Abstract

Η μακρά μη-κωδικοποίησης ΚΝΑ Hotair έχει αναφερθεί ότι είναι ένας φτωχός προγνωστικός βιοδείκτη σε μία ποικιλία κακοηθών όγκων. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για τη σύνδεση των Hotair με καρκίνο του στομάχου. Εξετάσαμε την έκφραση του θερμού αέρα σε 68 γαστρικό δείγματα καρκίνου χρησιμοποιώντας ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR και αναλύθηκαν συσχέτιση με τις κλινικές παραμέτρους. Ο λειτουργικός ρόλος του Hotair εξετάστηκε με παραγωγή ανθρώπινου γαστρικού καρκινικές κυτταρικές γραμμές με αυξημένη ή καταστέλλεται έκφραση Hotair. Η αγκύρωση ανεξάρτητη από ανάπτυξη εκτιμήθηκε με δοκιμασία μαλακού άγαρ. Η αυξημένη ή καταστέλλεται Hotair εκφράζουν γαστρικά καρκινικά κύτταρα εγχύθηκαν εντός της φλέβας της ουράς ή περιτοναϊκή κοιλότητα ποντικών με ανοσοανεπάρκεια να εξετάσει την επίδραση αυτού του μορίου σε μετάσταση και περιτοναϊκή διάχυση. Η έκφραση του θερμού αέρα ήταν σημαντικά υψηλότερη σε αλλοιώσεις του καρκίνου από ότι σε γειτονικό μη καρκινικούς ιστούς σε ανθρώπινο γαστρικό καρκίνους. Στο διάχυτο τύπο του καρκίνου του στομάχου, η ομάδα υψηλού θερμού αέρα (θερμού αέρα /GAPDH & gt? 1) έδειξε σημαντικά περισσότερο φλεβική εισβολή, συχνές μεταστάσεις στους λεμφαδένες και ένα χαμηλότερο συνολικό ποσοστό επιβίωσης σε σύγκριση με την Low-Hotair ομάδα (Hotair /GAPDH & lt? 1). σχηματισμός αποικιών στο μαλακό άγαρ ενισχύθηκε σε Hotair-εξαρτώμενο τρόπο. Hotair εκφράζουν ΜΚΝ74 σχηματίζεται περισσότερο μετάσταση στο ήπαρ σε σύγκριση με τον έλεγχο, όταν εγχύθηκαν στην ουραία φλέβα των ποντικών. Επιπλέον, η μειωμένη έκφραση του θερμού αέρα στο ΚΑΤΩ III καταστέλλεται περιτοναϊκή διάχυση. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι Hotair διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου

Παράθεση:. Endo Η, Shiroki Τ, Nakagawa Τ, Yokoyama Μ, Tamai Κ, Yamanami H, et al. (2013) Ενισχυμένη Έκφραση του Long μη-κωδικοποίησης RNA Hotair συνδέεται με την ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου. PLoS ONE 8 (10): e77070. doi: 10.1371 /journal.pone.0077070

Επιμέλεια: Dajun Deng, το Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Αντικαρκινικό Νοσοκομείο και το Ινστιτούτο, η Κίνα

Ελήφθη: 10 Ιούνη του 2013? Αποδεκτές: 5 Σεπτεμβρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 10 Οκτωβρίου 2013

Copyright: © 2013 Endo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από JSPs KAKENHI numbers24791480 επιχορήγησης και 24591022 (https://www.jsps.go.jp/j-grantsinaid/index.html), και επιχορήγηση-in-βοήθειας από Hiromi Ίδρυμα Ιατρικής Έρευνας (http: //www.smtb .jp /προσωπικά /ανάθεση /διαχείριση /δημόσια /παράδειγμα /pdf /φυσική-06a.pdf) και Daiwa Ίδρυμα Υγείας Securities (https://www.daiwa-grp.jp/dsh/grant/outline.html). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η επίπτωση και η θνησιμότητα του καρκίνου του στομάχου έχουν μειωθεί δραματικά τα τελευταία 50 χρόνια στις περισσότερες περιοχές του κόσμου, αλλά εξακολουθεί να παραμένει η δεύτερη κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με όλο τον κόσμο [1]. Παρά τις πρόσφατες προόδους στις διαγνωστικές τεχνικές, όπως μεγεθυντικό ενδοσκόπηση με τα στενά απεικόνισης μπάντα (ΝΒ) [2], και στη θεραπεία, συμπεριλαμβανομένης της θεραπείας με στόχο [3,4], εξακολουθούν να υπάρχουν μεγάλοι αριθμοί των ασθενών με γαστρικό καρκίνο με κακή πρόγνωση. Ο παθογόνος μηχανισμός που συμβάλλει στην επιθετική βιολογική χαρακτηριστικό αυτού του καρκίνου παραμένει να διευκρινιστεί.

Τα σχέδια γονιδιώματος απεκάλυψε ότι το ανθρώπινο γονιδίωμα αποτελείται από κωδικοποίησης γονιδίων λιγότερο από 2% πρωτεΐνη, και περισσότερο από το 90% του γονιδιώματος μεταγράφεται ως μη-κωδικοποίησης RNAs (ncRNA) [5-7]. Αυτά ncRNAs κατατάσσονται σε δύο ομάδες ανάλογα με το μέγεθος νουκλεοτιδίων. Micro RNAs είναι περίπου 18-25 νουκλεοτίδια σε μήκος, ενώ μεγάλες μη-κωδικοποίησης RNA αποτελείται από περισσότερα από 200 νουκλεοτίδια. Hotair είναι μια μακρά μη κωδικοποιητικό RNA που ταυτοποιήθηκε από μια συστοιχία έθιμο όργωμα της θέσεως HOXC. Hotair δείχθηκε να trimethylate Histon H3 λυσίνη-27 του HOXD τόπου με την Polycomb κατασταλτική συγκρότημα 2 (PRC2) και αναστέλλουν την έκφραση του γονιδίου HOXD, που βρίσκεται σε ένα διαφορετικό χρωμόσωμα [8]. Hotair προωθεί μετάσταση μέσω αλληλεπίδρασης με PRC2 να καταστείλει τη μεταγραφή πολλαπλών γονιδίων μετάστασης καταστολέα στον καρκίνο του μαστού [9]. Η ενισχυμένη έκφραση του θερμού αέρα συνδέεται με διεισδυτικότητα, μετάσταση και φτωχή πρόγνωση σε ποικιλία καρκίνων όπως του μαστού, του παχέος εντέρου, του παγκρέατος και καρκίνο του πνεύμονα [9-12]. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για την έκφραση ή /και τη λειτουργία του θερμού αέρα σε ανάπτυξη γαστρικού καρκινώματος. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε η συμμετοχή των Hotair στην ανάπτυξη του ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου και εξέτασε κατά πόσον η έκφραση της θα συσχετίζονται με την επιθετική συμπεριφορά του γαστρικού καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

ιστοί

68 γαστρικό καρκινικούς ιστούς ελήφθησαν από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση στο Miyagi Cancer Center (Natori, Ιαπωνία), μεταξύ των ετών 2007 και 2011. Όλα τα δείγματα καταψύχθηκαν αμέσως αμέσως μετά την εκτομή σε υγρό άζωτο και αποθηκεύονται στους -80 ° C ή που καθορίζεται στο 10% ρυθμισμένη φορμαλίνη και εγκλείστηκαν σε παραφίνη κερί. Οι γαστρικών καρκίνων ήταν ιστοπαθολογικά χαρακτηριστεί ως το εντερικό τύπο (n = 36), διάχυτη τύπου (n = 32) σύμφωνα με την ταξινόμηση του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας και προηγούμενες εκθέσεις [13]. Δεν ασθενείς έλαβαν χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία πριν από την επέμβαση. Για τη στατιστική ανάλυση, η συνολική επιβίωση ορίστηκε από το θάνατο από οποιαδήποτε αιτία, και χρησιμοποιήθηκαν καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier.

Οι κυτταρικές σειρές

Η κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου ΜΚΝ74 (εντερικού τύπου) [14] και ΚΑΤΩ III (διάχυτη τύπου) [15] ελήφθησαν από RIKEN Bioresource Κέντρο (Tsukuba, Ιαπωνία). Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 (Gibco /τεχνολογίες Ζωής Co., CA) που περιείχε 10% απενεργοποιημένο FBS (EuroClone, Μιλάνο, Ιταλία) με 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη (Gibco /τεχνολογίες Ζωής Co. , CA) και καλλιεργήθηκαν σε υγροποιημένη 5% CO

2 επωαστήρα στους 37 ° C.

παρασκευή RNA, αντίστροφη μεταγραφή, και ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

Ολικό RNA από κατεψυγμένα δείγματα και κυτταρικές σειρές εκχυλίζεται με ISOGENE (NIPPON GENE, Tokyo, Japan) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. cDNAs από όλα τα δείγματα συντέθηκαν από 1.0 μg ολικού RNA με PrimeScript® 1ο κλώνου cDNA Synthesis Kit (Takara Bio, Siga, Japan) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η έκφραση του Hotair ποσοτικοποιήθηκε με LightCycler Λαμπρό SYBR Green qRT-PCR κιτ (Roche Applied Science, ΙΝ) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή με τις συγκεκριμένες ομάδες εκκινητών σύμφωνα με την προηγούμενη μελέτη [9]. Το επίπεδο έκφρασης Hotair σε κάθε δείγμα κανονικοποιήθηκε προς το αντίστοιχο επίπεδο έκφρασης GAPDH. Η ιδιαιτερότητα του κάθε αντίδραση PCR επιβεβαιώθηκε από την τήξη αναλύσεις καμπύλης.

έκφραση Hotair ρετροϊού

Hotair cDNA του Ανθρώπου (addgene, Cambridge, ΜΑ) ενισχύθηκε με PCR και εισήχθη στο Puro pBabe φορέας (pBabe -HOTAIR). Ανασυνδυασμένο ρετροϊό παρήχθη με Platinum-Α (Plat-Α, που παρέχονται από τον καθηγητή Kitamura) συσκευασίας κυτταρικές σειρές όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. Εν συντομία, τα κύτταρα Plat-Α επιμολύνονται με pBabe -HOTAIR ή pBabe-puro Vector (EV). Fugene-6 (Roche Applied Science) και Opti-ΜΕΜ Ι (Gibco τεχνολογίες /Ζωής Co.) προστέθηκαν ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, το υπερκείμενο ρετροϊός που περιέχει συλλέχθηκε και διαβιβάστηκε μέσω φίλτρου 0,45 μm. κύτταρα ΜΚΝ74 μολύνθηκαν με τους ανασυνδυασμένους ρετροϊούς και στη συνέχεια επιλέγονται με πουρομυκίνη.

RNA παρεμβολής

Για να νοκ ντάουν Hotair ΚΑΤΩ III, χρησιμοποιήσαμε Knockout RNAi Systems ™ (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, σχεδιάσαμε τέσσερις αλληλουχία shRNA στοχευμένη Hotair όπως φαίνεται στον Πίνακα 1. Μετά την ανόπτηση των συμπληρωματικών ολιγονουκλεοτιδίων shRNA, εμείς προσδέθηκε τα ανοπτημένα ολιγονουκλεοτίδια σε φορέα pSIREN (shHOTAIR). Στη συνέχεια, τα επιμολυσμένα κύτταρα Plat-A με shHOTAIR ή pSIREN Vector (EV), και μολύνθηκαν ΚΑΤΟ III με τους ανασυνδυασμένους ρετροϊούς και επιλέχθηκαν με πουρομυκίνη. Τα κύτταρα που μετατρέπονται με το SH-HOTAIR2 και -3 διάνυσμα επιλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτη. Κάθε

στο vitrto

πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν, επαναλαμβάνεται τρεις φορές και αντιπροσωπευτικά δεδομένα φαίνονται.

shRNA

Ακολουθία

shHOTAIR-1sensegatccgaacgggagtacagagagattttcaagagaaatctctctgtactcccgttcttttttganti-senseaattcaaaaaagaacgggagtacagagagatttctcttgaaaatctctctgtactcccgttcgshHOTAIR-2 sensegatccgccacatgaacgcccagagattttcaagagaaatctctgggcgttcatgtggttttttg αντι-senseaattcaaaaaaccacatgaacgcccagagatttctcttgaaaatctctgggcgttcatgtggcgshHOTAIR-3 sensegatccgtaacaagaccagagagctgttttcaagagaaacagctctctggtcttgttattttttganti-senseaattcaaaaaataacaagaccagagagctgtttctcttgaaaacagctctctggtcttgttacgshHOTAIR-4sensegatccaattcttaaattgggctggttcaagagaccagcccaatttaagaattttttttganti-senseaattcaaaaaaaattcttaaattgggctggtctcttgaaccagcccaatttaagaattgTable 1. Ακολουθίες shRNA ένθετα για την έκφραση φορέα shHOTAIR.

CSV Λήψη CSV

Η ανάπτυξη των κυττάρων δοκιμασία

1 Χ 10

4 κύτταρα σπάρθηκαν ανά φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων σε φυσιολογική ανάπτυξη των κυττάρων μεσα ΜΑΖΙΚΗΣ ενημέρωσης. Η δοκιμασία 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου, κίτρινο τετραζόλιο (ΜΤΤ) πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα πολλαπλασιασμός των κυττάρων Kit Ι (GE Healthcare Life Sciences, NJ) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Μετρήσεις της απορρόφησης στα 570 nm με VersaMax (Molecular Devices, CA) έγιναν για να εκτιμηθεί ΜΤΤ-φορμαζάνης παραγωγή μετά από 24, 48 και 72 ώρες επώασης. Ο δείκτης αξιολογήθηκε στις 48 και 72 ώρες κανονικοποιηθεί προς εκείνη σε 24 ώρες.

μαλακό άγαρ σχηματισμού αποικίας δοκιμασία

Soft δοκιμασίες άγαρ δομήθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων. Το στρώμα βάσης του κάθε φρεάτιο αποτελείτο από 1 ml με τελικές συγκεντρώσεις 1 χ μέσο (RPMI-1640 συν 10% απενεργοποιημένο FBS) και 0.6% χαμηλού σημείου τήξης αγαρόζη. Οι πλάκες ψύχονται σε θερμοκρασία δωματίου έως ότου το στερεό, στο οποίο σημείο ένα στρώμα άγαρ ανάπτυξης του 1 ml χύθηκε, που αποτελείται από 1 χ 10

4 κύτταρα αιωρούνται σε 1 χ media και 0,3% αγαρόζη χαμηλού σημείου τήξης. Οι πλάκες και πάλι ψύχονται σε θερμοκρασία δωματίου μέχρι το στρώμα ανάπτυξη πήξει. Ένα επιπλέον 1 ml από 1 χ μέσο χωρίς αγαρόζης προστέθηκαν στην κορυφή του στρώματος ανάπτυξης κατά την ημέρα 0 και πάλι κατά την ημέρα 14 της ανάπτυξης. Τα κύτταρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν στους 37 ° C για 4 εβδομάδες και συνολική αποικίες μετρήθηκαν.

Ζώα

6-εβδομάδων θηλυκά NOD /Shi-SCID-IL2Rγ

null (NOG ) ποντίκια αγοράστηκαν από Κεντρικό Ινστιτούτο πειραματόζωα (CIEA, Kawasaki, Ιαπωνία) και χρησιμοποιήθηκαν σε αυτό το πείραμα. Τους επετράπη να εγκλιματιστούν για μια εβδομάδα πριν από τα πειράματα. Είχαν στεγάζεται σε ένα καθαρό δωμάτιο των εγκαταστάσεων φροντίδας των ζώων σε Miyagi Cancer Research Center και διατηρούνται υπό κανονικές συνθήκες θερμοκρασίας, υγρασίας και χρονικά συνθήκες φωτισμού και με την προϋπόθεση κατά βούληση τροφή /νερό ποντίκι.

δοκιμασία φλέβα της ουράς των καρκινικών κυττάρων της μετάστασης

Για να αξιολογηθεί η επίδραση της έκφρασης Hotair για μετάσταση μεταδίδονται με το αίμα, εμείς ένεση 1,0 x 10

5 κύτταρα HOTAIR- (n = 9) ή EV-εκφράζοντα (n = 9) ΜΚΝ74 με 0,2 ml PBS στην φλέβα ουράς ποντικών. Οι ποντικοί παρατηρήθηκαν γενικά για σημάδια ασθένειας εβδομάδα για την διάρκεια του πειράματος, και θυσιάστηκαν 8 εβδομάδες μετά την ένεση. Οι πνεύμονες, το συκώτι, τα νεφρά, τα επινεφρίδια, και οι σπλήνες των ποντικών αποκόπηκαν και διερευνήθηκαν μακροσκοπικά σχετικά με την παρουσία της μετάστασης.

περιτοναϊκή μετάσταση

1.0 χ 10

6 κύτταρα shHOTAIR- (n = 5) ή EV-εκφράζοντα (n = 5) ΚΑΤΟ III ενέθηκαν με 0.2 ml PBS μέσα στο περιτόναιο των ποντικών για να αξιολογηθεί η επίδραση της έκφρασης Hotair σε περιτοναϊκή μετάσταση. Οι ποντικοί παρατηρήθηκαν γενικά για σημάδια ασθένειας εβδομάδα για την διάρκεια του πειράματος, και θυσιάστηκαν 8 εβδομάδες μετά την ένεση. Η παρουσία των οζιδίων και ασκίτη στην περιτοναϊκή κοιλότητα ερευνήθηκε.

Ιστολογία και ανοσοϊστοχημεία

Τα εκτομή ιστοί σταθεροποιήθηκαν σε 10% ρυθμισμένη φορμαλίνη για 24 ώρες, στη συνέχεια κόβονται και εγκλείστηκαν σε παραφίνη για μικροσκοπική έρευνα. Τα δείγματα κόπηκαν σε 4-μm πάχους τομές και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε). Διερευνήθηκε η παρουσία μικρο-μετάσταση που δεν είχε αναγνωρισθεί μακροσκοπικά. Οι αναγνωρισμένες όγκοι ερευνήθηκαν περαιτέρω ανοσοϊστοχημικά χρησιμοποιώντας πρωτογενές αντίσωμα για την ανθρώπινη κυτοκερατίνη (Anti Cytokeratin Low, DC10 /5D3, Nichirei Co, Tokyo, Japan) για να βεβαιωθείτε ότι προήλθαν από ένεση ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου των κυττάρων. Μετά αποπαραφίνωση, οι τομές ιστών επωάστηκαν σε μεθανόλη με υπεροξείδιο του υδρογόνου 0,3% σε απεσταγμένο νερό για 20 λεπτά για να εμποδίσει την ενδογενή δραστηριότητα υπεροξειδάσης. Το αντιγόνο ανάκτηση πραγματοποιήθηκε με πίεση μαγείρεμα στους 95 ° C για 5 λεπτά σε 10 mM κιτρικό ρυθμιστικό, ρΗ 6,0, και στη συνέχεια αφήνεται να ψυχθεί σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Η ενδογενής βιοτίνης ή αβιδίνης θέσεις δέσμευσης φράχθηκαν με διαδοχική επώαση για 30 λεπτά. Οι τομές επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4 ° C με το πρωτογενές αντίσωμα που περιγράφεται παραπάνω και αντέδρασαν με δεύτερο αντίσωμα. Ένα σύμπλοκο υπεροξειδάσης αβιδίνης-βιοτίνης χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει το δεύτερο αντίσωμα. Η χρώση οπτικοποιήθηκε με διαμινοβενζιδίνη (DAB). Οι τομές βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη, πλύθηκαν και αφυδατώθηκε χρησιμοποιώντας μία διαβάθμιση αιθανόλης για να ξυλόλιο.

Στατιστική ανάλυση

Η συσχέτιση της έκφρασης Hotair με κλινικοπαθολογοανατομικές μεταβλητές του ασθενούς και ο ρυθμός της μετάστασης στο εγχυθεί ποντίκια αναλύθηκαν με το τεστ chi-square. Η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών μεταξύ των 2 ομάδων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας Wilcoxon τεστ και

P

αξίας (

& lt? 0,05) θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική. Στατιστική διαφορά μεταξύ των 3 ομάδων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία Χάλυβα Dwass ή ανάλυση Bonferroni και

P

αξίας (& lt? 0.017) θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική Συνολική πιθανότητα επιβίωσης αναλύθηκαν με τις μεθόδους Kaplan-Meier και αξιολογούνται από log-rank δοκιμής, και

P

αξίας (& lt? 0,05) θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση Ekuseru-Toukei 2012 (Κοινωνική Έρευνα Research Information Co., Ltd., Tokyo, Japan). Η

P

αξίας (& lt? 0,05) θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική

Ηθική

Το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review του Κέντρου Καρκίνου Μιγιάγκι (MCC) ενέκρινε το πρωτόκολλο της μελέτης,. και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε ασθενή (Αριθμός άδειας: MCC-22-30). Το πρωτόκολλο των πειραμάτων σε ζώα εγκρίθηκε από την επιτροπή MCC Animal Care and Use (Αριθμός Άδειας: MCC-AE-2011-12).

Αποτελέσματα

Η έκφραση Hotair του ανθρώπινου γαστρικού δείγματα καρκίνου

τα επίπεδα έκφρασης Hotair των καρκινικών και παρακείμενων noncancerous ιστούς από τους ασθενείς με γαστρικό καρκίνο εξετάστηκαν από qRT-PCR και κανονικοποιήθηκαν από το επίπεδο έκφρασης GAPDH. Το μέσο επίπεδο έκφρασης Hotair ήταν 4,952 ± 6,462 και 3,804 ± 6,721 (Hotair /GAPDH ± τυπική απόκλιση) σε καρκίνωμα και μη-καρκινικές βλάβες, αντίστοιχα. Τα επίπεδα έκφρασης του θερμού αέρα ήταν σημαντικά υψηλότερα σε βλάβες καρκίνωμα σε σύγκριση με εκείνες των μη-καρκινικές αλλοιώσεις (

P

= 0,019, Σχήμα 1Α).

Α, τα επίπεδα έκφρασης Hotair των καρκινικών και παρακείμενων noncancerous ιστοί από τους ασθενείς με γαστρικό καρκίνο εξετάσθηκαν από qRT-PCR και κανονικοποιήθηκαν από το επίπεδο έκφρασης GAPDH. Τα επίπεδα έκφρασης του θερμού αέρα ήταν σημαντικά υψηλότερη σε βλάβες καρκίνωμα σε σύγκριση με εκείνες των μη-καρκινικές βλάβες (

P

= 0,019). Β και Γ, το ανθρώπινο γαστρικό καρκινικούς ιστούς περαιτέρω κατατάσσονται ανάλογα με το επίπεδο έκφρασης θερμού αέρα σε ένα υψηλής Hotair ομάδα (Hotair /GAPDH & gt? 1,0) και η ομάδα χαμηλής θερμού αέρα (θερμού αέρα /GAPDH & lt? 1,0) στον εντερικό (Β ) και διάχυτη τύπου (C) του γαστρικού καρκίνου, αντίστοιχα.

η

σύνδεσης μεταξύ της έκφρασης του θερμού αέρα και τα κλινικοπαθολογοανατομικές παραγόντων στην ανθρώπινη γαστρικών καρκίνων

το ανθρώπινο γαστρικό καρκινικούς ιστούς ήταν ιστοπαθολογικά ταξινομηθεί σε εντερικό (n = 36) και διάχυτη τύπων (n = 32). Το ανθρώπινο γαστρικό καρκινικούς ιστούς περαιτέρω κατατάσσονται ανάλογα με το επίπεδο έκφρασης θερμού αέρα στην ομάδα υψηλού θερμού αέρα (θερμού αέρα /GAPDH & gt? 1,0) και Low-Hotair ομάδα (Hotair /GAPDH & lt? 1,0) (Εικόνες 1Β και Γ). Η συσχέτιση της έκφρασης Hotair με τα χαρακτηριστικά κλινικοπαθολογικά στην εντερική και διάχυτη τύπου του καρκίνου του στομάχου συνοψίζεται στους Πίνακες 2 και 3, αντίστοιχα. Στην εντερική τύπο του καρκίνου του στομάχου, καμία σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης Hotair και των κλινικοπαθολογικών ευρήματα (Πίνακας 2). Επιπλέον, δεν υπάρχει σημαντική σχέση παρατηρήθηκε μεταξύ της έκφρασης θερμού αέρα και τη συνολική επιβίωση, αν και η ομάδα υψηλού Hotair έτειναν να δείχνουν μικρότερη επιβίωση από το Low-Hotair ομάδα (Εικόνα 2Α). Από την άλλη πλευρά, μια σημαντική συσχέτιση βρέθηκε μεταξύ της έκφρασης Hotair και λεμφαδένα μετάσταση (P = 0,043), φλεβική διήθηση (

P

= 0,0083), και μικρή συνολική επιβίωση (

P

= 0,018) στην διάχυτη τύπου γαστρικού καρκίνου (Πίνακας 3 και Σχήμα 2Β). Ωστόσο, δεν υπήρχε σχέση μεταξύ του σταδίου και της έκφρασης θερμού αέρα.

Η Hotair χαμηλή

θερμού αέρα υψηλής

P

αξία

Age73.07 ± 9.1870.87 ± 10.650.53Gender0.63Male1016female37T0.87T1, T2610T3, T4713N0.26N078N1, Ν2 , N3615Ly0.68ly069ly1, Ly2, ly3714v0.19v089v1, v2, v3514Stage0.501,27153,4680.50Table 2. Η σύνδεση της έκφρασης Hotair με κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά στο εντερικό τύπο του καρκίνου του στομάχου.

CSV CSV Κατεβάστε

Hotair χαμηλή

θερμού αέρα υψηλής

P

αξία

Age59.250 ± 10.7566.35 ± 10.160.07Gender0.71male812female48T0.87T1, T212T3, T41118N0.043*N086N1,N2,N3414ly0.40ly067ly1,ly2,ly3613v0.0083*v0119v1,v2,v3111Stage0.311,2783,4512Table 3. Η συσχέτιση της έκφρασης Hotair με κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά σε διάχυτο τύπο του καρκίνου του στομάχου.

CSV Λήψη CSV

Α, στον εντερικό τύπο του καρκίνου του στομάχου, καμία σημαντική σχέση παρατηρήθηκε μεταξύ της έκφρασης θερμού αέρα και τη συνολική επιβίωση, αν και η ομάδα υψηλού Hotair έτειναν να δείχνουν μικρότερη επιβίωση από την ομάδα χαμηλής θερμού αέρα. Β, η ομάδα υψηλού Hotair έδειξαν σημαντικά μικρότερη επιβίωση από την ομάδα χαμηλής Hotair στο διάχυτο τύπο του γαστρικού καρκίνου (

P

= 0,018).

Η

Δημιουργία Hotair ανάντη και κάτω-ρυθμίζονται κύτταρα και συσχέτιση με την κυτταρική βιωσιμότητα

Για να αξιολογηθεί ο λειτουργικός ρόλος του θερμού αέρα στο γαστρικό την ανάπτυξη του καρκίνου, δημιουργήσαμε σταθερά Hotair εκφράζουν ΜΚΝ74 κύτταρα (ΜΚΝ-θερμού αέρα) και σταθερά shHOTAIR κύτταρα που εκφράζουν ΚΑΤΩ III (KATO- shHOTAIR). qRT-PCR ανάλυση έδειξε ότι τα κύτταρα ΜΚΝ-Hotair εξέφρασαν επίπεδο Hotair περίπου 10 φορές εκείνη της EV εκφράζουν (ΜΚΝ-EV) ή γονική ΜΚΝ74 κύτταρα και ότι η έκφραση αυτού του μορίου μειώθηκε κατά 30 έως 70% στα κύτταρα ΚΑΤΩ-shHOTAIR σε σύγκριση με EV μεταχθέντα (ΚΑΤΩ-EV) ή ΚΑΤΟ III (ΚΑΤΩ-EV) κύτταρα γονική (Σχήμα 3Α). Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας ΜΤΤ απέδειξαν ότι ούτε τα πάνω ρύθμιση ούτε προς τα κάτω ρύθμιση Hotair επηρεάζονται γαστρικού πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων (Σχήμα S1).

Α, τα σχετικά επίπεδα έκφρασης Hotair σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου αναλύθηκαν με qRT- PCR ανάλυση. κύτταρα ΜΚΝ-θερμού αέρα που εκφράζεται περίπου 10 φορές υψηλότερα επίπεδα του θερμού αέρα από γονικών κυττάρων ΜΚΝ74 και ΜΚΝ-EV. Από την άλλη πλευρά, η έκφραση του θερμού αέρα σε κύτταρα ΚΑΤΩ-shHOTAIR μειώθηκε κατά 30 έως 70% σε σύγκριση με γονικά κύτταρα ΚΑΤΟ III και ΚΑΤΩ-EV. Β, Ο ραβδόγραμμα κατέδειξε την σχετική έκφραση Hotair σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου, φυσιολογικά και καρκίνωμα ιστών του στομάχου αναλύθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Η έκφραση του Hotair κανονικοποιήθηκε με εκείνο του GAPDH. Οι τιμές εκφράζονται σε σχέση με το 1,00 για την έκφραση σε γονικά κύτταρα ΜΚΝ74.

Η

μαλακό άγαρ σχηματισμού αποικίας δοκιμασία

Για να διαφωτίσει τις λειτουργίες του θερμού αέρα στην αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη των γαστρικών καρκινικών κυττάρων, χρησιμοποιήσαμε μια δοκιμασία μαλακού άγαρ. κύτταρα ΜΚΝ-Hotair σχηματίζεται ένα μεγαλύτερο αριθμό των αποικιών από κύτταρα ΜΚΝ-EV (

P

= 0.009, Εικόνα 4Α). Συνεπής με αυτή τη διαπίστωση, τα κύτταρα ΚΑΤΩ-shHOTAIR παρουσίασαν σημαντική λιγότερες αποικίες από τα κύτταρα ΚΑΤΩ-EV (Εικόνα 4Β). Επιπλέον, τα γαστρικά καρκινικά κύτταρα με παρόμοιο επίπεδο έκφρασης Hotair (ΜΚΝ-Hotair και shHOTAIR-3, Σχήμα 3Β) σχηματίζονται παρόμοιους αριθμούς αποικιών, υποδεικνύοντας ότι αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη των γαστρικών καρκινικών κυττάρων ρυθμίστηκε σε Hotair-εξαρτώμενο τρόπο.

Δυναμικό της αγκύρωσης ανάπτυξη ανεξάρτητη των γαστρικών καρκινικών κυττάρων εκτιμήθηκε με δοκιμασία μαλακού άγαρ. κύτταρα ΜΚΝ-θερμού αέρα που σχηματίζονται σημαντικά μεγαλύτερο αριθμό των αποικιών από κύτταρα ΜΚΝ-EV (

P

= 0,009) (Α), ενώ κύτταρα ΚΑΤΩ-shHOTAIR παρουσίασαν σημαντικά λιγότερες αποικίες από τα κύτταρα ΚΑΤΩ-EV σε Hotair τρόπο έκφρασης (EV έναντι SH- HOTAIR2,

P

= 0,016 και EV έναντι sh-HOTAIR3,

P

= 0,0035) (Β).

Η

έκφραση θερμού αέρα και γαστρικό καρκίνο κυττάρων μετάσταση και περιτοναϊκή διάχυση

από Hotair ενίσχυσε την ανεξάρτητη από προσκόλληση αλλά δεν εξαρτάται από την αγκύρωση ανάπτυξη των γαστρικών καρκινικών κυττάρων, υποθέσαμε ότι Hotair μπορεί να συμβάλει στη μακρινή μετάσταση και /ή περιτοναϊκή διάχυση μάλλον παρά άμεση εισβολή στο γειτονικό όργανα. Για την αντιμετώπιση αυτού του ζητήματος που απασχολούσε δοκιμασία φλέβα της ουράς και περιτοναϊκή έγχυση των κυττάρων να εξετάσει κατά πόσον η έκφραση Hotair προωθεί το αίμα -borne μετάσταση και περιτοναϊκή διάχυση, αντίστοιχα. Όπως ήταν αναμενόμενο, τα κύτταρα ΜΚΝ-Hotair εκτίθενται συχνά μεταστάσεις στο ήπαρ (

P

= 0,01) σε σύγκριση με τα κύτταρα ΜΚΝ-EV. Επιπλέον, οι αριθμοί και τα μεγέθη των μεταστατικών όγκων του ήπατος ήταν σημαντικά μεγαλύτερη με κύτταρα ΜΚΝ-θερμού αέρα από ό, τι με τα κύτταρα ΜΚΝ-EV (

P

= 0,03 και

P

= 0,019, αντίστοιχα, τα σχήματα 5Α και Β). Είναι ενδιαφέρον, ένα ποντίκι ένεση με ΜΚΝ-Hotair έδειξε μετάσταση στους νεφρούς και τα επινεφρίδια εκτός από το ήπαρ, ενώ με τα κύτταρα ΜΚΝ-EV μεταστατικών όγκων που σχηματίζονται μόνο στο ήπαρ. Σταθερά, περιτοναϊκή διάχυση ήταν σημαντικά μειωμένη (1/5,

P

= 0.009), όταν Hotair αδρανοποιήθηκε σε κύτταρα ΚΑΤΟ III ενώ όλα τα κύτταρα ελέγχου που σχηματίζεται περιτοναϊκή διάχυση (5/5) (Σχήματα 6Α και Β). Οι μεταστατικοί όγκοι είχαν ιστολογικά επιβεβαιωμένο και έδειξαν έντονη θετική χρώση για ανθρώπινη κυτοκερατίνη (Σχήματα 5C και 6C).

Α, η επίδραση του θερμού αέρα επί μετάστασης διερευνήθηκε με δοκιμασία φλέβα της ουράς. 1.0 χ 10

5 Hotair κυττάρων που εκφράζουν (ΜΚΝ-Hotair, n = 9) και κύτταρα ελέγχου (ΜΚΝ-EV, η = 9) εγχύθηκαν στην ουραία φλέβα των ποντικών. κύτταρα ΜΚΝ-Hotair πιο συχνά έδειξε μεταστάσεις στο ήπαρ (

P

= 0,01) σε σύγκριση με τα κύτταρα ΜΚΝ-EV (αριστερό πάνελ). Επιπλέον, οι αριθμοί (μεσαίο πλαίσιο) και τα μεγέθη των μεταστατικών όγκων του ήπατος (δεξί πάνελ) ήταν σημαντικές μεγαλύτερα με κύτταρα ΜΚΝ-Hotair ό, τι με κύτταρα ΜΚΝ-EV (

P

= 0,03 και

P

= 0,019, αντίστοιχα). Β, Οι μεταστατικοί όγκοι μπορεί να αναγνωριστεί σαφώς μακροσκοπικά (βέλος). C, τα κύτταρα του όγκου που σχηματίζονται αδένες και θεωρούνταν θα προέρχονται από τις εγχέεται ανθρώπινη γαστρικού καρκίνου κυτταρικών γραμμών (αριστερό πάνελ, HE, orginal μεγέθυνση x40). Αυτά τα καρκινικά κύτταρα παρουσίασαν έντονη ανοσολογική αντίδραση για την ανθρώπινη κυτοκερατίνη (δεξιά πλευρά).

Η

Ένα, περιτοναϊκή διάχυση μειώθηκε σημαντικά (1/5,

P

= 0,009), όταν Hotair αδρανοποιήθηκε σε κύτταρα ΚΑΤΩ III από shRNA μεταγωγή, ενώ όλα τα κύτταρα ελέγχου που σχηματίζεται περιτοναϊκή διάχυση (5/5). Β, ο ποντικός με περιτοναϊκή διάχυση έδειξε αιματηρή ασκίτη (αριστερό πάνελ) και οζίδια (βέλος στο δεξί πάνελ) στην περιτοναϊκή κοιλότητα. C, τα οζίδια στην περιτοναϊκή κοιλότητα αποτελούνταν από τα καρκινικά κύτταρα, και μερικοί από αυτούς είχαν βλεννίνης σαν ένα καρκίνωμα σφραγίδα κύτταρο δακτυλίου. Είχαν πιστεύεται ότι προέρχεται από τις εγχέεται ανθρώπινη γαστρικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (HE, αρχική μεγέθυνση χ 100), δεδομένου ότι αυτά τα κύτταρα έδειξαν έντονη ανοσοαντιδραστικότητα για ανθρώπινη κυτοκερατίνη (δεξί πάνελ).

Η

Συζήτηση

στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε την έκφραση του θερμού αέρα σε καρκίνο του στομάχου και να εξετάσει συσχετισμό του με τις κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά, όπως η πρόγνωση των ασθενών. Τα αποτελέσματα μας αποκάλυψαν σαφώς ενισχυμένη έκφραση του θερμού αέρα σε καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με μη-καρκινικούς ιστούς του στομάχου και ότι η υψηλού επιπέδου έκφραση αυτού του μορίου συνδέθηκε με μετάσταση λεμφαδένα, φλεβική εισβολή και η κακή επιβίωση στην διάχυτη τύπο καρκίνου του στομάχου. Αυτά τα ευρήματα είναι συνεπή με την πρόσφατη μελέτη που δείχνει ότι πάνω ρύθμιση του θερμού αέρα βρίσκεται στο γαστρικό καρκίνο σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς και συσχετίζεται με το στάδιο του όγκου και μετάσταση λεμφαδένα [17]. Επιπλέον, Hotair εκφράζουν γαστρικών καρκινικών κυττάρων εμφάνισαν την ενίσχυση της κυτταρικής ανάπτυξης αγκύρωσης ανεξάρτητη

in vitro

και μεταστάσεις στο ήπαρ

in vivo

ενώ μειωμένη έκφραση του θερμού αέρα στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα οδήγησε σε μειώθηκαν αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη και περιτοναϊκή διάχυση, υποδηλώνοντας ότι Hotair παίζει κεντρικό ρόλο στη γαστρική εξέλιξης του καρκίνου.

υψηλότερη έκφραση του Hotair ανιχνεύθηκε σε καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με τα αντίστοιχα μη-όγκου κύτταρα σε διάφορους καρκίνους συμπεριλαμβανομένου του μαστού, του παχέος εντέρου, του ήπατος, του παγκρέατος και του καρκίνου του ρινοφαρυγγικού [9-11,18-20]. Σε αυτούς τους καρκίνους, Hotair επίσης δείχθηκε να συνδέεται με τη μετάσταση ή /και κακή πρόγνωση. Επιπλέον, το υψηλό επίπεδο της έκφρασης Hotair συσχετίστηκε με μικρή ελεύθερη νόσου επιβίωση στον καρκίνο του πνεύμονα [12]. Ως εκ τούτου, το παρόν τα ευρήματά μας είναι σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες που δείχνουν ότι η έκφραση του Hotair εμπλέκεται στην ενισχυμένη επιθετικότητα των διαφόρων τύπων των κυττάρων καρκινώματος. Από την άλλη πλευρά, δεν μπορέσαμε να βρούμε αρνητική προγνωστική επίδραση του θερμού αέρα στο εντερικό τύπο του καρκίνου του στομάχου, αν και η ομάδα υψηλού Hotair έτειναν να δείχνουν μικρότερη συνολική επιβίωση σε σύγκριση με την ομάδα χαμηλής θερμού αέρα. Αυτό μπορεί να οφείλεται στο μικρό αριθμό των ασθενών στην παρούσα μελέτη, αφού εξαναγκασμένη έκφραση Hotair σε ένα εντερικό γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή (ΜΚΝ74) κέρδισε την επιθετική φαινότυπο

in vitro

και

in vivo

. Περαιτέρω έρευνες με μεγάλο αριθμό δειγμάτων εκτός από την πειραματική μελέτη χρησιμοποιώντας άλλες εντερικές κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου θα πρέπει να αντιμετωπίσει αυτό το ζήτημα.

Στην παρούσα μελέτη, δεν διαπιστώθηκε καμία συσχέτιση ανάμεσα στην έκφραση θερμού αέρα και την ανάπτυξη των κυττάρων σε γαστρικό καρκίνο. Σε μαστού, του παχέος εντέρου και καρκίνο του ήπατος, η συμμετοχή των Hotair στην ανάπτυξη των κυττάρων, δεν έχει αποδειχθεί [9,10,18], ενώ Hotair προωθείται και μείωσε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων στον καρκίνο του παγκρέατος [11] και τον καρκίνο του πνεύμονα [12], αντίστοιχα. Περαιτέρω, δεν βρέθηκε σημαντική διαφορά στην ανάπτυξη του υποδόριου όγκου σε ποντικούς NOG μεταξύ Hotair εκφράζουν και κύτταρα ελέγχου στην τρέχουσα μελέτη (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Με βάση αυτά τα ευρήματα, είναι πιθανό ότι η σχέση μεταξύ έκφρασης Hotair και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων εξαρτάται από τον τύπο του καρκίνου. Σε αντίθεση, η ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη των γαστρικών καρκινικών κυττάρων ήταν σαφώς βελτιωμένη σε Hotair-εξαρτώμενο τρόπο. Επιπλέον, η έκφραση Hotair προκάλεσε περισσότερο μεταστάσεις στο ήπαρ και άλλα όργανα, και ένα ελάττωμα του Hotair κατέστειλε την περιτοναϊκή διάχυση των κυττάρων γαστρικού καρκινώματος. Αυτές οι παρατηρήσεις, μαζί με το γεγονός ότι η έκφραση Hotair συμβάλλει στην μετάσταση σε διάφορους καρκινώματα [9-12,18], υποδεικνύουν ότι Hotair ασχολείται κυρίως στη μεταστατική διαδικασία παρά στην ανάπτυξη του πρωτογενούς όγκου.

Εν κατακλείδι, αυξημένη έκφραση θερμού αέρα στο διάχυτο τύπο του καρκίνου του στομάχου συνδέθηκε με τη συχνότητα εμφάνισης της φλεβικής εισβολής και κακή πρόγνωση ανεξάρτητα του παράγοντα Τ, και ανάγκασε την έκφραση του θερμού αέρα στο γαστρικό καρκίνο κύτταρα προωθούνται αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη των κυττάρων

in vitro

και μεταστάσεις στο συκώτι

in vivo

. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι Hotair είναι πιθανό να εμπλέκονται στην ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου και μπορεί επίσης να είναι ένας θεραπευτικός στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου του στομάχου.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Η ένωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων με την έκφραση θερμού αέρα. Τα αποτελέσματα του ΜΤΤ δοκιμασίας αξιολογήθηκε στις 72 ώρες κανονικοποιήθηκαν προς εκείνη σε 24 ώρες. Καμία σχέση βρέθηκε μεταξύ της έκφρασης θερμού αέρα και τον πολλαπλασιασμό των γαστρικών καρκινικών κυττάρων

doi:. 10.1371 /journal.pone.0077070.s001

(ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε καθηγητής Κιταμούρα (Το Πανεπιστήμιο του Τόκιο, Τόκιο, Ιαπωνία) για την παροχή κυττάρων Platinum-A.