Αφηρημένο

καρκίνο του στομάχου είναι μια από τις πιο συχνές κακοήθειες σε όγκους στις χώρες της Ανατολικής Ασίας. Προσδιορισμός ακριβής προγνωστικοί δείκτες και αποτελεσματική θεραπευτικών στόχων είναι σημαντική στη θεραπεία του καρκίνου του στομάχου. microRNAs (miRNAs) παίζουν σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση. Πάντως, οι μηχανισμοί με τους οποίους miRNAs ρυθμίζουν γαστρική μετάσταση καρκίνου παραμένει ελάχιστα κατανοητή. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι τα επίπεδα του miR-410 σε γαστρικό καρκίνο και κυτταρικές γραμμές ήταν πολύ χαμηλότερη από εκείνη στο φυσιολογικό έλεγχο, αντίστοιχα, και το χαμηλότερο επίπεδο του miR-410 ήταν σημαντικά σχετίζεται με μετάσταση λεμφαδένων. Η επιμόλυνση του miR-410 μιμείται θα μπορούσε να αναστείλει σημαντικά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και εισβολή στις κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου HGC-27. Σε αντίθεση, knockdown του miR-410 είχε το αντίθετο αποτέλεσμα επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, μετανάστευση και εισβολή. Επιπλέον, βρήκαμε επίσης ότι MDM2 αρνητικά ρυθμίζεται από miR-410 στο μετα-μεταγραφικό επίπεδο, μέσω μία ειδική θέση στόχου με το 3’UTR με δοκιμασία λουσιφεράσης. Η έκφραση του ΜΌΜ2 ήταν αντιστρόφως ανάλογη με την έκφραση miR-410 στο γαστρικό καρκινικούς ιστούς, και η υπερέκφραση του MDM2 σε miR-410-μορφομετατραπέντα κύτταρα γαστρικό καρκίνο διασώθηκε αποτελεσματικά την αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της εισβολής που προκαλούνται από miR-410. Έτσι, τα ευρήματά μας πρότεινε ότι miR-410 έδρασε ως νέος καταστολέας όγκου με στόχευση του γονιδίου MDM2 και αναστέλλοντας γαστρικού καρκινικών κυττάρων τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή. Τα ευρήματα αυτής της μελέτης συνέβαλαν στην τρέχουσα κατανόηση των λειτουργιών του miR-410 στο γαστρικό καρκίνο

Παράθεση:. Shen J, Niu W, Zhou Μ, Zhang Η, Ma J, Wang L, et al. (2014) microRNA-410 Καταστέλλει τη Μετανάστευση και την εισβολή από Στόχευση MDM2 σε γαστρικό καρκίνο. PLoS ONE 9 (8): e104510. doi: 10.1371 /journal.pone.0104510

Επιμέλεια: Jin Ερ Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & amp? Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6 Μαΐου του 2014? Αποδεκτές: 9 Ιούλη του 2014? Δημοσιεύθηκε: 19, Αύγ του 2014

Copyright: © 2014 Shen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Anhui Provincial Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών (. ΟΧΙ 1208085QH169) https://220.178.98.52/zrkxjj/. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή οι

Διαφορετικές στρατηγικές έχουν χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία του γαστρικού καρκίνου (GC), η οποία είναι ο τέταρτος συχνότερος καρκίνος και η δεύτερη κύρια αιτία θανάτων καρκίνου στον κόσμο [1], [2]. Οι περισσότεροι ασθενείς GC έχει διαγνωστεί σε στάδιο ΙΙΙ ή IV, και ο ρυθμός της μετάστασης λεμφαδένα είναι υψηλή [3], [4]. Σήμερα, οι ασθενείς με το GC όψιμη φάση είναι με την επιβίωση μιας συνολικής 5 φετινή appoximately 20% [5]. Αυτών, έχει μεγάλη κλινική αξία για τη διαλεύκανση περαιτέρω των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στη μετάσταση GC και για την ταυτοποίηση νέων δεικτών για τη διάγνωση, την πρόγνωση και τη θεραπεία για τους ασθενείς με GC.

microRNAs (miRNAs) είναι μικρά μη κωδικοποιητική RNAs από ~ 22 νουκλεοτιδίων στο μήκος που ρυθμίζουν την έκφραση των mRNAs στόχου τους μέσω μεταφραστικής καταστολής ή mRNA διάσπασης [6]. Εμπλέκονται σε κρίσιμες βιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης και διαφοροποίησης [7], [8]. Η απορύθμιση της miRNAs συσχετίζεται να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου με τη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, διαφοροποίηση, απόπτωση και carcinogesis [9], [10]. Η ανώμαλη έκφραση των miRNAs ή μεταλλάξεις των γονιδίων miRNA έχουν καλά μελετηθεί σε πολλούς τύπους όγκων, συμπεριλαμβανομένου του λεμφώματος, του πνεύμονα, του παγκρέατος, της λευχαιμίας, του μαστού, του παχέος εντέρου και καρκίνων του ήπατος [11] – [15]. Ωστόσο, οι ρόλοι των miRNAs σε GC παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστες.

Προηγούμενες μελέτες έχουν διερευνήσει το ρόλο του miR-410 σε διάφορες μορφές καρκίνου. Gattolliat et al [16] .demonstrated ότι η έκφραση του miR-410 ήταν σημαντικά σχετίζεται με τη νόσο επιβίωση χωρίς τη μη ενισχυμένο ευνοϊκή νευροβλάστωμα. Περαιτέρω, Chen στο el [17] βρήκαν ότι η έκφραση του miR-410 μειώθηκε σε ανθρώπινα γλοιώματα και την αναγκαστική έκφραση του miR-410 σε κύτταρα γλοιώματος ανέστειλε ισχυρά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, που προκαλείται από την εισβολή στόχευση ΚΟΑ. Επιπλέον, Chien et al [18] διαπίστωσε ότι το miR-410 ρυθμίζεται αρνητικά pRb /E2F μονοπάτι με απευθείας στόχευση CDK1 που ήταν ένα ογκογονίδιο στον καρκίνο του μαστού. Ωστόσο, ο ρόλος του miR-410 σε GC παραμένει ασαφής. Στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε ότι μειωμένη έκφραση miR-410 είναι ένα χαρακτηριστικό μοριακό αλλαγή στο GC και διερευνήθηκε η επίδραση του διαμορφωμένου επίπεδα miR-410 επί των φαινοτύπων των κυτταρικών GC γραμμών. Έχουμε, επίσης, έδειξε ότι το miR-410 μπορεί να λειτουργήσει ως ένα ογκογονίδιο με απευθείας στόχευση MDM2.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Όλοι αυτοί οι ασθενείς συμφώνησαν να συμμετάσχουν στη μελέτη και έδωσε γραπτή συγκατάθεση. Τόσο η μελέτη αυτή και συγκατάθεση εγκρίθηκαν από την ηθική του διοικητικού συμβουλίου της Anhui Provincial Hospital και συμμορφώθηκε με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι.

Ανθρώπινα δείγματα

Ανθρώπινο GC και τα αντίστοιχα μη-νεοπλασματικές γαστρικού δείγματα συλλέχθηκαν τους κατά το χρόνο της χειρουργικής εκτομής από το Anhui Επαρχιακό Νοσοκομείο από το 2008 έως το 2009. Γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε πριν από τη συλλογή. Ένα μέρος σταθεροποιήθηκε με 10% φορμαλίνη για ιστοπαθολογική διάγνωση, και η άλλη αμέσως συμπληρωματικό καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και αποθηκεύονται στους -196 ° C σε υγρό άζωτο μέχρι εκχυλίζεται RNA. Χρήση ανθρώπινων ιστών εγκρίθηκε από την Κλινική Επιτροπή Ερευνητικής Δεοντολογίας της Anhui Provincial Hospital.

καλλιέργειας κυττάρων

SGC-7901, HGC-27, MGC-803, ΜΚΝ-45 και τα κύτταρα ΗΕΚ293Τ ήταν αγοράστηκε από την Σαγκάη Ινστιτούτο Βιοχημείας και Κυτταρικής Βιολογίας στο κινεζική Ακαδημία Επιστημών. Γαστρικού επιθηλίου-1 κυττάρων (GES) λήφθηκε από την Σαγκάη Ruijin Νοσοκομείο Σαγκάη Jiaotong University School of Medicine. Το SGC-7901, HGC-27, MGC-803, ΜΚΝ-45 και GES διατηρήθηκαν σε RPMI1640 και ΗΕΚ293Τ διατηρήθηκε σε τροποποιημένο μέσο μέσο Eagle κατά Dulbecco. Το μέσο συμπληρώθηκε με 10% ορό εμβρύου μόσχου. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο θάλαμο που περιέχει 5% διοξείδιο του άνθρακα.

Πλασμίδια και διαμόλυνσης κυττάρων

MiR-410 μιμητικό /αναστολέα και οι έλεγχοι αγοράστηκαν από RiboBio (Guangzhou, Κίνα). Τα κύτταρα HGC-27 σπάρθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων σε 30% συρροή μία ημέρα πριν από την επιμόλυνση. Η επιμόλυνση με miR-410 μιμούνται /αναστολέα ή των ελέγχων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Lipofectamine αντιδραστήριο 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). σύμπλοκα Επιμόλυνση παρασκευάστηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

qRT-PCR

Για προσδιορισμούς qRT-PCR, το συνολικό RNA εκχυλίστηκε από τα κύτταρα με το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε με τη PrimeScript RT Kit αντιδραστηρίου με gDNA γόμα (Takara) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η έκφραση του miR-410 επαληθεύτηκε από την αλλαγή του stemloop RT-PCR με ειδικούς RT και PCR εκκινητών. U6 snRNA χρησιμοποιήθηκε ως ενδογενή έλεγχο. αντιδράσεις RT πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση κλάσμα RNA με Promega RT Kit ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Οι συνθήκες PCR διεξήχθησαν με μετουσίωση του DNA στους 94 ° C για 4 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους ενίσχυσης: 94 ° C για 40 s, 52 ° C για 40 s, 72 ° C για 40 s για τη συλλογή δεδομένων. Ποσοτική PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα ΑΒΙ 7500 θερμοκυκλοποιητή (Applied Biosystems) χρησιμοποιώντας SYBR πρόμιγμα Ex Taq (Perfect Real Time) Kits (Takara, Ιαπωνία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

κυτταρικού πολλαπλασιασμού Δοκιμασία

Ένα σύνολο 10

4 κύτταρα ανά πηγάδι τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων πριν την επιμόλυνση και καλλιεργούνται για 24 ώρες σε κανονικές συνθήκες. Αυτά στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με miR-410 μιμούνται ή αναστολέα αντι-miR-410, μαζί με συζευγμένες αρνητικούς μάρτυρες. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε με τη χρήση του κυττάρου Μετρώντας Kit 8 (Dojindo, Τόκιο, Ιαπωνία) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

μετανάστευση κυττάρων και εισβολή

δοκιμασία

Για τις δοκιμασίες μετανάστευσης, 5 × 10

4 κύτταρα προστέθηκαν μέσα στον άνω θάλαμο του ενθέτου (BD Bioscience, 8-μm μέγεθος πόρων). Για τους προσδιορισμούς εισβολής, 1 × 10

5 κυττάρων προστέθηκαν στον άνω θάλαμο του ενθέτου προεπικαλυμμένα με Matrigel (BD Bioscience). Σε αμφότερες τις δοκιμασίες, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε μέσο χωρίς ορό, και μέσο που περιέχει 10% FBS στον κάτω θάλαμο υπηρέτησε ως χημειοπροσελκυστικό. Μετά από αρκετές ώρες επώασης, τα κύτταρα που δεν μεταναστεύουν ή εισβάλλουν μέσω των πόρων προσεκτικά σκουπιστεί έξω με βαμβάκι. Στη συνέχεια, τα ένθετα βάφτηκαν με 20% μεθανόλη και 0,2% crystal violet, απεικόνιση, και μετρήθηκαν με ένα IX71 ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Olympus).

Western ανάλυση κηλίδος

Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε SDS-πολυακρυλαμιδίου ηλεκτροφόρηση γέλης και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Η μεμβράνη μπλοκαρίστηκε με 5% μη λιπαρό γάλα και επωάστηκαν με το μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού αντι-MDM2 (1:1000? Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ, USA) και το μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-β-GAPDH ποντικού (1:10000 ? Sigma). Οι πρωτείνες ανιχνεύθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια αντιδραστήρια (Pierce, Rockford, IL, USA).

λουσιφεράσης ανταποκριτής δοκιμασία

κύτταρα ΗΕΚ293Τ απλώθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων. Μετά από 24-ώρες επώασης, ένα μίγμα 100 ng pLuc 3’UTR, 5-pmol αρνητικό έλεγχο, miR-410 μιμητικό συνεπιμολύνθηκε με 20 ng.

Renilla σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, πυγολαμπίδας και δραστηριότητες λουσιφεράσης Renilla μετρήθηκαν με το Dual-Luciferase Reporter System (Promega, Madison, WI, USA). Η αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης ομαλοποιήθηκε με συνδιαμόλυνση με ένα φορέα ρεπόρτερ Renilla.

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως το μέσο ± τυπική απόκλιση των κατά τα τρία τουλάχιστον πειραμάτων. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση SPSS 15.0. Μία μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης δοκιμής (ANOVA) και t δοκιμή Student χρησιμοποιήθηκε για τη στατιστική ανάλυση. Μια τιμή του ρ & lt?. 0.05 θεωρήθηκε ότι υποδηλώνει στατιστική ανάλυση

Αποτέλεσμα

Η έκφραση του miR-410 ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται στο κελί GC και ιστών

Για την εκτίμηση ο ρόλος του miR-410 σε GC, αξιολογήσαμε την έκφραση του miR-410 στο κελί GC γραμμή, ιστούς και συμφωνημένα φυσιολογικούς ιστούς τους χρησιμοποιώντας ποσοτική RT-PCR. Βρήκαμε ότι τα επίπεδα miR-410 ήταν συχνά κάτω-ρυθμίζονται σε κυτταρικές σειρές GC σε σύγκριση με το ΓΕΣ. Η Εικόνα 1Β δείχνει ότι τα επίπεδα miR-410 ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω σε ιστούς GC σε σύγκριση με εκείνους σε συμφωνημένα φυσιολογικούς ιστούς. Το μέσο επίπεδο έκφρασης σε ιστούς καρκινώματος (συνδυασμός) ήταν σημαντικά υψηλότερη σε σύγκριση με παρακείμενες μη νεοπλασματικά ιστούς τους (Σχήμα 1C). Δείξαμε επίσης ότι η έκφραση του miR-410 στις μεταστάσεις GC ιστούς ήταν χαμηλότερη από ότι σε μη-μεταστάσεις ιστούς (Σχ. 1D).

A. ανάλυση qRT-PCR της έκφρασης miR-410 σε τέσσερις κυτταρικές γραμμές που προέρχονται από καρκίνο του στομάχου και μία μη κακοήθη γαστρικού κυτταρική γραμμή (GES). (Β) ανάλυση qRT-PCR του miR-410 έκφρασης σε 60 ιστούς ζεύγη GC και τα αντίστοιχα γειτονικά nontumorous ιστούς τους. Η έκφραση του miR-410 ομαλοποιήθηκε με U6 snRNA. (Γ) Σχετικά επίπεδα έκφρασης του miR-410 σε ιστούς GC και παρακείμενο φυσιολογικό περιοχές? (Δ) Η στατιστική ανάλυση της σχέσης μεταξύ του επιπέδου των miRNAs μεταξύ στάδιο μ.μ. (αριθ μετάσταση και μετάσταση, αντίστοιχα)? * P & lt? 0,05 και ** p & lt?. 0.01

Η

miR-410 ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων GC, τη μετανάστευση και την εισβολή

Τα επίπεδα του miR-410 ήταν σημαντικά αυξημένη στα κύτταρα GC ότι επιμολύνθηκαν με miR-410 μιμείται και τα επίπεδα miR-410 μειώθηκαν που υποβλήθηκαν σε αγωγή με τον αναστολέα miR-410 (Σχ. 2Α). Up-ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού miR-410 ανέστειλε GC? Αντίθετα, knockdown του miR-410 είχε το αντίθετο αποτέλεσμα επί του κυττάρου πολλαπλασιασμό (Εικ. 2Β). Επιπλέον, η δοκιμασία προσδιορισμού transwell και εισβολή έδειξε ότι η μετεγκατάσταση και διεισδυτικότητα των κυττάρων επιμολυσμένων με miR-410 μιμείται ήταν δραματικά μειωμένη σε σύγκριση με τον έλεγχο και μη επεξεργασμένα κύτταρα. Δείξαμε επίσης ότι η μετεγκατάσταση και διεισδυτικότητα των κυττάρων επιμολυσμένων με αναστολέα miR-410 ήταν δραματικά αυξημένη σε σύγκριση με τον έλεγχο και μη επεξεργασμένα κύτταρα. (Σχ. 2C και D).

Η έκφραση του miR-410 κανονικοποιήθηκε προς U6 snRNA. (Β) Τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με miR-410 μιμείται, αναστολείς ή sramble ή καμία διαμόλυνση μετρήθηκαν με δοκιμασία CCK8 σε διαφορετικές χρονικές περιόδους. (C) Transwell ανάλυση των HGC-27 κυττάρων μετά από θεραπεία με miRNA μιμείται, αναστολείς ή αγωνίζομαι ή χωρίς επιμόλυνση? Η σχετική αναλογία του μετανάστευσαν κυττάρων ανά πεδίο φαίνεται παρακάτω. (D) Transwell ανάλυση των HGC-27 κυττάρων μετά από θεραπεία με miRNA μιμείται, αναστολείς ή αγωνίζομαι ή χωρίς επιμόλυνση? η σχετική αναλογία των μεταστατικών κυττάρων ανά πεδίο παρουσιάζεται πιο κάτω, * ρ & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01 και *** ρ & lt?. 0.001

Η

miR-410 άμεσα στοχευμένες MDM2 σε GC

Όπως προβλέπεται από PicTar, υπήρξε συμπληρωματικότητα μεταξύ έχει-miR-410 και MDM2 3′-UTR (Εικ. 3Α). Για να αποδείξει ότι το miR-410 ρυθμίζει άμεσα MDM2, χρησιμοποιήσαμε ένα σύστημα αναφοράς διπλής λουσιφεράσης. Βρήκαμε ότι η συν-έκφραση της miR-410 κατέστειλε σημαντικά την firely δραστικότητας ανταποκριτή λουσιφεράσης του άγριου τύπου MDM2 3’UTR αλλά όχι ο μεταλλαγμένος 3’UTR (Σχ. 3Β). Η υπερέκφραση του miR-410 μείωσε την έκφραση της MDM2 mRNA και της πρωτεΐνης (Εικ. 3C και D).

(Α) Οι αλληλουχίες των θέσεων σύνδεσης miR-410 εντός του ανθρωπίνου MDM2 3’UTRs και σχηματική κατασκευάσματα ανταποκριτή, σε αυτόν τον πίνακα, c-MDM2-WT αντιπροσωπεύουν τις κατασκευάσματα ανταποκριτή που περιέχει το σύνολο των 3’UTR αλληλουχίες MDM2. C-MDM2-MUT αντιπροσωπεύουν τις δομές δημοσιογράφος που περιέχουν μεταλλαγμένα νουκλεοτίδια. (Β) Η ανάλυση των σχετικών λουσιφεράσης δραστηριότητες της MDM2-WT, MDM2-MUT στα κύτταρα 293Τ. Οι ράβδοι σφάλματος που προέρχονται από εις τριπλούν expriments. ανάλυση (C) qRT-PCR της έκφρασης ΜΌΜ2 mRNA σε HGC-27 κυττάρων μετά από θεραπεία με μιμείται miRNA ή αγωνίζομαι ή χωρίς επιμόλυνση. Η έκφραση του MDM2 κανονικοποιήθηκε προς GAPDH. (Δ) Ανάλυση Western blot της έκφρασης MDM2 σε HGC-27 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-410 μιμείται ή σκαρφάλωμα ή καμία διαμόλυνση. GAPDH ανιχνεύθηκε επίσης ως μάρτυρας φόρτωσης.

Η

Η υπερέκφραση του MDM2 από μειωμένη miR-410 που προκαλείται από την αναστολή της εισβολής στα κύτταρα GC

Πραγματοποιήσαμε πειράματα διάσωσης από επιμόλυνση 3’UTR- αρνητικό MDM2 μαζί με miR-410. Όπως ήταν αναμενόμενο, επιμόλυνση με το pcDNA3.1-MDM2 ανακουφιστεί η μείωση του MDM2 προέκυψε από miR-410 μιμούνται θεραπεία (Εικ. 4Α). Σε συμφωνία με την έκφραση των πρωτεϊνών στόχων, η επιμόλυνση με το pcDNA3.1-MDM2 μετρίασε την αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Εικ. 4Β) και την αύξηση των μεταστατικών κυττάρων (Εικ. 4C) προέκυψε από miR-410 μιμούνται θεραπεία.

(Β) καμπύλες ανάπτυξης κυττάρου σε HGC-27 κύτταρα επιμολυσμένα με διαφορετικούς συνδυασμούς. (D) Transwell ανάλυση των HGC-27 κύτταρα κατεργασμένα με διαφορετικούς συνδυασμούς. Η σχετική αναλογία των μεταστατικών κυττάρων ανά πεδίο εμφανίζεται δεξιά. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt?. 0.001

Η

MDM2 ήταν αντιστρόφως εκφράζεται με miR-410 στο GC

Για την περαιτέρω διαλεύκανση της σχέσης μεταξύ miR -410 και έκφραση MDM2 σε πρωτογενή δείγματα, έχουμε κατ ‘αρχάς ανιχνεύεται MDM2 σε κυτταρικές σειρές GC. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α και 5Β, το mRNA και η πρωτεΐνη έκφραση ΜΌΜ2 ήταν πολύ Higer στις κυτταρικές γραμμές 4 GC από ότι στην GES. Βρήκαμε επίσης ότι η έκφραση του ΜΌΜ2 σε ιστούς GC ήταν σημαντικά υψηλότερο από ό, τι τα αντίστοιχα γειτονικά φυσιολογικούς ιστούς (Σχ. 5C). Το διάγραμμα διασποράς και η ανάλυση συσχέτισης Pearson έδειξε, επίσης, ότι η έκφραση του miR-410 ήταν αρνητική συσχέτιση με τα επίπεδα της πρωτεΐνης-στόχου στα δείγματα GC (Εικ. 5D). Αυτά τα δεδομένα πρότειναν ότι η μειωμένη έκφραση miR-410 είχε σχέση με την αύξηση των επιπέδων MDM2 στο μεγαλύτερο μέρος των ασθενών GC.

(Α) Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης ΜΌΜ2 mRNA προσδιορίστηκαν με qRT-PCR σε τέσσερις κυτταρικές γραμμές που προέρχεται από καρκίνο του στομάχου και ένα μη κακοήθη γαστρική κυτταρική σειρά (GES). Η έκφραση του MDM2 κανονικοποιήθηκε προς GAPDH. (Β) Ανάλυση Western blot της έκφρασης MDM2 σε τέσσερις κυτταρικές γραμμές που προέρχονται από καρκίνο του στομάχου και μία μη κακοήθη γαστρικού κυτταρική γραμμή (GES). GAPDH ανιχνεύθηκε επίσης ως έλεγχος φόρτωσης. (C) Ανάλυση qRT-PCR της έκφρασης MDM2 σε 40 ζεύγη γαστρικό καρκινικούς ιστούς και τα αντίστοιχα γειτονικά τους φυσιολογικούς ιστούς. Η έκφραση του MDM2 κανονικοποιήθηκε προς GAPDH. Η έκφραση της MDM2 σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς ήταν σημαντικά υψηλότερο από ό, τι τα αντίστοιχα γειτονικά φυσιολογικούς ιστούς. (D) Ανάλυση συσχέτισης του miR-410 και την έκφραση MDM2 σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt?. 0.001

Η

Συζήτηση

miRNAs έχουν ενεργήσει ως σημαντικοί ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο και ρυθμίζουν ένα ευρύ φάσμα φυσιολογικών και αναπτυξιακών διαδικασιών [6], [19], [20]. Τοποθέτηση ενδείξεις υποδηλώνουν ότι οι μεταβολές στην έκφραση του miRNAs συμβάλλουν στην παθογένεση των πλέον ανθρώπινων καρκίνων, που μπορούν να δράσουν είτε ως ογκογονίδια ή καταστολείς όγκων [21], [22]. Πρόσφατα, συσσωρεύοντας τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι οι miRNAs εμπλέκονται σε πολλές σημαντικές βιολογικές εκδηλώσεις, όπως ογκογένεση και τη μετάσταση του καρκίνου [23], [24]. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε η βιολογικός ρόλος των miR-410 στην ογκογένεση του ανθρώπου GC. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι miR-410 ήταν συχνά ρυθμίζεται προς τα κάτω σε ανθρώπινο GC και ότι κάτω ρύθμιση του συσχετίστηκε σημαντικά με το κλινικό στάδιο και μετάσταση λεμφαδένα. Η αναγκαστική έκφραση του miR-410 θα μπορούσε να αυξήσει τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή της γραμμής κυττάρων GC in vitro. Έχουμε ακόμη εντοπιστεί MDM2, ένα υποθετικό ογκοκατασταλτικό γονίδιο, ως άμεση λειτουργική στόχο του miR-410. Για τις γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη μελέτη για να διερευνήσει τον ρόλο του miR-410 στο GC, και τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το miR-410 έδρασε ως ένα νέο ογκογονίδιο στο GC.

Η απορρύθμιση του miR-410 είναι ένα συχνό συμβάν σε διάφορους καρκίνους, γεγονός που υποδηλώνει ότι miR-410 μπορεί να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση και την εξέλιξη του όγκου. Gattolliat και οι συνεργάτες του δείχνουν ότι η έκφραση miR-410 ήταν σημαντικά σχετίζεται με τη νόσο επιβίωση χωρίς τη μη ενισχυμένο ευνοϊκή νευροβλάστωμα [16]. Περαιτέρω, Chen [17] διαπίστωσε ότι το miR-410 έκφρασης μειώθηκε σε ανθρώπινα γλοιώματα και ανάγκασε miR-410 έκφρασης σε κύτταρα γλοιώματος ανέστειλε έντονα τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την εισβολή διαμεσολαβείται από τη στόχευση ΚΟΑ. Ωστόσο, η έκφραση και η λειτουργία των miR-410 στην ανάπτυξη των GC δεν έχει αναφερθεί. Σε αυτή τη μελέτη, προσδιορίσαμε την έκφραση του miR-410 σε διάφορες κυτταρικές γραμμές και GC της GES χρησιμοποιώντας qRT-PCR. Η έκφραση του miR-410 ήταν σημαντικά αυξημένη σε όλες τις κυτταρικές σειρές τέσσερα GC σε σχέση με το ΓΕΣ. Επιπλέον, τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από ιστό κλινικές GC επιβεβαίωσε επίσης ότι miR-410 ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω στους ιστούς GC σε σύγκριση με τα ζεύγη μη-καρκινικές παρακείμενους ιστούς, υποδεικνύοντας πιθανή εμπλοκή της σε τόσο ογκογόνο μετασχηματισμό και μετάσταση όγκου. Εμείς στη συνέχεια επιβεβαίωσε ότι η αναστολή του miR-410 προωθείται σημαντικά κυττάρων GC πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή in vitro.

Είμαστε ακόμη διερευνηθεί το μοριακό μηχανισμό που διέπουν το ρόλο του miR-410 και προσδιορίζονται MDM2 ως άμεση λειτουργική κατάντη στόχος της miR-410 στα κύτταρα GC. προσεγγίσεις βιοπληροφορική, οι οποίες χρησιμοποιήθηκαν για την πρόβλεψη των στόχων των miRNAs, υπογράμμισε υψηλό αγώνα σπόρο δωρεάν ενέργεια στο καλά διατηρημένο χώρο miRNA-δέσμευσης και mRNAs στόχο της, αλλά η ειδικότητα παρέμεινε ένα πρόβλημα στον καθορισμό των στόχων των πολλών miRNAs. Ετσι, υπερ-έκφραση ενός miRNA μπορούσε ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφραση της πρωτεΐνης στόχου. Συμπληρωματική αλληλουχία του miR-410 προσδιορίζονται στην 3’UTR του MDM2 mRNA. Περαιτέρω, δείξαμε ότι miR-410 στοχεύει άμεσα την 3’UTR της MDM2, όπως η υπερέκφραση του συνδέθηκε με την καταστολή της δραστηριότητας της λουσιφεράσης. Επιπλέον, μια σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω στο επίπεδο της MDM2 πρωτεΐνης παρατηρήθηκε μετά από miR-410 υπερέκφραση, υποδεικνύοντας μετα-μεταγραφική ρύθμιση της MDM2 μέσω στόχευσης 3’UTR της. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι miR-410 μπορεί να λειτουργήσει ως καταστολέας όγκου εν μέρει προκαλούνται από καταστολή έκφρασης miR-410 στην ανάπτυξη των GC.

MDM2 είναι ένα ογκογονίδιο το οποίο ήταν αρχικά ανακαλύφθηκε σε ένα τόπο ενισχύθηκαν σε χρωμοσώματα διπλό λεπτά σε ένα ογκογόνο κυτταρική σειρά ποντικού (3Τ3-DM) [25]. Η κύρια λειτουργία του MDM2 είναι να αναστέλλει ρ53 βιοδραστικότητα αναστέλλοντας τη μεταγραφική δραστικότητα της ρ53 και της προώθησης αποικοδόμηση πρωτεΐνης p53 [26] – [28]. Υψηλά επίπεδα MDM2 μειωμένα επίπεδα της πρωτεΐνης ρ53 και μπορεί να εξασθενήσει η λειτουργία ρ53, η οποία αυξημένο κίνδυνο καρκίνου και /ή ο σχηματισμός επιταχυνόμενη όγκου και προόδου [29]. Το ογκογονίδιο MDM2 έπαιξε σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου [30]. Η υπερέκφραση του MDM2 σε καρκινικά κύτταρα επαγόμενο πολλαπλασιασμό κυττάρου, αναστέλλει τον κυτταρικό απόπτωση [31]. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι MDM2 υπερέκφραση συσχετίστηκε με κακή επιβίωση και ήταν ένα χρήσιμο προγνωστικό παράγοντα για την κακή πρόγνωση σε ανθρώπους με ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα καρκίνωμα του μαστού και [32], [33]. Επιπλέον, η πρόσφατη μελέτη έχουν διαπιστώσει ότι MDM2 εκφράστηκε σε υψηλότερα επίπεδα σε ιστούς GC σε σχέση με το μη-καρκινικές γαστρικό βλεννογόνο, και η έκφραση ΜϋΜ2 συνδέθηκε με κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά σε ασθενείς που έλαβαν μόνο με χειρουργική επέμβαση [34], [35]. Επιπλέον, knockdown του MDM2 ή υπερέκφραση JWA έχει συνεργιστική επίδραση επί της καταστολής του γαστρικού πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων και τη μετανάστευση [35]. Ωστόσο, ο μηχανισμός πως MDM2 ήταν η υπερέκφραση είναι ακόμα άγνωστη. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ικανότητα του miR-410 για τη στόχευση MDM2 μπορεί να παρέχει ένα τέτοιο μηχανισμό της μετα-μεταγραφικό έλεγχο του MDM2.

Συνοπτικά, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι miR-410 ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε GC κυττάρων και ιστών. Επιβάλλεται η έκφραση του miR-410 αυξημένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων GC, τη μετανάστευση και την εισβολή μέσω της άμεσης στόχευσης MDM2. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η νέα αυτή miR-410 του άξονα /MDM2 παρέχει νέες γνώσεις σχετικά με την μηχανισμών που διέπουν τη μετάσταση του όγκου, και την καταστολή των miR-410 έκφρασης μπορεί να είναι μια δυνητική θεραπευτική στρατηγική για την αντιμετώπιση του GC στο μέλλον.

Συμπληρωματικές πληροφορίες

πίνακα S1.

κλινικοπαθολογικοί ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ασθενών με GC

doi:. 10.1371 /journal.pone.0104510.s001

(DOCX)

Πίνακας S2.

Primer ακολουθία

doi:. 10.1371 /journal.pone.0104510.s002

(DOCX)