωστά από NGS με την Colon AmpliSeq και πάνελ Καρκίνο του Πνεύμονα (Πίνακας 1). Μεταξύ των 11 μεταλλάξεων που υπάρχουν στο multiplex πρότυπο αναφοράς, όλες οι μεταλλάξεις με AF & gt? 3% ανιχνεύθηκαν σωστά από NGS με εξαίρεση το

KIT

μετάλλαξη διότι αυτό το γονίδιο δεν περιλαμβάνεται στις 22 γονίδια του πάνελ . Για τα 3 μεταλλάξεις με κολπική μαρμαρυγή & lt? 3%, μόνο ένα (

EGFR

απαλοιφή στο εξόνιο 19, AF = 2,0%) ανιχνεύθηκε από το Variant καλούντος, ενώ τα άλλα δύο (

EGFR

σ .L858R και p.T790M με AF = 2,7% και 0,9% αντίστοιχα) δεν ήταν. Με την επιθεώρηση IGV, βρήκαμε ότι αυτές οι παραλλαγές ήταν παρόντες, αλλά με χαμηλή AF (25/1633 έχει ως εξής (1,5%) και 7/1613 διαβάζει (0,4%), αντίστοιχα). Πρόσθετες μεταλλάξεις στο

CTNNB1

,

BRAF

,

PIK3CA

και

EGFR

ανιχνεύθηκαν από το Variant καλούντος στα πρότυπα αναφοράς (Πίνακας 1). Η

KRAS

και

NRAS

τα πρότυπα που παράγεται από την κυτταρική σειρά SW48 που φέρεται να μεταφέρει

CTNNB1

p.S33Y και

EGFR

p.G719S μεταλλάξεις στην κοσμική βάση δεδομένων (https://www.sanger.ac.uk/cosmic)? η

Οι EGFR

πρότυπα που παράγεται από την κυτταρική σειρά RKO που φέρεται να μεταφέρει

BRAF

p.V600E και

PIK3CA

μεταλλάξεις p.H1047R. Τέλος, η multiplex πρότυπο αναφοράς παράγεται από τις κυτταρικές σειρές RKO, SW48 και HCT16, γεγονός που εξηγεί την ανίχνευση του

CTNNB1

μετάλλαξη p.S33Y σε αυτό τον έλεγχο.

Η

Η ακρίβεια (αναπαραγωγιμότητα και επαναληψιμότητα) αξιολογήθηκε επίσης χρησιμοποιώντας 2 δείγματα όγκων FFPE και το multiplex πρότυπο αναφοράς. Τα δείγματα αναλύθηκαν 5 φορές (5 παραγωγές βιβλιοθήκη ξεκινώντας από το ίδιο εκχύλισμα DNA) σε τρία διαφορετικά πειράματα (Πίνακας 2). Όλες οι μεταλλάξεις με AF & gt? 4% ανιχνεύθηκαν με συνέπεια. Ωστόσο, οι μεταλλάξεις με AF & lt? 3% ανιχνεύθηκαν από το Variant καλούντος σε ένα ή περισσότερα, αλλά όχι όλα, από τα πέντε επαναλήψεις. Με την επιθεώρηση IGV, οι μεταλλάξεις TP53 ασυνέπεια που ανιχνεύεται από τον Variant καλούντος ήταν παρόντες μόνο στο αντίγραφο για το οποίο εντοπίστηκε η μετάλλαξη από το Variant καλούντος, αλλά όχι για τις άλλες επαναλήψεις (S1 πίνακα). Για το πρότυπο αναφοράς, οι 3 παραλλαγές EGFR είχαν εντοπιστεί από την επιθεώρηση IGV (αλλά με μια παραλλαγή κάλυψη & lt? 30x για την πλειοψηφία των επαναλήψεων). Αν και αυτά ήταν ανακόλουθο ανιχνεύεται από τον Variant καλούντος (S1 πίνακα)

Η

Επιπλέον, ορισμένες μεταλλάξεις επαληθεύτηκαν με ddPCR (Πίνακας 2). Η μετάλλαξη p.H1047Q PIK3CA, ανιχνεύεται σταθερά από NGS με μέση AF 10,8%, ανιχνεύθηκε επίσης με ddPCR με AF του 9,1%. Σε αντίθεση, η p.R181C και οι p.H168Y ΤΡ53 μεταλλάξεις με ασυνέπεια ανιχνευθεί με NGS δεν ανιχνεύθηκαν με ddPCR. Λαμβάνοντας υπόψη τα γεγονότα που ανιχνεύονται μεταλλάξεις με AF & lt? 3% δεν είχαν επικυρωθεί από ddPCR (για TP53 μεταλλάξεις) ή να μην ανιχνεύεται (μεταλλάξεις του EGFR στο πρότυπο αναφοράς), και ότι η μετάλλαξη KRAS με αναμενόμενη AF 5% ανιχνεύθηκε σταθερά με AF ποικίλες 4,6 έως 5,9%, που επιλέξει ένα 4% το όριο AF για την υποβολή εκθέσεων μετάλλαξη. Το όριο αυτό είναι σύμφωνο με τα δεδομένα που αναφέρονται στη βιβλιογραφία για αυτή την πλατφόρμα NGS [9, 16, 21].

παραστάσεις αλληλουχίας

Ένα σύνολο των 90 δειγμάτων FFPE, συμπεριλαμβανομένων 51 CRC και 39 NSCLC , αλληλουχήθηκε με NGS. απόδοση αλληλουχίας αξιολογήθηκε από τον αριθμό και την κατανομή των διαβάζει σε όλες τις στοχευμένες περιοχές. Μεταξύ των 90 αλληλουχία περιπτώσεις, 89 (98,9%) ήταν επιτυχής (αριθμός χαρτογραφηθεί διαβάζει & gt? 100000 ή μέσο κάλυψης βάσης & gt? 500x). Η άστοχος από την περίπτωση θεωρήθηκε μη κατατοπιστική λόγω του αριθμού των διαβάζει & lt? 100 000 (40.072 αναγνώσεις) και η μέση βάσης κάλυψη & lt? 500x (1.2Χ). Μεταξύ των 89 αλληλουχία με επιτυχία τις περιπτώσεις, μία υπόθεση κρίνεται μη ικανοποιητικός (αριθμός έχει ως εξής: 69.564 και κατά μέσο όρο βάση κάλυψης: 676x), ωστόσο η ποιότητα της αλληλουχίας θεωρήθηκε αρκετά καλή για περαιτέρω ανάλυση. Όλες οι άλλες περιπτώσεις (n = 88, 97,8%) είχαν μια σειρά διαβάζει & gt? 100.000 και ένα μέσο βάσης κάλυψη & gt? 1000X. Ο μέσος αριθμός των διαβάζει ανά δείγματα ήταν 232.832 και το μέσο βάθος κάλυψη βάση ήταν 2.296. Κατά μέσο όρο το 91,6% των αμπλικονίων είχαν βάθος κάλυψη άνω 500χ (Πίνακας 3). Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ CRC και NSCLC από την άποψη του αριθμού των διαβάζει (p = 0.45), το βάθος της κάλυψης βάσης (ρ = 0.42) και το ποσοστό των αμπλικονίων με βάθος κάλυψη μεγαλύτερη από 500χ (p = 0.32) (δοκιμή Mann-Whitney ). Για 12 περιπτώσεις, η ποσότητα του DNA που ελήφθη μετά την εκχύλιση ήταν πολύ χαμηλή για να επιτευχθεί το απαιτούμενο 10 ng για στοχευμένη αλληλουχίας (συγκέντρωση DNA που κυμαίνεται από 0,1 έως 1.5ng /μl). Ο προσδιορισμός της αλληλουχίας ήταν επιτυχής για τις 12 περιπτώσεις και καμία στατιστική διαφορά δεν παρατηρήθηκε ως προς τον αριθμό των διαβάζει (p = 0.45), το βάθος της κάλυψης βάσης (ρ = 0.42) και ως προς το ποσοστό των αμπλικονίων με βάθος κάλυψη περισσότερων από 500x ( p = 0.32) μεταξύ των δειγμάτων με μικρότερο από το απαιτούμενο 10 ng του DNA και τα δείγματα με αρκετή DNA (Mann-Whitney test, πίνακας 3). Αυτό υποδηλώνει ότι η επιτυχής αλληλουχίας μπορεί να ληφθεί από μόλις 1 ng του DNA.

Η

Στη συνέχεια εξέτασε την επίδραση των διαφόρων τύπων πρωτογενούς δείγματος σχετικά με την απόδοση αλληλουχίας. Στατιστική διαφορά παρατηρήθηκε όσον αφορά τον αριθμό των διαβάζει και βάθος κάλυψη βάσης μεταξύ χειρουργικές εκτομές, βιοψίες και μπλοκ κυττάρων (τεστ Kruskal-Wallis, Πίνακας 3). Ωστόσο, το ποσοστό των αμπλικονίων με βάθος κάλυψη των περισσότερων από 500Χ ήταν σημαντικά υψηλότερο για μπλοκ κυττάρων από ό, τι για τις βιοψίες (Kruskal-Wallis test p = 0.02 και post-hoc test p = 0.02).

Τα αμπλικόνια ότι έδειξε μια κάλυψη κάτω από 250X θεωρήθηκαν ως μη κατατοπιστική. Το όριο αυτό είχε ήδη χρησιμοποιηθεί στη βιβλιογραφία [22]. Μερικά από τα αμπλικόνια του πάνελ επανειλημμένα απέτυχε να φθάσει 250X (σε περισσότερο από το 10% των δειγμάτων). Αυτά τα αμπλικόνια παρατίθενται στον Πίνακα 4. Τα αμπλικόνια που επανειλημμένα αποτύχει ήταν η ίδια για τα διάφορα είδη πρωτογενούς δείγματος (βιοψίες, μπλοκ των κυττάρων και η χειρουργική εκτομή). Για αυτούς τους αμπλικόνια, η περιεκτικότητα σε GC ήταν σημαντικά υψηλότερη (κατά μέσο όρο περιεχόμενο GC 7 αμπλικόνια που επανειλημμένα απέτυχαν ήταν 69,6% έναντι 48% για τις άλλες αμπλικόνια, ρ = 0,00005), ενώ το μήκος δεν ήταν σημαντικά διαφορετική (το μέσο μήκος των 7 αμπλικόνια που επανειλημμένα αποτύχει ήταν 108 bp έναντι 112 για τις άλλες αμπλικόνια).

Η

Σύγκριση με άλλες μεθόδους

Ένα σύνολο των 90 δειγμάτων FFPE, συμπεριλαμβανομένων 51 CRC και 39 NSCLC, ήταν αλληλουχία από NGS. Η μεταλλαξιογόνος κατάσταση του

KRAS

(εξόνιο 2) και

BRAF

(p.V600E) στο CRC και

EGFR

(p.L858R και διαγραφές στο εξώνιο 19) σε NSCLC είχε προηγουμένως εκτιμηθεί με PCR στο πλαίσιο της καθημερινής πρακτικής.

NSCLC.

αλληλουχίας ήταν επιτυχής για 38 από τα 39 δείγματα που εξετάστηκαν (97%), ενώ η

EGFR

ανάλυση με τη μέθοδο PCR ήταν επιτυχής για μόνο 35 από τα 39 δείγματα (90%). 34 δείγματα έχουν επιτυχή δοκιμή τόσο με NGS και PCR, επιτρέποντας τη μελέτη της αντιστοιχίας.

Χρησιμοποιώντας NGS, μεταλλάξεις στο

EGFR

ανιχνεύθηκαν σε 4/38 περιπτώσεις (10,5%). Τρεις στους τέσσερις

EGFR

μεταλλάξεις ανιχνεύθηκαν επίσης με PCR. Για ένα δείγμα που θεωρήθηκε ως μη κατατοπιστική με PCR, μια p.L861Q

EGFR

μετάλλαξη ανιχνεύτηκε χρησιμοποιώντας NGS (S2 Πίνακας). Επιπλέον, ένα p.L858R

EGFR

μετάλλαξη ανιχνεύτηκε με PCR και με NGS. Ωστόσο, για το δείγμα αυτό η Variant καλούντος ανιχνεύεται μετάλλαξη σε AF 1,9%? δεδομένο τα κριτήριά μας για να εξετάσει μια παραλλαγή ως αυθεντικό (βλέπε υλικά και μέθοδοι) δεν μπορεί να επικυρώσει αυτή την παραλλαγή.

Συνολικά, η συμφωνία μεταξύ των δύο μεθόδων για

EGFR

ανίχνευση μεταλλάξεων ήταν 33/34 (97%)

Επιπλέον, μεταλλάξεις σε άλλα γονίδια ανιχνεύτηκαν με NGS:. μεταλλάξεων στο

KRAS

για 15/38 δείγματα (39,5%), οι μεταλλάξεις σε

ΤΡ53

για 15/38 ασθενείς (39,5%), οι μεταλλάξεις σε

STK11

για 3/38 ασθενείς (7,9%), η μετάλλαξη σε

BRAF

για ένα δείγμα (2,6%), η μετάλλαξη σε

PIK3CA

για έναν ασθενή (2,6%), η μετάλλαξη σε

CTNNB1

για ένα δείγμα (2.6%). Μεταλλακτικές προφίλ των NSCLC συνοψίστηκαν στο σχήμα 1 και στον πίνακα S2. Συνολικά, 29/38 δείγματα χαρακτηρίζονται από τουλάχιστον μία μετάλλαξη (76,3%).

Οι μεταλλάξεις σε διαφορετικά γονίδια (σειρές) που αναφέρεται για κάθε δείγμα NSCLC (στήλες). Ένα γκρι τετράγωνο υποδεικνύει ότι η μετάλλαξη (αναφερόμενη στην κοσμική βάση δεδομένων (https://www.sanger.ac.uk/cosmic), εξαιρουμένων των πολυμορφισμός) βρέθηκε με την Colon Ampliseq και τον πίνακα του πνεύμονα στο γονίδιο, ενώ ένα κενό τετράγωνο υποδεικνύει ότι δεν έχει καμία ουσιαστική μετάλλαξη βρέθηκε για το γονίδιο

η

Τα 2 μεταλλάξεις KRAS ταυτίζεται με ένα AF & lt?. 6% (ένα p.G12S με AF του 4%, ένα p.G12D με AF 5%) έχουν ελεγχθεί από ddPCR. Τα 2 μεταλλάξεις ανιχνεύθηκαν με ddPCR με AF 1,1 και 5,7%, αντίστοιχα (S2 πίνακα).

CRC.

Sequencing και PCR ήταν επιτυχής για όλα τα δείγματα.

Χρήση NGS, μεταλλάξεις στο

KRAS

ανιχνεύθηκαν σε 30/51 περιπτώσεις (58,8%), ενώ

KRAS

ανάλυση με τη μέθοδο PCR ανιχνεύεται μόνο 23 περιπτώσεις μεταλλάξεων στο

KRAS

γονίδιο (45,1%). Πέντε από τις 7 ασύμφωνα περιπτώσεις χαρακτηρίζονται από μεταλλάξεις στα κωδικόνια 59, 61 και 146 (εξώνια 3 και 4) που δεν καλύπτονται από τη δοκιμή PCR. Μεταλλάξεις στα κωδικόνια 61 και 146 ελέγχθηκαν και επικυρωθεί από ddPCR (S3 Πίνακας) Για τις 2 υπόλοιπες περιπτώσεις δεν ανιχνεύονται με PCR,

KRAS

μετάλλαξη p.G12V ανιχνεύθηκε από NGS με AF 8 και 9%, αντίστοιχα. Αυτές οι μεταλλάξεις ανιχνεύθηκαν επίσης με ddPCR με AF 12,5 και 9%, αντίστοιχα. Στις 23 συγκλίνουσες περιπτώσεις, AF του

KRAS

μεταλλάξεις ήταν υψηλότερες από 20% για 21 περιπτώσεις? μόνο δύο περιπτώσεις χαρακτηρίζεται από AF των 9 και 10%, αντίστοιχα.

Το κατάστασης μεταλλάξεων του

BRAF

με PCR αξιολογήθηκε για 49 περιπτώσεις (για 2 περιπτώσεις που δεν υπήρχε αρκετό DNA) .

BRAF

μετάλλαξη p.V600E ανιχνεύθηκε για 5 ασθενείς (10,2%), χρησιμοποιώντας NGS ή PCR. . Επιπλέον, ένα

BRAF

μετάλλαξη p.E586K ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας NGS

Επιπλέον, μεταλλάξεις σε άλλα γονίδια εντοπίστηκαν από NGS: μεταλλάξεις στο

NRAS

για 2/51 ασθενείς (3,9%), μεταλλάξεις στο

TP53

για 32/51 ασθενείς (62,7%), μεταλλάξεις στο

PIK3CA

για 10/51 ασθενείς (19,6%) και μεταλλάξεις στο

FBXW7

για 5/51 δείγματα (9,8%). Τα 2 NRAS μεταλλάξεις και η p.E545K, p.H1047 PIK3CA μεταλλάξεις όλα επικυρωθεί από ddPCR (S3 Πίνακας).

προφίλ μεταλλάξεων του CRC συνοψίστηκαν στο Σχήμα 2 και S3 πίνακα. Συνολικά, 45/51 δείγματα χαρακτηρίζονται από τουλάχιστον μία μετάλλαξη (88,2%).

Οι μεταλλάξεις σε διαφορετικά γονίδια (σειρές) που αναφέρεται για κάθε δείγμα CRC (στήλες). Ένα γκρι τετράγωνο υποδεικνύει ότι η μετάλλαξη (αναφερόμενη στην κοσμική βάση δεδομένων (https://www.sanger.ac.uk/cosmic), εξαιρουμένων των πολυμορφισμός) βρέθηκε με την Colon Ampliseq και τον πίνακα του πνεύμονα στο γονίδιο, ενώ ένα κενό τετράγωνο υποδεικνύει ότι καμία σχετική μετάλλαξη βρέθηκε για το γονίδιο.

η

Συζήτηση

Ένα σημαντικό πλεονέκτημα του NGS πάνω από τις παραδοσιακές μεθόδους ανίχνευσης μετάλλαξης είναι η ικανότητά του για τη διαλογή πολλαπλές μεταλλάξεις σε πολλαπλά γονίδια ταυτόχρονα, χωρίς την ανάγκη να εκτελούν διάφορες διαδοχικές δοκιμές. Αρκετές μελέτες έχουν ήδη επικυρωθεί με τη χρήση της NGS και την υπεροχή της στον όρο της ευαισθησίας, την ταχύτητα και το κόστος σε σύγκριση με τις παραδοσιακές μεθόδους. [18, 23, 24] Στη δική μας εμπειρία, για τις δοκιμές συμπεριλαμβανομένων περισσότερων από δύο σε τρία διαφορετικά σημεία σύνδεσης, NGS είναι φθηνότερη, ταχύτερη και απαιτεί λιγότερο DNA από ότι θα χρειάζονται για τις παραδοσιακές μεθόδους. Αυτό έχει ιδιαίτερη σημασία για τα δείγματα κυτταρολογίας και βιοψίες μικρής ιστού για τις οποίες πρέπει να υποβληθούν σε διαλογή αρκετές μοριακές αλλαγές, όπως για τα δείγματα NSCLC π.χ. [9, 18]. Πράγματι, NGS απαιτεί μόνο 10 ng για την πλήρη παχέος εντέρου και του καρκίνου του πνεύμονα πίνακα, ενώ οι παραδοσιακές μέθοδοι μπορεί να απαιτήσει έως και 10 ng του DNA για κάθε μετάλλαξη δοκιμαστεί.

Η ακρίβεια (επαναληπτικότητα και η επαναληψιμότητα) ανάλυση χρησιμοποιώντας πρότυπα αναφοράς με γνωστό AF μας επέτρεψε να δείξουμε ότι όλες οι μεταλλάξεις με AF & gt? 5% ανιχνεύθηκαν με συνέπεια. Ωστόσο, οι μεταλλάξεις με AF & lt? 3% ανιχνεύθηκαν με ασυνέπεια. Επιπλέον, όταν κλινικά δείγματα αναλύθηκαν 5 φορές σε 3 διαφορετικά πειράματα, η παραλλαγή καλούντος ανιχνεύεται με ασυνέπεια μεταλλάξεις με AF & lt? 3% που δεν ανιχνεύονται από ddPCR, προτείνοντας ότι αυτές οι μεταλλάξεις αντιστοιχούν σε αντικείμενα αλληλουχίας, όπως συχνά παρατηρείται με το DNA εξάγεται από τα δείγματα FFPE [25-27]. Το όριο 4% ήταν έτσι επιλεγεί για την υποβολή εκθέσεων μετάλλαξη ως μια ισορροπία μεταξύ της μεγιστοποίησης την ευαισθησία και την ελαχιστοποίηση των ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων λόγω τεχνικών τεχνούργημα. Το όριο αυτό είναι συνεπές με άλλα δεδομένα ευαισθησίας και ειδικότητας που αναφέρονται στη βιβλιογραφία για αυτή την πλατφόρμα NGS [16, 21]. Χρησιμοποιώντας αυτό το όριο, μία περίπτωση NSCLC με μετάλλαξη p.L858R EGFR χάθηκε. Για αυτό το δείγμα, το Variant καλούντος ανιχνευθεί η μετάλλαξη στο AF 1,9%. Ωστόσο, λαμβάνοντας υπόψη τα κριτήρια μας για να θεωρηθεί μια παραλλαγή ως αυθεντική (AF & gt? 4% και παραλλαγή κάλυψη & gt? 30x), δεν θα μπορούσαμε να επικυρώσει αυτήν την παραλλαγή. Είχε πρόσφατα πρότεινε ότι κλινικά σχετικές παραλλαγές γονιδίων, όπως

EGFR

μεταλλάξεις για NSCLC, θα πρέπει να αναφερθεί ανεξάρτητα από την AF [28]. Στην τρέχουσα κλινική πρακτική μας, όταν παρατηρούμε ένα γνωστό κλινικά σχετική παραλλαγή του γονιδίου, αλλά με AF κάτω από το όριο, αναφέρουμε ότι η παραλλαγή του γονιδίου είναι ύποπτο, αλλά δεν έχει επιβεβαιωθεί και ότι θα ήταν ενδιαφέρον να δοκιμάσει ένα άλλο δείγμα από τον ασθενή εάν είναι διαθέσιμη .

οι διαφορές μεταξύ NGS και τις παραδοσιακές μεθόδους παρατηρήθηκαν για 2 περιπτώσεις CRC με μεταλλάξεις KRAS G12V, δύο με συχνότητα αλληλομόρφων & lt? 10%. Αυτή η χαμηλή AF μπορεί να εξηγήσει τις διαφορές επειδή το όριο της παραδοσιακής μεθόδου ποικίλει από 3 έως 20% του μεταλλαγμένου DNA για τη δοκιμή KRAS. Για αυτές τις 2 περιπτώσεις, το

KRAS

μεταλλάξεις p.G12V επικυρώθηκαν από ddPCR.

Μία από τις προκλήσεις χρησιμοποιώντας NGS είναι να ερμηνεύσει τις μεταλλάξεις που ανιχνεύθηκαν μέσα στο βιολογικό πλαίσιο. Όπως έχει ήδη περιγραφεί [28], οι παραλλαγές μπορούν να ομαδοποιηθούν σε τρεις κατηγορίες: i) εκείνες που ενδέχεται να έχουν άμεσο αντίκτυπο στην περίθαλψη των ασθενών και θεωρούνται προσφυγής? (Ii) αυτές που μπορεί να έχει βιολογική σημασία, αλλά δεν είναι σαφώς προσφυγής? και (iii) εκείνα τα οποία είναι άγνωστης σημασίας. Στην παρούσα μελέτη, ανάλυση NGS ανιχνεύονται μεταλλάξεις (εκτός από

EGFR

μεταλλάξεις για NSCLC και από

KRAS

και

NRAS

για CRC) με πιθανή κλινική επίπτωση για τους 4 ασθενείς με NSCLC (ένα

PIK3CA

μετάλλαξη και 3

STK11

μεταλλάξεις) και για 14 ασθενείς με CRC (10

PIK3CA

μεταλλάξεις, 5

BRAF

μεταλλάξεις-ένα υπόθαλψη ασθενή

PIK3CA

και

BRAF

μεταλλάξεις). Πράγματι, προκλινικά δεδομένα υποστηρίζουν την άποψη ότι κυτταρικές σειρές NSCLC με

PIK3CA

ή

STK11

και

KRAS

μετάλλαξη δείχνουν αυξημένη ευαισθησία σε αναστολείς PIK3 ή ΜΑΡΚ και mTOR αναστολή σηματοδότησης, αντίστοιχα [29] – [30]. Επιπλέον, μια φάσης Ι κλιμάκωσης της δόσης κλινική δοκιμή ενός αναστολέα της ΡΙ3Κ παν-κατηγορίας Ι σε ασθενείς με προχωρημένους συμπαγείς όγκους-πρωτίστως ορθοκολικού, μαστού και πνεύμονα-έδειξαν προκαταρκτικά αντικαρκινική δραστηριότητα [31]. Κατά τον ίδιο τρόπο, εμφανή δραστηριότητα κατά του όγκου παρατηρήθηκε για τους ασθενείς με

BRAF

μεταλλαγμένα CRC θεραπεία με έναν εκλεκτικό αναστολέα μεταλλαγμένο γονίδιο BRAF [32].

Εν κατακλείδι, η παρούσα μελέτη επικύρωσε την κλινική εφαρμογής του παχέος εντέρου Ion Ampliseq και ο πίνακας του καρκίνου του πνεύμονα στο Ion Torrent Personal Genome Machine για τη διαλογή του πνεύμονα και του παχέος εντέρου. Συνολικά, το παχύ έντερο /πνεύμονα πίνακα καρκίνο AmpliSeq ήταν συγκεκριμένες και αρκετά ευαίσθητη για την ανάλυση μετάλλαξης του πάνελ γονιδίων και μπορεί να ενσωματωθεί σε κλινική καθημερινή πρακτική.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 αρχείου. Συμπληρωματικές μέθοδοι:. Ανίχνευση KRAS, BRAF και οι μεταλλάξεις του EGFR και σταγονίδιο ψηφιακή PCR

doi: 10.1371 /journal.pone.0138245.s001

(DOCX)

S1 πίνακα. ανάλυση κάλυψης για παραλλαγές που δεν ανιχνεύονται με συνέπεια στην ανάλυση της ακρίβειας

doi:. 10.1371 /journal.pone.0138245.s002

(DOC)

S2 πίνακα. Αποτελέσματα αλληλούχισης του NSCLC

doi:. 10.1371 /journal.pone.0138245.s003

(DOCX)

S3 πίνακα. Αποτελέσματα αλληλούχισης του CRC

doi:. 10.1371 /journal.pone.0138245.s004

(DOCX)