Αφηρημένο

Ιστορικό

επιθηλιακών κυττάρων μετασχηματισμού ακολουθία 2 (ECT2) είναι ένας παράγοντας ανταλλαγής νουκλεοτιδίων γουανίνης για Rho οικογένεια ΘΤΡάσης, η οποία έχει έχουν εμπλακεί στην κακοήθη φαινότυπο ανθρώπινων καρκίνων. Λίγα είναι γνωστά για την επίδραση του υψηλού επιπέδου ECT2 στη ρύθμιση του στόματος καρκινικών κυττάρων συμπεριφορά. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε η συμμετοχή των ECT2 σε καρκίνωμα του στόματος πλακωδών κυττάρων (OSCC).

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

αναλύσαμε την έκφραση ECT2 σε OSCC που προέρχονται από κυτταρικές σειρές και πρωτογενή OSCCs σε σύγκριση με το συμφωνημένα φυσιολογικό ιστό (n = 96) με ποσοτική ανάστροφης μεταγραφάσης αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης, στύπωμα Western, και ανοσοϊστοχημεία. Στη συνέχεια αξιολογήθηκε η συσχέτιση μεταξύ της κατάστασης έκφρασης ECT2 στην πρωτοβάθμια OSCCs και τα κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά. ECT2 έκφραση ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε OSCCs

in vitro

και

in vivo

(

σ

& lt? 0,05). Μεταξύ των κλινικών μεταβλητών που αναλύθηκαν, υψηλότερη έκφραση ECT2 επίσης συνδέθηκε με την κατάταξη στάδιο ΤΝΜ (

σ

& lt? 0,05). Όταν εκτελείται λειτουργικές αναλύσεις των ECT2 σε OSCC προερχόμενα κύτταρα χρησιμοποιώντας το σύστημα shRNA, ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός των ECT2 knockdown κυττάρων μειώθηκε σημαντικά σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (

ρ

& lt? 0,05). Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου με κυτταρομετρία ροής έδειξε σύλληψη πρόοδο του κυτταρικού κύκλου κατά την G1 φάση στα ECT2 knockdown κυττάρων. Βρήκαμε επίσης προς τα πάνω ρύθμιση της οικογένειας CIP /Kip των αναστολέων της κινάσης κυκλίνη-εξαρτώμενη, ρ21

Cip1 και p27

kip1, και προς τα κάτω ρύθμιση της κυκλίνης D1, κυκλίνη Ε, και CDK4. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η αυξημένη CIP /Kip οικογένεια που προκαλείται από την αναστολή της κυκλίνης D1-CDK σύνθετη δραστηριότητα που οδηγεί σε διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη φάση G1.

Συμπεράσματα /Σημασία

Τα αποτελέσματα μας προτείνονται για την πρώτη φορά ότι ECT2 είναι ένας δείκτης του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε OSCCs και ότι ECT2 μπορούσε να είναι ένα πιθανό θεραπευτικό στόχο για την ανάπτυξη νέων θεραπειών για OSCCs

Παράθεση:. Iyoda Μ, Kasamatsu α, Ishigami Τ, Nakashima α, Ενδο-Sakamoto Υ, Ogawara Κ, et al. (2010) επιθηλιακών κυττάρων Ο μετασχηματισμός Ακολουθία 2 σε ανθρώπινο καρκίνο του στόματος. PLoS ONE 5 (11): e14082. doi: 10.1371 /journal.pone.0014082

Επιμέλεια: Jörg Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Γερμανία

Ελήφθη: 18 Ιουνίου, 2010? Αποδεκτές: 28 Οκτ 2010? Δημοσιεύθηκε: 29 Νοέμ του 2010

Copyright: © 2010 Iyoda et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από μια Grant-in-Aid Επιστημονικής Έρευνας (Νο 20592353) από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας της Ιαπωνίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Στοματική ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (OSCC) είναι μια σημαντική αιτία νοσηρότητας και θνησιμότητας παγκοσμίως, αντιπροσωπεύοντας 275.000 νέα κρούσματα και περισσότερους από 120.000 θανάτους ετησίως [1]. Πολλοί παράγοντες κινδύνου έχουν προσδιοριστεί, συμπεριλαμβανομένων των προϊόντων καπνού και αλκοόλ [2], [3], [4]. Ωστόσο, ορισμένοι ασθενείς αναπτύσσουν OSCC χωρίς παράγοντες κινδύνου, υποδηλώνοντας ότι η ευαισθησία υποδοχής παίζει σημαντικό ρόλο. Μοριακή αλλαγές σε ένα αριθμό ογκογονιδίων και ογκοκατασταλτικών γονιδίων που σχετίζονται με την ανάπτυξη του OSCC θα μπορούσε να είναι σημαντικά στοιχεία για την πρόληψη αυτής της ασθένειας [4], [5].

τεχνολογία μικροσυστοιχιών ήταν πολύ χρήσιμη για την ανάλυση μεταβολών σε χιλιάδες γονιδίων και τον προσδιορισμό των σημαντικών προτύπων. Αναφέραμε προηγουμένως προφίλ γονιδιακής έκφρασης του OSCC για την ταυτοποίηση γονιδίων που σχετίζονται με τον καρκίνο [6]. Μεταξύ των γονιδίων, των επιθηλιακών κυττάρων μετασχηματισμού αλληλουχία 2 (ECT2) ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε OSCC. ECT2 είναι ένας παράγοντας γουανίνη ανταλλαγής νουκλεοτιδίων (GEF) για την οικογένεια Rho ΟΤΡάσης που σχετίζονται με την κυτοκίνηση [7], [8], [9], [10], [11]. GEFs καταλύουν την ανταλλαγή του ΑΕΠ για το GTP, με αυτόν τον τρόπο την ενεργοποίηση των Rho ΘΤΡάσες στη μεταγωγή σήματος. ECT2 έκφραση ελέγχεται δυναμικά σε όλη του κυτταρικού κύκλου. Μετά κατανομή του πυρηνικού φακέλου κατά τη διάρκεια της μίτωσης, ECT2 διασπείρεται σε όλο το κυτταρόπλασμα, τότε ECT2 γίνεται εντοπισμένη στις μιτωτικών ατράκτων κατά τη διάρκεια της μετάφασης, ο αυλάκι διάσπαση κατά την διάρκεια της τελόφασης, και τα μέσα του σώματος στο τέλος του κυτοκίνηση [8]. Οι Rho ΘΤΡάσες έχουν εμπλακεί στην κακοήθη φαινότυπο ανθρώπινων καρκίνων, ως αποτέλεσμα της συμμετοχής τους σε παρεκκλίνουσα σηματοδότηση σε κύτταρα όγκου [12], [13], [14], [15], [16], [17].

στην παρούσα μελέτη, ECT2 ήταν συχνά υπερεκφράζεται σε OSCC που προέρχονται από κυτταρικές σειρές και πρωτογενή OSCCs. Επιπλέον, ένα πείραμα έδειξε ότι shRNA ECT2 κάτω ρύθμιση οδήγησε σε μείωση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού με διακοπή του κυτταρικού κύκλου της φάσης G1. Ως εκ τούτου, προτείναμε ότι ECT2 θα μπορούσε να είναι ένας βιοδείκτης του πολλαπλασιασμού και πιθανό θεραπευτικό στόχο για OSCCs.

Αποτελέσματα

Αξιολόγηση

ECT2

έκφραση mRNA σε OSCC κυτταρικές γραμμές που παράγονται

Για να διερευνηθεί η έκφραση του mRNA της

ECT2

προσδιορίζονται ως γονίδιο σχετίζεται με τον καρκίνο με ανάλυση μικροσυστοιχιών μας [6], πραγματοποιήσαμε ποσοτικό ανάστροφης μεταγραφάσης PCR ανάλυση (qRT-PCR) χρησιμοποιώντας έξι OSCC προερχόμενο κύτταρο γραμμές (HSC-2, HSC-3, HSC-4, Η1, Ca9-22, και Sa3) και ανθρώπινη φυσιολογική στοματική κερατινοκύτταρα (HNOKs). τα επίπεδα έκφρασης του mRNA κανονικοποιήθηκαν προς GAPDH.

ECT2

mRNA ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε όλες τις κυτταρικές σειρές OSCC σε σύγκριση με τις HNOKs (Σχήμα 1Α, *

σ

& lt? 0,05).

(Α) Ποσοτικοποίηση

ECT2

επίπεδα mRNA σε OSCC κυτταρικές γραμμές που παράγονται με ανάλυση qRT-PCR. Για να προσδιοριστεί η έκφραση του mRNA της

ECT2

στον καρκίνο του στόματος, πραγματοποιήσαμε ανάλυση qRT-PCR χρησιμοποιώντας έξι OSCC που προέρχονται από κυτταρικές σειρές (HSC-2, HSC-3, HSC-4, Η1, Ca9-22 και Sa3 ) και HNOKs. Σημαντικές πάνω ρύθμιση του

ECT2

mRNA παρατηρείται σε έξι OSCC κυτταρικές γραμμές που παράγονται σε σύγκριση με εκείνη στα HNOKs. Τα δεδομένα εκφράζονται ως το μέσο ± SEM τιμών από τρεις δοκιμασίες (*

ρ

& lt? 0,05? Mann-Whitney

U

δοκιμής). (Β) Ανάλυση στυπώματος Western της πρωτεΐνης ECT2 στις OSCC προερχόμενων κυτταρικών σειρών και HNOKs. Για να διερευνηθεί πρωτεΐνη έκφραση ECT2 στον καρκίνο του στόματος, εκτελέσαμε ανάλυση κηλίδος Western χρησιμοποιώντας έξι OSCC προερχόμενων κυτταρικών σειρών (HSC-2, HSC-3, HSC-4, Η1, Ca9-22, και Sa3) και HNOKs. έκφραση ECT2 πρωτεΐνη είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε OSCC κυτταρικές γραμμές που παράγονται σε σύγκριση με HNOKs. Η πυκνομετρική δεδομένα πρωτεΐνη ECT2 κανονικοποιούνται προς α-τουμπουλίνης επίπεδα πρωτεΐνης. Οι τιμές εκφράζονται ως ποσοστό των HNOKs.

Η

Αξιολόγηση της έκφρασης πρωτεΐνης ECT2 σε OSCC κυτταρικές γραμμές που παράγονται

Πραγματοποιήσαμε ανάλυση κηλίδος Western για να διερευνήσει την κατάσταση έκφρασης πρωτεΐνης ECT2 στην OSCC κυτταρικές γραμμές που παράγονται και τις HNOKs (Σχήμα 1Β). Το μοριακό βάρος του ECT2 ήταν 112 kDa. Μια σημαντική αύξηση στην έκφραση πρωτεΐνης ECT2 παρατηρήθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές OSCC σύγκριση με τα HNOKs. Η ανάλυση έκφρασης έδειξαν ότι και οι δύο μεταγραφή και μετάφραση των προϊόντων αυτού του μορίου ήταν εντόνως εκφρασμένο σε OSCC προερχόμενων κυτταρικών σειρών.

Αξιολόγηση της έκφρασης ECT2 σε πρωτογενείς OSCCs

μετράται η

ECT2

τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της πρωτοβάθμιας OSCCs και σε συνδυασμό κανονική προφορική ιστών από 96 ασθενείς. Παρόμοια με τα δεδομένα από τις OSCC κυτταρικές γραμμές που παράγονται, ανάλυση qRT-PCR έδειξε ότι

ECT2

mRNA έκφραση ήταν ρυθμιζόμενες σε 75 (78%) του 96 πρωτογενών OSCCs σύγκριση με τα συμφωνημένα κανονικά από το στόμα ιστούς. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του mRNA στην κανονική στοματικών ιστών και πρωτογενείς OSCCs κυμαίνονταν από 0,003 να 1.632 (μέσος όρος 0.081) και 0,005 να 4.39 (διάμεσος, 0.289), αντίστοιχα (Εικόνα 2,

ρ

& lt? 0,05).

Για να διερευνήσουν το

ECT2

επίπεδα έκφρασης του mRNA της πρωτοβάθμιας OSCCs και σε συνδυασμό κανονική προφορική ιστών από 96 ασθενείς, πραγματοποιήσαμε ανάλυση qRT-PCR. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης mRNA σε πρωτογενή OSCCs και οι ευθυγραμμισμένοι στοματικών ιστών (n = 96) κυμαίνεται από 0,005 να 4.39 (διάμεσος, 0.289) και 0,003 να 1.632 (μέσος όρος 0.081), αντίστοιχα.

ECT2

mRNA έκφραση ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σε 75 (78%) του 96 πρωτογενών OSCCs σύγκριση με τα συμφωνημένα κανονικά από το στόμα ιστούς. Σημαντικά υψηλότερο

ECT2

έκφραση του mRNA παρατηρήθηκε στην πρωτοβάθμια OSCCs από ταιριάζουν κανονικά από το στόμα ιστούς (

P

& lt? 0,05? Mann-Whitney

U

δοκιμή).

Στη συνέχεια αναλύονται ECT2 έκφραση της πρωτεΐνης με ανοσοϊστοχημεία (IHC). Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα IHC για ECT2 πρωτεΐνης σε φυσιολογικό ιστό του στόματος και πρωτογενών OSCC φαίνεται στο Σχήμα 3Α και Β Θετική ανοσοαντίδρασης για ECT2 ανιχνεύθηκε στον πυρήνα και στο κυτταρόπλασμα. Ισχυρή ανοσολογικές αντιδράσεις ECT2 ανιχνεύθηκαν σε OSCCs, ενώ η κανονική προφορική ιστών έδειξε αρνητική ανοσοχρώση. Οι ECT2 IHC βαθμολογίες των φυσιολογικών ιστών του στόματος και OSCCs κυμαίνονταν από 8,33 να 85.33 (διάμεση τιμή, 44,00) και 55,67 να 211,33 (διάμεσος, 163,33), αντίστοιχα. Οι ECT2 IHC βαθμολογίες στην πρωτοβάθμια OSCCs ήταν σημαντικά υψηλότερα από εκείνα σε φυσιολογικούς ιστούς (Σχήμα 3C,

σ

& lt? 0.001). Οι συσχετισμοί μεταξύ των κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά των ασθενών με OSCC και την κατάσταση της πρωτεϊνικής έκφρασης ECT2 χρησιμοποιώντας το σύστημα βαθμολόγησης IHC φαίνονται στον Πίνακα 1. Μεταξύ των κλινικών ταξινομήσεις, ECT2 θετικά OSCCs συσχετίστηκαν με το μέγεθος του όγκου (

ρ

= 0.043) και ΤΝΜ σταδιοποίηση του OSCC (

σ

= 0,044) (Πίνακας 1).

(Α, Β) τα αποτελέσματα Εκπρόσωπος IHC της ECT2 στην κανονική προφορική ιστών και την πρωτοβάθμια OSCC. (Α) Κανονική προφορική ιστών δεν έχει καμία έκφραση της πρωτεΐνης ECT2. Αρχική μεγέθυνση, × 100. Ράβδοι κλίμακας, 50 μm. (Β) ECT2-θετικών κρουσμάτων OSCC. Θετική ανοσοαντίδρασης για ECT2 ανιχνεύεται στον πυρήνα και στο κυτταρόπλασμα. Αρχική μεγέθυνση, × 400. Ράβδοι κλίμακας, 10 μm. (C) μέλος της πρωτεϊνικής έκφρασης ECT2 στο nomal προφορική ιστών και την πρωτοβάθμια OSCC. Για να διερευνήσουν πρωτεΐνη έκφραση ECT2 στην πρωτοβάθμια OSCCs, θα πραγματοποιηθεί IHC. Οι βαθμολογίες ECT2 IHC υπολογίζεται ως εξής: σκορ IHC = 1 × (αριθμός των αδύναμων χρώση κυττάρων στο πεδίο) + 2 × (αριθμός των μετρίως χρώση κυττάρων στο πεδίο) + 3 × (αριθμός έντονα χρωματισμένο κυττάρων στο πεδίο) . Οι βαθμολογίες ECT2 IHC για OSCCs και κανονικά από το στόμα ιστούς κυμαίνεται από 55,67 να 211,33 (διάμεσος, 163.33) και 8,33 να 85,33 (διάμεση τιμή, 44,00), αντιστοίχως. Το επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης ECT2 στο OSCCs είναι σημαντικά υψηλότερο από ότι στην κανονική ιστών του στόματος (

σ

& lt? 0,001? Mann-Whitney

U

δοκιμή).

Η

Ίδρυση ECT2 νοκ ντάουν κυττάρων

Για να αποκτήσετε σταθερή ECT2 νοκ ντάουν επιμολύνσεις, χρησιμοποιήσαμε το ECT2 shRNA (shECT2) πλασμίδιο και τον έλεγχο shRNA (Mock) πλασμίδιο. Για να εκτιμηθεί ECT2 mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης σε shECT2-επιμολυσμένα κύτταρα, πραγματοποιήσαμε qRT-PCR και αναλύσεις κηλίδος Western. Το Σχήμα 4Α δείχνει ότι η

ECT2

έκφραση mRNA σε shECT2-επιμολυσμένα κύτταρα ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ό, τι σε ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα. ECT2 επίπεδα πρωτεΐνης σε shECT2-επιμολυσμένα κύτταρα επίσης μειώθηκε σημαντικά σε σύγκριση με ψευδο-μορφομετατραπέντα κύτταρα (Σχήμα 4Β). ECT2 επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης ήταν σύμφωνα με την έκφραση του mRNA στα επιμολυσμένα.

Για να ληφθούν σταθερές ECT2 knockdown επιμολύνσεις, εκτελέσαμε επιμόλυνση της ECT2 shRNA (shECT2) και τον έλεγχο shRNA (Mock) σε κυτταρικές σειρές OSCC (Sa3 και Η1). Πραγματοποιήσαμε qRT-PCR και κηλίδας Western αναλύσεις για τη διερεύνηση ECT2 mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης σε shECT2-επιμολυσμένα κύτταρα. (Α) Έκφραση του

ECT2

mRNA σε shECT2- και Mock-επιμολυσμένα κύτταρα Sa3. (Β) ανάλυση κηλίδας Western των πρωτεϊνών ECT2 σε shECT2- και ψευδο-μορφομετατραπέντα κύτταρα. Το mRNA και πρωτεϊνών ECT2 είναι σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε shECT2-επιμολυσμένα κύτταρα.

Η

Μειωμένη κυτταρική ανάπτυξη σε ECT2 νοκ ντάουν κύτταρα

Για να διερευνήσουν τις αντιπολλαπλασιαστικές επιδράσεις στην shECT2-επιμολυσμένα κύτταρα, κυτταρικές ανάπτυξη παρακολουθήθηκε επί 7 ημέρες. Οι shECT2-επιμολυσμένα κύτταρα έδειξαν μια σημαντική μείωση στην κυτταρική ανάπτυξη σε σύγκριση με ψευδο-μορφομετατραπέντα κύτταρα (Σχήμα 5).

Για να προσδιοριστεί η επίδραση της shECT2 επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, shECT2- και ψευδο-μορφομετατραπέντα κύτταρα σπάρθηκαν σε 6 -Καλά πλάκες σε πυκνότητα 1 × 10

4 βιώσιμα κύτταρα ανά φρεάτιο. shECT2- και ψευδο-μορφομετατραπέντα κύτταρα μετρώνται επί 7 συνεχείς ημέρες. Η ανάπτυξη των shECT2 επιμολυσμένα κύτταρα αναστέλλεται σημαντικά σε σχέση με τα ψευδώς επιμολυσμένα κύτταρα μετά από 7 ημέρες. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως το μέσο ± SEM τιμών από τρεις δοκιμασίες. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ψευδώς και shECT2-επιμολυσμένα κύτταρα (

σ

& lt? 0,01? Mann-Whitney

U

δοκιμή).

Η

Νοκ ντάουν της ECT2 προάγει τον κυτταρικό κύκλο

σύλληψη

για να διερευνήσουν τον μηχανισμό με τον οποίο ECT2 σχετίζεται με την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, πραγματοποιήσαμε ανάλυση FACS της shECT2-επιμολυσμένα κύτταρα. Το ποσοστό της φάσης G1 σε shECT2-επιμολυσμένα κύτταρα ήταν σημαντικά υψηλότερη από ό, τι σε ψευδο-μορφομετατραπέντα κύτταρα (Σχήμα 6Α,

ρ

& lt? 0,05), υποδηλώνοντας ότι η ρύθμιση προς τα κάτω του ECT2 ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό κατά την επαγωγή του G1 σύλληψη. Για τον προσδιορισμό του μηχανισμού με τον οποίο ECT2 μπλοκ G1 εξέλιξη, αξιολογήσαμε το επίπεδο έκφρασης των αναστολέων της κινάσης εξαρτώμενης από κυκλίνη (p16

ΙΝΚ4 &, p21

Cip1, p27

kip1), κυκλίνη D1, κυκλίνη Ε, και CDK4 (Σχήμα 6Β). δεδομένα PCR έδειξαν up-ρύθμιση του

p21

Cip1

και

p27

kip1

και κάτω ρύθμιση των

κυκλίνη D1

,

κυκλίνης Ε

,

και CDK4

σε shECT2-επιμολυσμένα κύτταρα.

Για να διερευνηθεί εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, αναλύσαμε κυτταρομετρίας ροής προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε DNA από FACScalibur στην G0-G1, S, και, G2-M φάσεις. Στη συνέχεια καθορίζεται το επίπεδο έκφρασης των αναστολέων της κινάσης εξαρτώμενης από κυκλίνη (p16

ΙΝΚ4 &, p21

Cip1, και ρ27

kip1), κυκλίνη D1, κυκλίνη Ε, και CDK4 για τον προσδιορισμό του μηχανισμού με τον οποίο μπλοκ ECT2 G1 προχώρηση. (Α) Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής διεξήχθη για να διερευνηθεί κυτταρικού κύκλου σε shECT2- και ψευδο-μορφομετατραπέντα κύτταρα. Ο αριθμός των κυττάρων στο G1 έχει αυξηθεί σημαντικά στα ECT2 knockdown κυττάρων. (Β) qRT-PCR διεξήχθη για να διερευνήσει τα επίπεδα mRNA των γονιδίων που σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο. PCR δείχνει προς τα πάνω ρύθμιση του

p21

Cip1

και

p27

kip1

και κάτω ρύθμιση των

κυκλίνη D1

,

κυκλίνης Ε

,

και CDK4

. Τα δεδομένα εκφράζονται ως το μέσο ± SEM τιμών από τρεις δοκιμασίες (*

ρ

& lt? 0,05? Mann-Whitney

U

test).

Η

Συζήτηση

προηγούμενα δεδομένα μικροσυστοιχιών μας [6] έδειξαν σημαντική προς τα πάνω ρύθμιση του

ECT2

σε OSCC που προέρχονται από κυτταρικές σειρές. Στην παρούσα μελέτη, ECT2 mRNA και πρωτεΐνης υψηλής έκφρασης

in vitro

και

in vivo

στην OSCC. Περιφερειακή αριθμού αντιγράφων 3q26 αυξήσεις σε πολλά καρκίνων, όπως κεφάλι και το λαιμό, τους πνεύμονες, και του τραχήλου [18], [19]. Η περιοχή αυτή έχει τα γονίδια που σχετίζονται με τον καρκίνο (PRKC1 και SOX2), καθώς και ECT2. Ως εκ τούτου, γονιδιωματική ανισορροπία θα ήταν ο λόγος της ECT2 υπερέκφραση σε OSCC. Τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης σε πρωτογενείς ECT2 OSCCs συσχετίστηκαν με τη διαβάθμιση στάδιο ΤΝΜ (Πίνακας 1) (

ρ

& lt? 0,05). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι ECT2 έχει ένα σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και την εξέλιξη OSCC. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά σχετικά με το μηχανισμό της ECT2 στην εξέλιξη OSCC. Για να προσδιορίσετε αν η λειτουργία ECT2 είναι σχετικό με την εξέλιξη OSCC, πραγματοποιήσαμε το πείραμα shECT2 και διαπίστωσε ότι ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός μειώθηκε σημαντικά, ως αποτέλεσμα της σύλληψης του κυτταρικού κύκλου στην G1 φάση ECT2 νοκ ντάουν κύτταρα με up-ρύθμιση του p21

Cip1 και p27

kip1 και προς τα κάτω ρύθμιση της κυκλίνης D1, κυκλίνη Ε, και CDK4, υποδεικνύοντας ότι ECT2 λειτουργία σχετίζεται στενά με την εξέλιξη της OSCC.

GEFs, συμπεριλαμβανομένων ECT2, καταλύουν την ανταλλαγή του ΑΕΠ για το GTP, ενεργοποιώντας έτσι οι Rho ΘΤΡάσες στη μεταγωγή σήματος [7], [8], [9], [10], [11]. Η ενεργοποιημένη Rho ΘΤΡάσες συνδέονται και ενεργοποιούν αρκετούς μεταγενέστερους τελεστές, οδηγώντας σε πολλαπλές βιολογικές διεργασίες, όπως την κυτταρική μέγεθος, την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση, την επιβίωση, τη μορφολογία, κυτταρική πολικότητα, κυτταρική προσκόλληση, και η διακίνηση της μεμβράνης [20], [21]. Up-ρύθμιση της δραστικότητας ΟΤΡάσης Rho, που συχνά συνδέονται με ογκογένεση [22], έχει ανιχνευθεί σε διάφορους ανθρώπινους όγκους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παγκρέατος, καρκίνο του μαστού, μελάνωμα, καρκίνο του πνεύμονα, καρκίνο του παχέος εντέρου, και γαστρικού καρκίνου [12], [23]. Από την άλλη πλευρά, Rho ΘΤΡάσες διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην προώθηση της προόδου G1-S μέσω διαμόρφωσης της κυκλίνης και των εξαρτώμενων από κυκλίνη αναστολείς κινάσης (CDKIs) [24], [25]. Yamamoto et al. ανέφεραν ότι όταν Rho ΟΤΡάσης ανεστάλη από το

Clostridium botulinum

C3 τοξίνη ή ένα κυρίαρχο αρνητικό μετάλλαγμα, G1-S εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου ήταν σημαντικά μειωμένη [26]. Η μειωμένη ενεργοποίηση των GTPases σχετίζεται με συστατικά αυξημένα επίπεδα του p21

Cip1 και p27

kip1, προκαλώντας τα κύτταρα να συσσωρεύονται στη φάση G1 [27], [28], [29], [30], [31 ], [32]. Έχουμε σκεφτεί ότι ECT2 νοκ ντάουν οδηγεί σε μειωμένη ενεργοποίηση των Rho ΟΤΡάσης, και σύμφωνα με αυτό, βρήκαμε όχι μόνο προς τα πάνω ρύθμιση της οικογένειας CIP /Kip (p21

Cip1 και p27

kip1), αλλά και προς τα κάτω ρύθμιση της κυκλίνη D1, κυκλίνη Ε, και CDK4, που οδηγεί σε διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην G1 φάση, σε ECT2 knockdown κυττάρων.

κυκλίνη D1, κυκλίνη Ε, και CDK4 είναι επίσης ένα κρίσιμο ρυθμιστής της προόδου G1 και G1-S μετάβαση. Η αναστολή της κυκλίνης D1, κυκλίνη Ε, και μπλοκ έκφραση CDK4 G1-S μετάβαση του κυτταρικού κύκλου [33], [34], [35], [36]. Οι κυκλίνες D1-D3 και των οικογενειών Ε και αντίστοιχους εταίρους κινάσης τους, CDK4 /6 και CDK2, είναι υπεύθυνες για τη ρύθμιση της μετάβασης από G1 προς S φάση. Οι δραστηριότητες των συμπλοκών κυκλίνης-CDK διαμορφώνεται από δύο τύπους CDKIs, CIP /Kip (p21

Cip1, p27

Kip1, και p57

Kip2) και η ΙΝΚ4 (p15

INK4B, p16

ΙΝΚ4 &, p18

INK4C, και ρ19

INK4D) οικογένειες, οι οποίες ρυθμίζουν την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου [37]. Μέλη της οικογένειας bind CIP /Kip σε σύμπλοκα κυκλίνης-CDK και αναστέλλουν τις δραστηριότητές τους, η οποία οδηγεί σε μειωμένη φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη ρετινοβλαστώματος και G1 διακοπή του κυτταρικού κύκλου.

Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι ECT2 υπερεκφράζεται συχνά σε OSCC . Επιπλέον, ECT2 knockdown ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό

in vitro

συλλαμβάνοντας εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου στην φάση G1 μέσω διαμόρφωσης της έκφρασης των μορίων συνδέονται με τον κύκλο των κυττάρων, η οποία τελικά οδηγεί στην αναστολή της κυκλίνης D1-CDK σύνθετη δραστηριότητα. Αυτά τα δεδομένα πρότειναν ότι ECT2 παίζει σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων OSCC. ECT2 έκφραση είναι πιθανό να είναι ένα βιοδείκτη του πολλαπλασιασμού και ένα πιθανό θεραπευτικό στόχο για την ανάπτυξη αντικαρκινικών φαρμάκων στην πρωτοβάθμια OSCCs.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Όλοι οι ασθενείς που παρέχονται εν επιγνώσει συναίνεση για ένα πρωτόκολλο ελεγχθεί και εγκριθεί από την επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Chiba. Οι γραπτές πληροφορημένες συγκαταθέσεις ελήφθησαν από όλους τους ασθενείς.

OSCC που προέρχονται από κυτταρικές γραμμές και δείγματα ιστών

κυτταρικές σειρές HSC-2, HSC-3, HSC-4, και Ca9-22, που προέρχεται από ανθρώπινα OSCCs, αγοράστηκαν από το Science Research Τράπεζα ανθρώπινου Δυναμικού (Osaka, Japan). κυτταρικές σειρές H1 και Sa3 ευγενικά από τον Dr. S. Fujita σε Wakayama Ιατρικό Πανεπιστήμιο (Wakayama, Ιαπωνία). Πρωτογενή καλλιεργημένα HNOKs ελήφθησαν από τρεις υγιείς δότες [38], [39]. Όλα τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε Dulbecco τροποποιημένο μέσο Eagle /F-12 ΗΑΜ (Sigma-Aldrich Co, St. Louis, ΜΟ) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Sigma) και 50 μονάδες /ml πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη (Sigma).

τα δείγματα ιστών από 96 Ιάπωνες ασθενείς άσχετα με πρωτοπαθή OSCC που έλαβαν στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Chiba ελήφθησαν κατά τη διάρκεια χειρουργική εκτομή. Οι εκτομή ιστοί χωρίζεται σε δύο μέρη, ένα από τα οποία καταψύχονται αμέσως και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι την απομόνωση RNA, και το δεύτερο από τα οποία έχει καθορισθεί σε διάλυμα ρυθμιστικού διαλύματος φορμαλδεΰδης 10% για παθολογική διάγνωση και IHC. Ιστοπαθολογική ανάλυση των ιστών πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τα κριτήρια του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας από το Τμήμα Παθολογίας, Chiba University Hospital. Κλινικοπαθολογικοί στάσης προσδιορίστηκε από την ταξινόμηση ΤΝΜ της Διεθνούς Ένωσης κατά του Καρκίνου. Όλοι οι ασθενείς είχαν OSCC αυτό ήταν ιστολογικά επιβεβαιωμένο, και ελέγχθηκαν δείγματα όγκου ώστε να εξασφαλισθεί ότι ιστό όγκου ήταν παρούσα σε περισσότερο από 90% του δείγματος.

Παρασκευή cDNA

Το ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας Αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. cDNA παρήχθη από 5 μg ολικού RNA με τη χρήση Ready-To-Go You-Prime First-Strand Χάντρες (GE Healthcare, Buckinghamshire, Ηνωμένο Βασίλειο) και ολιγο (dT) εκκινητή (Sigma Genosys, Ishikari, Ιαπωνία), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή .

έκφραση του mRNA ανάλυση

σε πραγματικό χρόνο qRT-PCR διεξήχθη για να αξιολογήσει τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων-στόχων (

ECT2

,

p16

ΙΝΚ4 &

,

p21

Cip1

,

p27

kip1

,

κυκλίνη D1

,

κυκλίνης Ε

, και

CDK4

) σε κύτταρα OSCC που προέρχονται και πρωτοβάθμια OSCCs. qRT-PCR διεξήχθη με μία μέθοδο χρησιμοποιώντας ένα LightCycler FastStart DNA κύριο SYBR Green 1 Kit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany). Οι ακόλουθοι εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν: ECT2, προς τα εμπρός 5′-ATTTTCATGTCGCCCGTTGT-3 ‘και αντίστροφος 5′-CCCATGTGATGGACCAATGTC-3’? p16

ΙΝΚ4 &, προς τα εμπρός 5′-CAGACATCCCCGATTGAAAGAAC-3 ‘και αντίστροφη 5′-GGTAGTGGGGGAAGGCATATATCT-3’? p21

Cip1, μπροστά 5′-CCCAGTTCATTGCACTTTGATTAGC-3 ‘και αντίστροφη 5′-CAGTCTAGGTGGAGAAACGGGAAC-3’? p27

kip1, μπροστά 5′-CCGGCTAACTCTGAGGACAC-3 ‘και αντίστροφη 5′-AGAAGAATCGTCGGTTGCAG-3′? κυκλίνη D1, μπροστά 5’-GCATGTTCGTGGCCTCTAAGA-3 ‘και αντίστροφη 5′-CGGTGTAGATGCACAGCTTCTC-3′? κυκλίνη Ε, μπροστά 5’-TTCTTGAGCAACACCCTCTTCTGCAGCC-3 ‘και αντίστροφη 5′-TCGCCATATACCGGTCAAAGAAATCTTGTGCC-3′? CDK4, μπροστά 5’-TGCAACACCTGTGGACATGTG-3 ‘και αντίστροφη 5′-ATTTTGCCCAACTGGTCGG-3’. Τα ενισχυμένα προϊόντα αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης 3% να εξακριβωθεί το μέγεθος και την καθαρότητα. Οι αντιδράσεις PCR με τη χρήση του LightCycler συσκευή διεξήχθησαν σε έναν τελικό όγκο 20 μΙ ενός μίγματος αντιδράσεως αποτελούμενο από 2 μΙ FirstStart DNA κύριο SYBR Green Ι αναμειγνύεται, 3 mM MgCl

2, και το L μΜ εκκινητών, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το μίγμα της αντίδρασης φορτώθηκε σε τριχοειδή σωληνάρια υάλου και υποβάλλονται σε μια αρχική μετουσίωση στους 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 45 κύκλους ενίσχυσης στους 95 ° C (10 δευτερόλεπτα) για μετουσίωση, 62 ° C (10 δευτερόλεπτα) για ανόπτηση, και 72 ° C (10 δευτερόλεπτα) για την επέκταση, με μια κλίση θερμοκρασίας 20 ° C /sec. Τα ποσά μεταγραφής για τα γονίδια-στόχους εκτιμήθηκαν από τις αντίστοιχες πρότυπες καμπύλες και ομαλοποιούνται στη αφυδρογονάση γλυκεραλδεΰδης-3-φωσφορικής (GAPDH) (προς τα εμπρός 5′-3 ‘και CATCTCTGCCCCCTCTGCTGA-αντίστροφη 5′-GGATGACCTTGCCCACAGCCT-3’) μεταγραφή ποσό καθορίζεται αντίστοιχα δείγματα.

Protein

εκχύλιση

Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS) και φυγοκεντρήθηκε για λίγο. Οι σβώλοι κυττάρων επωάστηκαν στους 4 ° C για 30 λεπτά σε ένα ρυθμιστικό λύσης (7 Μ ουρία, 2 Μ θειουρία, 4% β /ο CHAPS, και 10 mM Tris ρΗ 7,4) με κοκτέιλ αναστολέα πρωτεϊνάσης (Roche). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε με BCA Protein Assay Kit (Thermo, Rockford, IL).

Western ανάλυση κηλίδος

εκχυλίσματα πρωτεΐνης ηλεκτροφορήθηκαν σε 4-12% Bis-Tris γέλη, μεταφέρθηκαν σε νιτροκυτταρίνη μεμβράνες (Invitrogen), και δεσμεύτηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου σε Blocking One (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan). Οι μεμβράνες πλύθηκαν τρεις φορές με 0,1% Tween 20 σε Tris-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα και επωάστηκαν με 2 μg /ml αντι-ανθρώπινου αντισώματος ECT2 πολύκλωνα συγγένεια καθαρισμένο κουνελιού (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Οι μεμβράνες πλύθηκαν και πάλι και επωάστηκαν με 1:10,000 της IgG αντι-κουνελιού κατσίκας (H + L) HRP συζυγούς (Promega, Madison, WI) ως δευτερεύον αντίσωμα για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας υπόστρωμα SuperSignal West Pico χημειοφωταύγειας (Thermo) και ανοσοκηλίδωση οπτικοποιήθηκε με έκθεση των μεμβρανών σε ΑΤΤΟ Light-Capture II (ΑΤΤΟ, Tokyo, Japan). εντάσεις σήματος ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας την έκδοση 3.0 του λογισμικού CS Analyzer (ΑΤΤΟ).

Η επιμόλυνση

OSCC κυτταρικές γραμμές (SA3 και H1) διαμολύνθηκαν σταθερά με το ECT2 shRNA (shECT2) ή τον έλεγχο shRNA (Mock) (Santa Cruz Biotechnology) κατασκευή από Lipofectamine LTX και Plus Αντιδραστήρια (Invitrogen). Μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα σταθερώς shECT2 απομονώθηκαν από το μέσο καλλιέργειας που περιέχει 2 μg /mL πουρομυκίνη (Invitrogen). 2-3 εβδομάδες μετά την επιμόλυνση, βιώσιμες αποικίες συλλέχθηκαν και μεταφέρθηκαν σε νέα πιάτα. shECT2- και ψευδο-μορφομετατραπέντα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω πειράματα.

IHC

IHC 4-μm τομών σε δείγματα εγκλεισμένους σε παραφίνη διεξήχθη χρησιμοποιώντας αντι-κουνελιού ECT2 πολυκλωνικού αντισώματος (Santa Cruz Biotechnology ). Εν συντομία, μετά αποπαραφινώσεως και ενυδάτωση, η ενδογενής δράση υπεροξειδάσης αποσβέστηκε με 30-λεπτών επώαση σε ένα μίγμα από 0,3% διάλυμα υπεροξειδίου του υδρογόνου σε 100% μεθανόλη, μετά από την οποία τα τμήματα αποκλείστηκαν για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου με 1,5% αποκλεισμού ορού ( Santa Cruz Biotechnology) σε PBS πριν από την αντίδραση με το αντίσωμα αντι-ECT2 (1:100 αραίωση) στους 4 ° C σε ένα υγρό θάλαμο όλη τη νύκτα. Κατά την επώαση με το πρωτεύον αντίσωμα, τα δείγματα πλύθηκαν τρεις φορές σε PBS και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με αντιδραστήριο Envision (DAKO, Carpinteria, CA) ακολουθούμενη από ανάπτυξη χρώματος σε τετραϋδροχλωρική 3,3′-διαμινοβενζιδίνη (ϋΑΚΟ). Τα πλακίδια έπειτα χρωματίσθηκαν ελαφρά με αιματοξυλίνη, αφυδατώνονται με αιθανόλη, καθαρίζονται με ξυλόλιο, και τοποθετημένα. Μη-ειδική πρόσδεση ενός αντισώματος σε πρωτεΐνες, εκτός από το αντιγόνο μερικές φορές συνέβη. Για να αποφευχθεί η μη-ειδική σύνδεση, διεξήχθη μία ανοσοποιητικά πεπτίδιο μπλοκαρίσματος πείραμα. Ως αρνητικός έλεγχος, τριπλούν τομές ανοσοχρωματίστηκαν χωρίς έκθεση σε πρωτογενή αντισώματα, τα οποία επιβεβαίωσαν την ειδικότητα χρώσης. Για να ποσοτικοποιηθεί η κατάσταση της πρωτεϊνικής έκφρασης ECT2 σε αυτά τα συστατικά, χρησιμοποιήσαμε συστήματα βαθμολογία IHC περιγράφηκε προηγουμένως [6], [39], [40], [41], [42], [43], [44], [45] , [46], [47]. Εν συντομία, τα χρωματισμένα κύτταρα προσδιορίστηκαν σε τουλάχιστον πέντε τυχαία πεδία στα 400 χ μεγέθυνση σε κάθε τμήμα. Η ένταση της ανοσοαντίδρασης ECT2 στο κύτταρο βαθμολογήθηκε ως εξής: 1+, αδύναμη? 2+, μέτρια? και 3+, έντονη. Ο αριθμός των κυττάρων και η ένταση χρώσης στη συνέχεια πολλαπλασιάστηκαν για να παράγει ένα αποτέλεσμα ECT2 IHC. Θήκες με βαθμολογία άνω των 85,33 (την υψηλότερη βαθμολογία για φυσιολογικό ιστό) ορίστηκαν ως ECT2 θετικά. Δύο ανεξάρτητοι παθολόγους, δύο από τους οποίους ήταν καλυμμένη με την κλινική κατάσταση των ασθενών, κάνει αυτές τις αποφάσεις.

Ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός

Για να διερευνηθεί η επίδραση της shECT2 επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, shECT2- και Mock-επιμολυσμένα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

4 βιώσιμα κύτταρα ανά φρεάτιο. Στα ενδεικνυόμενα χρονικά σημεία, τα κύτταρα υπέστησαν κατεργασία τρυψίνης και απαριθμήθηκαν χρησιμοποιώντας αιμοκυτόμετρο εις τριπλούν.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Για να προσδιοριστεί κατανομή κύκλου κυττάρου, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με PBS, και ανιχνεύθηκαν με CycleTEST Plus kit αντιδραστήριο DNA (Becton-Dickinson, San Jose, CA), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα συμπυκνώθηκαν σε 5,0 × 10

5 κύτταρα /ml υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 400 χ g για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια προσθέσαμε 250 μλ διαλύματος Α (ρυθμιστικό θρυψίνη) προς το σωλήνα και αναμιγνύεται ήπια. Αφήσαμε την θρυψίνη να αντιδράσει για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, προσθέσαμε 200 μΐ διαλύματος Β (αναστολέα της θρυψίνης και RNase σε ένα ρυθμιστικό) και απαλά αναμείξτε. Επωάσαμε με το μίγμα για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, προστέθηκαν 200 μΐ του διαλύματος C (διάλυμα χρώσης ιωδιούχο προπίδιο). Και αναμίχθηκαν ήπια ως ανωτέρω και επωάζονται για 10 λεπτά στο σκοτάδι επί πάγου. Προσδιορισμός με κυτταρομετρία ροής του περιεχομένου DNA αναλύθηκε με FACScalibur (Becton-Dickinson). Τα κλάσματα των κυττάρων στην G0-G1, S, G2 και φάσεις-M αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Flow Jo (Tree Star, Ashland, OR).

Στατιστική ανάλυση

Η στατιστική σημαντικότητα των επιπέδων έκφρασης ECT2 αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το ακριβές τεστ του Fisher ή Mann-Whitney

U

δοκιμή.

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM.

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Lynda Γ Charters για την επεξεργασία αυτού του χειρογράφου, και Δρ. Hiroshi Nakajima και Hiroaki Takatori, Τμήμα Μοριακής Γενετικής, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Chiba, για τις χρήσιμες συζητήσεις και κριτική επισκόπηση του χειρογράφου.