Αφηρημένο

Ιστορικό

CD44 είναι ένας σημαντικός κυτταρικός υποδοχέας για το υαλουρονικό οξύ. Η δομή στέλεχος του CD44 που κωδικοποιείται από δέκα κανονική εξώνια μπορεί να διευρύνεται με δέκα παραλλαγή εξώνια (v1-V10) από εναλλακτικό μάτισμα. Πετύχαμε την προετοιμασία MV5 πλήρως ανθρώπινων IgM και την κατηγορία μεταγωγή μονοκλωνικό αντίσωμα GV5 IgG του (mAb) που αναγνωρίζει την εξωκυτταρική περιοχή ενός ισομορφής CD44R1 που περιέχει την εισαχθείσα περιοχή που κωδικοποιείται από την παραλλαγή (V8, V9 και V10) εξώνια και εκφράζεται επί της επιφάνεια διαφόρων ανθρώπινων επιθηλιακών καρκινικών κυττάρων.

Μέθοδοι και Principal Ευρήματα

κατέδειξε την αναστολή της ανάπτυξης των ξενομοσχευμάτων ανθρώπινου καρκίνου με ένα GV5 IgG mAb αναδιαμορφωθεί από MV5 IgM. Το επίτοπο που αναγνωρίζεται από MV5 και GV5 ταυτοποιήθηκε σε μία περιοχή V8 κωδικοποίησης από την ανάλυση της πρόσδεσης του mAb με διάφορες ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες CD44 με ανοσορροφητική δοκιμασία συνδεδεμένη με ένζυμο. GV5 έδειξε προτιμησιακή αντιδραστικότητα έναντι διαφόρων κακοήθων ανθρώπινων κυττάρων έναντι των φυσιολογικών ανθρώπινων κυττάρων εκτιμήθηκε με κυτταρομετρία ροής και ανοσοϊστολογική ανάλυση. Όταν τα κύτταρα καρκινώματος τραχήλου της μήτρας του ανθρώπου ΜΕ180 υποδορίως εμβολιάσθηκαν σε αθυμικούς ποντικούς με GV5, παρατηρήθηκε σημαντική αναστολή του σχηματισμού όγκου. Επιπλέον, ενδοπεριτοναϊκές ενέσεις GV5markedly ανέστειλε την ανάπτυξη των ορατών καθιερωμένων όγκων από κύτταρα καρκινώματος λάρυγγα HSC-3 του ανθρώπου που είχε υποδορίως μεταμοσχευθεί μία εβδομάδα πριν από την πρώτη θεραπεία με GV5. Από

in vitro

πειράματα, εξαρτώμενη από αντίσωμα κυτταρική κυτταροτοξικότητα και εσωτερίκευση του CD44R1 φαινόταν να είναι πιθανοί μηχανισμοί για

in vivo

δραστικότητα κατά του όγκου με GV5.

Συμπεράσματα

CD44R1 είναι μια εξαιρετική μοριακός στόχος για θεραπεία mAb του καρκίνου, πιθανώς ανώτερη σε μόρια στοχεύονται από τις υπάρχουσες θεραπευτικές mAb, όπως Trastuzumab και Cetuximab αναγνωρίζοντας οικογένεια ανθρώπινου υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα

Παράθεση:. Masuko Κ, Okazaki S, Satoh Μ, Tanaka G, Ikeda Τ, Torii R, et al. (2012) Anti-Tumor Επίδραση κατά της ανθρώπινης ξενομοσχευμάτων καρκίνου από ένα πλήρως ανθρώπινο μονοκλωνικό αντίσωμα με μια παραλλαγή 8-επιτόπων των CD44R1 εκφράζονται πάνω Cancer Stem Cells. PLoS ONE 7 (1): e29728. doi: 10.1371 /journal.pone.0029728

Επιμέλεια: Patrick Tan, Duke-Εθνικό Πανεπιστήμιο της Σιγκαπούρης Πτυχιούχος Ιατρικής Σχολής, Σιγκαπούρη

Ελήφθη: 15 Αυγ 2011? Αποδεκτές: 2 του Δεκέμβρη 2011? Δημοσιεύθηκε: 17 Ιανουαρίου 2012

Copyright: © 2012 Masuko et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Πρόγραμμα «Ακαδημαϊκή Frontier» του Πανεπιστημίου Κίνκι (2005-2007) και «Αντιγήρανση Κέντρο» Έργο του Πανεπιστημίου Κίνκι (2008-2012) για τα Ιδιωτικά πανεπιστήμια: ταιριάζουν επιδότηση ταμείο από MEXT (Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού , Επιστήμης και Τεχνολογίας) και υποστηρίζεται επίσης από το «A-ΒΗΜΑ (προσαρμόσιμο και Seamless Τεχνολογίας Πρόγραμμα μεταφοράς μέσω της έρευνας & amp? Ανάπτυξης)» Project (2009-2011): επιδότηση ταμείο αντιστοίχιση από την Ιαπωνία Επιστήμης και Τεχνολογίας του Οργανισμού. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Στην παρούσα έρευνα, που αντιστοιχεί συγγραφέα (TM) συνεργάστηκε με Kohjin Bio Co., Ltd στη μελέτη της ADCC, με Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd στη χρήση των ποντικών KM, και με την Link Genomics, Inc. στη μελέτη της ανοσοϊστοχημείας. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

CD44 είναι ένας τύπος Ι γλυκοπρωτεΐνη στην επιφάνεια του κυττάρου, η οποία λειτουργεί ως το κύριο κυτταρικής προσκόλλησης μόριο για υαλουρονικά οξέα [1] – [3]. Πρότυπο CD44 (CD44s) που κωδικοποιούνται από τα δέκα κανονικές εξώνια (ex1-5 και ex16-20) μπορεί να διευρυνθεί από τα ενθέματα που κωδικοποιούνται από διάφορους συνδυασμούς παραλλαγής εξώνια (ex6-15 ή v1-v10) του CD44 με εναλλακτικό μάτισμα [3] , [4]. Αν και η φυσιολογική σημασία του εναλλακτικού ματίσματος του CD44 παραμένει ασαφής, κάποια παραλλαγή CD44 μορίων (CD44v) έχουν αναφερθεί να είναι υπερ-εκφράζεται σε διάφορες κακοήθειες του τρωκτικού και ανθρώπινων συστημάτων [5] – [8].

Μεταξύ πολλές CD44v, CD44R1 [7], [8] το οποίο έχει ένα εισαχθέν περιοχή που κωδικοποιείται από V8 (ex13), V9 (EX14) και V10 (ex15) εξώνια εκφράζεται επιλεκτικά σε διάφορους επιθηλιακούς καρκίνους του ανθρώπου. Για παράδειγμα, CD44R1 mRNA είναι αυξημένο σε ανθρώπινο κόλον, κύστης, πνεύμονα, λάρυγγα και του μαστού [8], και ανοσοϊστολογική ανάλυση (ΙΗΑ) αποκάλυψε επίσης ότι CD44R1 πρωτεΐνη υπερ-εκφράζεται σε πνεύμονα υπεζωκότα δείγματα σε σύγκριση με εκείνη σε γειτονικές φυσιολογικούς ιστούς, χρησιμοποιώντας κουνελιού πολυκλωνικά αντισώματα εγείρονται έναντι ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης CD44 [8]. Επιπλέον, έχουμε καταδείξει ότι πρόσφατα ομόλογο ποντικού του ανθρώπινου CD44R1 εκφράζεται σε προκαρκινικές περιοχές, που πιθανώς περιέχει καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) ή ογκογενή κύτταρα, κατά τη διάρκεια του ποντικιού γαστρική καρκινογένεση [9], [10].

Ωστόσο, δεδομένου ότι συγκεκριμένες πλήρως ανθρώπινων μονοκλωνικών αντισωμάτων (mAb) που αναγνωρίζει την εξωκυτταρική περιοχή του ανθρώπινου CD44R1 εκφράζεται σε ζωντανά κύτταρα όγκου δεν ήταν διαθέσιμες μέχρι τώρα, ακριβή εκτίμηση του θεραπευτικού αποτελέσματος των αντι-CD44R1 mAb επί ανθρώπινων κακοηθειών απομένει να αναληφθούν. Σε αυτή τη μελέτη, αναφέρουμε την αναστολή της ανάπτυξης των ξενομοσχευμάτων ανθρώπινου καρκίνου σε αθυμικούς ποντικούς με τοπικά ή συστηματικά χορηγούμενη πλήρως ανθρώπινα mAb αναγνωρίζουν CD44R1, και συζητούν την ιδιαιτερότητα, μηχανισμούς κατά του όγκου και η χρησιμότητα των πλήρως ανθρώπινων αντι-CD44R1 mAb στην θεραπεία του καρκίνου.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

CD44, η οποία συνδέεται με υαλουρονικό, είναι ένα αξιόπιστο μόριο δείκτη για ΚΕΠ [11] – [16], και συμμετέχει σημαντικά στη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων [16] – [ ,,,0],19]. Ετσι, CD44 θεωρείται ότι είναι μια πολλά υποσχόμενη μοριακός στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου με τη χρήση mAb. Από CD44s εκφράζεται σε διάφορους φυσιολογικούς ιστούς [20], έχουμε επικεντρωθεί στην όγκους πρωτεΐνες επιλεκτικής ματίσματος παραλλαγή CD44v. Μεταξύ των πάνω από 1000 θεωρητικά δυνατό πρωτεΐνες ματίσματος παραλλαγή CD44v [21], CD44R1 αφού το ένθετο κωδικοποιείται από V8, V9 και V10 εξώνια εκφράζεται επιλεκτικά σε διάφορα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα [8].

Έχουμε ετοιμάσει πρόσφατα πέντε αντι -ανθρώπινη CD44 πλήρως τα ανθρώπινα IgM mAb (MV1 κατά CD44s, και MV2, MV3, MV4 και MV5 κατά CD44R1) από το κελί συγχωνεύσεις μεταξύ των κυττάρων μυελώματος ποντικού και τα κύτταρα σπλήνας του Kirin-Medarex (KM) ποντίκια [22] εμβολιαστεί κατά ανασυνδυασμένη ανθρώπινη πρωτεΐνες CD44 που παράγονται σε

Escherichia coli

. Σε αυτή την εργασία, παρουσιάζουμε την προετοιμασία της κατηγορίας-switched αντι-CD44R1 ανθρώπινη IgG mAb (GV5), η εξειδίκευση των MV1, MV5 και GV5, και

in vivo

και

in vitro

αντι- επίδραση του όγκου των GV5.

πλήρως ανθρώπινα IgM και IgG mAb εναντίον ανθρώπινες πρωτεΐνες CD44 παρήχθησαν

Πέντε αντι-ανθρώπινο CD44 πλήρως τα ανθρώπινα IgM mAb (MV1, MV2, MV3, MV4 και MV5) ήταν που παράγονται έναντι ενός ανασυνδυασμένου CD44 (R1a? Δex5-V8-V9-V10-Δex16) πρωτεΐνη που παράγεται σε

Escherichia coli

[8]. MV1 αντιδρά με RH7777 κύτταρα ηπατώματος αρουραίου που εκφράζουν CD44s ή CD44R1, και MV2, MV3, MV4 και MV5 αντέδρασαν ειδικά με κύτταρα που εκφράζουν RH7777 CD44R1 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για να αξιολογηθεί η αντιδραστικότητα του mAb με ανθρώπινο

in vivo

όγκους, εκτελέσαμε ΙΗΑ (Εικ. 1). MV1 και MV5 σίγουρα χρώση των κυτταρικών μεμβρανών του

in vivo

όγκου από ΜΕ180 ανθρώπινο μήτρας καρκίνος τραχήλου αναπτυχθεί σε αθυμικούς ποντικούς, και CD44R1 ήταν ετερογενώς εκφράζεται σε ξενομοσχεύματα ανθρώπινου καρκίνου, αν και MV2, MV3 και MV4 έδειξαν σχετικά ασθενείς αντιδράσεις σε σύγκριση με MV5 (Εικ. 1). Ως εκ τούτου, έχουμε αναδιαμορφωθεί (κατηγορία μεταγωγής) MV5 ανθρώπινα IgM σε GV5 ανθρώπινη IgG. Η αντιδραστικότητα του GV5 με

in vivo

όγκους από ΜΕ180 ήταν επίσης θετικό στην κυτταρική μεμβράνη αυτών των κυττάρων όγκου (Εικ. 2), και CD44R1 ήταν ετερογενώς εκφράζεται στον όγκο, όπως στην περίπτωση με την κηλίδωση του ΜΕ180 όγκου με MV5. Σε αντίθεση, η έκφραση του HER2 αναγνωρίζεται με την trastuzumab σχετικά ομοιόμορφη στον όγκο ΜΕ180, και η έκφραση του CD20 που αναγνωρίζεται από Rituximab ήταν εντελώς αρνητική.

τομές ιστών ανθρώπινων όγκων ΜΕ180 αναπτύχθηκαν σε αθυμικούς ποντικούς σταθεροποιήθηκαν με PFA και επωάσθηκαν διαδοχικά με τα ανθρώπινα mAb, συγκεκριμένα είδη βιοτινυλιωμένο αντι-ανθρώπινη IgG + IgM (Η + L), αντιδραστήριο ABC και διάλυμα υποστρώματος που περιέχει DAB και H

2O

2. Οι πυρήνες βάφτηκαν με αιματοξυλίνη.

Η

τομές ιστών ανθρώπινων όγκων ΜΕ180 αναπτύχθηκαν σε αθυμικούς ποντικούς σταθεροποιήθηκαν με ψυχρή ακετόνη, και διαδοχικά επωάστηκαν με πρωτογενές mAb, συγκεκριμένα είδη βιοτινυλιωμένο αντι-ανθρώπινο IgG Ρογ, ABC αντιδραστηρίων και διάλυμα υποστρώματος που περιέχει DAB και H

2O

2. Οι πυρήνες βάφτηκαν με αιματοξυλίνη. Άνω ή κάτω πίνακες παρουσιάζουν αντίστοιχα χαμηλή ή υψηλή μεγέθυνση των χρωματισμένων ιστών.

Η

Η ειδικότητα και επιτόπου πλήρως ανθρώπινων MV1 και MV5 IgM, και τάξη-switched GV5 IgG mAb εναντίον CD44 προσδιορίστηκαν

ιδιαιτερότητες της MV1, MV5 και GV5 συγκρίθηκαν για την αντιδραστικότητα με κύτταρα HEK293F ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά εκφράζουν CD44R1 ή CD44s (Εικ. 3Α), όπως περιγράφεται αλλού [10], [23]. MV5 και GV5 αντέδρασαν ειδικά με την πρωτεΐνη CD44R1-πράσινη φθορίζουσα (GFP) εκφράζοντα κύτταρα σε μία GFP-έκφραση-εξαρτώμενο τρόπο? Ωστόσο, αυτά mAb δεν αντέδρασε με κύτταρα που εκφράζουν CD44s-GFP, αποδεικνύοντας ότι GV5 διατηρεί την ιδιαιτερότητα του MV5 και ειδικά αναγνωρίζει μια ανθρώπινη πρωτεΐνη CD44R1 με κυτταρομετρία ροής (FCM). Σε αντίθεση, MV1 αντέδρασε με κύτταρα που εκφράζουν HEK293F CD44s-GFP ή CD44R1-GFP. Η εξειδίκευση του ανθρώπινου mAb επίσης τεκμηριώθηκε με ανάλυση FCM χρησιμοποιώντας κύτταρα αρουραίου RH7777 επιμολυσμένα με cDNA του ανθρώπινου CD44s ή CD44R1 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στη συνέχεια, MV1, MV5 και GV5 αξιολογήθηκαν για αντιδραστικότητα με διάφορες ανασυνδυασμένες ανθρώπινες πρωτεΐνες CD44 συντηγμένη με S-τρανσφεράση γλουταθειόνης (GST) (Σχ. 3Β). R1a είναι ένα ανοσογόνο για την παραγωγή του αντι-CD44 ανθρώπινο mAb, και R1b περιέχει μικρότερες πολυπεπτιδίων σε EX5 και V8 περιοχές από R1a. Ο επίτοπος που ορίζεται με πλήρως ανθρώπινα mAb εντοπίστηκε σε μια περιοχή EX5 κωδικοποίηση για MV1, και μια περιοχή V8 κωδικοποίηση για MV5 και GV5 με ανοσορροφητική δοκιμασία συνδεδεμένη με ένζυμο (ELISA). Το επίτοπο πεπτίδιο όπως ορίζεται με MV5 ή GV5 φάνηκε να εκτεθούν σε ανθρώπινα κύτταρα επειδή αυτά τα mAb σίγουρα και ειδικώς αντέδρασαν με κύτταρα HEK293F εκφράζουν CD44R1, αν και CD44R1 βαριά γλυκοζυλιωμένη και η έκφραση αυτών των επιτόπων θα μπορούσε να επηρεαστεί από την γλυκοζυλίωση κυμαίνεται μεταξύ κυτταρικών τύπων ή συνθήκες των κυττάρων.

(Α) MV1 (αριστερά), MV5 (μέση) και GV5 (δεξιά) συγκρίθηκαν για την αντιδραστικότητα με κύτταρα που εκφράζουν ανθρώπινο HEK293F CD44R1-GFP (άνω) ή ανθρώπινο CD44s-GFP (κατώτερο) από FCM. (Β) Η αντιδραστικότητα των αντισωμάτων έναντι διαφόρων GST-συντηγμένων ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών CD44 (R1a και R1b? Δex5-V8-V9-V10-Δex16, V8, V9, V10 και EX5) συντήκονται με GST προσδιορίστηκε με ELISA. Διαφορά στο μήκος των Δex5 και Δex16 μεταξύ R1a και R1b ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών περιγράφεται στο «Υλικά και Μέθοδοι».

Η

Anti-CD44R1 πλήρως ανθρώπινα GV5 αντιδρά επιλεκτικά με ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκινώματος, αλλά όχι με διάφορους ανθρώπινα κανονικά κύτταρα

Μερικά από τα υπάρχοντα θεραπευτικά mAb στοχεύονται με τον υποδοχέα του ανθρώπινου επιδερμικού αυξητικού (HER) οικογένεια [24] – [27]. Συγκρίναμε την αντιδραστικότητα του GV5, Cetuximab (αντι-HER1) και Trastuzumab (αντι-ΗΕΚ2) με HCT116 ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα κόλου, φυσιολογικά ανθρώπινα επιδερμικά κερατινοκύτταρα (ΝΗΕΚ) και ανθρώπινα ομφαλικά φλεβικά ενδοθηλιακά κύτταρα (HUVEC) (Σχ. 4Α, C) . GV5, cetuximab και τραστουζουμάμπη ήταν σίγουρα αντιδρούν με HCT116 ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. GV5 ασθενώς αντέδρασε με ΝΗΕΚ, παρόλο Το cetuximab έντονα και τραστουζουμάμπη μέτρια αντέδρασε με ΝΗΕΚ. Επιπλέον, GV5 ήταν σχεδόν ανενεργό με HUVEC, αν και cetuximab και τραστουζουμάμπη αντέδρασε ουσιαστικά με HUVEC. Στη συνέχεια, εξετάσαμε την αντιδραστικότητα των GV5 εναντίον διαφόρων επιπλέον ανθρώπινες κυτταρικές σειρές (Σχ. 4Β). GV5 σίγουρα αντιδρά με διάφορα καλλιεργημένων επιθηλιακών καρκίνων του ανθρώπου (ΒΤ20 μαστού, KATOIII στομάχι, LS-174Τ του παχέος εντέρου, του τραχήλου της μήτρας ΜΕ180, KPK-1 νεφρού και KU-1 κύστη), αν και αυτό το mAb δεν αντέδρασε ή μόνο ασθενώς αντιδρά με Molt-4 T λευχαιμία, SK-MEL-37 μελανώματος και μη-καρκινικές κυτταρικές γραμμές από δέρμα ενηλίκων (EK325), εμβρυϊκό έντερο (Int407) και εμβρυϊκού νεφρού (HEK293F). GV5 αντέδρασε επίσης με ΜΚΝ-7 στομάχι και κυτταρικές γραμμές καρκινώματος τραχήλου της μήτρας HeLa-S, αλλά όχι με U-2ος οστεοσάρκωμα, Jurkat, Daudi και κυτταρικές γραμμές HL60 λευχαιμία (Εικ. 4C). Έκφραση CD44R1 σε πολλά κύτταρα καρκινώματος ήταν ετερογενής (Εικ. 4Β), όπως στις περιπτώσεις της ανθρώπινης ξενομοσχεύματα σε αθυμικούς ποντικούς (Εικ. 1, Εικ. 2). Επιπλέον, GV5 δεν αντέδρασε με ηρεμία μικρά λεμφοκύτταρα σε όλα? Είναι επίσης ενδιαφέρον ότι δεν αντιδρούν με λεμφοκύτταρα που διεγείρονται με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ιντερλευκίνη-2 (IL-2) για 48 ώρες ή 12

O

τετραδεκανοϋλοφορβολο-13-οξικό (ΤΡΑ) συν Ca ιονοφόρος ( Α23187) για 24 ώρες, υποδεικνύοντας ότι ενεργοποιημένα Τ και Β λεμφοκύτταρα δεν είναι αντιδραστικά με GV5 (Εικ. 4C). Η ειδικότητα του GV5 υποδεικνύει ότι CD44R1 είναι ένας όγκος-επιλεκτική και ανώτερη μόριο στόχο σε σύγκριση με HER1 ή HER2. Στην πραγματικότητα, σοβαρή δερματική τοξικότητα παρατηρήθηκε στην αγωγή του cetuximab έναντι ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου, πιθανώς λόγω της σύνδεσης προς HER1 επί των κερατινοκυττάρων του δέρματος. Στο πλαίσιο της έκφρασης του HER2, GV5 αντέδρασαν ισχυρά με ένα τριπλό-αρνητικό καρκίνο του μαστού κυτταρική γραμμή ΒΤ20 που δεν εκφράζει υποδοχείς οιστρογόνων και προγεστερόνης και HER2, αν και αυτό το mAb δεν αντέδρασαν με HER2-υπερεκφράζουν SK-BR-3 καρκίνου του μαστού κυτταρική γραμμή (Σχ. 4Β, C). Ως εκ τούτου, αναμένουμε ότι η αντι-CD44R1 θεραπευτικών mAb θα μπορούσε να αντισταθμίσει για αντι-HER2 mAb στην θεραπεία των καρκίνων του μαστού.

GV5, cetuximab και Trastuzumab συγκρίθηκαν για την αντιδραστικότητα με HUVEC, ΝΗΕΚ και HCT116 με FCM (ιστογραμμάτων ) με μία ροή Accuri C6 κυτταρόμετρο (Α). Αντιδραστικότητα GV5 με διάφορα ανθρώπινα κύτταρα αναλύθηκε με FCM, και απεικονίζεται ως ιστογράμματα (Β) χρησιμοποιώντας ένα BD-LSR κυτταρόμετρο ροής και ως ΔMFI (C) χρησιμοποιώντας μια ροή Accuri C6 κυτταρομετρητή.

Η

CD44R1 ήταν ειδικά ανιχνεύονται σε ανθρώπινα επιθηλιακά καρκινικούς ιστούς

Πρώτον, η διανομή των CD44s και CD44R1 σε ανθρώπινους καρκίνους αναλύθηκε με αρουραίου mAb (RV7 και RV9) έναντι του ανθρώπινου CD44, αφού ανοσοχρώση ανθρώπινων ιστών με GV5 που ακολουθείται από αντι-ανθρώπινο ανοσοσφαιρίνες δεν είχε ως αποτέλεσμα την προφανή αποτέλεσμα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε ΙΗΑ για τα ανθρώπινα μαστού και του παχέος εντέρου ιστούς (Εικ. 5), και οι δύο RV7 καθορισμένες CD44s και RV9 καθορισμένες CD44R1 (V8) έχουν σίγουρα εκφράζονται στην κυτταρική μεμβράνη των κυττάρων του μαστού και τον καρκίνο του παχέος εντέρου, αν και CD44s αλλά δεν CD44R1 εκφράστηκε επίσης σε κυττάρων στο στρώμα. Έκφραση των CD44R1 σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του μαστού ήταν χαμηλό και ήταν αρνητική σε επιθηλιακά κύτταρα του παχέος εντέρου. Επιπλέον, CD44R1 ήταν ετερογενώς εκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα, όπως στην περίπτωση με την κηλίδωση των ξενομοσχευμάτων ανθρώπινου καρκίνου του (Εικ. 1 και Εικ. 2) και κυτταρικές σειρές καρκίνου (Σχ. 4Β) με GV5 αντι-CD44R1 ανθρώπινο mAb. Σε ΙΗΑ στην ανθρώπινη αμυγδαλές, RV9 αντι-CD44R1 (V8) mAb ασθενώς χρωματισμένο το επιθήλιο, ειδικά κύτταρα στη βασική στοιβάδα, αλλά δεν βάφει λεμφοβλαστοειδή κύτταρα στο βλαστικό κέντρο του ιστού αμυγδαλής, αν και RV7 αντι-CD44s mAb σίγουρα βαμμένα κύτταρα στην περιοχή αυτή, εκτός από τα κύτταρα σε ολόκληρο το επιθήλιο (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα ευρήματα συμπίπτουν καλά με το unreactivity του GV5 με ενεργοποιημένα ανθρώπινα λεμφοκύτταρα (Εικ. 4C). Αυτά τα αποτελέσματα από FCM και ΙΗΑ έδειξαν εξαιρετική καρκίνο εξειδίκευση της CD44R1, αναμφίβολα ανώτερη από αυτή των CD44s. Στη συνέχεια εξετάσαμε την αντιδραστικότητα του βιοτινυλιωμένου GV5 με δείγματα ανθρώπινου ιστού. GV5 σίγουρα αντιδρά με καρκινώματα πλακωδών του τραχήλου της μήτρας (πρωτοπαθή καρκίνο), του δέρματος (πρωτογενούς καρκίνου) και πνεύμονα (μεταστατικό καρκίνο στους μαλακούς ιστούς), τα αδενοκαρκινώματα του στομάχου και του παχέος εντέρου, αλλά όχι με συγκεντρωτική λεμφικού οζίδια του σκωληκοειδής απόφυση (Εικ. 6). Έτσι, η έκφραση του CD44R1 περιορίζεται σε επιθηλιακούς καρκίνους, και δεν είναι αυξημένα κατά τη διαδικασία της ενεργοποίησης λεμφοκυττάρων

in vitro

ή

in vivo

, αν και η έκφραση ενός δεδομένου εγγενών ογκοπρωτεΐνη στα λεμφοκύτταρα συχνά up-ρυθμίζεται από διάφορα ερεθίσματα ενεργοποίησης [28], [29].

η αντιδραστικότητα του αντι-ανθρώπινου CD44s ή αντι-ανθρώπινο CD44R1 (V8) mAb αρουραίου με τα τμήματα του μαστού και ιστού του κόλου από ανθρώπινα χειρουργικά δείγματα ήταν αναλύονται με χρώση ανοσοϋπεροξειδάσης ABC. Τμήματα από PFA-σταθερές και ανθρώπινους ιστούς του μαστού και του παχέος εντέρου εγκλεισμένα σε παραφίνη υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μικροκύματα σε κιτρικό ρυθμιστικό για την ανάκτηση των αντιγόνων, και επωάζονται με mAb RV7 ή RV9 αρουραίου. Αφού ξεπλύθηκαν σε PBS, τομές ιστών επωάσθηκαν διαδοχικά με τα συγκεκριμένα είδη βιοτινυλιωμένου γαϊδάρου αντι-αρουραίου IgG (H + L), αντιδραστήριο ABC και διάλυμα υποστρώματος που περιέχει DAB και H

2O

2. Οι πυρήνες βάφτηκαν με αιματοξυλίνη. Μη καρκίνου ή του καρκίνου ιστούς: τα δείγματα από ένα πανομοιότυπο ασθενή.

Η

Τμήματα από PFA-σταθερές και εγκλεισμένοι σε παραφίνη ανθρώπινοι ιστοί υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μικροκύματα σε κιτρικό ρυθμιστικό για την ανάκτηση των αντιγόνων, και επωάστηκαν με βιοτινυλιωμένο GV5. Αφού ξεπλύθηκαν σε PBS, τμήματα ιστού επωάστηκαν με διάλυμα αντιδραστηρίου και του υποστρώματος ABC περιέχουν DAB και H

2O

2. Οι πυρήνες βάφτηκαν με αιματοξυλίνη.

Η

Anti-CD44R1 GV5 ανθρώπινο mAb εκτίθενται

in vivo

θεραπευτική επίδραση στην ανθρώπινη καρκινώματα σε μοντέλα ξενομοσχεύματος

GV5 αξιολογήθηκε ως προς την αντι- επίδραση του όγκου έναντι ανθρώπινων όγκων σε αθυμικούς ποντικούς. Το μέγεθος του κάθε όγκου σχηματίσθηκε περιοδικώς μετρήθηκε, όπως περιγράφεται αλλού [30] – [32]. Πρώτον, GV5 εξετάστηκε για την επίδραση επί του σχηματισμού όγκου με ΜΕ180 ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του τραχήλου της μήτρας σε ένα μοντέλο εξουδετέρωση όγκου [33]. Το μοντέλο αυτό για να αξιολογηθεί η τοπική επίδραση των αντισωμάτων έναντι ανάπτυξης όγκου ιστορικά προέρχονταν από δοκιμή Winn [34] που προορίζονται για την αξιολόγηση του αποτελέσματος κατά του όγκου των κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων. Τα καρκινικά κύτταρα εμβολιάστηκαν υποδορίως σε αθυμικούς ποντικούς με ή χωρίς GV5 (50 μα /θέση), και την ανάπτυξη του όγκου σε GV5 treatedmice ήταν σημαντικά ανέστειλε σε σύγκριση με εκείνη των ποντικών ελέγχου (Εικ. 7). Στη συνέχεια, GV5 εξετάστηκε για αντικαρκινική δράση έναντι ενός HSC-3 ανθρώπινου καρκίνου του λάρυγγα σε ένα καθιερωμένο μοντέλο όγκου [35]. Σε αυτή την συστηματική χορήγηση του mAb σε ποντίκια που φέρουν όγκο, υιοθετήσαμε σκόπιμα ενδοπεριτοναϊκή αλλά όχι ενδοφλέβια ένεση για τη χορήγηση μίας ακριβής ποσότητα mAb σε κάθε ποντικό. Επτά ημέρες μετά την HSC-3 κύτταρα εμβολιάστηκαν υποδορίως σε αθυμικούς ποντικούς και μια ορατή όγκου σε κάθε ποντίκι επιβεβαιώθηκε, έλεγχος οχήματος GV5or έγινε ενδοπεριτοναϊκά ένεση δύο φορές σε διάστημα μιας εβδομάδας. Σε αυτό το πειραματικό μοντέλο, ανάπτυξη όγκου σε GV5 treatedmice ήταν και πάλι ανέστειλε σημαντικά σε σύγκριση με εκείνη των ποντικών ελέγχου (Εικ. 8).

μοντέλο όγκου εξουδετέρωση εγκρίνεται. κύτταρα ανθρώπινου όγκου ΜΕ180 (1.0 × 10

6) με ή χωρίς mAb (50 μα /θέση) σε 200 μΙ PBS υποδορίως εμβολιάσθηκαν στο δεξιό ραχιαίο πλευρό του κάθε ζώου. Το μέγεθος του κάθε όγκου σχηματίσθηκε περιοδικά μετριέται και ο όγκος του όγκου (mm

3) υπολογίστηκε από τον τύπο 0.4 × (μήκος) χ (πλάτος)

2. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν στατιστικά με τεστ ANOVA αμφίδρομη με επαναλαμβανόμενες μετρήσεις.

Η

Ιδρύθηκε το μοντέλο όγκου εκδόθηκε. Επτά ημέρες μετά κύτταρα καρκινώματος που προέρχονται από ανθρώπινο λάρυγγα HSC-3 όγκων (1,0 × 10

6) σε 200 μΐ PBS ενοφθαλμίστηκαν υποδορίως σε αθυμικούς ποντικούς και ορατό όγκο σε κάθε ποντικό επιβεβαιώθηκε, 500 μΙ PBS με ή χωρίς GV5 (100 μ§) ενδοπεριτοναϊκά εμβολιάσθηκαν την ημέρα 7 και την ημέρα 14 (κατακόρυφα βέλη). Το μέγεθος του κάθε όγκου σχηματίσθηκε περιοδικά μετριέται και ο όγκος του όγκου (mm

3) υπολογίστηκε από τον τύπο 0.4 × (μήκος) χ (πλάτος)

2. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν στατιστικά με

t

δοκιμές δύο όψεων του Student (άνω), και με δοκιμές ANOVA αμφίδρομη με επαναλαμβανόμενες μετρήσεις (κατώτερο). Κάθετες μπάρες δείχνουν τυπικές αποκλίσεις.

Η

προκαλείται από GV5 εσωτερίκευση των CD44R1 και ADCC

in vitro

Η

Για να αναλυθούν οι μηχανισμοί του

in vivo

αντικαρκινική δράση του GV5 έναντι ξενομοσχευμάτων ανθρώπινου καρκίνου σε αθυμικούς ποντικούς, internalizations του CD44R1, εξαρτώμενη από συμπλήρωμα κυτταροτοξικότητα (CDC) και εξαρτώμενη από αντίσωμα κυτταρική κυτταροτοξικότητα (ADCC) μέσω GV5 εξετάστηκαν. Δεδομένου ότι η δυσλειτουργία του CD44R1 από το mAb θα μπορούσε να οδηγήσει σε αναστολή της ανάπτυξης ή τον κυτταρικό θάνατο των καρκινικών κυττάρων, λόγω της έλλειψης σήματος από έναν υπόστρωμα προσκόλλησης, εξετάσαμε την επίδραση της GV5 στην κατανομή των πρωτεϊνών CD44 κυτταρικής επιφάνειας. Με την προσθήκη του GV5 στην καλλιέργεια του HSC-3 κύτταρα για 12 ώρες, περίπου το 50% των πρωτεϊνών CD44R1 εξαφανίστηκαν από την κυτταρική επιφάνεια (Σχ. 9Α). CDC χρησιμοποιώντας GV5 σε συνδυασμό με το ποντίκι, κουνέλι ή ανθρώπινο ορό δεν είχε ως αποτέλεσμα τον θάνατο των καρκινικών κυττάρων (Σχ. 9Β). Στην ADCC, σπληνοκύτταρα από αθυμικούς ποντικούς προ-καλλιεργήθηκαν με IL-2 για 12 ώρες για να ενισχυθεί η δραστικότητα θανάτωσης των κυττάρων τελεστών. Με τη χρήση της IL-2 επεξεργασμένα κύτταρα-τελεστές, GV5clearly αύξησε την κυτταροτοξικότητα εναντίον HSC-3 καρκινικά κύτταρα σε ADCC (Σχ. 9Γ, D).

(Α) κύτταρα HSC3 καλλιεργήθηκαν με ή χωρίς GV5 ( 10 μg /ml) για 12 ώρες, και ανοσοχρωματίστηκαν με GV5 που ακολουθείται από FITC-συζευγμένο γαϊδάρου αντι-ανθρώπινης IgG (h + L). πρωτεΐνες CD44R1 κυττάρων επιφάνεια σε αυτά τα κύτταρα ανιχνεύθηκαν με FCM. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές και ελήφθησαν παρόμοια αποτελέσματα. (Β) Μετά HSC-3 κύτταρα και ορούς για συμπληρώματος και mAb αναμείχθηκαν και επωάστηκαν σε κάθε φρεάτιο U πυθμένα πλάκας 96-φρεατίων για 1 ώρα, DAPI προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Ποσοστά ϋΑΡΙ-χρωματισμένων κυττάρων (νεκρά κύτταρα) υπολογίστηκαν με FCM. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές και ελήφθησαν παρόμοια αποτελέσματα. (C) HSC-3 κύτταρα (1.5 × 10

5) αναμίχθηκαν με κύτταρα τελεστές σπληνοκυττάρων (3 χ 10

6 ή 9 × 10

6) από KNS γυμνά ποντίκια, τα οποία είχαν προ-καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα με IL-2, με ή χωρίς mAb, σε κάθε φρεάτιο U πυθμένα πλάκας 96-φρεατίων για 5 ώρες, και ΡΙ προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Η κυτταροτοξικότητα αναλύθηκε χρησιμοποιώντας μια ροή Accuri κυτταρόμετρο. R1, HSC3 ανθρώπινα κύτταρα-στόχους? R2, κύτταρα τελεστές ποντικού? R3, ΡΙ-χρώση των νεκρών κυττάρων στο R1? R4, PI-βάφτηκε ζωντανά κύτταρα στο R1. (D) κυτταρικού θανάτου (%) του HSC-3 κύτταρα με κύτταρα τελεστές ποντικού (Ε /Τ = 0, 20 ή 60), με ή χωρίς GV5 παραστάθηκε γραφικά. Ε /Τ σημαίνει αναλογία τελεστή να στοχεύσετε.

Η

προκαλείται από GV5 αποτελεσματική ADCC με ανθρώπινα κύτταρα τελεστές

Από τη στιγμή που επιβεβαιώθηκε η δραστικότητα ADCC GV5 με κύτταρα τελεστές ποντικού, εξετάσαμε έπειτα η δραστικότητα ADCC GV5 με ανθρώπινα κύτταρα-τελεστές. GV5 έδειξαν σημαντική δραστικότητα ADCC έναντι HSC-3 κύτταρα όγκου με IL-2-διεγερμένα ανθρώπινα λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος (PBL) ως κύτταρα τελεστές, ακόμη και σε χαμηλή τελεστή /στόχου (Ε /Τ) αναλογία του 2,5 (Σχ. 10Α). Σε μια αναλογία Ε /Τ 10, GV5 έδειξαν επαυξημένης κυτταροτοξικότητα εναντίον HCS 3-κυττάρων σε σύγκριση με μόνη ανθρώπινα κύτταρα-τελεστές, σε όλα τα χρονικά σημεία μεταξύ 2 ώρες και 7 ώρες (Σχ. 10Β).

HSC-3 κύτταρα σημάνθηκαν με Calcein-ΑΜ, και τα κύτταρα (2 χ 10

5) αναμείχθηκαν με ενεργά κύτταρα του ανθρώπινου PBL (5 × 10

5 ή 2 × 10

6), τα οποία ήταν προ-καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα με IL-2, με ή χωρίς mAb σε κάθε φρεάτιο U πυθμένα πλάκας 96-φρεατίων για 7 ώρες. Η κυτταροτοξικότητα αξιολογήθηκε από την απελευθέρωση του Calcein-ΑΜ από νεκρά κύτταρα του όγκου εντός του μέσου, και τα αποτελέσματα καταγράφηκαν αυτόματα χρησιμοποιώντας μια Terascan microfluorocytometer VP σε διαστήματα 1 h για 7 ώρες. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν στατιστικά με αμφίδρομη τεστ ANOVA με επαναλαμβανόμενες μετρήσεις (Α) και από δύο όψεων του Student

t

δοκιμασίες (Α και Β). Κηλίδες και κάθετες μπάρες δείχνουν αντίστοιχα μέσα και τυπικά σφάλματα.

Η

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε παράγονται με επιτυχία πλήρως τα ανθρώπινα GV5 mAb αναγνωρίζουν ειδικά CD44R1, και απέδειξε την αναστολή της ανάπτυξης των ανθρώπινων ξενομοσχευμάτων καρκίνου σε ποντίκια χωρίς θύμο αδένα από GV5 . Όσον αφορά τους μηχανισμούς κατά του όγκου έναντι ξενομοσχευμάτων ανθρώπινου από GV5 σε αθυμικούς ποντικούς, έχουμε δοκιμαστικά προτείνουμε την συμβολή της επαγόμενης εσωτερικοποίηση CD44R1 από GV5 και επαυξημένης κυτταροτοξικότητα σε ADCC με τελεστή κυττάρων ποντικού με GV5. Αναμένουμε επίσης ότι GV5can εμφανίσει ένα ADCC μεσολάβηση θεραπευτική επίδραση στην ανθρώπινη κακοήθειες, αφού GV5has έδειξε δραστικότητα ADCC με ανθρώπινα PBL ως κύτταρα τελεστές. Επιδράσεις των αντι-CD44R1 mAb σχετικά με την ενσωμάτωση του υαλουρονικού είναι τώρα υπό έρευνα? Ωστόσο, έχουμε ήδη επιβεβαιώσει ότι GV5 θα μπορούσε να προκαλέσει την εσωτερικοποίηση του CD44R1 από την κυτταρική επιφάνεια, προτείνοντας πιθανές επιπτώσεις για την ενσωμάτωση των υαλουρονικού και επαυξημένης αντικαρκινική επίδραση αυτού του mAb, εκτός από την ADCC δραστηριότητα.

Πρόσφατα, ειδικές χιμαιρικά ή εξανθρωπισμένα mAb κατά των εξωκυτταρικών περιοχών του HER2 [24], [25], HER1 [26], [27] και CD20 [36] – [38] έχουν εισαχθεί για τη θεραπεία του καρκίνου του μαστού, καρκίνο του παχέος εντέρου ή Β κακοήθειες κυττάρων, αντίστοιχα. Παρά το γεγονός ότι έχουν πρόσφατα διεξαχθεί κλινικές δοκιμές φάσης Ι με αντι-CD44v6 χιμαιρικό mAb έναντι καρκινώματα πλακωδών κυττάρων [39] – [41], σοβαρή δερματική τοξικότητα παρατηρήθηκε πιθανώς λόγω της σύνδεσης προς CD44v6 σε κερατινοκύτταρα του δέρματος [39], [40]. Στο πλαίσιο αυτό, η αντιδραστικότητα των GV5 με ανθρώπινη φυσιολογική κερατινοκύτταρα του δέρματος ήταν αρνητική ή αμελητέα (Εικ. 3Α), γεγονός που υποδηλώνει χαμηλή τοξικότητα του δέρματος μας αντι-CD44R1 (V8) πλήρως ανθρώπινο mAb.

Οι συσσωρευμένες στοιχεία έχουν δείξει ότι CD44 είναι χαρακτηριστικά εκφράζεται σε ΚΕΠ διαφόρων προελεύσεων ιστού [11] – [16]. Τώρα εστιάζουμε την προσοχή μας σε CD44v (CD44R1), αλλά δεν CD44s εκφράζεται στην επιφάνεια των ΚΕΠ σε προκαρκινικές περιοχή του γαστρικού αδενοκαρκινώματος του

K19-Wnt1 /C2mE

διαγονιδιακά ποντίκια [9], [10]. Αντιδραστικότητα GV5 με ΜΕ180 ή HSC-3 φάνηκε σχετικά ετερογενές? Ωστόσο, ο σχηματισμός όγκου ή την ανάπτυξη του όγκου ήταν σχεδόν πλήρως ανασταλεί από GV5, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα ΚΕΠ αποτελείται κυρίως από GV5-αντιδρώσα υψηλής κύτταρα CD44R1

, αλλά όχι GV5-αδρανής CD44R1

χαμηλή κύτταρα. Σε αυτό το πλαίσιο, τα πρόσφατα στοιχεία μας έχουν προσκομίσει αποδεικτικά στοιχεία ότι η έκφραση του CD44R1 και η σύνδεσή της με XCT κυστεΐνη-γλουταμινικό αντιμεταφορέα, μια ελαφριά αλυσίδα υπομονάδας του CD98 ογκοπρωτεΐνης [10], [23], [30] – [32], [42 ], [43], εμποδίσει τις αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) επαγόμενη στρες σηματοδότησης που οδηγεί σε διακοπή της ανάπτυξης, της διαφοροποίησης των κυττάρων και γήρανση, και με τον τρόπο αυτό προάγουν τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και το σχηματισμό θανατηφόρων γαστρεντερικών όγκων [44]. Δεδομένου ότι CD44R1 εκφράζουν ΚΕΠ διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο στην αντίσταση στη θεραπεία του καρκίνου, θα πρέπει να υποτεθεί ότι η θεραπευτική mAb θα μπορούσε να στοχεύσει το CD44R1

πληθυσμό υψηλού κυττάρων στον καρκίνο.

παρούσες μας αναλύει έντονα δείχνουν ότι η θεραπεία του καρκίνου με αντι-CD44R1 πλήρως ανθρώπινα mAb είναι ελπιδοφόρα, ειδικά έναντι διαφόρων ανθρώπινων επιθηλιακών καρκίνων όπως αδενοκαρκινώματα του μαστού, του στομάχου και του παχέος εντέρου, το μεταβατικό κυτταρικό καρκίνωμα της ουροδόχου κύστεως, και νεφρικό καρκίνωμα, εκτός από πλακωδών κυττάρων καρκινώματα από διάφορες περιοχές του σώματος.

Υλικά και Μέθοδοι

κύτταρα και κυτταρικής καλλιέργειας συνθήκες

κυτταρικών σειρών από ανθρώπινο καρκίνωμα λάρυγγα (γα) (HSC-3), ca μαστού (ΒΤ20, SK-Br-3) , γαστρικό Ca (GAS-1, ΜΚΝ-7, ΜΚΝ-28, KATOIII), ορθοκολικό Ca (LS-174Τ, HCT116), του τραχήλου της μήτρας Ca (ΜΕ180, HeLa-S), νεφρική Ca (KPK-1, TOS-1 ), της ουροδόχου κύστης Ca (KU-1), μελάνωμα (SK-Mel-37), οστεοσάρκωμα (U-2ος), εμβρυϊκό έντερο (Int407) και ηπατώματος αρουραίου κυτταρική σειρά (RH7777?. γενναιόδωρα παρέχεται από Tanabe Mitsubishi Pharm) καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ? Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA) συμπληρωμένο με 7% θερμικά απενεργοποιημένο ορό εμβρύου μόσχου (FBS? ICN Biomedicals, Aurora, ΟΗ, USA) σε υγροποιημένο επωαστή (5% CO

2) στους 37 ° ΝΤΟ. GAS-1, ΜΚΝ-28 ή TOS-1 αντίστοιχα, που λαμβάνονται από Kotanagi H (Πανεπιστήμιο Akita), ιαπωνική συλλογή της έρευνας Bioresources (JCRB) Cell Bank ή Satoh Μ (Πανεπιστήμιο Tohoku). Τ-κυττάρων λευχαιμίες (Jurkat, Molt-4), Β-κυττάρου λευχαιμία (Daudi), προμυελοκυτταρική λευχαιμία (HL60) ανθρώπινης προέλευσης, τα ανθρώπινα PBL με ή χωρίς ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ιντερλευκίνη 2 (IL-2, 100 IU? Shionogi & amp? Co . Ltd., Osaka, Japan) και το ποντίκι σπληνοκυττάρων με IL-2 (100 IU) για ADCC, μυελώματα ποντικού (SP2, Χ63) και καθιερωμένες κύτταρα υβριδώματος καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (RPMI? Sigma-Aldrich) συμπληρωμένο με 7% θερμότητα FBS, υπό τους όρους που αναφέρονται παραπάνω. Για να αποκτήσετε ενεργοποιημένα ανθρώπινα λεμφοκύτταρα για FCM, PBL ήταν επίσης καλλιεργήθηκαν και διεγέρθηκαν με IL-2 (100 IU) για 48 ώρες ή 12

O

τετραδεκανοϋλοφορβολο-13-οξικό άλας (ΤΡΑ, 20 ng /ml? Sigma -Aldrich) συν Ca ιονοφόρος (Α23187, 0.3 μΜ? Calbiochem, La Jolla, CA, USA) για 24 ώρες σε RPMI με 7% FBS. HUVEC (Takara Bio Inc., Otsu, Ιαπωνία) διατηρήθηκαν σε EGM-2 μέσο (Lonza, Walkersville, ΜΟ, USA) και χρησιμοποιήθηκε σε τρίτη έως πέμπτη διόδους. ΝΗΕΚ (Takara Bio Inc.) καλλιεργήθηκαν σε HuMedia-KG2 (Lonza) και χρησιμοποιήθηκε σε τρίτης και τέταρτης περάσματα. ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα HEK293F (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) και μια ανθρώπινη επιδερμικού κερατινοκυττάρου-κυτταρική γραμμή που λαμβάνεται (EK325) που ιδρύθηκε από εμάς καλλιεργήθηκαν σε μέσο έκφρασης FreeStyle293 (Invitrogen) σε υγροποιημένο επωαστή (5% CO

2 ). GFP ήταν γενετικά συγχωνευμένο με την κυτταροπλασματική καρβοξυλο άκρο του ανθρώπινου CD44s ή CD44R1 σε ένα φορέα έκφρασης pACGFP (BD Biosciences, Mountain View, CA, USA), και HEK293F και RH7777 κύτταρα αντίστοιχα επιμολύνθηκαν με αυτά τα πλασμίδια CD44-GFP με 293fectin (Invitrogen) ή Lipofectamine 2000 (Invitrogen), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, επιλέγονται με τη χρήση μέσου καλλιέργειας που περιέχει G418 (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) αραιωμένο σε 400 μg /ml, και ο κλώνος-ταξινομημένο για κυψελοειδή πράσινο φθορισμό χρησιμοποιώντας ένα διαλογέα κυττάρων JSAN (Bay Bioscience, Κόμπε, Ιαπωνία). Αυτές οι καθιερωμένες κυτταρικές γραμμές HEK293F και RH7777 που εκφράζουν πρωτεΐνες CD44-GFP διατηρήθηκαν σε μέσο έκφρασης FreeStyle293 με G418 (400 μg /ml). Τα κύτταρα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC), εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Οι περισσότερες κυτταρικές γραμμές που περιέχουν HSC-3 αναφέρονται αλλού [45].

Τα υπάρχοντα θεραπευτικά μονοκλωνικά αντισώματα

Anti-HER1 χιμαιρικό Το cetuximab (MerckSerono, Rockland, ΜΑ, USA), αντι-HER2 ανθρωποποιημένα τραστουζουμάμπη και αντι-CD20 χιμαιρικό Rituximab (Roche-Chugai, Tokyo, Japan) χρησιμοποιήθηκαν για την χρώση ανθρώπινων κυττάρων ή ιστών.

Παρασκευή ενός ανασυνδυασμένου πλήρως ανθρώπινο IgG1 mAb αναγνωρίζουν CD44R1

MV1, MV2, MV3, MV4 και MV5 πλήρως ανθρώπινα IgM mAb παρασκευάστηκαν από κυτταρική σύντηξη μεταξύ των κυττάρων σπλήνας από Kirin-Medarex (ΚΜ) ποντίκια (22) ανοσοποιούνται έναντι ενός ανασυνδυασμένου Δex5-V8-V9-V10-Δex16 πρωτεΐνη (R1a) (8) συγχωνευμένο με S-τρανσφεράση γλουταθειόνης (GST) και κύτταρα μυελώματος ποντικού SP2. Η διαδικασία για την κυτταρική σύντηξη και την εγκατάσταση των υβριδωμάτων πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στην επόμενη ενότητα. Σε ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες R1a, Δex5 ή Δex16 αντιστοιχεί αντίστοιχα σε μερική βραχύ πεπτίδιο (Δex5, 19 αμινοξέα? Δex16, 8 αμινοξέα) που γειτνιάζουν με V8 ή V10. Μεταγραφεί αντίστροφα cDNAs από τη μεταβλητή περιοχή των βαρέων και ελαφριών αλυσίδων, οι οποίες κλωνοποιήθηκαν από το ολικό RNA των κυττάρων υβριδώματος που εκκρίνουν ένα IgM (μ, κ ανθρώπινο mAb έναντι CD44R1 (MV5), γενετικά αναδιαμορφωθεί προς cDNAs της ανθρώπινης IgG1 (γ1, κ