Αφηρημένο

Ιστορικό

Η ανάλυση των δειγμάτων όγκου για μεταλλάξεις γίνεται ολοένα και πιο σημαντικό στην οδήγηση εξατομικευμένη θεραπεία του καρκίνου. Καθώς αναπτύσσονται πιο στοχευμένες θεραπείες, οι επιλογές για την έρευνα μεταλλάξεις σε πολλαπλά γονίδια σε ένα μόνο δείγμα όγκου θα γίνει ακόμα πιο ελκυστική και αναμένεται να γίνει ο στυλοβάτης της μοριακής διάγνωσης σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) στο μέλλον.

Υλικά και Μέθοδοι

238 μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) δείγματα όγκων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα προσαρμοσμένο πίνακα των 82 δοκιμασίες μετάλλαξης σε 14 ογκογονίδια συμπεριλαμβανομένων των

KRAS

και

EGFR

χρησιμοποιώντας Sequenom iPlex Matrix Υποβοηθούμενη εκρόφησης λέιζερ /ιονισμού Ώρα της Φασματομετρίας μάζας πτήσης (MALDI-TOF). Συγκρίναμε τα δεδομένα που δημιουργούνται για

KRAS

μεταλλάξεις σε εκείνους που ανιχνεύεται από Amplification Refractory Mutation System (ΟΠΛΑ) με βάση DxS TheraScreen K-RAS Κιτ μετάλλαξης.

Ανιχνεύεται

Αποτελέσματα

Οι βραχίονες μεταλλάξεις σε 46/238 δείγματα όγκων. Για δείγματα με μεταλλάξεις που ανιχνεύονται από τις δύο προσεγγίσεις, παρατηρήθηκε 99,1% συνολική συμφωνία. Η μέθοδος MALDI-TOF εντόπισε ένα επιπλέον 6 δείγματα ως

KRAS

μετάλλαξη θετικά και επίσης στοιχεία σχετικά με την ταυτόχρονη μεταλλάξεις συμπεριλαμβανομένου του

PIK3CA

και

TP53

.

συμπεράσματα

Η μέθοδος Sequenom MALDI-TOF παρέχει μια ευαίσθητη προσέγγιση του πίνακα με βάση το οποίο κάνει αποδοτική χρήση των ασθενών διαγνωστικών δειγμάτων. Αυτή η τεχνολογία θα μπορούσε να δώσει την ευκαιρία να παραδώσει ολοκληρωμένο έλεγχο των σχετικών βιοδεικτών στην κλινική νωρίτερα στη διαχείριση της νόσου, χωρίς την ανάγκη για επανάληψη της βιοψίας και να επιτρέψει την πρόσθετη κατάντη ανάλυση NSCLC όπου αυτά είναι διαθέσιμα ιστού μπορεί να έχουν εξαντληθεί.

Παράθεση : Sherwood JL, Müller S, Orr MCM, Ratcliffe MJ, Walker J (2014) Πίνακας Βασισμένο MALDI-TOF όγκου Profiling είναι μια ευαίσθητη μέθοδος για την ανίχνευση μεταλλάξεων στην Κλινική μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα όγκου. PLoS ONE 9 (6): e100566. doi: 10.1371 /journal.pone.0100566

Επιμέλεια: Αντώνης WI. Lo, το Κινεζικό Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 21 Μαρ 2014? Αποδεκτές: 23, Μάη, 2014? Δημοσιεύθηκε: 23 Ιούνη του 2014

Copyright: © 2014 Sherwood et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Τα δεδομένα είναι διαθέσιμα σε αριθμούς στο χειρόγραφο και στον συμπληρωματικό πίνακα

Χρηματοδότηση:. Το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε από την AstraZeneca. Ο χρηματοδότης παρέχεται στήριξη με τη μορφή ofmsalaries για τους συγγραφείς JLS, MCMO, MJR, και JW και Sequenom GmbH για το συγγραφέα SM, αλλά δεν έχουν κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, η συλλογή δεδομένων ή ανάλυση, η απόφαση για τη δημοσίευση ή την προετοιμασία του χειρογράφου.

Αντικρουόμενα συμφέροντα: JLS, MCMO, MJR, και JW είναι υπάλληλοι και κατέχουν μετοχές της AstraZeneca, του οποίου η εταιρεία που χρηματοδοτούνται αυτή τη μελέτη. SM είναι υπάλληλος της Sequenom GmbH. Διπλώματα ευρεσιτεχνίας που αφορούν selumetinib έχουν ως εξής: patentid patenttitle, US200903005, 8, τοσυλικό άλας του 6- (4-br0m0-2-chl0r0phenylamin0) -7-φθορο-Ν- (2-υδροξυαιθοξυ) -3-μεθυλ-3Η-benzimi οξφενδαζόλης – 5 – καρβοξαμίδη, αναστολέα ΜΕΚ χρήσιμες στη θεραπεία του καρκίνου, US200924627, 4 φαρμακευτικής σύνθεσης 271 US201013051, 9 συνδυασμένη θεραπεία που περιλαμβάνει AZD2171 και azd6244 ή ΜΕΚ-αναστολέα. II, US200323286, 9 Ν3 αλκυλιωμένα βενζιμιδαζολίου παράγωγα ως αναστολείς ΜΕΚ, us7842816 η3 αλκυλιωμένα βενζιμιδαζολίου παράγωγα ως αναστολείς ΜΕΚ, US7777050 N3 αλκυλιωμένα παράγωγα βενζιμιδαζολίου ως αναστολείς ΜΕΚ, US7576114 N3 αλκυλιωμένα βενζιμιδαζολίου παράγωγα ως αναστολείς ΜΕΚ, US8193229, μέθοδο θεραπείας χρησιμοποιώντας η3 αλκυλιωμένα παράγωγα βενζιμιδαζόλης ως αναστολείς ΜΕΚ, US8193230, συνθέσεις που περιλαμβάνουν η3 αλκυλιωμένα βενζιμιδαζολίου παράγωγα ως αναστολείς ΜΕΚ και μεθόδους χρήσης αυτών, us7235537, N3 αλκυλιωμένα βενζιμιδαζολίου παράγωγα ως αναστολείς ΜΕΚ, US7973170, N3 παράγωγα αλκυλιωμένα βενζιμιδαζόλης ως αναστολείς ΜΕΚ, US8003805, N3 αλκυλιωμένα βενζιμιδαζολίου παράγωγα ως αναστολείς ΜΕΚ , US7425637, N3 παράγωγα αλκυλιωμένα βενζιμιδαζόλης ως αναστολείς ΜΕΚ, US8178693, N3 παράγωγα αλκυλιωμένα βενζιμιδαζόλης ως αναστολείς ΜΕΚ. Δεν υπάρχουν περαιτέρω διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

NSCLC αποτελεί περίπου το 85% όλων των καρκίνων του πνεύμονα [1]. Περίπου το 20% των Καυκάσιων με NSCLC, αυξάνεται σε πάνω από 26% των ατόμων με αδενοκαρκινώματα (ADC) έχουν την ενεργοποίηση μεταλλάξεων στο

KRAS

[2]. Οι ασιατικοί πληθυσμοί έχουν ένα

KRAS

μετάλλαξη συχνότητα εμφάνισης 11% στο ADC. Μεταλλάξεις στο

EGFR

υπάρχουν στο 48% των ασιατικών NSCLC ADC έναντι 19% στην Καυκάσιοι ADC.

EML4-ALK

μεταλλάξεις είναι παρούσα σε 6% του Καυκάσου NSCLC ADC και 5% των ασιατικών ADC [2]. Μοριακή ανάλυση των εκτροπών σε

EGFR

και

ALK

έχει εδραιωθεί και να χρησιμοποιηθεί για τον εντοπισμό ασθενών κατάλληλο για στοχευμένες θεραπείες, όπως οι αναστολείς της τυροσίνης κινάσης του EGFR (TKIs) gefitinib, erlotinib και afatinib, και

ALK

αναστολείς όπως crizotinib [3].

KRAS

είναι μια σημαντική αναδυόμενη δείκτη σε NSCLC. Η κλινική αξία της καθιέρωσης

KRAS

κατάσταση μετάλλαξης μπορεί να αυξηθεί εάν η ανάπτυξη των αναστολέων ΜΕΚ σε NSCLC με μεταλλαγμένο KRAS ακόμα πιο θετικά αποτελέσματα οφέλους κινδύνου για τους ασθενείς. ΜΕΚ είναι γνωστό ότι είναι ένας καθοδικός τελεστής του

KRAS

σηματοδότησης και έχει ενοχοποιηθεί για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την ανάπτυξη του όγκου. Selumetinib (AZD6244, Arry-142886) είναι ένας ισχυρός και εκλεκτικός, μη ανταγωνιστικός της ΑΤΡ 2 αναστολέα /MEK1 [4]. Μια πρόσφατη κλινική δοκιμή φάσης ΙΙ (NCT00890825) συνέκρινε την αποτελεσματικότητα της selumetinib σε συνδυασμό με ντοσεταξέλη σε σχέση με την docetaxel ως μονοθεραπεία σε προ-θεραπεία των ασθενών με

KRAS

μετάλλαξη-θετικό τοπικά προχωρημένο ή μεταστατικό μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. Η διάμεση συνολική επιβίωση ήταν 9,4 μήνες (6,8 έως 13,6) στην ομάδα selumetinib και 5.2 μήνες (95% CI 3.8-μη υπολογίσιμη) στην ομάδα του εικονικού φαρμάκου (αναλογία κινδύνου (HR) για θάνατο was0 · 80, 80% CI 0 · 56 -1 · 14? μονόπλευρη p = 0.21). Η διάμεση επιβίωση χωρίς εξέλιξη ήταν 5 · 3 μηνών (4 · 6-6 · 4) η ομάδα selumetinib και 2,1 μήνες (95% CI 01/04 – 03/07) στην ομάδα του εικονικού φαρμάκου (HR για την εξέλιξη 0,58, 80% CI 0,42 – 0,79 ? μονόπλευρη p = 0,014) [5]. Η αποτελεσματικότητα των selumetinib σε άγριου τύπου

KRAS

NSCLC δεν έχει ακόμη καθοριστεί. Άλλοι αναστολείς ΜΕΚ σε εξέλιξη περιλαμβάνουν cobimetinib (GDC-0973, XL-518) και trametinib. Το τελευταίο εγκρίθηκε πρόσφατα για χρήση από το FDA το

BRAF

V600E μεταλλαχθεί μελάνωμα. Επίδειξη μιας σαφούς κλινικό όφελος σε μια

KRAS

με θετικό στη μετάλλαξη του πληθυσμού NSCLC που οδηγεί στην έγκριση του φαρμάκου θα οδηγήσει την ανάγκη για τον εντοπισμό σχετικών

KRAS

μεταλλάξεις σε ασθενείς με ΜΜΚΠ κατά τη διάγνωση, εκτός από

EGFR

και

ALK

εκτροπές, να ενημερώσει τις αποφάσεις της θεραπείας.

Στη δοκιμή NCT00890825 οι ΟΠΛΑ βάση DxS TheraScreen K-RAS Κιτ μετάλλαξης χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό μελλοντικά

KRAS

ασθενών με θετικό στη μετάλλαξη επιλέξιμες για τυχαιοποίηση και θεραπεία. επιλέγεται ARMS μεθοδολογία καθώς παρέχει ανώτερη ευαισθησία και ειδικότητα σε σταθεροποιημένα με φορμαλίνη ενσωματωμένα σε παραφίνη υλικό (FFPE), σε σύγκριση με την άμεση αλληλούχιση [6], [7]. Στην κλινική δοκιμή ρύθμιση αυτή qPCR μέθοδος που βασίζεται μπορούσε να γίνει με μια γρήγορη στροφή γύρω από το χρόνο σε μικρό αριθμό ασθενών που υποβλήθηκαν τα δείγματα.

Σε μια άλλη πρόσφατη μελέτη της selumetinib σε δερματικό μελάνωμα, NCT00936221 [8], τα δείγματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα συνδυασμό των όπλων και των μεθοδολογιών προσδιορισμού αλληλουχίας για τη δοκιμή για

BRAF

μεταλλάξεις στο κωδικόνιο V600.

Το Pro τεχνολογία Sequenom iPlex MALDI-TOF επιτρέπει πολλαπλές μεταλλάξεις σε δείγματα FFPE να αναλυθούν σε ένα μόνο PCR αντιδράσεις έρευνα με τη χρήση πολυπλεξίας [9]. Η τεχνολογία χρησιμοποιεί μικρές (~ 80 ζεύγη βάσης) ενίσχυση PCR προϊόν το οποίο είναι βέλτιστο για την ενίσχυση του κατακερματισμένου DNA templates όπως αυτά που εκχυλίζονται από δείγματα όγκων FFPE. Μετά την ενίσχυση, ένα μόνο βήμα επέκτασης ζεύγος βάσεων πραγματοποιείται στο χώρο των μεταλλαγμένων βάσεων του ενδιαφέροντος με μάζα τροποποιημένο ddNTP μείγματος τερματισμού. Το πλεονέκτημα αυτής της προσέγγισης είναι η ικανότητα να επιλύσει τα τέσσερα βάσεις στο φάσματα. Το προκύπτον θραύσμα, με τροποποιημένη βάση στη θέση της μετάλλαξης, στη συνέχεια αναλύεται χρησιμοποιώντας το φασματόμετρο μάζας Sequenom MassARRAY οποίο έχει σχεδιαστεί και βελτιστοποιηθεί ειδικά για την ανίχνευση νουκλεϊκών οξέων. Ένα σαφές πλεονέκτημα αυτού του συστήματος είναι η ικανότητα να αναγνωρίζουν κάθε μεταλλαγμένο βάση στη δεδομένη θέση σημαίνει μία δοκιμασία καλύπτει και τις τρεις πιθανές αλλαγές βάσεων χωρίς την ανάγκη για ένα ξεχωριστό προσδιορισμό για κάθε δυνητική μετάλλαξη. Για παράδειγμα, η Gly12Cys μετάλλαξη στο

KRAS

προκαλείται από μια G & gt? Τ μεταστροφής στην θέση 34. Sequenom iPlex Pro θα ανιχνεύσει οποιαδήποτε μετάλλαξη στην θέση αυτή βάση, συμπεριλαμβανομένων των μεταλλάξεων Gly12Arg και Gly12Ser που προκαλούνται από την G & gt? Μετάβαση C και η G & gt? Ένα tranversion αντίστοιχα. Αυτό μειώνει την απαίτηση προτύπου DNA και επομένως ελαχιστοποιεί τη ζήτηση των ιστών.

Εδώ να αναφέρουμε πως η μέθοδος MALDI-TOF συγκρίνει με τα όπλα ως μέθοδο για την ανίχνευση

KRAS

και

BRAF

μεταλλάξεις σε κλινικά δείγματα και πώς η χρήση ενός multiplex πάνελ μας επέτρεψε να εκτιμηθεί ο επιπολασμός των λιγότερο συχνές μεταλλάξεις σε NSCLC ομάδα μας.

Υλικά και Μέθοδοι

Ανάλυση του όγκου του δείγματος

Τα 238 NSCLC δείγματα ασθενών ήρθε από τη μελέτη NCT00890825 [5].

177 δείγματα μελανώματος από τη μελέτη NCT00936221 [8] επίσης, συλλέγονται και υποβάλλονται σε επεξεργασία όπως περιγράφεται στο Robert et al [8].

Όλες οι διαδικασίες πραγματοποιούνται σύμφωνα με τη δήλωση του Ελσίνκι (1964, τροποποιήθηκε το 1975, 1983, 1989, 1996 και 2000) του Παγκόσμιου Ιατρικού Συλλόγου και όλα τα δείγματα ασθενών που υποβλήθηκαν για ανάλυση έγιναν τόσο με την πλήρη επιγνώσει συναίνεση του ασθενείς

Παθολογία

οι ασθενείς σε αυτή την ομάδα NSCLC παρέχεται ένα δείγμα όγκου που χρονολογείται από το Μάιο του 2007 και τον Μάιο του 2010. τα δείγματα επιβεβαιώθηκαν ιστολογικά ή κυτταρολογικά ως στάδιο IIIB-IV NSCLC μετά από την H & amp?. χρώση Ε με ειδική ιστοπαθολόγου σε LabCorp Κέντρο Μοριακής Βιολογίας και Παθολογίας (CMBP), Research Triangle Park, NC, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής.

νουκλεϊκών οξέων εξόρυξη

εξόρυξη

νουκλεϊνικών οξέων διεξήχθη σε LabCorp CMBP, Research Triangle Park, NC, USA, από 4 × 5 μm τομές FFPE, με την αφαίρεση της παραφίνης με τήξη.

εκχύλιση του DNA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το Qiagen QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Γερμανία), σύμφωνα με στο ένθετο του κιτ. Η έκλουση ήταν σε 100 μL νερό.

DNA ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ TaqMan RNase Ρ Ανίχνευσης Αντιδραστήρια και TaqMan PCR καθολική βασικού μείγματος (Applied Biosystems, Carlsbad, California USA) για τη δημιουργία ενισχύσιμο απόδοση.

KRAS

μετάλλαξη Ανάλυση κατάσταση

δείγματα όγκου προοπτικά αξιολογούνται για

KRAS

κατάσταση μετάλλαξης χρησιμοποιώντας το TheraScreen K-RAS ΟΠΛΩΝ Mutation Kit (QIAGEN Μάντσεστερ [πρώην DxS Ltd], Μάντσεστερ, UK).

η ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (qPCR) εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα ΑΒΙ Prism 7900 σύστημα qPCR (Applied Biosystems).

KRAS

ανάλυση μετάλλαξης διεξήχθη από LabCorp CMBP, Research Triangle Park, NC, USA.

Ένα κλάσμα του απομένοντος ϋΝΑ που παρέχονται σε Sequenom GmbH, Hamburg για ανάλυση χρησιμοποιώντας χημεία Sequenom iPlex και MALDI-TOF.

Sequenom iPlex Pro Δοκιμασία Σχεδιασμός

ο Πίνακας 1 δείχνει το έθιμο πάνελ αναλύσεις μετάλλαξης που είχε σχεδιαστεί για μεταλλάξεις σε 14 ογκογονίδια δηλαδή

BRAF, CDNK2A, CTNNB1, EGFR, erbB2, FGFR, HRAS, KRAS, STK11, ΚΟΑ, ΕΡΑ, TP53, PIK3CA

και

PTEN

. Μεταλλάξεις επιλέχθηκαν με βάση την γνωστή συχνότητα σε NSCLC ή μελάνωμα, βιολογική σημασία ή παρουσία οποιωνδήποτε σημαντικών «hotspots» δανείζουν τους εαυτούς τους σε στοχευμένες αναλύσεις [2], [10] – [13].

Η

Η μετάλλαξη ανάλυση διεξήχθη στους Sequenom GmbH (Αμβούργο) και αποτελούνταν από 10 πολυπλέκτες που περιέχει 82 δοκιμασιών για την ανίχνευση πάνω από 160 διαφορετικές μεταλλάξεις. πρότυπο πρωτόκολλο του κατασκευαστή ακολουθήθηκε [9]. Εν ολίγοις, 2 μί προτύπου γονιδιωματικού DNA ενισχύθηκε με πολλαπλή PCR για την επέκταση άγριου τύπου (WT) και μεταλλάκτη DNA, που ακολουθείται από μια κατεργασία γαρίδα-αλκαλική φωσφατάση για να απομακρυνθεί το πλεόνασμα νουκλεοτίδια. Στη συνέχεια, μία αντίδραση επέκτασης εναρκτήρα (iPlex Pro) διεξήχθη με μάζα-τροποποιημένα νουκλεοτίδια περατώσεως, και τα προϊόντα κηλιδώθηκαν επί SpectroCHIP (Sequenom). Οι διακριτές μάζες προσδιορίστηκαν με MALDI-TOF φασματομετρία μάζας. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση του λογισμικού MassARRAY Typer Analyser (Sequenom) [9].

Αποτελέσματα

Ανάλυση Επιτυχίες

απόδοση του DNA κυμαινόταν από -10 γονιδιωματική αντίγραφα ανά μλ για να ~30,000 αντίγραφα ανά μL με μέσο όρο 1.837 αντίγραφα ανά μι (5,9 ng /μL). Έντεκα δείγματα με πολύ χαμηλό αριθμό αντιγράφων (≤10 αντίγραφα ανά μί) απέτυχε ανάλυση χρησιμοποιώντας το κιτ όπλων. Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν με επιτυχία χρησιμοποιώντας τον πίνακα MALDI-TOF.

Σύγκριση Μεταξύ MALDI-TOF Panel και τα όπλα Kit για

KRAS

σε NSCLC

238 δείγματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τα όπλα κιτ το οποίο σχεδιάστηκε για να ανιχνεύει τα ακόλουθα 7

KRAS

μεταλλάξεις: G12C /R /S /V /A /D και G13D. 46/238 δείγματα ασθενών (19%) ταξινομήθηκαν ως

KRAS

μεταλλαγμένο θετικά από τη δοκιμή όπλων. Η μέθοδος MALDI-TOF καλύπτει G12C /R /S /V /A /D, G13D /V /A /E και Q61L /R /P /E /K /H. 53/238 (22%) δείγματα ταξινομήθηκαν ως

KRAS

θετικά με MALDI-TOF, με έναν ασθενή που έχει δύο χωριστές μεταλλάξεις, το ένα στο κωδικόνιο 12 και μία στο κωδικόνιο 61.

Α

KRAS

ανάλυση μετάλλαξης A146 συμπεριλήφθηκε στον πίνακα MALDI-TOF και καμία μεταλλάξεις ανιχνεύθηκαν, σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές που υποδηλώνει αυτό το συγκεκριμένο μετάλλαξη, αν και σχετικές σε ορθοκολικό καρκίνο, δεν είναι σημαντικό σε NSCLC [12], [14] .

Συμφωνία της MALDI-TOF Μέθοδος με ARMS Kit

Συμφωνία μεταξύ των δύο πλατφόρμες προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας δεδομένα από δείγματα που αξιολογήθηκαν με δύο μεθόδους (δηλαδή αποκλείσαμε τα 11 δείγματα που απέτυχαν από ΟΠΛΩΝ μέθοδος). Η μέθοδος MALDI-TOF ανιχνεύεται 6 (13%) περισσότερο

KRAS

μεταλλάξεις στο σύνολο, εν μέρει λόγω της ευρύτερης κάλυψης (Πίνακας 2 & amp? 3). Για τις μεταλλάξεις ανιχνεύονται με τις δύο πλατφόρμες το θετικό ποσοστό συμφωνίας (PPA) μεταξύ της μεθόδου ARMS και μέθοδος MALDI-TOF ήταν 97,8% (πίνακας 4) και το συνολικό ποσοστό συμφωνίας (OPA) ήταν 99,1%. Η ιδιαιτερότητα της πλατφόρμας Sequenom σε δείγματα καθιερωθεί ως άγριου τύπου από ΟΠΛΩΝ ήταν 98,3% (αρνητικό ποσοστό συμφωνίας).

Η

Η

Οι δύο ασύμφωνα δείγματα που περιλαμβάνονται ένα δείγμα στο οποίο MALDI-TOF ανιχνεύεται μία μετάλλαξη G12D με αποτέλεσμα δοκιμασίας ARMS υπερβαίνει τα κριτήρια που περιγράφονται στο ένθετο κιτ για ένα θετικό αποτέλεσμα. Στο δεύτερο δείγμα, MALDI-TOF που δημιουργείται κανένα ανιχνεύσιμο σήμα ενώ ARMS ανίχνευσε ένα G12C. Η πιο πιθανή εξήγηση για αυτό είναι ότι το υψηλό ποσοστό των DNA άγριου τύπου μπορεί να έχουν υπερβεί το αναλυτική ευαισθησία του προτύπου Pro χημεία iPlex. Έχει αποδειχθεί από αυτήν την ομάδα (δεδομένα που δεν έχει δημοσιευθεί), ότι αυτή η ομάδα ήταν σε θέση να ανιχνεύσει μεταλλάξεις σθεναρά σε 5% (όριο της ανάλυσής μας) με τη χρήση προσμίξεων κυτταρικής γραμμής.

Ως εκ τούτου, η πλατφόρμα Sequenom MassARRAY εκτελεί στο τουλάχιστον εξίσου καλά σε (OPA = 99,1%), την αξιολόγηση

KRAS

κατάσταση μετάλλαξης σε κλινικά δείγματα διαθέσιμα NSCLC FFPE ως πλατφόρμα ΟΠΛΩΝ (Πίνακας 4), με ενισχυμένη αναλυτική ευαισθησία (Πίνακας 3).

επικράτηση των άλλων μεταλλάξεων στο NCT00890825 NSCLC Cohort

δεδομένα MALDI-TOF δημιουργήθηκε για πρόσθετες μεταλλάξεις συμπεριλαμβανομένου του κωδικονίου 12, 13 και 61 στο

HRAS

και

NRAS

και κωδικόνιο 600

BRAF

. 107 του 238 δείγματα (45%) ήταν θετικά για τουλάχιστον μία μετάλλαξη (βλέπε πίνακα S1). 52/238 (22%) των ασθενών είχαν μεταλλάξεις στο

KRAS

, σύμφωνο προς την προβλεπόμενη επικράτηση στον NSCLC [2] (Πίνακας 5).

NRAS

μεταλλάξεις ανιχνεύτηκαν σε 5 ασθενείς (2,1%), συμπεριλαμβανομένων 3 Q61 μεταλλάξεις, μια G12 και G13 μετάλλαξη. Υπήρχαν 3

BRAF

δείγματα V600E μεταλλαγμένα και 2

HRAS

μεταλλαγμένα δείγματα στα κωδικόνια Q61 και G12.

Η

Ο αριθμός των γνωστών

TP53

μεταλλάξεις διερευνήθηκαν και βρέθηκε να είναι παρούσα σε 23/238 (10%) των ασθενών. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η ανάλυση MALDI-TOF ανακρίνονται μόνο 10/480 (2%) των αντικαταστάσεων που έχουν αναφερθεί στον πνεύμονα από συστηματική οθόνες στην κοσμική βάση δεδομένων [13], αν και ήταν τα 10 πιο κοινά μεταλλαγμένα βάσεις αναφερθεί σ ‘αυτό ( Πίνακας 5).

EGFR

μεταλλάξεις εντοπίστηκαν σε 20/238 (8,8%) των δειγμάτων μας. Αυτό είναι λίγο μικρότερη από ό, τι αναμενόταν από τις προηγούμενες εκθέσεις που δείχνουν

EGFR

μεταλλάξεις είναι παρόντες από 10% έως 15% σε Καυκάσιους με NSCLC [15]. Μια σειρά από παράγοντες μπορεί να έχουν συμβάλει στο χαμηλό επιπολασμό του

EGFR

μεταλλάξεις στη μελέτη μας. Πρώτον 9% των δειγμάτων μας ήταν πλακώδες καρκίνωμα, οι οποίες έχουν πολύ χαμηλότερη συχνότητα εμφάνισης

EGFR

μεταλλάξεις από ADC. Δεύτερον, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε την τοπική προ-επιλογή των ασθενών για τη μελέτη μας, λόγω της γνώσης του

KRAS

θετική κατάσταση μετά από τοπική δοκιμή,

EGFR

θετικούς ασθενείς να εκτραπεί προς ΤΚΙ θεραπεία ή αυξημένο ποσοστό των ασθενών με ιστορικό καπνίσματος, το οποίο θα είναι λιγότερο πιθανό να έχουν

EGFR

μεταλλάξεις [2], [12].

συνακολουθίας της μεταλλάξεις σε NSCLC

10/52 (19%) των ασθενών με

KRAS

μεταλλάξεις είχαν ταυτόχρονη μεταλλάξεις, το συνηθέστερο από τα οποία ήταν

TP53

,

PIK3CA

και

CDNK2A

. Σχήμα 1α. δείχνει την χρονική σύμπτωση των μεταλλάξεων σε κάθε δείγμα όγκου που περιείχε τουλάχιστον μία μετάλλαξη, η = 107.

Β).

KRAS

μεταλλαγμένα δείγματα σε NCT00890825 με ταυτόχρονη μεταλλάξεις.

Η

Εικόνα 1β. δείχνει τα 10 δείγματα τα οποία ήταν

KRAS

θετικά και είχαν ταυτόχρονη μεταλλάξεις. Τέσσερα δείγματα είχαν

TP53

μεταλλάξεις οι οποίες ήταν είτε στο

TP53

R282 ή το DNA R175 δεσμευτική μεταλλάξεις της περιοχής. Και οι δύο αυτές μεταλλάξεις είναι το πιο συχνό

TP53

μεταλλάξεις βρίσκονται σε καρκίνο και είναι επιβλαβή για TP53 λειτουργία [16].

Δύο δείγματα είχαν μια

KRAS

μετάλλαξη G12D κορυφή 6 συνυπάρχουσες με μια ενεργοποίησης

PIK3CA

μετάλλαξη. Συνακολουθίας αυτών των μεταλλάξεων έχει παρατηρηθεί προηγουμένως [12]. Ένα δείγμα περιείχε μια μετάλλαξη R248C στο

FGFR

εξωκυττάριο τόπο που ήταν συμπτωματικά με

KRAS

G12C.

FGFR3

μεταλλάξεις είναι παρούσα σε περίπου 3% στον καρκίνο του πνεύμονα [17] και η μετάλλαξη R248C είναι γνωστό ότι οδηγεί σχηματισμό όγκων σε μοντέλα ξενομοσχεύματος που ανεστάλησαν από αναστολέα ponatinib multi-κινάσης.

Μία δείγματος με ένα

KRAS

μετάλλαξη έδειξε μια ταυτόχρονη μετάλλαξη με ένα

EGFR

Τ790Μ μετάλλαξη.

KRAS

και

EGFR

ενεργοποιώντας μεταλλάξεις θεωρούνται γενικά να είναι αμοιβαία αποκλειόμενα [18], ωστόσο, έχουν παρατηρηθεί σε πολύ χαμηλές συχνότητες [19], [20]. Η μετάλλαξη T790M είναι γνωστό ότι προσδίδουν ανθεκτικότητα σε

EGFR

ΤΚΙ του. Παραδόξως, αυτό το δείγμα περιείχε επίσης ένα διπλό

KRAS

μετάλλαξη και

PTEN

μετάλλαξη. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η συγκέντρωση του DNA ήταν εξαιρετικά χαμηλό σε αυτό το δείγμα και περαιτέρω επιβεβαίωση με αλληλούχιση δεν ήταν δυνατή.

Εκτέλεση της MALDI-TOF MS Panel σε μελάνωμα Δείγματα

Το ίδιο MALDI -TOF MS πίνακα χρησιμοποιήθηκε επίσης σε ένα σύνολο 177 δειγμάτων μελανώματος από κλινική δοκιμή NCT00936221 η οποία αξιολόγησε την αποτελεσματικότητα των selumetinib σε συνδυασμό με δακαρβαζίνη σε σύγκριση με δακαρβαζίνη και μόνο σε ασθενείς πρώτης γραμμής με

BRAF

μετάλλαξη θετικό προχωρημένο δερματικό ή άγνωστη πρωτογενές μελάνωμα [8]. 69/177 (39%) δείγματα ήταν

BRAF

V600E θετική χρήση MALDI-TOF. Αυτό συγκρίνεται πολύ καλά με τα αποτελέσματα από NCT00936221, η οποία πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός συνδυασμού δύο διαφορετικών ARMS δοκιμές που βασίζονται και αλληλούχιση Sanger, το οποίο ανιχνεύεται μεταλλάξεις V600E BRAF σε 69/177 δείγματα. Η συντριπτική πλειοψηφία των δειγμάτων διερευνήθηκαν χρησιμοποιώντας τις δοκιμές όπλων. Δύο δείγματα ήταν

BRAF

μετάλλαξη θετικά με MALDI-TOF και αρνητικά με προσδιορισμό της αλληλουχίας Sanger. Οι φασματογράφους MALDI-TOF έδειξαν ότι αυτές οι μεταλλάξεις ήταν παρόντες κάτω από την ονομαστική ευαισθησία του προσδιορισμού αλληλουχίας Sanger που μπορεί να είναι τόσο υψηλό όπως 20% μεταλλαγμένο DNA σε άγριου τύπου υπόβαθρο. Δύο δείγματα ήταν αρνητικά με MALDI-TOF, αλλά θετικά από ένα τεστ που βασίζεται όπλων. Η δοκιμή ARMS είχε ευαισθησία 2%, η οποία είναι καλύτερη από την ευαισθησία του 5% που καθορίστηκε για τον πίνακα MALDI-TOF (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Συνολικά 21/177 (12%) των δειγμάτων μελανώματος απέτυχε ανάλυση χρησιμοποιώντας είτε ένα τεστ όπλα ή αλληλουχίας Sanger, ενώ η μέθοδος MALDI-TOF ήταν επιτυχής σε όλες τις περιπτώσεις.

NRAS

μεταλλάξεις ανιχνεύθηκαν επίσης σε δείγματα 38/177 (22%) του μελανώματος με χρήση του πίνακα MALDI-TOF. Ως άμεση σύγκριση σε σχέση με τα δεδομένα που παράγονται από ARMS και με αλληλούχιση συλλογικά η MALDI-TOF το συνολικό ποσοστό συμφωνίας ήταν 97% (152/156).

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε η χρησιμότητα της πλατφόρμας Sequenom MassARRAY MALDI-TOF στην ανίχνευση μετάλλαξης σε NSCLC και μελανώματος, σε σύγκριση με την τεχνολογία ARMS που έδειξε ανώτερη ευαισθησία από την άμεση αλληλούχιση σε δείγματα FFPE. Η μέθοδος MALDI-TOF είχαν υψηλότερο ποσοστό επιτυχίας ανάλυση σε δείγματα με χαμηλή απόδοση DNA, πιθανότατα λόγω του μικρότερου μεγέθους αμπλικονίου (~ 80 bp), πολύ κάτω από το μέσο μέγεθος θραύσματος του DNA που μπορεί να ληφθεί από δείγματα FFPE (-200 bp). Προηγούμενες μελέτες έχουν αποδείξει την αναλυτική ευαισθησία της τεχνολογίας Φασματομετρίας Μάζας Sequenom ως 1-10% [21]. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η τεχνολογία MALDI-TOF Sequenom είναι επαρκή ευαισθησία και ειδικότητα που θα χρησιμοποιηθούν για την άμεση θεραπεία για

KRAS

μετάλλαξη θετικούς ασθενείς, σε NSCLC.

Η σημασία των δοκιμών για μεταλλάξεις στο 3 κωδικόνια (G12, G13 και Q61) σε

KRAS

συχνά μεταλλάσσεται σε NSCLC αποδείχθηκε από την ανίχνευση του 13% περισσότερα

KRAS

θετικούς ασθενείς σε αυτή την κλινική ομάδα. Μια μελέτη φάσης ΙΙΙ, SELECT-1, (NCT01933932) είναι σήμερα σε εξέλιξη για να εκτιμηθεί η αποτελεσματικότητα και η ασφάλεια του selumetinib σε συνδυασμό με ντοσεταξέλη στο

KRAS

μετάλλαξη θετικό NSCLC ασθενείς που λαμβάνουν θεραπεία 2ης γραμμής. Σε αυτή τη δοκιμή, οι ασθενείς επιλέγονται με τη χρήση των Cobas

KRAS

Mutation Test (CE /IVD) το οποίο έχει σχεδιαστεί για την ανίχνευση 19 μεταλλάξεων στα κωδικόνια 12, 13 και 61 [22].

Άλλα μεταλλάξεις στο

HRAS

,

NRAS

και

BRAF

ανιχνεύθηκαν επίσης. Δεδομένου ότι αυτές οι μεταλλάξεις έχουν συνδεθεί με την ενεργοποίηση ΜΕΚ, ασθενείς που φέρουν αυτές τις μεταλλάξεις μπορεί επίσης να είναι υποψήφιοι για θεραπεία με έναν αναστολέα ΜΕΚ αν και η σημασία αυτών των μεταλλάξεων σε NSCLC είναι άγνωστος [23] – [25]. Για παράδειγμα, κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα που περιέχουν

NRAS

έχουν μεταλλάξεις αποδειχθεί ότι είναι ευαίσθητη στο selumetinib αναστολέα ΜΕΚ [26].

Τα δεδομένα που δημιουργούνται για

BRAF

V600E μεταλλάξεις στο δείγματα μελανώματος έδειξε επίσης συμφωνία σε 152/156 (97%) των δειγμάτων με όπλα ή αλληλουχίας Sanger αποδεικνύουν την ακρίβεια της μεθόδου MALDI-TOF MS σε

BRAF

μεταλλάξεις V600E. Δερματικό μελάνωμα δείγματα περιέχουν συχνά υψηλές συγκεντρώσεις της μελανίνης η οποία αναστέλλει την PCR. Η επιτυχής ανάλυση των δειγμάτων η οποία απέτυχε χρησιμοποιώντας ARMS κατέδειξε την ικανότητα της μεθόδου MALDI-TOF MS για να δώσει επιτυχώς δεδομένα σε δείγματα μελανώματος.

Μια μελλοντική πρόκληση στην κλινική είναι η πιθανότητα μειωμένης διαθεσιμότητας ιστού λόγω αυξημένης ζήτησης για τη δοκιμή. Διαδοχική δοκιμή αντανακλαστικό των γενετικών ανωμαλιών μπορεί να οδηγήσει στην ανάγκη για περαιτέρω επεμβατικές διαδικασίες βιοψίας που θα μπορούσε να αποφευχθεί σε ορισμένες περιπτώσεις με τη δοκιμή για όλες πληροφοριακοί δείκτες παράλληλα όταν ο ασθενής πρώτα δώρα με NSCLC.

Η αξία της Sequenom πλατφόρμα ήταν ότι χρησιμοποιούνται λιγότερο δείγμα από άλλες μεθόδους? 2 φορές λιγότερο DNA χρησιμοποιήθηκε για γονότυπο 27 φορές όσες θέσεις (82 έναντι 3) σε 14 γονίδια, από ό, τι είχε χρησιμοποιηθεί για τη δοκιμή βραχίονες που εξέτασαν μόνο σε ένα μόνο γονίδιο. Θεωρητικά 2 × 5 μm τομές εκλούεται σε 50 μL θα έχει επαρκές υλικό για το μοριακό χαρακτηρισμό των δειγμάτων στην ομάδα αυτή. Τα δεδομένα στη μελέτη μας δημιουργήθηκε σε 1 εργάσιμη ημέρα που δείχνει ευπείθεια του στην κλινική λαμβάνοντας υπόψη στροφή γύρω απαιτήσεις.

Διαπιστώσαμε μεταλλάξεις ταυτόχρονα με

KRAS

σε 10/52 (19%) των περιπτώσεων. Δύο δείγματα έδειξαν ταυτόχρονη

PIK3CA

μεταλλάξεις με

KRAS

.

PIK3CA

μεταλλάξεις σε συνδυασμό με

KRAS

έχει δειχθεί ότι προσδίδουν ανθεκτικότητα σε αναστολείς ΜΕΚ

in-vivo

[27]. Η ικανότητα να ανιχνεύει ταυτόχρονη μεταλλάξεις θα μπορούσαν να παρέχει πρόσθετο κλινικό όφελος και ενδεχομένως να προσφέρουν μια εικόνα κατάλληλο συνδυασμό προσεγγίσεις στη θεραπεία. Οι αριθμοί των ασθενών σε NCT00890825 με ταυτόχρονη μεταλλάξεις ήταν πολύ μικρή για να παρατηρήσει οποιαδήποτε σχέση με την ανταπόκριση.

Τα στοιχεία μας αποδεικνύουν την πιθανή χρησιμότητα του πίνακα Sequenom MALDI-TOF σε κλινικά δείγματα NSCLC.

Μια πιθανή περιοριστικός παράγοντας στην χρήση των δοκιμών πάνελ, όπως Sequenom στη διαγνωστική ρύθμιση είναι η απαίτηση από τις ρυθμιστικές αρχές για την εκτεταμένη επικύρωση κάθε ανιχνεύσιμη παραλλαγή η οποία δεν είναι πάντα κατ ‘ευθείαν προς τα εμπρός λόγω της διαθεσιμότητας των δειγμάτων για επικύρωση.

Θα πρέπει Σημειώνεται ότι η χρήση αυτής της τεχνολογίας για την ανίχνευση μεταλλάξεων σε ογκοκατασταλτικά γονίδια, όπως

ΤΡ53

και

CDNK2A

θα ήταν μια πρακτική και μη αποτελεσματική χρήση των ιστών λόγω του αριθμού των βάσεων που θα πρέπει να να ανακριθούν. τεχνολογία

Next Generation Sequencing (NGS) μπορεί επίσης να καλύπτει πολλαπλά γονίδια. NGS είναι ιδιαίτερα πλεονεκτική όταν διαλογή γονιδίων που έχουν ανόμοιες μοτίβα μετάλλαξης όπως

ΤΡ53

, και μπορεί να ανιχνεύσει νέα μεταλλάξεων, κάτι επιτυγχάνεται λιγότερο εύκολα στην πλατφόρμα MALDI-TOF. NGS πάνελ γενικά απαιτούν μεγαλύτερη εισροή DNA από αυτό το σύστημα για να επιτρέψουν την παραγωγή αξιοποιήσιμες βιβλιοθήκες αλληλουχίας, και ευαισθησίες μπορεί να περιορίζεται σε περίπου 5%, ανάλογα με τις απαιτήσεις διαβάσει το βάθος και το πλαίσιο ακολουθία. NGS παρουσιάζει επίσης τις δικές της προκλήσεις με τη σειρά του γύρω από το χρόνο και το κόστος για την ανάλυση, επιμέλεια και διαχείριση των δεδομένων.

Σε ένα διαγνωστικό περιβάλλον όπου λίγες μεταλλάξεις είναι γνωστές ενδιαφέρον για στοχευμένες θεραπείες, όπως σε NSCLC, Sequenom MALDI-TOF έχει ένα σαφές πλεονέκτημα έναντι των μεθόδων άμεση αλληλούχιση λόγω αποδείξει τη χρησιμότητά της στην προέρχεται FFPE DNA, γρήγορη στροφή γύρω από το χρόνο, μέτρια απαιτήσεις αποθήκευσης δεδομένων και την ελάχιστη απαίτηση ανάλυσης των χρηστών.

Εν κατακλείδι, η προσέγγιση Sequenom MALDI-TOF σε μετάλλαξη προφίλ είναι μια αποτελεσματική και ενημερωτική χρήση των δειγμάτων των ασθενών. Δείχνει συγκρίσιμη ευαισθησία και καλή συμφωνία με ένα καθιερωμένο εξαιρετικά ευαίσθητο

KRAS

ΟΠΛΑ δοκιμών, όταν χρησιμοποιείται σε δείγματα NSCLC, με την ικανότητα να εντοπίσει ένα ευρύτερο φάσμα των μεταλλάξεων, χρησιμοποιώντας λιγότερη ιστού. Η ταυτόχρονη προφίλ μετάλλαξη σε δείγματα NSCLC FFPE θα μπορούσε να ενημερώσει τη στρατηγική της θεραπείας που χρησιμοποιούν οι κλινικοί γιατροί σε ατομική βάση για κάθε ασθενή.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1.

Όλες οι μεταλλάξεις που ανιχνεύονται από το προσαρμοσμένο πίνακα MALDI-TOF, με δείγμα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0100566.s001

(XLSX)