Αφηρημένο

Η κυκλική ΑΜΡ (cAMP) αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό πολλών καρκινικών κυττάρων. Αναφέραμε προηγουμένως ένα αντιπολλαπλασιαστικό αποτέλεσμα του ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP (8-PIP-cAMP και 8-ΗΑ-cAMP) σε δύο ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές διαφορετικής προέλευσης. 8-Cl-cAMP, ένα άλλο ανάλογο της cAMP με γνωστές αντιπολλαπλασιαστικές ιδιότητες, έχει διερευνηθεί ως ένα δυνητικό αντικαρκινικό φάρμακο. Εδώ, συγκρίναμε την αντιπολλαπλασιαστική επίδραση της 8-Cl-cAMP και το ρΚα I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP σε τρεις καρκινικές κυτταρικές σειρές ανθρώπου (ARO, ΝΡΑ και WRO). 8-Cl-cAMP και οι ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP είχε ομοίως ισχυρά αντιπολλαπλασιαστικά αποτελέσματα επί των BRAF-θετικά ARO και ΝΡΑ κύτταρα, αλλά όχι στα BRAF-αρνητικά κύτταρα WRO, στην οποία μόνο το 8-Cl-cAMP με συνέπεια ανέστειλε την κυτταρική ανάπτυξη . Ενώ η θεραπεία με τις Ι-εκλεκτικά ανάλογα cAMP ΡΚΑ συνδέθηκε με διακοπή αύξησης, 8-Cl-cAMP που επάγεται απόπτωση. Για να διερευνηθούν περαιτέρω οι δράσεις του 8-Cl-cAMP και το ρΚα I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP, αναλύσαμε τις επιπτώσεις τους στην οδών που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την απόπτωση σηματοδότησης. Είναι ενδιαφέρον ότι, οι ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP αλλά όχι 8-Cl-cAMP, ανέστειλε ERK φωσφορυλίωση, ενώ 8-Cl-cAMP μόνη προκάλεσε μια προοδευτική φωσφορυλίωση του ρ38 ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ), μέσω της ενεργοποίησης του ΑΜΡΚ από μεταβολίτης του 8-Cl-αδενοσίνης. Είναι σημαντικό ότι η προ-αποπτωτική επίδραση του 8-Cl-cAMP θα μπορούσε να προληφθεί σε μεγάλο βαθμό από φαρμακολογική αναστολή της ΜΑΡΚ p38. Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι το 8-Cl-cAMP και οι ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP, αν και συγκρίσιμων αντιπολλαπλασιαστική δραστικότητα, δρουν μέσω διαφορετικών μηχανισμών. ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP επάγει αναστολή της ανάπτυξης σε κύτταρα που φέρουν το ογκογονίδιο BRAF, ενώ 8-Cl-cAMP επάγει απόπτωση, προφανώς μέσω της ενεργοποίησης του μονοπατιού ρ38 ΜΑΡΚ

Παράθεση:. Lucchi S, D Calebiro, de Filippis T, Grassi ES, Borghi ΜΟ, Persani L (2011) 8-χλωρο-κυκλικό ΑΜΡ και κινάσης Α Ι-Selective κυκλικού ΑΜΡ ανάλογα αναστέλλουν τον καρκίνο πρωτεΐνη ανάπτυξη των κυττάρων μέσω διαφορετικών μηχανισμών. PLoS ONE 6 (6): e20785. doi: 10.1371 /journal.pone.0020785

Συντάκτης: Andrew D. Badley, Mayo Clinic, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 19η Ιανουαρίου του 2011? Αποδεκτές: 9, Μαΐου 2011? Δημοσιεύθηκε: 10 του Ιούνη 2011

Copyright: © 2011 Lucchi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από ερευνητικά κονδύλια του Istituto Italiano Auxologico. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση που έλαβε για την παρούσα μελέτη

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η κυκλική ΑΜΡ (cAMP) είναι μια αρχαία και πανταχού παρούσα χημικό νευροδιαβιβαστή, που βρίσκονται τόσο σε προκαρυωτικούς και ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Στα σπονδυλωτά είναι ένα σημαντικό ενδοκυττάριο μεσολαβητή των νευροδιαβιβαστών και ορμονών και ρυθμίζει ουσιαστικές λειτουργίες των κυττάρων, όπως συστολή, έκκριση και την αντιγραφή. Ενώ cAMP έχει αντιπολλαπλασιαστικό αποτέλεσμα στους περισσότερους τύπους κυττάρων, παρέχει ένα αντίθετο, δηλαδή προ-μιτωτικούς, ερέθισμα για τους νευρώνες και αρκετά κύτταρα των ενδοκρινικών προέλευσης [1], [2]. Δεν αποτελεί έκπληξη λοιπόν, γονίδια που κωδικοποιούν τα βασικά στοιχεία του cAMP πράξη οδό όπως ογκογονίδια ή oncosuppressors, πιο εξαίσια σε ενδοκρινή κύτταρα [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9] , [10]. Επιπλέον, μια ρύθμιση προς τα άνω των ισομορφών τύπου Ι της cAMP-εξαρτώμενη πρωτεϊνική κινάση Α (ΡΚΑ) έχει τεκμηριωθεί σε πολλές κακοήθειες [11].

Από cAMP έχει αντιπολλαπλασιαστική επίδραση στα κύτταρα του όγκου, τα ανάλογα cAMP κύτταρο διαπερατό έχουν θεωρηθεί για την θεραπεία του ανθρώπινου καρκίνου [11]. 8-Cl-cAMP, το καλύτερο που μελετήθηκαν αυτών των ενώσεων, έχει αντιπολλαπλασιαστικές ιδιότητες τόσο

in vitro

και

in vivo

και έχει αξιολογηθεί στην φάση Ι /ΙΙ κλινικών δοκιμών [11], [ ,,,0],12], [13]. Ωστόσο, παρά τις καλά τεκμηριωμένες επιδράσεις των 8-Cl-cAMP, δεν υπάρχει κοινή συμφωνία για το μηχανισμό δράσης του. Στις πρωτοποριακές μελέτες από την ομάδα των Yoon Cho-Chung ήταν πράγματι δείξει ότι το 8-Cl-cAMP τροποποιεί την αναλογία των ρυθμιστικών (R) υπομονάδες ΡΚΑ (τύπος Ι vs. τύπου II) με τη μείωση των επιπέδων των υπομονάδων IR τύπου [11], [14]. Αν και το φαινόμενο αυτό θεωρείται υπεύθυνη για την αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του 8-Cl-cAMP, τα αποτελέσματα της πιο πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι τα αποτελέσματα του 8-Cl-cAMP αντίθετα διαμεσολαβούνται από μεταβολίτη της 8-Cl-αδενοσίνη και είναι ανεξάρτητες από την ενεργοποίηση ΡΚΑ ή /και μεταβολές της αναλογίας μεταξύ τύπου Ι και τύπου II υπομονάδες R [15], [16], [17], [18].

σε προηγούμενη εργασία διαπιστώσαμε ότι ένα ζεύγος site-specific αναλόγων cAMP (8-PIP-cAMP και 8-ΗΑ-cAMP), το οποίο, όταν χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό, επιλεκτικά ενεργοποιούν ΡΚΑ I, είχε μια ισχυρή αντιπολλαπλασιαστική επίδραση σε δύο κυτταρικές γραμμές καρκινώματος BRAF-θετικό (ARO και ΝΡΑ), αλλά όχι σε οι BRAF-αρνητικά κύτταρα WRO [19]. Σε αυτή τη μελέτη συνέκρινε τα αποτελέσματα του 8-Cl-cAMP και αυτές ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP στις ίδιες κυτταρικές γραμμές καρκινώματος (ARO, ΝΡΑ και WRO), εξετάζοντας παραμέτρους όπως την ανάπτυξη των κυττάρων, την απόπτωση και τροποποιήσεις των βασικών σηματοδότηση καταρράκτες που θα μπορούσαν να εμπλέκονται στην αντιπολλαπλασιαστικές επιδράσεις τους.

Αποτελέσματα

Επίδραση των 8-Cl-cAMP ή τα PKA I-επιλεκτική αναλόγων cAMP στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων

Κατ ‘αρχάς, συνέκρινε την αντιπολλαπλασιαστική επίδραση του 8-Cl-cAMP και τις ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP. Για το σκοπό αυτό, υποβάλλαμε σε αγωγή ARO (καρκίνος του παχέος εντέρου), ΝΡΑ (μελάνωμα) και WRO (θυλακιώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς) κυττάρων με διαφορετικές συγκεντρώσεις του 8-Cl-cAMP ή τις ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP για διάφορες χρονικές περιόδους (24-96 h) και αξιολογήθηκε η βιωσιμότητα κυττάρου χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι και οι δύο θεραπείες ήταν παρομοίως ισχυρές στην αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων ARO και ΝΡΑ, ενώ μόνο το 8-Cl-cAMP είχε μια συνεπή αντιπολλαπλασιαστική επίδραση στα κύτταρα WRO (Σχήμα 1). Η επίδραση των δύο θεραπειών φθάσει σε ένα μέγιστο μετά 72-96 ώρες επώασης (τα δεδομένα δεν φαίνονται) και ήταν δοσοεξαρτώμενη, με τιμές IC50 55,3 μΜ σε ARO και 84.8 μΜ σε κύτταρα ΝΡΑ για τις ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP και μεταξύ 2.3 και 13.6 μΜ για 8-Cl-cAMP και στις τρεις κυτταρικές σειρές. Συνεπής με την προηγούμενη διαπίστωση ότι η αντιπολλαπλασιαστική επίδραση του 8-Cl-cAMP είναι ΡΚΑ-ανεξάρτητη και τουλάχιστον μερικώς διαμεσολαβούνται από μεταβολίτη της 8-Cl-αδενοσίνη [15], [16], [17], [18], η επίδραση 8-Cl-cAMP ανεστάλη σημαντικά με θεραπεία με τον αναστολέα φωσφοδιεστεράσης ΙΒΜΧ, το οποίο αποκλείει τη μετατροπή της 8-Cl-cAMP και 8-Cl-αδενοσίνης. Αντιθέτως, ΙΒΜΧ δε μετέβαλαν το αντιπολλαπλασιαστικό αποτέλεσμα των ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP (Σχήμα S1). Επιπλέον, η αντιπολλαπλασιαστική επίδραση της 8-Cl-cAMP δεν φαίνεται να μεσολαβείται από PKC, όπως θεραπεία με έναν αναστολέα PKC δεν τροποποίησε την απόκριση σε 8-Cl-cAMP (Σχήμα S2).

ARO, ΝΡΑ και WRO κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 72 ώρες παρουσία των ενδεικνυόμενων συγκεντρώσεων είτε του τύπου του cAMP αναλόγου (ες) και η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την δοκιμασία ΜΤΤ. PKA Ι, PKA I-επιλεκτική ανάλογα χρησιμοποιούνται σε ισομοριακές συγκεντρώσεις.

Η

Επίδραση των 8-Cl-cAMP ή τα PKA I-επιλεκτική αναλόγων cAMP στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης

Στη συνέχεια , αξιολογήσαμε εάν η αντιπολλαπλασιαστική επίδραση των 8-Cl-cAMP και το I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP ΡΚΑ σχετίστηκε με διακοπή αύξησης και /ή απόπτωση. Αυτό το ζήτημα αντιμετωπίστηκε με συνδυασμό των προσεγγίσεων.

Πρώτα, αναλύσαμε τις επιδράσεις της 8-Cl-cAMP και το ρΚα I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP επί του κυτταρικού κύκλου και απόπτωση με κυτταρομετρία ροής ανάλυση του περιεχομένου πυρηνικού DNA . Για το σκοπό αυτό, ARO, ΝΡΑ και WRO κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τους δύο τύπους του cAMP αναλόγου (ων) για διαφορετικές χρονικές περιόδους και αναλύθηκαν μετά από χρώση του DNA με ιωδιούχο προπίδιο. θεραπεία 8-Cl-cAMP σχετίστηκε με μείωση των κυττάρων σε G0 /G1 και συσσώρευση των κυττάρων στη φάση S. Επιπλέον, συνοδεύθηκε από σημαντική αύξηση στο κλάσμα των αποπτωτικών κυττάρων, δηλαδή εκείνες με περιεχόμενο DNA υπο-G0 /G1. Αντίθετα, η έκθεση στο i-εκλεκτικά ανάλογα cAMP ΡΚΑ δεν προκάλεσε σημαντική αύξηση στην απόπτωση. Η μόνη σημαντική επίπτωση των ΡΚΑ I-εκλεκτικοί αναλόγων cAMP ήταν μια ελαφρά αύξηση στον αριθμό των κυττάρων σε G0 /G1 (στατιστικά σημαντική σε κύτταρα ARO) και μία τάση προς μείωση των κυττάρων σε S και G2 /φάσεις M, τόσο συμβατό με συσσώρευση σε G0 /G1 (Πίνακας 1).

η

στη συνέχεια, αναλύσαμε την απελευθέρωση των θραυσμάτων DNA ιστόνης δεσμευμένη στο κυτοσόλιο, ως δείκτης της αποπτωτικής κατάτμησης DNA. ARO, ΝΡΑ και WRO κύτταρα εκτέθηκαν σε υπο-μέγιστες συγκεντρώσεις των ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP ή 8-Cl-cAMP, και η ποσότητα του νουκλεοσωμάτων στο κυτταρόπλασμα αξιολογήθηκε με μια συγκεκριμένη ELISA. θεραπεία 8-Cl-cAMP προκάλεσε σημαντική αύξηση στην κατάτμηση του DNA και στις τρεις κυτταρικές σειρές που ήταν ανιχνεύσιμη ξεκινώντας από 48 ώρες επώασης. Αντιθέτως, καμία επαγωγή της κατάτμησης DNA παρατηρήθηκε σε κύτταρα υπό θεραπεία με τις ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP (Σχήμα 2Α και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται)

Α:. Επίδραση στην κατάτμηση του DNA. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 8-Cl-cAMP (100 μΜ) ή τις ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP (100 μΜ το καθένα) για 48 ώρες και η απελευθέρωση των θραυσμάτων DNA ιστόνης δεσμευμένη στο κυτοσόλιο αξιολογήθηκε με μια συγκεκριμένη ELISA. Τα δεδομένα είναι από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Β: επίδραση στην κασπάσης 3/7. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 8-Cl-cAMP (100 μΜ) ή τις ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP (100 μΜ το καθένα) για 72 ώρες και η δραστικότητα κασπάσης 3/7 προσδιορίστηκε με μία δοκιμασία φωταύγειας. Τα δεδομένα είναι από τρία ανεξάρτητα πειράματα. * P & lt? 0.001 έναντι κύτταρα ελέγχου. Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως η μεταβολή έναντι κυτταρική καλλιέργεια ελέγχου χωρίς φάρμακα.

Η

Τέλος, όπως απόπτωση συνδέεται με την ενεργοποίηση της κασπάσης [20], εξετάσαμε την επίδραση των δύο θεραπειών για την δραστηριότητα της κασπάσης 3 /7, το οποίο μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία φωταύγειας. Μια σημαντική αύξηση στη δραστηριότητα της κασπάσης 3/7 ανιχνεύθηκε σε ARO, ΝΡΑ και WRO κύτταρα εκτίθενται σε 8-Cl-cAMP, αρχής γενομένης από 24 ώρες της θεραπείας, αλλά όχι στα ίδια κύτταρα σε επεξεργασία με τις ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP (Σχήμα 2Β ).

Λαμβανόμενα μαζί αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι το 8-Cl-cAMP αλλά όχι τα ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP που επάγεται απόπτωση σε κύτταρα ARO, ΝΡΑ και WRO.

οδούς αποπτωτικός ενεργοποιούνται από 8- Cl-cAMP

Για να διερευνηθεί το μονοπάτι που εμπλέκονται στην απόπτωση που επάγεται από 8-Cl-cAMP, αξιολογήσαμε την ενεργότητα της κασπάσης 8 (εξωγενής οδός) και κασπάσης 9 (ενδογενές μονοπάτι) χρησιμοποιώντας ειδικές δοκιμασίες φωταύγειας. Ένα από τα πρώτα και παροδική (10 min-1 h) ενεργοποίηση της κασπάσης 8, αλλά όχι της κασπάσης 9, παρατηρήθηκε (Σχήμα 3), γεγονός που υποδηλώνει ότι το 8-Cl-cAMP μπορεί να επάγουν την εξωγενή οδό. Ωστόσο, αυτά τα δύο κασπασών δεν έδειξε καμία ενεργοποίηση σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία (24-48 h) (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

ARO, ΝΡΑ και WRO κύτταρα εξετέθησαν σε 8-Cl-cAMP (200 μΜ) για διαφορετικές χρονικές περιόδους και τις δραστηριότητες της κασπάσης 8 και 9 μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ειδικές δοκιμασίες φωταύγειας. Τα δεδομένα είναι από τρία έως έξι ανεξάρτητα πειράματα. * P & lt? 0,05 έναντι βασικής. ** P & lt? 0,01 έναντι βασικής. *** P & lt? 0.001 έναντι βασικής. Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως η μεταβολή έναντι της γραμμής βάσης.

Η

Επίδραση της 8-Cl-cAMP ή οι ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP στα επίπεδα του ΡΚΑ υπομονάδων

Δεδομένου ότι υπήρξε ανέφεραν ότι το 8-Cl-cAMP προκαλεί ρύθμιση προς τα κάτω των ΚΙα και μία ανοδική ρύθμιση της ΡΙΙβ υπομονάδες [14], [21], συγκρίναμε τις επιδράσεις της 8-Cl-cAMP και το ρΚα I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP για την έκφραση των υπομονάδων ΡΚΑ R. Για το σκοπό αυτό, ARO, ΝΡΑ και WRO κύτταρα διεγέρθηκαν με 8-Cl-cAMP ή τις ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP για διαφορετικές χρονικές περιόδους και τα επίπεδα του ΚΙα, RIIα και ΚΙΙβ αξιολογήθηκαν με ανάλυση στυπώματος Western χρησιμοποιώντας ισομορφής ειδικά αντισώματα. Η επεξεργασία των κυττάρων ARO, ΝΡΑ και WRO είτε με 8-Cl-cAMP ή το I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP ΡΚΑ σχετίστηκε με μείωση των επιπέδων έκφρασης της υπομονάδας του Rla, ενώ τα επίπεδα των υπόλοιπων υπομονάδων δεν επηρεάστηκαν (Σχήμα 4 ).

ARO, ΝΡΑ και WRO κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 8-Cl-cAMP (100 μΜ) ή τις ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP (100 μΜ το καθένα) για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα. Τα επίπεδα ΚΙα, RIIα και ΚΙΙβ μετρήθηκαν με ανάλυση αποτύπωσης Western. Ορατή είναι αντιπροσωπευτικά κηλίδες Western (Α), καθώς και τα αποτελέσματα της πυκνομετρική ανάλυση τεσσάρων ανεξάρτητων πειραμάτων (Β). * P & lt? 0,01 έναντι βασικής. ** P & lt? 0.001 έναντι βασικής. Αυτά τα δεδομένα εκφράζονται ως μεταβολή έναντι της γραμμής βάσης.

Η

Επίδραση της 8-Cl-cAMP ή οι ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP επί ERK 1/2 και Akt

Σε μια προσπάθεια να κατανοήσουν καλύτερα τον μηχανισμό δράσης των 8-Cl-cAMP και τις ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP, μπορούμε στη συνέχεια εξετάστηκε η επίδραση και των δύο τύπων θεραπείας σε δύο βασικές καταρράκτες σηματοδότησης που εμπλέκονται στην κυτταρική ανάπτυξη, δηλαδή το εξωκυτταρικό σήμα ρυθμίζεται κινάση 1/2 (ERK) που ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ) και η φωσφατιδυλινοσιτόλη 3-κινάση (ΡΙ3Κ) /Akt μονοπάτι.

ERK1 /2 είναι καλά χαρακτηρισμένη MAPKs που ενεργοποιούνται σε απόκριση σε ερεθίσματα ανάπτυξης και παίζουν σημαντικό ρόλο στην νεοπλασματικό μετασχηματισμό [22]. Επιπλέον, cAMP έχει βρεθεί ότι αναστέλλει ERK 1/2 ενεργοποίηση σε αρκετές από τις κυτταρικούς τύπους όπου έχει ένα αντιπολλαπλασιαστικό αποτέλεσμα [1], [2]. Αυτό φαίνεται να είναι η περίπτωση, επίσης, σε ARO και ΝΡΑ κύτταρα, όπου, όπως έχουμε δείξει προηγουμένως, η αντιπολλαπλασιαστική επίδραση των αναλόγων ΡΚΑ I-επιλεκτικό cAMP σχετίζεται με μια αναστολή της ERK 1/2 φωσφορυλίωση στη Thr202 /Tyr204 [19] . Σε αυτή τη βάση, αξιολογήσαμε το αποτέλεσμα της θεραπείας 8-Cl-cAMP επί της φωσφορυλίωσης ERK σε Thr202 /Tyr204 με ανάλυση κηλίδος Western με ένα φωσφο-ειδικό αντίσωμα. Ανάλυση της ενεργοποίησης ΕΚΚ σε πρώιμα χρονικά σημεία αποκάλυψε παροδικές αυξήσεις και για τις δύο αγωγές (Σχήμα S3). Σε αντίθεση με αυτό που παρατηρήθηκε προηγουμένως σε απάντηση των ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP, η χρόνια έκθεση σε 8-Cl-cAMP δεν συνδέθηκε με μια καθυστερημένη και επίμονη αναστολή της φωσφορυλίωσης ERK (Εικόνα 5).

ARO , ΝΡΑ και WRO κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 8-Cl-cAMP (100 μΜ) ή τις ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP (100 μΜ το καθένα) για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα. Τα επίπεδα ERK 1/2 φωσφορυλιωμένο στο Thr202 /Tyr204 και ολική ΕΚΚ μετρήθηκαν με ανάλυση αποτύπωσης Western. Ορατή είναι αντιπροσωπευτικά κηλίδες Western, καθώς και η πυκνομετρική ανάλυση τριών έως τεσσάρων ανεξάρτητων πειραμάτων. Οι αναλογίες P-ΕΚΚ /ολική ΕΚΚ εκφράζεται ως η σχετική διακύμανση σε σχέση με τα βασικά επίπεδα κάθε μεμονωμένο πείραμα. * P & lt? 0,05 έναντι βασικής. ** Ρ & lt?. 0,01 vs. βασικοκυτταρικό

Η

Μια άλλη πρωτεΐνη που έχει εμπλακεί στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό είναι η κινάση σερίνης /θρεονίνης Akt, η οποία ενεργοποιείται από προϊόντα ΡΙ3Κ και η φωσφορυλίωση στη Ser473 και Thr308 [23] . Ως εκ τούτου, αξιολόγησε την επίδραση του 8-Cl-cAMP και το ρΚα I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP επί της φωσφορυλίωσης Akt σε Ser473 και Thr308, ενδεικτικό της ενεργοποίησης της. Συνεπής με αυτά που έχουν αναφερθεί στο παρελθόν [19], η αγωγή με 8-Cl-cAMP ή τις ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα δεν προκαλούν σχετικές τροποποιήσεις της φωσφορυλίωσης Akt σε πρώιμα χρονικά σημεία (Σχήμα S3) και για μέχρι 72 ώρες (τα στοιχεία δεν φαίνεται).

Επίδραση της 8-Cl-cAMP ή οι ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP στο ΜΑΡΚ p38

8-Cl-cAMP έχει δειχθεί ότι διεγείρει φωσφορυλίωση ρ38 ΜΑΡΚ σε HL60 και κύτταρα HeLa [24], [25]. Ως εκ τούτου, αξιολογήσαμε την επίδραση της 8-Cl-cAMP και το ρΚα I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP επί της φωσφορυλίωσης ρ38 ΜΑΡΚ. Βρήκαμε ότι η επεξεργασία του ARO, ΝΡΑ και κυττάρων WRO με 8-Cl-cAMP συνδέθηκε με μια προοδευτική αύξηση στη φωσφορυλίωση ρ38 ΜΑΡΚ, που αρχίζει στις 24 ώρες επώασης (Σχήμα 6). Αντίθετα, η θεραπεία με το i-επιλεκτική αναλόγων cAMP PKA δεν μετέβαλαν την κατάσταση φωσφορυλίωσης της p38 ΜΑΡΚ (Σχήμα 6), εκτός από τις δευτερεύουσες και παροδικές αυξήσεις που δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Επιπλέον, η θεραπεία με 8-Cl-cAMP ή τις ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα δεν προκάλεσε τροποποιήσεις της φωσφορυλίωσης ρ38 ΜΑΡΚ σε πρώιμα χρονικά σημεία (Σχήμα S3).

ARO, ΝΡΑ και WRO κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 8- Cl-cAMP (100 μΜ) ή οι ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP (100 μΜ το καθένα) για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα. Τα επίπεδα φωσφορυλιωμένου και συνολικής p38 ΜΑΡΚ μετρήθηκαν με ανάλυση αποτύπωσης Western. Ορατή είναι αντιπροσωπευτικά κηλίδες Western, καθώς και η πυκνομετρική ανάλυση των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. P-p38 λόγος /συνολικές-p38 ομαλοποιείται στα βασικά επίπεδα. * P & lt? 0,05 έναντι βασικής. ** P & lt? 0,01 έναντι βασικής. *** P & lt?. 0.001 έναντι βασικής

Η

Τέλος, αξιολογείται κατά πόσον η προ-αποπτωτική δράση του 8-Cl-cAMP ήταν εξαρτάται από την ενεργοποίηση της p38 MAPK. Για το σκοπό αυτό, θα υποβάλλονται σε θεραπεία για 48-72 ώρες και τα τρία κυτταρικές σειρές με 8-Cl-cAMP παρουσία ή απουσία των εκλεκτικών αναστολέων ρ38 ΜΑΡΚ (SB 202190 ή SB203580) και αναλύθηκε η κατανομή του κυτταρικού κύκλου με κυτταρομετρία ροής, όπως περιγράφεται παραπάνω. Είναι ενδιαφέρον ότι, η αναστολή της ΜΑΡΚ p38 εμπόδισε σε μεγάλο βαθμό την προ-αποπτωτικό αποτέλεσμα 8-Cl-cAMP (Σχήμα 7).

Τα κύτταρα διεγέρθηκαν με 8-Cl-cAMP (100 μΜ), είτε παρουσία είτε στο απουσία αναστολέων ΜΑΡΚ p38 (10 μΜ SB203580 ή SB202190) για 72 ώρες και η απόπτωση αξιολογήθηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής μετά από χρώση με ιωδιούχο προπίδιο. Τα δεδομένα είναι από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Τα δεδομένα εκφράζονται ως η μεταβολή έναντι κυτταρική καλλιέργεια ελέγχου. * Ρ & lt? 0.05 και ** Ρ & lt?. 0.001 vs. κύτταρα κατεργασμένα μόνο με 8-Cl-cAMP

Η

Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν έντονα ότι η προ-αποπτωτική επίδραση του 8-Cl-cAMP στην ARO, NPA και WRO κύτταρα διαμεσολαβείται από την ΜΑΡΚ p38.

Συμμετοχή της ΑΜΡΚ στην ενεργοποίηση της p38 ΜΑΡΚ από 8-Cl-cAMP

Μια πρόσφατη μελέτη [25] ανέφερε ότι οι αντιπολλαπλασιαστικές επιδράσεις της 8-Cl-cAMP θα μπορούσαν να μεσολαβεί ένας ενεργοποίηση της AMP-ενεργοποιημένη πρωτεϊνική κινάση (ΑΜΡΚ) μετά μεταβολισμού της σε 8-Cl-αδενοσίνης. Για να επαληθευτεί αυτή η υπόθεση αξιολογήσαμε τα αποτελέσματα και των δύο ενός ενεργοποιητή, AICAR, και ενός αναστολέα, Ενωση C, του ΑΜΡΚ. Η θεραπεία με AICAR μιμήθηκε τις επιδράσεις της 8-Cl-cAMP επί της φωσφορυλίωσης ρ38 ΜΑΡΚ και επί της δραστικότητας κασπάσης 3/7. Επιπλέον, η Ένωση C ήταν σε θέση να εμποδίσει σε μεγάλο βαθμό τόσο τη φωσφορυλίωση της ρ38 ΜΑΡΚ και την ενεργοποίηση της απόπτωσης που επάγεται από 8-Cl-cAMP (Σχήμα 8).

ARO, ΝΡΑ και WRO κύτταρα διεγέρθηκαν με 8- Cl-cAMP (100 μΜ) ή ένας ενεργοποιητής ΑΜΡΚ (AICAR, 1 mM) για 72 ώρες είτε με την παρουσία ή απουσία προ-θεραπεία με έναν αναστολέα ΑΜΡΚ (Ενωση C, 2,5 μΜ). Α: τα επίπεδα φωσφορυλιωμένης και ολικής p38 ΜΑΡΚ μετρήθηκαν με ανάλυση αποτύπωσης Western. Δεικνύονται τα αποτελέσματα των αντιπροσωπευτικών πειραμάτων Western Blot καθώς και η πυκνομετρική ανάλυση των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Τα δεδομένα είναι κανονικοποιημένα να ελέγξουν τα επίπεδα. Β: κασπάσης 3/7 δραστικότητα προσδιορίστηκε με μία δοκιμασία φωταύγειας. Δεικνύονται τα αποτελέσματα από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Τα δεδομένα κανονικοποιούνται για τον έλεγχο της κυτταρικής καλλιέργειας. Υπόμνημα: Α: έλεγχος, Β: 8-Cl-cAMP, C: AICAR, D: Ένωση C, E: 8-Cl-cAMP + Ενωση C, F: AICAR + Ενωση C. * Ρ & lt? 0,05, ** Ρ & lt? 0,01, *** P & lt? 0,001 έναντι του ελέγχου. # P & lt? 0,05, ## Ρ & lt? 0,01, ### Ρ & lt? 0.001 έναντι 8-Cl-cAMP. § P & lt? 0,05, §§ P & lt? 0,01, §§§ P & lt?. 0.001 έναντι AICAR

Η

Συζήτηση

αναλόγων cAMP αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό πολλών καρκινικών κυττάρων. Το καλύτερα μελετημένο από αυτά ένωση είναι 8-Cl-cAMP, η οποία έχει αποδειχθεί αντιπολλαπλασιαστική επίδραση τόσο

in vitro

και

in vivo

και έχει αξιολογηθεί σε Ι /ΙΙ κλινικών δοκιμών φάσης [11 ], [12], [13]. Σε μια πρόσφατη μελέτη, έχουμε περιγράψει την αντιπολλαπλασιαστική επίδραση ενός ζεύγους cAMP αναλόγων επιλεκτικό για ΡΚΑ I, ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκινώματος [19]. Ο στόχος αυτής της εργασίας ήταν να συγκριθεί η επίδραση αυτών των αναλόγων cAMP με εκείνη του καλά μελετηθεί 8-Cl-cAMP και περαιτέρω διερεύνηση του μηχανισμού (ων) δράσης τους. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το 8-Cl-cAMP και το ρΚα I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP, αν και παρόμοια ισχύ, διαφέρουν σε τύπο κυττάρων και επιλεκτικότητα μηχανισμός (οί) δράσης. Οι ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP επάγει διακοπή αύξησης, αλλά όχι απόπτωση, και, όπως έχουμε δείξει προηγουμένως, τα αποτελέσματά τους φαίνεται να διαμεσολαβείται από ένα ΡΚΑ-εξαρτώμενη αναστολή της ενεργοποίησης ERK. Αντίθετα, τα αποτελέσματα 8-Cl-cAMP πιθανότατα ασκείται από μεταβολίτη της 8-Cl-αδενοσίνη, είναι ανεξάρτητες από την ενεργοποίηση ΡΚΑ, και προφανώς προκαλείται από την ενεργοποίηση και την επακόλουθη ΑΜΡΚ p38 ΜΑΡΚ-εξαρτώμενη επαγωγή της απόπτωσης.

τα δεδομένα μας δείχνουν ότι το 8-Cl-cAMP και οι ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP έχουν μια παρόμοια ισχυρή αντιπολλαπλασιαστική επίδραση, υποδηλώνοντας ότι και τα δύο μπορούν να διατηρήσουν ένα δυναμικό για τη θεραπεία του καρκίνου. Οι PKA I-επιλεκτική αναλόγων cAMP φαίνεται να απαιτεί την παρουσία συστατική ενεργοποίηση ERK, όπως προτείνεται με το να είναι ιδιαίτερα ενεργό μόνο στις BRAF

ARO και NPA κύτταρα V600E-μεταλλαγμένα, όπου αναστέλλει τη φωσφορυλίωση της ERK τους. Αντιθέτως, 8-Cl-cAMP αναστέλλει ισχυρώς την ανάπτυξη των κυττάρων και στις BRAF-αρνητικά κύτταρα WRO, υποδηλώνοντας ότι μπορεί να είναι αποτελεσματικό σε ένα ευρύτερο φάσμα των καρκινικών κυττάρων.

Αρκετά ευρήματα δείχνουν ότι το 8-Cl-cAMP και οι ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP δρουν μέσω διαφορετικών μηχανισμών. Πρώτον, η επίδραση του 8-Cl-cAMP φαίνεται να διαμεσολαβείται κυρίως, σε συμφωνία με προηγούμενες παρατηρήσεις [15], [16], [17], [18], με μεταβολίτη 8-Cl-αδενοσίνης του, ενεργώντας μέσω ΑΜΡΚ, και όχι από τη διέγερση του ΡΚΑ, όπως προτείνεται από την επίδραση της ΙΒΜΧ και επιλεκτική ενεργοποίηση ΑΜΡΚ /αναστολή? αντιθέτως, ΙΒΜΧ δεν τροποποιεί την αντιπολλαπλασιαστική απόκριση στις ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP. Δεύτερον, 8-Cl-cAMP και οι ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP παράγουν ανόμοιες τροποποιήσεις κυτταρικού κύκλου. Συγκεκριμένα, 8-Cl-cAMP, αλλά όχι τις ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP, επάγουν απόπτωση. Τρίτον, οι ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP αλλά όχι 8-Cl-cAMP, να μειώσει φωσφορυλίωση ERK σε κύτταρα ARO και ΝΡΑ. Τέταρτον, 8Cl-cAMP, αλλά όχι τα ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP, να αυξήσει την φωσφορυλίωση ρ38 ΜΑΡΚ.

Ο μηχανισμός δράσης του 8-Cl-cAMP είναι εξαιρετικά συζητηθεί. Cho-Chung και οι συνεργάτες του έχουν κάνει ένα σημαντικό ποσό των εργασιών για το θέμα αυτό, τα αποτελέσματα της οποίας δείχνουν ότι το 8-Cl-cAMP προκαλεί αναστολή της ανάπτυξης με την αύξηση του RI στον RII αναλογία [14], [21]. Από την άλλη πλευρά, πιο πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι αυτή η ρύθμιση δεν είναι η κύρια αιτία της παρατηρούμενης αναστολής της ανάπτυξης [17]. Στην έκθεση αυτή, διαπιστώνουμε ότι 8-Cl-cAMP μειώνει την έκφραση του Rla εις κύτταρα ARO, NPA και WRO. Ωστόσο, θεωρούμε ότι ΙΒΜΧ, η οποία αναστέλλει τη μετατροπή της 8-Cl-cAMP και 8-Cl-αδενοσίνης, ενός μεταβολίτη αδυνατεί να ενεργοποιήσει ΡΚΑ, μειώνει σημαντικά την αντιπολλαπλασιαστική επίδραση της 8-Cl-cAMP.

Α πρόσφατη μελέτη [25] έδειξε ότι 8-Cl-αδενοσίνης είναι ικανή να διεγείρει ΑΜΡΚ, οπότε διερευνήθηκε η εμπλοκή αυτής της οδού σε 8-Cl-cAMP-προκαλούμενη απόπτωση. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η επαγωγή της απόπτωσης από 8-Cl-cAMP συνοδεύεται από την ενεργοποίηση της κασπάσης 3/7, και παρόμοια αποτελέσματα λήφθηκαν με AICAR, έναν ενεργοποιητή της ΑΜΡΚ. Περαιτέρω, η ένωση C, ένας αναστολέας ΑΜΡΚ, εμποδίζει την επαγωγή των δύο AICAR και 8-Cl-cAMP κασπάσης 3/7 αντίστοιχα. Στο τέλος, προτείνουμε ότι η προ-αποπτωτική επίδραση του 8-Cl-cAMP διαμεσολαβείται από ΑΜΡΚ.

Επιπλέον, δείχνουμε ότι η προ-αποπτωτική επίδραση του 8-Cl-cAMP συνοδεύεται από ένα σταδιακή αύξηση της φωσφορυλίωσης της p38 ΜΑΡΚ. Η ΜΑΡΚ p38 είναι ένας βασικός ρυθμιστής της κυτταρικής επιβίωσης [26], [27], και έχει ενοχοποιηθεί για την προ-αποπτωτική επίδραση του 8-Cl-cAMP σε HL60 κύτταρα HeLa και [24], [25]. Για να διερευνηθεί εάν η ενεργοποίηση της p38 ΜΑΡΚ εξαρτάται από AMPK χρησιμοποιήσαμε μια στρατηγική ενεργοποίησης /αναστολής παρόμοια με αυτή που υιοθετήθηκε για κασπάσης 3/7. Από αποκλεισμός ΑΜΡΚ εμποδίζεται σε μεγάλο βαθμό και η ενεργοποίηση ΑΜΡΚ μιμήθηκε τις επιδράσεις της 8-Cl-cAMP στο ΜΑΡΚ p38, τα δεδομένα μας υποδηλώνουν έντονα ότι το 8-Cl-cAMP μετά τη μετατροπή σε μεταβολίτης του 8-Cl-αδενοσίνη ενεργοποιεί την ΜΑΡΚ p38 μέσω της διέγερσης του ΑΜΡΚ.

σε μια προσπάθεια να αποσαφηνιστεί το μονοπάτι που οδηγεί σε κασπάσης 3/7 ενεργοποίησης, μετρήσαμε τη δράση των ανάντη κασπασών 8 και 9, τα οποία εμπλέκονται στην εξωγενείς και ενδογενείς αποπτωτικών οδών, αντίστοιχα. Ενώ δεν παρατηρήθηκε ενεργοποίηση της κασπάσης 9, ανιχνεύθηκε ένα πρώιμο και μόνο παροδικές (5 min-1 h) ενεργοποίηση της κασπάσης 8. Αυτά τα δεδομένα μπορεί να υποδεικνύουν μία εμπλοκή της εξωγενούς οδού στην προ-αποπτωτικά αποτελέσματα του 8-Cl-cAMP. Ωστόσο, δεδομένης της παρατηρείται μεγάλη καθυστέρηση μεταξύ της ενεργοποίησης της κασπάσης 8 και 3/7, και την παροδική φύση της κασπάσης 8 ενεργοποίησης, είναι πιθανό ότι άλλοι μηχανισμοί, πιθανόν ανεξάρτητο του ανάντη κασπασών, μπορεί να εμπλέκεται στην ενεργοποίηση της κασπάσης 3 /7. Είναι ενδιαφέρον ότι, αν και οι μηχανισμοί με τους οποίους ο ΜΑΡΚ p38 μπορεί να ενεργοποιήσει κασπάσες δεν είναι πλήρως διευκρινιστεί, μια πιθανή άμεση ενεργοποίηση της κασπάσης 3 από την ΜΑΡΚ ρ38 έχει επίσης αναφερθεί [28].

Συμπερασματικά, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι τόσο 8-Cl-cAMP και οι ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP έχουν μια παρόμοια ισχυρή αντιπολλαπλασιαστική επίδραση επί καρκινικών κυτταρικών γραμμών διαφορετικής προέλευσης. Έτσι, και οι δύο διατηρούν δυναμικό ως αντικαρκινικά φάρμακα. 8-Cl-cAMP φαίνεται να είναι αποτελεσματική σε ένα ευρύτερο φάσμα κυτταρικών τύπων και επάγει την απόπτωση. Από την άλλη πλευρά, ο μηχανισμός (οι) δράσης του 8-Cl-cAMP και οι ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP είναι διαφορετικές, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να έχουν ανόμοια φαρμακολογικές και τοξικολογικές προφίλ, καθώς και το μοναδικό αντί-όγκου ιδιότητες. Μελλοντικές

in vivo πειράματα

θα υποχρεούνται να συγκρίνουν την αποτελεσματικότητα και την ανοχή τους σε προκλινικά μοντέλα καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά

αντιδραστήρια καλλιέργειας κυττάρων ήταν αγοράστηκε από την Invitrogen (San Giuliano Milanese, Ιταλία). 8-χλωροαδενοσίνη-3 ‘, 5′-κυκλικής μονοφωσφορικής (8-Cl-cAMP), 8-piperidinoadenosine-3′, 5’-κυκλικής μονοφωσφορικής (8-ΡΙΡ-cAMP) και 8-hexylaminoadenosine-3 ‘, 5’cyclic μονοφωσφορική (8-HA-cAMP) αγοράστηκαν από την BIOLOG Life Science Institute (Βρέμη, Γερμανία). Το κιτ και μεμβράνες νιτροκυτταρίνης BCA αγοράσθηκαν από την Pierce Biotechnology (Rockford, IL). PKARIα, PKARIIα, PKARIIβ και β-ακτίνης αντισώματα αγοράστηκαν από ΒΟ Biosciences Pharmingen (Μιλάνο, Ιταλία). Φωσφο-ΕΚΚ, φωσφο-Akt, φωσφο-ρ38 ΜΑΡΚ, ERK, Akt και ρ38 ΜΑΡΚ αντισώματα αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ). δευτερογενή αντισώματα συζευγμένο με HRP ποντικού και κουνελιού αγοράστηκαν από την Chemicon International (Temecula, CA). Το κιτ ECL-plus αγοράστηκε από την Amersham Biosciences Europe (Freiburg, Γερμανία). Η κυτταρικού θανάτου Ανίχνευση ELISA Plus kit αγοράστηκε από την Roche Applied Science (Mannheim, Γερμανία). Η βιωσιμότητα των κυττάρων CellTiter-Μπλε και κασπάσης-Glo 3/7, 8 ή 9 δοκιμασίες αγοράστηκαν από την Promega Corporation (Madison, WI, USA). 4- (4-φθοροφαινυλο) -2- (4-μεθυλσουλφινυλ-φαινυλ) -5- (4-πυριδυλ) 1 Η-ιμιδαζόλιο (SB203580) αγοράστηκε από την Biosource (Nivelles, Βέλγιο). 3-ισοβουτυλ-1-μεθυλξανθίνη (ΙΒΜΧ), 4- (4-φθοροφαινυλο) -2- (4-υδροξυφαινυλ) -5- (4-πυριδυλο) -1Η-ιμιδαζόλη (SB202190), bisindolyl-μαλεϊμίδιο Ι (GF109203X), AICAR, 6- [4- (2-πιπεριδιν-1-υλαιθοξυ) φαινυλ] -3-πυριδιν-4-ylpyrazolo [1,5-a] pyriimdine (Ενωση C) και όλα τα άλλα αντιδραστήρια αγοράστηκαν από τη Sigma-Aldrich (Μιλάνο , Ιταλία).

καλλιέργειας κυττάρων

ARO, NPA και WRO κύτταρα ευγενώς από τον Ι Bongarzone (Μιλάνο, Ιταλία). Μια πρόσφατη ανάλυση προφίλ DNA αποκάλυψε ότι τα κύτταρα ARO ταιριάζουν με την κυτταρική σειρά καρκίνου του παχέος εντέρου ΗΤ-29 και τα κύτταρα ΝΡΑ ταιριάζει με την κυτταρική σειρά μελανώματος Μ14 /MDA-MB-435S [29]. κύτταρα WRO προέρχονται από ένα θυλακιώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς [30]. Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FCS, 1% πενικιλλίνη και 1% στρεπτομυκίνη σε 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO

2.

επιλεκτική ενεργοποίηση του ΡΚΑ I

Για να ενεργοποιήσετε επιλεκτικά ΡΚΑ I, χρησιμοποιήσαμε την κοινώς χρησιμοποιούμενη στρατηγική του ταυτόχρονα χρησιμοποιώντας δύο διακριτές αναλόγων cAMP, δηλαδή 8-piperidinoadenosine-3 ‘, 5’-κυκλικής μονοφωσφορικής (8-ΡΙΡ-cAMP) και 8-hexylaminoadenosine-3 ‘, 5’cyclic μονοφωσφορική (8-ΗΑ-cAMP), το καθένα με υψηλή επιλεκτικότητα ως προς τη δέσμευση είτε θέση Α (8-ΡΙΡ-cAMP) ή Β (8-ΗΑ-cAMP) του τύπου Ι ΡΚΑ υπομονάδες R [19].

δοκιμασία πολλαπλασιασμού

ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας την δοκιμασία 3- (4,5-dimetylthiazole-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19 ]. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων, και 24 ώρες μετά την επίστρωση υποβλήθηκαν σε αγωγή με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις 8-Cl-cAMP ή τις ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP (8-PIP-cAMP + 8-ΗΑ-cAMP). Για την αναστολή της PKC, τα κύτταρα επωάστηκαν για 30 λεπτά με GF109203x πριν από την προσθήκη 8-Cl-cAMP ή τις ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP. ΜΤΤ (0,5 mg /mL) προστέθηκε σε κύτταρα τρεις ώρες πριν τη μέτρηση, και κρύσταλλοι φορμαζάνης, που σχηματίζεται με μιτοχονδριακή αναγωγή του ΜΤΤ, διαλυτοποιήθηκαν σε DMSO /αιθανόλης 1:01. Η σχετική ανάπτυξη υπολογίστηκε από την απορρόφηση στα 550 nm χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση: Σχετική αύξηση (%) = (OD

550 nm των φρεατίων αγωγή /OD

550 nm των φρεατίων ελέγχου) χ 100

Detection. αποπτωτικών κατακερματισμού του DNA

DNA κατακερματισμό αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το κινητό Θάνατος Ανίχνευση ELISA Plus σετ. Αυτή η δοκιμασία παρέχει έναν ποσοτικό προσδιορισμό θραυσμάτων ιστόνης που σχετίζονται με DNA (μονο- και ολιγο-νουκλεοσώματα) στην κυτταροπλασματική κλάσμα των προϊόντων λύσης κυττάρου. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και 24 ώρες αργότερα σε επεξεργασία με 8-Cl-cAMP ή τις ΡΚΑ I-εκλεκτικά ανάλογα cAMP για 48 ώρες. Τα δείγματα στη συνέχεια υποβάλλονται σε επεξεργασία και αναλύθηκαν εις τριπλούν, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Προσδιορισμός δραστηριοτήτων κασπάσης

δραστικότητα Caspase μετρήθηκε χρησιμοποιώντας την φωτοβόλο κασπάση-Glo 3/7, 8 ή 9 δοκιμασίες , ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Caspase 3/7 δραστικότητα κανονικοποιήθηκε για τον αριθμό των κυττάρων που περιέχονται σε κάθε φρεάτιο, προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας φθορομετρική CellTiter-Blue. Τα επίπεδα ενεργοποίηση κασπασών 8 και 9 εκφράζεται σε σχέση με μη επεξεργασμένα δείγματα. Φθορισμού και φθορίζοντα μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τον αναγνώστη Fluoroskan Ascent FL πολύδισκος (Thermo Labsystems, Helsinki, Finland).

Ανάλυση του κυτταρικού κύκλου με κυτταρομετρία ροής

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, πλύθηκαν σε PBS και στη συνέχεια μονιμοποιήθηκαν με παγωμένο 70% αιθανόλη. Σταθερή κύτταρα πλύθηκαν με PBS και βάφτηκαν με PBS που περιείχε ιωδιούχο προπίδιο 40 μg /ml και 100 μg /ml RNAse Α στους 37 ° C για 30 λεπτά. Τα δείγματα αναλύθηκαν με το κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur (Becton Dickinson, Buccinasco, Ιταλία).

Western ανάλυση κηλίδος

Για την ανίχνευση του ΡΚΑ ρυθμιστικών υπομονάδων, τα κύτταρα λύθηκαν σε τροποποιημένο ρυθμιστικό διάλυμα RIPA που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης ( 10 mM Tris-HCl ρΗ 7.5, 500 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% ΝΡ40, 1% δεοξυχολικό Να, 2 mM EDTA, 2 mM Na

2VO

4, 2 mM Na

4P

2O

7, 2 mM NaF). Για την ανίχνευση του ΕΚΚ, Akt, και ΜΑΡΚ φωσφορυλίωση ρ38, τα κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα SDS δείγματος (62,5 mM Tris-HCl ρΗ 6,8, 2% SDS, 10% γλυκερόλη, 50 mM DTT, 0,01% βρωμοφαινόλη μπλε), αμέσως θερμάνθηκαν για 5 min στους 95 ° C και κατεργασία με υπερήχους.