Αφηρημένο

Ιστορικό

Η διφωσφονικά, ζολεδρονικό οξύ (ZOL), μπορούν να αναστείλουν τους οστεοκλάστες που οδηγεί σε μειωμένη οστεοκλαστογένεση και οστεοκλαστών δραστηριότητα στα οστά. Εδώ, χρησιμοποιήσαμε ένα μικτό οστεολυτικές /οστεοβλαστική μοντέλο ποντικού για καρκίνο προστάτη οστών-μεταστατικό, RM1 (ΒΜ), για να καθορίσει πώς αναστολής της οστεόλυσης με ZOL επηρεάζει την ικανότητα των κυττάρων αυτών να καθιερώσει μεταστάσεις στα οστά, την ακεραιότητα των οστών που φέρουν όγκο και η επιβίωση των ποντικών που φέρουν όγκο.

Μέθοδοι

το μοντέλο περιλαμβάνει ενδοκαρδιακής ένεσης για αρτηριακή διάδοση των κυττάρων RM1 (ΒΜ) σε C57BL /6 ποντίκια. αγωγή ZOL δόθηκε μέσω υποδόριες ενέσεις τις ημέρες 0, 4, 8 και 12, στα 20 και 100 μg /kg δόσεις. ακεραιότητα των οστών εκτιμήθηκε με μικρο-υπολογιστική τομογραφία και ιστολογία με σύγκριση με τα μη θεραπευμένα ποντίκια. Η δραστηριότητα των οστεοκλαστών και οστεοβλαστών καθορίστηκε μετρώντας ανθεκτική σε τρυγικό όξινη φωσφατάση 5b ορού (TRAP 5b) και οστεοκαλσίνη, αντίστοιχα. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία σύμφωνα με προκαθορισμένα κριτήρια και η επιβίωση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας Kaplan Meier οικόπεδα.

Ευρήματα

μικρο-CT και ιστολογική ανάλυση έδειξε ότι η θεραπεία των ποντικιών με ZOL από την ημέρα της ενδοκαρδιακή ένεση RM1 κύτταρα (ΒΜ) ανέστειλε προκαλούμενη από όγκο οστού λύση, διατηρείται ο όγκος των οστών και μείωσε την ασβεστοποίηση του οστεοειδούς ενδοχονδρικού υλικού προκαλούμενη από όγκο. επεξεργασία ZOL οδήγησε επίσης σε μειωμένη οστεοκαλσίνης ορού και TRAP 5b επίπεδα. Επιπλέον, ποντίκια που έλαβαν αγωγή έδειξαν αυξημένη επιβίωση σε σύγκριση με τους μάρτυρες που έλαβαν φορέα. Ωστόσο, η θεραπεία ZOL δεν αναστέλλει την ικανότητα των κυττάρων να μετάσταση στα οστά, όπως ο αριθμός των οστών-μεταστάσεων ήταν παρόμοια και στις δύο με και χωρίς αγωγή ποντικούς.

Συμπεράσματα

θεραπεία ZOL προβλέπονται σημαντικά οφέλη για τη διατήρηση η ακεραιότητα των οστών που φέρουν όγκο και αύξησε την επιβίωση των ποντικών που φέρουν όγκο, αν και δεν εμπόδισε δημιουργία οστού-μεταστάσεων σε αυτό το μοντέλο. Από την μηχανιστική άποψη, αυτές οι παρατηρήσεις επιβεβαιώνουν ότι προκαλούμενη από όγκο των οστών λύση δεν αποτελεί προϋπόθεση για τη δημιουργία αυτών των όγκων των οστών

Παράθεση:. Hung TT, Chan J, Russell PJ, Υδραυλικό CA (2011) ζολεδρονικό οξύ Κουταλιού οστών Δομή και αυξάνει την επιβίωση, αλλά δεν περιορίζει εμφάνιση όγκου σε καρκίνο του προστάτη μετάσταση στα οστά μοντέλο. PLoS ONE 6 (5): e19389. doi: 10.1371 /journal.pone.0019389

Επιμέλεια: Wafik Σ El-Deiry, University of Pennsylvania, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13 Φλεβάρη 2011? Αποδεκτές: 28 Μαρτίου 2011? Δημοσιεύθηκε: May 16, 2011

Copyright: © 2011 Hung et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς επιθυμεί να δηλώσει ότι το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από μια επιχορήγηση για έρευνα από τη Novartis Αυστραλία. Novartis παρείχε επίσης το ζολεδρονικό οξύ για αυτή τη μελέτη. Θ υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Ίδρυμα Καρκίνου του Προστάτη της Αυστραλίας. ΚΓΠ χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από το Ίδρυμα Σίδνεϊ της ιατρικής έρευνας και είναι υπότροφος του Εθνικού Μηχανισμού Imaging, Αυστραλία. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Το έργο χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από μια ερευνητική επιχορήγηση από τη Novartis Αυστραλία. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

Μερικές πρωτογενείς καρκίνοι έχουν υψηλή ροπή προς μετάσταση στα οστά, αλλά οι λόγοι για αυτό παραμένουν ασαφείς, αν και είναι γενικά αποδεκτό ότι η ανάπτυξη των περισσότερων καρκίνων στα οστά εξαρτάται από παράγοντες που υπάρχουν στο μικρο-περιβάλλον οστό. Τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να επάγουν πολλαπλασιασμό και την ενεργοποίηση των κυττάρων του οστού μέσω απελευθέρωση αυξητικών παραγόντων και αυτή η αύξηση στη δραστικότητα προκαλεί περαιτέρω διέγερση των καρκινικών κυττάρων σε αυτό που έχει ονομαστεί ένα «φαύλο κύκλο» [1]. Η συμμετοχή των οστών είναι κοινή σε προστάτη και του μαστού και μυελώματος, και ενώ ο καρκίνος του μαστού και μυελώματος κόκαλα μεταστάσεις είναι κυρίως οστεολυτικές, που περιλαμβάνουν αυξημένη δραστικότητα των οστεοκλαστών που οδηγεί σε διάβρωση των οστών, περιπτώσεις μεταστάσεως του προστάτη καρκίνο των οστών είναι ετερογενείς, με τη συμμετοχή τόσο των οστών λυτική και σκληρωτικό επιδράσεις [ ,,,0],2]. Σε οστεολυτικές βλάβες, τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να παράγουν κυτοκίνες, οι οποίες προωθούν τη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών άμεσα [3], [4], και έμμεσα, μέσω διέγερσης των στρωματικών κυττάρων του μυελού των οστών για την προώθηση οστεοκλαστογένεση [5]. Παρομοίως, καρκινικά κύτταρα μπορούν να παράγουν κυτοκίνες που προωθούν δραστηριότητα των οστεοβλαστών και επάγουν την ανάπτυξη των οστών [6] και οστεοβλαστών μπορεί να διεγείρει την ανάπτυξη και την πρόοδο του καρκίνου [7], [8], [9]. Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και των κυττάρων των οστών υπαγορεύουν την μεταστατικό φαινότυπο των οστών.

Το zoledronic acid (ZOL) και άλλα διφωσφονικά (BP) αναστέλλουν την μετάσταση και την ανάπτυξη των όγκων των οστών-κάτοικος, μέσω αναστολής της λειτουργίας των οστεοκλαστών. Έτσι ZOL αναστέλλει το οστό καταστρεπτικές συνέπειες του όγκου και το προκύπτον αναστολή του οστικού μεταβολισμού επιβραδύνει επίσης τον φαύλο κύκλο, με αποτέλεσμα μία μείωση στο μέγεθος των οστών του όγκου και, σε ορισμένες περιπτώσεις, ο αριθμός των βλαβών οστού σε διάφορα ζωικά μοντέλα οστεολυτικού καρκίνο των οστών [10]. Ωστόσο, υπήρξαν αντιφατικές εκθέσεις των αποτελεσμάτων της ZOL στην οστεοβλαστική όγκων των οστών. Ενώ η θεραπεία ZOL δεν αναστέλλει ενδοστικό ανάπτυξη του οστεοβλαστική κυτταρική γραμμή LAPC-9 [11], η ανάπτυξη των ενδο-κνημιαίου LuCaP 23.1 κύτταρα αναστέλλεται από ZOL [12]. Μια μεταγενέστερη μελέτη προτείνει ότι όγκου-μεσολάβηση οστεόλυση δεν απαιτείται για οστεοβλαστικές μεταστάσεις [11].

Εδώ χρησιμοποιούμε ένα μικτό οστεολυτικές /οστεοβλαστική συγγενικά μοντέλο ποντικού της μετάστασης του καρκίνου του προστάτη στα οστά, το RM1 οστό μεταστατικό (ΒΜ) μοντέλο [13] για την αξιολόγηση των επιπτώσεων της θεραπείας ZOL στο

δημιουργία

των οστικών μεταστάσεων, την ακεραιότητα των οστών που φέρουν όγκο και τη συνολική επιβίωση των ποντικών.

RM1 κύτταρα (ΒΜ) με ένεση στην αριστερή κοιλία της καρδιάς αποτέλεσμα σε πολλαπλές οστικές μεταστάσεις, με λίγες μαλακούς ιστούς όγκων. Έχουμε αποδείξει ότι η αναστολή της οστεόλυσης με θεραπεία ZOL δεν επηρεάζει επίπτωση των οστικών όγκων. Παρ ‘όλα αυτά, η θεραπεία ZOL έκαναν αυξάνει την επιβίωση των ποντικών με έναν τρόπο που εξαρτάται από τη δόση. Το πιο σημαντικό, η θεραπεία ZOL μειώθηκε επίσης τα λυτικά αποτελέσματα των RM1 (ΒΜ) όγκους στα οστά, όπως εκτιμάται από την ιστολογία και μικρο-υπολογιστική τομογραφία (micro-CT) ανάλυση, και φαίνεται να αναστέλλει ασβεστοποίηση προκαλούμενης από όγκο ενδοχονδρικού οστού, αλλά όχι οστεοειδούς σχηματισμός. Εμείς δεν καθορίζουν εάν ZOL επηρεάζεται το μέγεθος ή η αύξηση της κινητικής των όγκων. Τα πειράματα που παρουσιάζονται εδώ χρησιμοποιείται ενδο-καρδιακή έγχυση, το οποίο δεν προκαλεί άμεσα βλάβη των οστών και η προκύπτουσα μεταστατικές εστίες σε αυτά τα πειράματα είναι πιθανό να περιλαμβάνει σχετικά λίγα κύτταρα. Έτσι, η δημιουργία μεταστάσεων από μεμονωμένα κύτταρα ή μικρές ομάδες κυττάρων, μια κατάσταση πιο πιθανό να αντανακλούν το φυσικό μεταστατικό γεγονότα, δεν απαιτεί απαραίτητα την αρχική λυτική συνθήκες.

Αποτελέσματα

Στο RM1 (BM ) μοντέλο μετάστασης οστών, θεραπεία ZOL είχε σημαντική επίδραση στην επιβίωση των ποντικών σε σύγκριση με χωρίς θεραπεία ποντικούς (Σχήμα 1). Συνολικά υπήρξε μια τάση αύξησης της επιβίωσης με αυξημένη δόση (p = 0,012). Η επιβίωση των ποντικών στη δόση 100 μg /kg ήταν σημαντικά διαφορετική από εκείνη της ομάδας που έλαβαν φορέα (ρ = 0.031), ενώ η δόση των 20 μg /kg δεν κατέληξε σε στατιστικά σημαντική διαφορά από την ομάδα ελέγχου με τα μεγέθη δείγματος που χρησιμοποιούνται σε αυτές πειράματα (ρ = 0.108). Ο διάμεσος χρόνος επιβίωσης για την με φορέα, 20 μg /kg ZOL- και 100 μg /kg ποντίκια ZOL αγωγή ήταν 14,5, 18,5 και 20 ημέρες αντίστοιχα.

(Α) Kaplan-Meier οικόπεδο επιβίωση των ποντικών που δίνεται μια ενδο-αρτηριακή έγχυση των κυττάρων RM1 (ΒΜ) που ακολουθείται από κατεργασία με 100 μg /kg ή 20 μg /kg ζολενδρονικού δοσολογικά σχήματα ή όχημα μόνο, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Η δοκιμή log rank για την τάση δείχνει μια τάση αύξησης της επιβίωσης με την αύξηση της δόσης (p = 0.012), και μια σημαντική διαφορά στην επιβίωση μεταξύ ποντίκια στην /kg ομάδα δόσης 100 μg vs ομάδες ελέγχου του οχήματος (p = 0,031, Kaplan-Meier ακολουθείται από Breslow κατά ζεύγη σύγκριση με τη χρήση του SPSS 17.0)

η

επίπεδα οστεοκαλσίνη ήταν γενικά χαμηλότερες σε ποντίκια που φέρουν όγκο, αν και η διαφορά δεν ήταν στατιστικά σημαντική και θεραπεία αυτών των ποντικών με 20 (p & lt?. 0.01) ή 100 μg /kg (ρ & lt? 0,01) από ZOL μειωθεί περαιτέρω η οστεοκαλσίνη ορού σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ελέγχους (Σχήμα 2Α). Η παγίδα ορό 5β επίπεδα που φέρει όγκο, χωρίς θεραπεία ποντικούς ήταν παρόμοια με αυτά των ελέγχων. Ωστόσο, η θεραπεία με 20 ή 100 μg /kg του ZOL μείωσε το TRAP ορού 5b σε λιγότερο από το 40% των ποντικών ελέγχου και εκείνων που έχουν τη RM1 (ΒΜ) κύτταρα μόνο (ρ & lt? 0.001, Σχήμα 2Β).

(Α) Επίπεδα του δείκτη των οστεοβλαστών, οστεοκαλσίνη μειώθηκαν στον ορό των ποντικών που έλαβαν ζολεδρονικό οξύ. (Β

)

ανθεκτική σε τρυγικό όξινη φωσφατάση 5b, ένας δείκτης της δραστικότητας των οστεοκλαστών, μειώθηκε επίσης με τη θεραπεία. Σημεία στο γράφημα αντιπροσωπεύουν επίπεδα ορού για μεμονωμένα ποντίκια ενώ μπάρες δείχνουν την θέση των μέσων μέσα σε κάθε ομάδα. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση μονόδρομης ANOVA για ανάλυση ακολουθούμενη από μετά τη δοκιμή του Tukey. *** Ρ & lt?. 0.001

Η

Η παρουσία καρκινικών βλαβών σε ποντικούς εκτιμήθηκε με δύο μέσα, απεικόνισης φθορισμού για πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) έκφραση από κύτταρα όγκου που ακολουθείται από επιβεβαίωση με ιστολογία όπως περιγράφεται [ ,,,0],13]. Η κυτταρική σειρά RM1 (ΒΜ) ήταν ευαίσθητη σε κατεργασία ZOL

in vitro

(δεδομένα δεν παρουσιάζονται), αλλά η θεραπεία είχε μικρή επίδραση στη συχνότητα των όγκων μαλακών ιστών ή οστού σε αυτό το μοντέλο. θεραπεία ZOL δεν μείωσε τον αριθμό των βλαβών οστεώδη ούτε τον αριθμό των όγκων μεταστάσεων σε μαλακό ιστό στο RM1 (ΒΜ) με ένεση ποντικούς (Σχήμα 3Α-Γ). Εμείς δεν αξιολόγησε την επίδραση της θεραπείας ZOL για την ανάπτυξη καθιερωμένων όγκων.

(Α) Συνολικός αριθμός των μεταστάσεων, (Β) με κόκαλα μεταστάσεις, ή (Γ) μεταστάσεις μαλακών ιστών, όπως εκτιμάται από το ένα τρόπο ANOVA. Κάθε σημείο παριστάνει τον αριθμό των μεταστάσεων σε ένα άτομο ποντικού, ράβδοι δείχνουν τη μέση μέσα στην ομάδα.

Η

έχουν ανακατασκευαστεί τρισδιάστατες εικόνες των οστών από μικρο-CT και αντιπροσωπευτικές Η και Ε χρώση ιστολογικές τομές φαίνεται στο Σχήμα 4 και 5 αντιστοίχως. Τα τμήματα επίσης χρωματίστηκαν με χρώση τετραχρώμιο [14] για τη διάκριση νέα ανάπτυξη οστού από καθιερωμένες /ασβεστοποιημένες οστού (Σχήμα 6). Τα ποντίκια με μεταστατικές βλάβες των οστών στα μακρά οστά έδειξαν σημαντική λύση των οστών, ιδιαίτερα κοντά στην επιφυσιακής πλάκας, με μείωση σε δοκιδωτό οστούν (Σχήμα 4Β) σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ελέγχους (Σχήμα 4Α). Η λυτική επίδραση του όγκου μειώνεται στην ομάδα θεραπείας kg 20 μg /ZOL (Σχήμα 4C) και ίσως περισσότερο σε ποντίκια που έλαβαν 100 μg /kg ZOL (Εικόνα 4D). Τα αποτελέσματα μικρο-CT επιβεβαιώνεται από τα ιστολογικά αποτελέσματα (Εικόνα 5 και 6), δείχνοντας την κανονική δοκιδωτού δομής των οστών στα μη επεξεργασμένα ποντίκια ελέγχου (Εικόνα 5Α, 5Β και 6Α), αλλά υπάρχουν ενδείξεις τόσο λυτικές και σκληρωτικό επιπτώσεις στο μη επεξεργασμένο φέροντα όγκο οστά (Σχήμα 5C, 5D και 6Β). θεραπεία ZOL στα 20 μg /kg διατηρημένα δομή δοκιδωτού στα οστά που φέρουν όγκο (Σχήμα 5Ε, 5F και 6C) και η δόση 100 μg /kg αύξησε δοκιδωτού οστού (Σχήμα 5G, 5Η και 6D). Η αύξηση του ενδοχονδρικού σχηματισμού δοκιδωτό οστό προκαλούμενη από όγκο είναι ιδιαίτερα εμφανής στα επεξεργασμένα ZOL ποντικούς (Σχήμα 5Ε και 5G) λόγω της ταυτόχρονης αναστολής της λύσης του όγκου που προκαλείται. Ωστόσο, ατελής ανοργανοποίηση του δοκιδωτό οστό οστεοειδούς κοντά στην πλάκα επίφυσης είναι εμφανής στα οστά που φέρουν όγκο ZOL-αγωγή (Σχήμα 6C και 6D)

MicroCT σαρώσεις μηρού και της κνήμης ποντικού.? κανονικό έλεγχο (Α), RM1 (ΒΜ) που φέρει όγκο (Β), RM1 (ΒΜ) που φέρει όγκο σε επεξεργασία με το /kg αγωγή ZOL 20 μg (C), RM1 (ΒΜ) που φέρει όγκο σε επεξεργασία με 100 μg /kg ZOL αγωγή (D)

η

η &?. Ε τομές της μηριαίας κεφαλής κατά 40Χ (Α, C, Ε και G) και 120X (Β, D, F και η) μεγέθυνση που δείχνει την κανονική (Α & amp? Β) και RM1 (ΒΜ) οστά που φέρουν όγκο (C-H)? Τυπικά παραδείγματα των οστών από μη κατεργασμένα ποντίκια (Α-Δ) και ποντικών που υπέστησαν αγωγή με 20 μg /kg ZOL (Ε & amp? F) ή 100 μg /kg ZOL (G & amp? H) δείχνονται. Τ = όγκος, βέλος = δοκιδωτού οστού.

Η

τετραχρώμιο λεκέ για διαφοροποίηση των ανοργανοποιημένο και unmineralised οστών σε 120x μεγέθυνση Normal (Α), ή RM1 (ΒΜ) του όγκου που φέρουν τα οστά (Β-Δ). (Amp A &? Β) Μη επεξεργασμένα, (C) 20 μg /kg ZOL (D) 100 μg /kg ZOL. Τ = όγκος, βέλος = δοκιδωτού οστού.

Η

Η ποσοτική ανάλυση των μικρο-CT στοιχεία δείχνουν ότι δεν υπήρξε καμία σημαντική αλλαγή στην επιφάνεια των οστών σε κανονική, που φέρει όγκο ή επεξεργασμένα οστά (Σχήμα 7Α). Η κύρια επίδραση του όγκου είναι η μείωση του όγκου του οστού (ρ & lt? 0,01, Σχήμα 7Β) και επακόλουθη αύξηση στην περιοχή του οστού επιφάνεια: αναλογία οστών όγκου στα οστά που φέρουν όγκο (ρ & lt? 0.001, Εικόνα 7C), ενώ η θεραπείες ZOL ως αποτέλεσμα την αύξηση του όγκου των οστών (ρ & lt? 0.001, Εικόνα 7Β) και μία μείωση στην περιοχή του οστού επιφάνεια:. αναλογία οστών όγκου (ρ & lt? 0.001, Εικόνα 7C) των οστών που φέρουν όγκο

δεν υπήρξε καμία σημαντική αλλαγή στην επιφάνεια του οστού (Α) που προκαλείται από την παρουσία ενός όγκου ή θεραπεία με ζολεδρονικό οξύ. Ωστόσο, ο όγκος των οστών μειώθηκε δραματικά σε RM1 (ΒΜ) που περιέχει τα οστά και η θεραπεία με ZOL απέτρεψε αυτή την απώλεια με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Β), με αποτέλεσμα χαμηλότερες επιφάνειας /όγκο αναλογία (αυξημένη πυκνότητα των οστών) σε σύγκριση με φυσιολογικά ή καρκινικά οποία φέρουν το οστά (C). Τα αποτελέσματα βασίζονται σε μετρήσεις που λαμβάνονται από αξονική τομογραφία, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι τμήμα. Η στατιστική ανάλυση έγινε με μονόδρομη ANOVA που ακολουθήθηκε από μετά τη δοκιμή του Tukey, * ρ & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001

Η

Συζήτηση

Όταν. εγχέεται από την ενδο-καρδιακή διαδρομή, η κυτταρική γραμμή RM1 (ΒΜ) επάγει πολλαπλές οστικές μεταστάσεις, με σχετικά λίγες (και σχετικά μικρή) όγκουε μαλακών ιστών [13]. Αξιοσημείωτη είναι η παρατήρηση ότι τα προκύπτοντα οστικές μεταστάσεις δεν δείχνουν προτίμηση για συγκεκριμένα σημεία του σκελετού όπου εμφανίζεται ο κύκλος εργασιών υψηλής οστών, υποδεικνύοντας ότι ο κύκλος εργασιών υψηλή οστική δεν απαιτείται για τη δημιουργία μεταστάσεων. Επιπλέον, τα προκύπτοντα οστικές μεταστάσεις έχουν ανάμεικτα οστεολυτικές και οστεοβλαστικές χαρακτήρες ούτε με φαινότυπο επικρατούν [13]. Διαπιστώσαμε ότι ενδοκαρδιακής ένεση κυττάρων RM1 (ΒΜ) είναι ένα εξαιρετικό μοντέλο για την αξιολόγηση εάν ZOL θα μπορούσε να αναστείλει τη δημιουργία όγκων μεταστάσεων που δεν ήταν εξαρτώνται από λυτική ανάπτυξη, δηλαδή, ο φαύλος κύκλος. Εκτιμήσαμε επίσης την ικανότητα της θεραπείας ZOL να αναστέλλουν την προκαλούμενη από όγκο οστεόλυση και του σχηματισμού ενδοχονδρικού οστού και καθορίζεται η επίδραση της θεραπείας στη συνολική επιβίωση των ποντικών.

Όπως και άλλα που περιέχουν άζωτο BPs, ZOL επάγει απόπτωση σε οστεοκλάστες αναστέλλοντας τα ένζυμα του μονοπατιού μεβαλονικού και την πρόληψη της ισοπρενυλίωσης των μικρών GTP-δεσμευτικές πρωτεΐνες όπως Ras και Rho [15], [16].

In vivo

, διφωσφονικά συνδέονται με υψηλή συνάφεια προς το οστό υδροξυ-appatite και έτσι απορροφάται από την ενεργό οστεοκλάστες σε υψηλές συγκεντρώσεις, οδηγώντας σε οστεοκλαστών απόπτωση. Αν και ένας αριθμός άλλων μηχανισμών που περιλαμβάνουν άμεση θανάτωση των καρκινικών κυττάρων, η αναστολή της αγγειογένεσης και της ενεργοποίησης των κυττάρων γδT [17], [18] έχουν αποδειχθεί για ZOL, η επίδρασή της στους οστεοκλάστες παραμένει ο κύριος μηχανισμός με τον οποίο ZOL αναστέλλει τον καρκίνο των οστών υπό τις τρέχουσες θεραπευτικές αγωγές. Το όφελος για τον ασθενή είναι δυνητικά διττός: ZOL αναστέλλει την οστεοκλαστών λύση που επάγεται από τον όγκο και έτσι διακόπτει τον φαύλο κύκλο και την επακόλουθη προώθηση της ανάπτυξης του όγκου. Αυτό ισχύει οπωσδήποτε για οστεολυτικές όγκων, αλλά τα αποτελέσματα της θεραπείας ZOL σε όγκους που δεν εξαρτώνται από την λύση των οστών είναι ελάχιστα κατανοητή.

Κατεργασία φέρουν όγκο ποντικών με ZOL παρέτεινε την επιβίωση των ποντικών στη μελέτη μας ( Φιγούρα 1). Στη δόση των 100 μg /kg, υπάρχει μια στατιστικά σημαντική αύξηση του χρόνου επιβίωσης σε σύγκριση με τα ποντίκια που έλαβαν φορέα και μια τάση προς την αυξημένη επιβίωση στα 20 μg /kg αγωγή ποντικούς. Παρόμοια αποτελέσματα έχουν αναφερθεί για άλλα συγγενικά μοντέλα καρκίνου του [7], [8], [9]. Ωστόσο, σε οστεολυτικές μοντέλα του πολλαπλού μυελώματος [10] και του καρκίνου του μαστού [8], σημαντική μείωση στην δημιουργία οστού μεταστατικών βλαβών παρατηρήθηκε, αλλά αυτό δεν είναι αλήθεια για το σύστημα μας (Σχήμα 3). Έχουμε αποδείξει προηγουμένως [13] ότι τα κύτταρα RM1 (ΒΜ) μετάσταση στα περισσότερα σημεία του σκελετού και κατά συνέπεια τη μετάσταση των κυττάρων αυτών να οστεώδη θέσεις φαίνεται να είναι ανεξάρτητη από τα ποσοστά οστικού μεταβολισμού. Έτσι, δεν είναι έκπληξη το γεγονός ότι η αναστολή της λύσης των οστών μέσω επεξεργασίας ZOL δεν έχει εμφανή επίδραση στη δημιουργία όγκων στα οστά. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η προτίμηση των κυττάρων RM1 (ΒΜ) για οστών εξαρτάται από άλλους παράγοντες, δυνητικά αυξημένη παλιννόστησης σε οστικές θέσεις ή εξάρτηση από παράγοντες ανεξάρτητους της λύσης των οστών. Αν και αυτό είναι ένα μικτό μοντέλο οστεολυτικές /οστεοβλαστική, τα αποτελέσματα είναι σε αντίθεση με εκείνες του Corey [12], αλλά είναι παρόμοια με τα αποτελέσματα που επιτυγχάνονται με τη γραμμή οστεοβλάστες, LAPC-9 [11].

Έχουμε αξιολογηθεί οι συγκεντρώσεις των δύο δεικτών του οστικού, οστεοκαλσίνη (που εκκρίνεται από οστεοβλάστες) και TRAP 5b (που παράγεται από οστεοκλάστες) στον ορό των πειραματικών ποντικών. θεραπεία ZOL ελαττώνει τα επίπεδα και των δύο αυτών των δεικτών (Σχήμα 2) που δείχνει ότι έχει ZOL ανέστειλε τόσο οστεοκλαστών και οστεοβλαστών δραστηριότητα σε συστημικό επίπεδο ορού. Τα αποτελέσματα αυτά είναι σε συμφωνία με προηγούμενες εκθέσεις του μειώθηκε οστεοκαλσίνης σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού [19] και μείωση TRAP 5b σε ποντίκια [20] μετά από θεραπεία με ZOL. Το εύρημα ότι τόσο οστεοβλαστών και οστεοκλαστική δραστηριότητα είναι μειωμένη υποδηλώνει ότι η παρατηρούμενη αύξηση του όγκου των οστών και την επιφάνεια με κατεργασία ZOL (Σχήμα 7) είναι ένα αποτέλεσμα της μειωμένης δραστηριότητας των οστεοκλαστών, παρά την αυξημένη δραστηριότητα των οστεοβλαστών. Ωστόσο, βρίσκουμε ότι είναι ιδιαίτερα ενδιαφέρον το γεγονός ότι τα επίπεδα οστεοκαλσίνης στον ορό μειώθηκαν σε ZOL αγωγή ποντικούς που φέρουν όγκο συνοδός με την παρατήρηση του αυξημένου σχηματισμού ενδοχονδρικού οστεοειδούς σε αυτά τα ποντίκια (Σχήμα 5 F και Η). Είναι σημαντικό ότι, η νέα οστεοειδούς υλικό που παρατηρήθηκε στους ποντικούς που έλαβαν ZOL εμφανίζεται σε μεγάλο βαθμό un-ασβεστοποιημένες (Σχήμα 6C και 6D), ιδιαίτερα στην υψηλή δόση (Σχήμα 6D), κατά το χρόνο όταν οι ποντικοί θανατώθηκαν υποδηλώνουν αποσύνδεση της ανάπτυξης οστεοειδούς και βήματα ασβεστοποίηση του σχηματισμού των οστών. Από ενδιαφέρον είναι η παρατήρηση ότι οστεοκαλσίνης-ανεπαρκή ποντίκια έχουν αυξημένη σχηματισμού των οστών [21]. Η μείωση στο σπογγώδες οστό ασβεστοποίηση με αυξημένη σε δόση ZOL είναι ένα νέο εύρημα και φαίνεται να έρχονται σε αντίθεση με την εκτεταμένη υπάρχουσα βιβλιογραφία σχετικά με τις επιδράσεις των διφωσφονικών στα οστά. Ωστόσο, δείχνουν επίσης ότι η αγωγή ZOL ποντικών που φέρουν όγκο αυξάνει τον όγκο των οστών των οστών των ποδιών ποντικού (Σχήμα 7Β), το οποίο υποστηρίζει τα προηγούμενα ευρήματα. Σε παρόμοιες προκλινικές μελέτες με τη χρήση της C4-2 [21] και LuCaP 23.1 [22] μοντέλα ξενομοσχεύματος, θεραπεία ZOL αποδείχθηκε επίσης να αυξήσει τον συνολικό όγκο των οστών. Έτσι, η μειωμένη ανοργανοποίηση του νεοσχηματισμένου δοκιδωτού οστού που παρατηρείται εδώ είναι σύμφωνη με μια συνολική διατήρηση των υφιστάμενων ανοργανοποιημένου οστού σε ποντίκια που φέρουν όγκο. Αυτές οι επιδράσεις της ZOL στη διατήρηση της ακεραιότητας των οστών που σχετίζεται με την αυξημένη επιβίωση σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή ZOL.

Τα αποτελέσματα του ZOL στη δομή των οστών μπορεί ή δεν μπορεί να επηρεάσει άμεσα την εξέλιξη του καρκίνου, αλλά η πρόληψη των ανώμαλων μοντελοποίησης οστού σε ένα οστό όγκο μαστίζονται μπορεί να είναι το κλειδί για ZOL μείωση του κινδύνου των σκελετικών επιπλοκών που σχετίζονται και παρατείνοντας το χρόνο να σκελετικό σχετίζονται εμφανιστεί κάποιο συμβάν σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη κόκαλα μεταστατικό [23], [24]. Επιπλέον, η θεραπεία ZOL έχει σημαντικές επιπτώσεις για την αντιμετώπιση μείωση του πόνου στην κλινική. Τα διφωσφονικά τη βελτίωση της δομής των οστών σε ασθενείς, με σημαντική μείωση των σχετικών πόνο [25], [26], [27], το οποίο έχει αποδοθεί στην εκ νέου ασβεστοποίηση των οστών, που έχει οδηγήσει σε μείωση αναλγητική χρήση. Που παρουσιάζουν ενδιαφέρον είναι η παρατήρηση σε πολλαπλές ασθενών με μυέλωμα (μια ασθένεια οστεολυτική), μειωμένα επίπεδα οστεοκαλσίνης, όπως αναφέρεται εδώ, συνδεόταν με μείωση των σκελετικών σχετικές εκδηλώσεις [28]. Η θεραπεία με ζολεδρονικό οξύ είναι μια αποτελεσματική θεραπεία για μικτές οστεοβλαστικά /λυτική όγκους, καθώς αυξάνει την επιβίωση των ποντικών που έλαβαν. Η θεραπεία αναστέλλει λύσεως των οστών και μειωμένη δραστηριότητα των οστεοκλαστών, όπως αναμένεται. θεραπεία ZOL επίσης μείωσε τα επίπεδα της οστεοκαλσίνης στον ορό, αλλά δεν ανέστειλε ενδοχονδρικού σχηματισμού οστεοειδούς προκαλούμενη από όγκο αν και μερικώς ανέστειλε μετέπειτα ασβεστοποίηση του υλικού αυτού οστεοειδούς με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. ZOL δεν μείωσε τη συχνότητα των μεταστάσεων που δείχνει ότι παρόλο που RM1 (BM) όγκοι επάγουν λύση των οστών, δημιουργία όγκων δεν εξαρτάται από λυτική ανάπτυξη.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Το Πανεπιστήμιο της Νέας Νότιας Ουαλίας φροντίδα των ζώων και την επιτροπή δεοντολογίας ενέκρινε τη στέγαση των ζώων, την εκτροφή, και όλες τις πειραματικές διαδικασίες που εκτελούνται σε ζώα πριν από πειράματα (Έργο αριθμός έγκρισης της αίτησης: 05 /120Β). Τα ποντίκια παρακολουθούνται στενά (σε καθημερινή βάση) και ευθανασία σύμφωνα με προκαθορισμένα κριτήρια (απώλεια 20% του σωματικού βάρους, σημαντική απώλεια της κατάστασης, ή μερική παράλυση), όπως εγκρίθηκε από τα ζωικά ηθική.

κυττάρων πολιτισμού

RM1 κύτταρα ελήφθησαν από τον Dr. Τ Thompson, Baylor College, και RM1 (ΒΜ) αναπτύχθηκε από σειριακό πέρασμα του RM1

in vivo

[13]. Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές καλλιεργήθηκαν υπό πρότυπες συνθήκες (37 ° C σε ένα 5% CO

2 επωαστήρας) σε ϋΜΕΜ (Invitrogen, Μελβούρνη, Αυστραλία) με 10% FBS (Invitrogen) και L-γλουταμίνη (Invitrogen).

υποκατάστατων δεικτών οστικών μεταστάσεων σε ορό

οι οροί από ποντίκια που είχαν ενεθεί καρκινικών κυττάρων και φυσιολογικών ποντικών ελέγχου συλλέχθηκαν κατά τη νεκροψία με καρδιακή παρακέντηση αξιολογήθηκαν για την παρουσία υποκατάστατων δεικτών του μεταβολισμού των οστών. Ανεπαρκείς ορού ήταν διαθέσιμη από ορισμένους ποντικούς για την αξιολόγηση των υποκατάστατων δεικτών. περιεχόμενο οστεοκαλσίνη αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα οστεοκαλσίνης ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA) (Biomedical Technologies Inc., Stoughton, ΜΑ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. όξινη φωσφατάση (TRAP) συγκέντρωση 5β ανθεκτική σε τρυγικό προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία Ποντικοπαγίδα (Suomen Bioanalytikka Oy, Turku, Φινλανδία) ως απαγορευμένο στο κιτ. Ορού επίπεδα πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν με σύγκριση με μία πρότυπη καμπύλη που παρασκευάζεται από πρότυπα που παρέχονται με τις δοκιμασίες.

Ζώα

ηλικίας 5-6 εβδομάδων C57BL /6 ποντικοί ελήφθησαν από το Κέντρο Resource Ζώων (Adelaide , Αυστραλία). Αυτοί στεγάστηκαν και διατηρήθηκαν στο Κέντρο Βιολογικών Πόρων, Little Bay, NSW. Την ημέρα 0 του πειράματος, οι ποντικοί εγχύθηκαν είτε με 3 × 10

4 RM1 (ΒΜ) κύτταρα σε αλατούχο διάλυμα ή αλατούχο διάλυμα μόνο (100 μΐ) στην αριστερή κοιλία της καρδιάς. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή τις ημέρες 0, 4, 8 και 12 με υποδόρια ένεση είτε 20 μg /kg ή 100 μg /kg του ζολεδρονικού οξέος (Novartis Pharmaceuticals, Αυστραλία), ή αλατούχο διάλυμα (όχημα). Η αθροιστική δόση 20 μg /kg ισοδυναμεί κατά προσέγγιση εφάπαξ δόση των 4 mg σε ασθενείς. Τα ποντίκια παρακολουθούνται στενά και ευθανασία σύμφωνα με προκαθορισμένα κριτήρια (απώλεια 20% του σωματικού βάρους, σημαντική απώλεια της κατάστασης, ή μερική παράλυση), όπως εγκρίθηκε από τα ζωικά ηθική. Ο αριθμός των όγκων σε κάθε ποντικό εκτιμήθηκε με φθορισμό GFP (όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13]) κατά τη νεκροψία που ακολουθείται από ιστολογία. Η παρουσία μόνο ενός θώρακα όγκου είναι μια ένδειξη ότι η ένεση IC δεν ήταν επιτυχής και, ως εκ τούτου, όπως τα ποντίκια είχαν αποκλειστεί σε αυτές τις εκτιμήσεις.

Ιστολογίας

Τα σφάγια ποντίκι μονιμοποιήθηκαν σε 10% φορμαλίνη σε ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS) για 48 ώρες και στη συνέχεια απασβεστωμένες σε 10% EDTA για 10-14 ημέρες. Απασβεστωμένες προσκήνιο και οπίσθιων άκρων ενσωματωμένα σε παραφίνη, μετά την επεξεργασία των ιστών (αφυδάτωση, την εκκαθάριση και τον εμποτισμό). Τμήματα (5 μm) κόπηκαν από κάθε μπλοκ και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη Harris και ηωσίνη (Η &? Ε). Για την ανάλυση της ανοργανοποίησης του οστού, τα τμήματα (8 μm) κόπηκαν και χρωματίστηκαν με χρώση τετραχρώμιο σύμφωνα με προηγουμένως δημοσιευμένες μεθόδους [14] με ελαφρές τροποποιήσεις: το κόκκινο διάλυμα Ponceau αντικαταστάθηκε με διάλυμα Briebrich Scarlet /όξινη φουξίνη. Οι τομές εξετάστηκαν με την Aperio Scanscope XT (CA, USA) και οι εικόνες που λαμβάνονται με Imagescope Viewer (Aperio, CA, USA).

μικρο-CT σάρωση και ανάλυση

Μετά την μονιμοποίηση φορμαλίνης, η οπίσθια άκρα επιλέχθηκαν για μικρο-αξονική τομογραφία πριν την επεξεργασία για ιστολογική εξέταση. άκρα των όγκων που φέρουν εντοπίστηκαν πριν από την έκφραση της GFP

in vivo

. Για τους ποντικούς που φέρουν όγκο που έλαβαν το δοσολογικό σχήμα /kg 20 μg, σαρώθηκαν τόσο δεξιά και αριστερά πίσω πόδια των πέντε ποντικών. Για άλλες ομάδες θεραπείας, μόνο ένα ενιαίο σκέλος σαρώθηκε από κάθε ποντικό. Όλα αναλύθηκαν οστά ήταν από ζώα που θανατώθηκαν μεταξύ της ημέρας 15 και 21 μετά την ένεση των κυττάρων. Σάρωση και ανακατασκευή έγινε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα μικρο-CT SKYSCAN 1072 και του σχετικού λογισμικού (SKYSCAN, Αμβέρσα, Βέλγιο). Διατηρώντας το δείγμα στον οπτικό πεδίο κατά τη διάρκεια της λήψης εικόνας, το δείγμα περιστράφηκε 180 ° γύρω από τον κατακόρυφο άξονα. Εικόνες εκτέθηκαν για 5,9 sec και τις προβλέψεις που καταγράφονται σε κάθε βήμα περιστροφής, κάθε 0,9 °, στο 80 keV και 100 mA. Διατομής εικόνες (σε μορφή DICOM) δημιουργήθηκαν από τις προβλεπόμενες CT εικόνες χρησιμοποιώντας Nrecon (SKYSCAN, Βέλγιο). Bone έκτασης και του όγκου υπολογίστηκαν από τις εικόνες χρησιμοποιώντας το λογισμικό DICOM του κατασκευαστή (CT-Analyzer, SKYSCAN, Βέλγιο). Η περιοχή του ποδιού γύρω από την άρθρωση του γόνατος από την κορυφή του τρίτου τροχαντήρα του μηρού προς τη διακλάδωση της κνήμης και περόνης επιλέχθηκε για αυτή την ανάλυση για να διασφαλιστεί η συνοχή. Ανασυγκρότηση του μοντέλου και της εικόνας απεικόνισης 3D πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού ΑΝΤ (SKYSCAN, Βέλγιο).

Η στατιστική ανάλυση

Η μονόδρομη ANOVA ακολουθούμενο από ταχυδρομική τεστ Tukey του πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση GraphPad Prism έκδοση 4.00 για Macintosh, GraphPad Software (San Diego, USA). Η επιβίωση αξιολογήθηκε με Kaplan-Meier που ακολουθείται από Breslow ζεύγη σύγκριση με τη χρήση του SPSS 17.0.