Αφηρημένο

Η διεγερτική NKG2D υποδοχέων σε λεμφοκύτταρα προωθεί όγκου ανοσοποιητικό επιτήρησης με τη στόχευση συνδέτες επιλεκτικά που προκαλείται σε καρκινικά κύτταρα . Προωθώντας όγκων εξουδετέρωση χρησιμοποιώντας τακτικές για να απενεργοποιήσετε NKG2D λεμφοκυττάρων. Αυτή η αρνητική δυναμική κλιμακώνεται ως κάποια ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα συν-opt έκφραση NKG2D, δεδομένου ότι συμπληρώνει την παρουσία των συνδετήρων για αυτόνομη διέγερση των ογκογόνων σηματοδότησης. Κλινικά δεδομένα σύνδεσης υποδηλώνουν σχέσεις μεταξύ των καρκινικών κυττάρων NKG2D και μεταστατική νόσο. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι NKG2D προωθεί καρκινικών κυττάρων πλαστικότητα με επαγωγή των φαινοτυπικών, μοριακή και λειτουργική υπογραφές διαγνωστικών της μετάβασης επιθηλιακά-μεσεγχυματικά, καθώς και τα χαρακτηριστικά του στελέχους-όπως

μέσω

επαγωγή της SOX9, ένας βασικός ρυθμιστής της μεταγραφής του μαστού βλαστικών κυττάρων συντήρησης. Τα ευρήματα αυτά που λαμβάνονται με τις γραμμές όγκων μοντέλο του μαστού και xenotransplants ήταν ανακεφαλαιώνει από

ex

vivo

καρκινικών κυττάρων από πρωτογενείς διηθητικά καρκινώματα μαστού. Έτσι, NKG2D μπορεί να έχουν την ικανότητα να οδηγούν υψηλό χαρακτηριστικά κακοήθειας υποκείμενη μεταστατική νόσο

Παράθεση:. Cai Χ, Dai Ζ, Reeves RS, Caballero-Μπενίτεθ Α, Duran KL, Delrow JJ, et al. (2014) Αυτόνομη Διέγερση του Cancer Cell Πλαστικότητας από το Human NKG2D λεμφοκυττάρων Receptor συνεκφράζονται με τους συνδέτες του σε καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 9 (10): e108942. doi: 10.1371 /journal.pone.0108942

Συντάκτης: Eric Vivier, INSERM- CNRS- Παν. Méditerranée, Γαλλία

Ελήφθη: May 16, 2014? Αποδεκτές: 27 Αύγ 2014? Δημοσιεύθηκε: 7 Οκτωβρίου 2014

Copyright: © 2014 Cai et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά στοιχεία (εκτός από τα δεδομένα μικροσυστοιχιών – βλέπε παρακάτω) είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και. δεδομένων των μικροσυστοιχιών είναι διαθέσιμα σε https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/υπό τον κωδικό ένταξη GSE53961

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας P50 επιχορήγησης CA083636 και Εθνικά Ινστιτούτα επιχορήγηση για την υγεία R01 CA174470. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

πλαστικότητα των κυττάρων του καρκίνου συνεπάγεται την ανάπτυξη των χαρακτηριστικών που επιτρέπει στα καρκινικά κύτταρα να αποσυνδεθεί από το πρωτοπαθούς όγκου, τη διάδοση και την επέκταση κλωνικά σε απομακρυσμένες περιοχές. Αυτή η διαδικασία ρυθμίζεται από την επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης (ΕΜΤ) και την αλληλένδετων απόκτηση της αναγεννητικής καρκίνο βλαστικών κυττάρων (CSC) αποδίδει [1], [2]. Γνωστά οδηγοί καρκινικών κυττάρων πλαστικότητα περιλαμβάνουν heterotypic νύξεις από σχετιζόμενο με τον όγκο στρωματικών ή /και τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος [1]. Έχουμε ήδη εντοπιστεί μια αντισυμβατική αλληλεπίδραση ομοτυπικό υποδοχέα-συνδετήρα επί καρκινικών κυττάρων [3] και να δείξει εδώ ότι συνισταμένη σηματοδότηση προκαλεί επαναπρογραμματισμό προς μεταναστευτικών και το στέλεχος-όπως ικανότητες.

Ο υποδοχέας που εμπλέκονται, NKG2D (φυσικών φονικών ομάδα 2 μέλος D ), είναι μια ενεργοποίηση των υποδοχέων λεμφοκυττάρων, κυρίως στα κύτταρα ΝΚ και CD8 Τ κύτταρα και είναι περισσότερο γνωστή για την μεσολάβηση του ανοσοποιητικού επιτήρηση μολυσμένα με ιούς και κακοήθη κύτταρα [4]. Ανθρώπινα NKG2D σήματα

μέσω

η DAP 10 (πρωτεΐνη DNAX-ενεργοποίησης 10) μετασχηματιστή, η οποία συνδέεται είτε PI3K (φωσφοϊνοσιτίδη 3-κινάσης) ή Grb2 (αύξηση υποδοχέα-δεσμευμένη πρωτεΐνη παράγοντας 2), ενεργοποιώντας έτσι PKB /AKT (πρωτεΐνη κινάση Β) ή ΜΑΡ (ενεργοποιημένη από μιτογόνο πρωτεΐνης) κινάσης καταρράκτες [5]. Συνδέτες για NKG2D σε ανθρώπους περιλαμβάνουν MICA και MICB (MHC τάξης Ι συνδέονται με αλυσίδες Α και Β) και έξι μέλη της οικογένειας ULBP (UL-16 πρωτεΐνη δέσμευσης) [6]. NKG2D συνδέτες απουσιάζουν σε μεγάλο βαθμό από την επιφάνεια των φυσιολογικών κυττάρων, αλλά μπορεί να προκληθεί με την ογκογένεση σχετιζόμενη αποκρίσεις στρες στα καρκινικά κύτταρα [7]. Αυτή η έκφραση επιλεκτικό συνδέτη επιτρέπει ΝΚ κύτταρα και CD8 Τ κύτταρα να στοχεύουν τα καρκινικά κύτταρα, τουλάχιστον στα αρχικά στάδια του όγκου πριν ανοσοκατασταλτική τακτική της προόδου όγκων καταπνίξει αυτό το σκέλος της ανοσολογικής απόκρισης [4], [8].

Εκτός από την αντιμετώπιση ανοσολογικές αντιδράσεις, μερικές καρκινικά κύτταρα συν-επιλέξουν NKG2D για δικό τους όφελος, συμπληρώνοντας την παρουσία των υποκαταστατών της για την αυτο-διέγερση των ογκογένεση [3]. Μεταβλητή αναλογίες του μαστού, των ωοθηκών, του προστάτη και του καρκίνου του παχέος εντέρου εκφράζουν κύτταρα σηματοδότησης ικανός σύμπλοκα NKG2D-DAP 10, τα οποία ενεργοποιούν την ΡΙ3Κ-ΑΚΤ-mTOR (στόχος της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά) άξονα σηματοδότησης και κατάντη επενεργητές. Επιπλέον, όπως σε λεμφοκύτταρα, NKG2D-DAP 10 διεγείρει φωσφορυλίωση ERK (εξωκυτταρικό σήμα ρυθμίζεται κινάση) και JNK σε καταρράκτες κινάσης ΜΑΡ [3]. Παθοφυσιολογική σημασία της NKG2D-DAP 10 σηματοδότηση υποστηρίζεται από μια κλινική μελέτη ένωση που ιδρύθηκε θετικές συσχετίσεις μεταξύ των ποσοστών των καρκινικών κυττάρων με την επιφάνεια NKG2D και το μέγεθος του όγκου και την εξάπλωση [3]. Αυτές οι σχέσεις επεκτάθηκαν με σημαντικές συσχετίσεις με μετάσταση στους λεμφαδένες, και συσχετίσεις τάση με το βαθμό και lymphovascular εισβολή, προτείνοντας αποτελέσματα NKG2D-DAP 10 στο σχηματισμό διάδοση των καρκινικών κυττάρων και τη μετάσταση [3]. Η παρούσα μελέτη εξετάζει την ικανότητα της NKG2D-DAP 10 για την προώθηση των καρκινικών κυττάρων πλαστικότητα υποκείμενη μεταστατική νόσο.

Αποτελέσματα

Πρόκληση EMT επαναπρογραμματισμού με διέγερση με συνδέτη του NKG2D

γραμμές όγκου Επιθηλιακός τυπικά εκφράζουν NKG2D προσδέματα αλλά είναι είτε αρνητικά για υποδοχέα NKG2D-DAP 10 ή, όπως με την MCF-7, ΒΤ-20, και MDA-MB-453 γραμμές καρκίνου του μαστού, μόλις και μετά βίας θετική όπως αντανακλάται από την ελάχιστη μετατοπίσεις κυτταρομετρίας ροής προφίλ και πολύ χαμηλή NKG2D και DAP 10 mRNA και η έκφραση της πρωτεΐνης (Σχήμα S1A και S1B? αναφέρονται επίσης στο Σχήμα 2Β και Σχήμα 2C στις παραπομπές 3 και 9, αντίστοιχα). Αυτή η σπανιότητα του υποδοχέα σε γραμμές όγκου είναι σε αντίθεση με τη σχετική αφθονία, τόσο από mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης, σε θετικές

ex

vivo

καρκινικά κύτταρα (Σχήμα S1c-Ε? Ανατρέξτε επίσης στην εικόνα 1C -Ε στην παραπομπή 3). Για να δοκιμαστεί σε ένα

σε

vitro

μοντέλο αν NKG2D επάγει EMT, μπορούμε έτσι εξετάστηκαν MCF-7 κύτταρα που διαμολύνθηκαν σταθερά με NKG2D-DAP 10 (MCF-7-TF κύτταρα) οδηγεί σε επιφάνεια έκφραση σε επίπεδα παρόμοια με

ex

vivo

καρκινικά κύτταρα (σύγκρινε Σχήμα S1c και Εικόνα S1F). Με μικροσκοπία αντίθεσης φάσης, τα κύτταρα MCF-7-TF που εμφανίζεται μορφολογικές μεταμορφώσεις σε σύγκριση με ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα ελέγχου, που επέδειξε σφικτά συγκεντρωμένα πλακόστρωτο σχημάτων που μοιάζουν. Τα κύτταρα MCF-7-TF, σε αντίθεση, εμφανίζονται μοιάζουν με ινοβλάστες μορφολογίες (Εικόνα 1Α). Οι αλλαγές αυτές οφείλονταν σε έκτοπη έκφραση της NKG2D-DAP 10 ως το πατρικό φαινότυπο αποκαταστάθηκε με ανασυνδυασμένη φακοϊό μεσολάβηση RNAi στόχευση NKG2D σε κύτταρα MCF-7-TF-ΚΟ (Σχήμα 1Α? Για κυτταρομετρία ροής προφίλ αυτών μοντέλου γραμμών βλέπε Σχήμα S1A και S1F). Οι παρατηρήσεις αυτές πρότειναν ότι ο συνδέτης μεσολάβηση διέγερση NKG2D οδήγησε σε επαγωγή του ΕΜΤ, η οποία περιλαμβάνει τη συντονισμένη μοριακές και κυτταρικές αλλαγές που οδηγούν σε απώλεια της πρόσφυσης επιθηλιακών κυττάρων-κυττάρων, την πολικότητα, και την ακεραιότητα του κυτταροσκελετού, ταυτόχρονα με την απόκτηση των μεσεγχυματικών υπογραφών πρωτεΐνης, άξονας-κυττάρου σχήματα, και επεμβατική και μεταναστευτικών ικανότητες [10], [11]. Διαγνωστικά του ΕΜΤ είναι μειωμένη έκφραση του κυττάρου διασταύρωση σχετιζόμενη Ε-καδερίνης, και επαγωγή Ν-καντερίνης και της κυτταροσκελετική ενδιάμεσου νηματίου βιμεντίνης. Με μικροσκοπία ανοσοφθορισμού, τα κύτταρα MCF-7-TF που εμφανίζεται αυτές τις αλλαγές σε επιθηλιακά και μεσεγχυματικά πρωτεΐνες δείκτες, οι οποίες αντιστραφεί με RNAi στόχευση του NKG2D (Σχήμα 1Α). Αντίστοιχες αποτελέσματα ελήφθησαν με ανοσοστύπωμα και προφίλ RT-PCR (Σχήμα 1Β). Επέκταση των δεδομένων σε επιπλέον πρωτεΐνες δείκτες και τα αντίστοιχα mRNAs τους, συμπεριλαμβανομένων των επιθηλιακών σφιχτό συνδετική Οοοίιιάεηδ-1 zona (ΖΟ-1) και occludin, κυτοκερατίνη 19 (CK19) και βλεννίνης 1 (MUC1), και ινοβλαστοειδή α-λείου μυός ακτίνη (α α-δΜΑ), απέδωσε σύμφωνο αποτελέσματα (Σχήμα 1Α και 1Β) [12]. EMT είναι ενορχηστρωμένη από τους παράγοντες μεταγραφής που περιλαμβάνουν Snail1 /2, Twist1 /2, Zeb1 /2, και LEF-1 [1]. Επαγωγή του mRNA για το σύνολο των στοιχείων αυτών, εκτός από Zeb1 καταγράφηκε με MCF-7-ΤΡ αλλά όχι τα κύτταρα MCF-7-TF-ΚΟ (Σχήμα 1Β). Προεπώαση MCF-7-ΤΡ κυττάρων με ένα κοκτέιλ αντισωμάτων σε σχετικές NKG2D προσδέματα ανέστειλαν όλα καταγράφονται πρωτεΐνη και τις αλλαγές mRNA, επιβεβαιώνοντας έτσι συνδέτη εμπλοκή (Εικόνα 1Β) [3]. προηγούμενη μελέτη μας με έδρα την απαίτηση της επαφής κυττάρου-κυττάρου για συνδέτη-μεσολαβούμενη διέγερση NKG2D-DAP 10 σηματοδότηση σε καρκινικά κύτταρα [3]. Κατά συνέπεια, όπως φαίνεται με κυτταρομετρία ροής, οι αναλογίες των επιφανειακών Ε-καδερίνης

-. /N-cadherin

+ μεσεγχυματικά κύτταρα MCF-7-ΤΡ συσχετίζεται με συρροή κυτταρικής καλλιέργειας (Σχήμα 1C)

(Α) μικροσκοπία αντίθεσης φάσης δείχνει μετάβαση από επιθηλιακά να ινοβλαστοειδή σχήματα των MCF-7-TF έναντι ψευδο-επιμολυσμένα ελέγχου και φαινοτυπική αναστροφή με MCF-7-TF-KO κύτταρα που εκφράζουν NKG2D RNAi. Με μικροσκοπία ανοσοφθορισμού, τα κύτταρα MCF-7-TF εμφανίζει μειωμένη Ε-καδερίνης, ΖΟ-1, occludin, και MUC1, και επαγόμενη από Ν-καδερίνης και βιμεντίνη. (Β) Αντίστοιχες ανοσοκηλίδας (άνω πλαίσιο) και RT-PCR (μεσαίο πλαίσιο) δεδομένων συμπεριλαμβανομένων των πρόσθετων CK19 και δείκτες α-SMA. Απώλεια των επιθηλιακών και κέρδος των δεικτών μεσεγχυματικών εξασθενεί όταν τα κύτταρα MCF-7-ΤΡ προεπωάστηκε με κοκτέιλ αντίσωμα προς NKG2D συνδετήρες. Κάτω πάνελ δείχνει ΕΜΤ-σχετιζόμενους παράγοντες μεταγραφής προφίλ RT-PCR των MCF-7-TF και γραμμές ελέγχου και εξασθένηση της απώλειας και κέρδους εκδηλώσεις συγκαλύπτοντας αντίσωμα NKG2D συνδετήρων. (Γ) Η κυτταρομετρία ροής των MCF-7 που προέρχονται από τις γραμμές αναπτύχθηκαν σε χαμηλή ή υψηλή συμβολή για Ε-καδερίνη και Ν-cadherin. Οι αριθμοί σε τεταρτημόρια δείχνουν κυττάρων αναλογίες τοις εκατό. Σημειώστε ότι αυτή η ανίχνευση είναι πιο ευαίσθητη, τότε η διαδικασία που χρησιμοποιείται στο (Α). (D) Παραδειγματικά δεδομένα που δείχνουν αυξημένο

σε

vitro

μετανάστευση και εισβολή από MCF-7-TF έναντι ψευδο-διαμολυσμένα αρνητικού ελέγχου και τα κύτταρα MCF-7-TF-KO. Παρουσία των αντι-συνδετήρα κοκτέιλ αντίσωμα αντιστρέφει τα κέρδη κινητικότητα. Οι αριθμοί δείχνουν μετρήσεις κυττάρων σε τυχαία επιλεγμένα μικροσκοπικά πεδία. (Ε) Γραφική απεικόνιση των δεδομένων κινητικότητος με μπάρες αντιπροσωπεύουν μέσες αριθμούς κυττάρων (+/- SD) που προέρχονται από τρία ανεξάρτητα πειράματα με κάθε τέσσερις μικροσκοπικές μετρήσεις πεδίου. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν

σ

6, και ΒΤ12), οι αναλογίες των μεσεγχυματικών (E-cadherin

-Ν-cadherin

+) κυττάρων ήταν σημαντικά μεγαλύτερη μεταξύ NKG2D

+ CD45

– EpCAM

χαμηλά σε σύγκριση με NKG2D

+ CD45

-EpCAM

υψηλής κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι EpCAM ρύθμιση προς τα κάτω μπορεί να συμβεί αργά στη διαδικασία EMT (Σχήμα 4Β και 4Γ). Συνολικά, οι παρατηρήσεις αυτές επιβεβαιώνονται οι διαπιστώσεις που έγιναν με τις σειρές μοντέλων όγκου, υποστηρίζοντας εξέχοντα ρόλο της NKG2D ως φυσικό ενεργοποιητή της EMT στον καρκίνο. Αυτό είναι συνεπές με το γεγονός ότι ο NKG2D

+ κύτταρα αποτελούσαν ουσιαστικό αναλογίες όταν καταγράφονται ως τοις εκατό των συνολικών υβριδικών και δείκτη μεσεγχυματικών κυττάρων προφίλ-θετικά (Πίνακας S1). Όλα τα 12 καρκινικών κυττάρων αναστολές περιείχε διάφορες αναλογίες των CD45

-EpCAM

– κύτταρα που έλειπε E-cadherin και N-cadherin και ως εκ τούτου δεν θα μπορούσε να ανατεθεί σε ένα συγκεκριμένο τύπο κυττάρων. Με την εξαίρεση των τεσσάρων δειγμάτων όγκου (BT2, BT3, BT11, και ΒΤ12), NKG2D

+ κύτταρα απουσίαζαν μεταξύ αυτών των πληθυσμών.

NKG2D προκαλεί EMT σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος όγκου

Συμπληρωματικά απόδειξη για ένα ρόλο του NKG2D σε ΕΜΤ ελήφθη από όγκους που προέρχονται από SUM149PT-ΤΡ ή κύτταρα αρνητικού ελέγχου ορθοτοπικά ξενο-μεταμόσχευσις σε μαστικά λιπώδη σώματα NOD /ποντίκια SCID, ένα πείραμα μοντέλο που συνέβαλε στην ίδρυση NKG2D γνώμονα ογκογονικότητα [9]. Πιο άμεση

in vivo

στοιχεία δεν ήταν εφικτό αφού αυθόρμητη ή καρκινογόνο που προκαλείται από καρκίνους στα ποντίκια δεν έχουν NKG2D έκφρασης [3]. Η γραμμή SUM149PT είναι φαινοτυπικά ετερογενή, που φιλοξενούν σημαντικές υποσύνολα των κυττάρων με μεσεγχυματικά προφίλ δείκτη [14]. Ως εκ τούτου, η ανοσοϊστοχημεία μπορεί να δημιουργήσει δυσκολίες στην αξιολόγηση της EMT που σχετίζονται με τις αλλαγές. Εξέταση του ξενομοσχεύματος κυτταρικών αιωρημάτων που προέρχονται από όγκους με κυτταρομετρία ροής εκτεθεί έντονα αυξημένη αναπαραστάσεις των υβριδικών /μεσεγχυματικών φαινοτύπων σε όλες τις πέντε NKG2D

+ SUM149PT-ΤΡ σε αντίθεση με NKG2D

– ψευδο όγκους ελέγχου (Σχήμα 5). EMT-συνδέονται μεταναστευτική δραστηριότητα των κυττάρων ξένο μόσχευμα SUM149PT-TF μπορεί να συνέβαλαν στην αυξημένη διάδοση των καρκινικών κυττάρων που παρατηρήθηκε προηγουμένως σε αυτό το ζωικό μοντέλο [9].

Τα κυτταρικά εναιωρήματα από όγκους που προέρχονται από ποντίκια με ανοσοανεπάρκεια ορθοτοπικώς ξενομοσχεύτηκε με καρκίνο του μαστού SUM149PT- τα κύτταρα TF (άνω γράφημα bar) έντονα λοξή προς την υβριδική E-cadherin

+ /N-cadherin

+ και περαιτέρω μεταβεί E-cadherin

– /Ν-cadherin

+ φαινοτύπων σε σύγκριση με τον έλεγχο όγκοι ψευδο-επιμολυσμένα SUM149PT κυττάρων (κάτω γράφημα bar). E

+ N

-, E

+ N

+, και Ε

-Ν

+ ανατρέξτε στο E-cadherin και N-cadherin κατάσταση? MID, τον αριθμό μητρώου του ποντικιού.

Η

Διδασκαλία της βλαστική ικανότητα επαναπρογραμματισμού από NKG2D

Εκτός από την ανάθεση των μεταναστευτικών ικανότητες, η μεταγραφή EMT παράγοντες Snail1 και Twist ρυθμίζουν προφίλ δείκτη επιφάνειας που ορίζουν οι πληθυσμοί των καρκινικών κυττάρων του μαστού εμπλουτισμένα για κύτταρα με χαρακτηριστικά στέλεχος που μοιάζει με [22] – [24]. Σε συνέπεια με την επαγωγή της Snail1 και Twist, έκτοπη έκφραση NKG2D-DAP 10 (συστατική ή Dox επαγόμενη) συνδέθηκε με τον καρκίνο του μαστού των βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με CD24

– /CD44

+ προφίλ μετατοπίσεις στην MCF-7-TF , MCF-10AT-TF και γραμμές SUM149PT-ΤΡ (Σχήμα 6Α) [22], [25]. Ωστόσο, μόνο ένα μικρό κλάσμα των κυττάρων με CSC-όπως φαινότυποι χαρακτηρίζονται ως λειτουργικές ΚΕΠ [2]. Περισσότερα σχετικά με EMT-βλαστική ικανότητα συσχετισμών μπορεί να είναι το γεγονός ότι οι παράγοντες μεταγραφής EMT, όπως Snail2 ή Zeb1, σε συνεργασία με ξεχωριστό γενετικό κυκλωματικούς, ρυθμίζει επίσης λειτουργικές καταστάσεις του μαστού CSC [2], [26] – [28]. Με μικροσυστοιχία προφίλ γονιδιακής έκφρασης, ταυτοποιήσαμε μια εξέχουσα επαγωγή του παράγοντα μεταγραφής SOX9 σε MCF-7-ΤΡ σε σύγκριση με ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα ελέγχου (βλέπε δεδομένα μικροσυστοιχιών στη διεύθυνση http: //www.ncbi.nlm.nih/geo/under προσχώρηση κωδικός GSE53961), η οποία επιβεβαιώθηκε ανεξάρτητα με ποσοτική RT-PCR και ανοσοστύπωμα (Σχήμα 6Β και 6C).

(Α) κυτταρομετρία ροής δύο χρωμάτων των προτύπων /CD44 CD24 σε σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα MCF-7-TF και SUM149PT-TF, και Dox-επαγόμενη μεταγωγή κύτταρα MCF-10AT-TF (όλα φαίνονται με κόκκινο χρώμα) σε σύγκριση με τους αρνητικούς μάρτυρες (εμφανίζεται σε μπλε χρώμα). Χρωματιστά αριθμούς σε τεταρτημόρια δείχνουν αντίστοιχο κελί αναλογίες τοις εκατό. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών πειραμάτων. (Β) Ποσοτική RT-PCR του SOX9 στην MCF-7 και MCF-10AT προερχόμενο γραμμές μοντέλο. Πειραματικά γραμμές δεδομένων αντιπροσωπεύουν φορές-αυξήσεις πάνω από τα δεδομένα αρνητικού ελέγχου ορίζεται σε ένα. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν

σ

& lt? 0.005. (C) αντίστοιχα στοιχεία ανοσοαποτύπωση για SOX9 και τον έλεγχο της ακτίνης. (D) μικρογραφίες αντίθεσης φάσης του mammospheres σχηματίζονται από MCF-7-TF και επαγόμενη MCF-10AT-TF έναντι αρνητικού γραμμές ελέγχου. Μπαρ γράφημα στο δεξιά (γκρι ράβδοι) συνοψίζει τα δεδομένα ως αριθμός organoids (& gt? Διαμέτρου 100 μm) μετρήθηκαν σε τρία σετ των τριπλών φρεατίων κάθε σπάρθηκε με 10

3 κύτταρα MCF-7-ΤΡ. Μαύρες μπάρες αντιπροσωπεύουν πειράματα που έγιναν με κύτταρα MCF-7-TF υπό τις ίδιες συνθήκες με την παρουσία των αναστολέων της PI3K (LY294002), παν-ΑΚΤ (AKTV), ΜΕΚ1 /2 (U0126), ή JNK (SP600125). Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. DMSO εξυπηρετεί τον έλεγχο ως διαλύτης. (Ε, F) Όπως στο (D), με κύτταρα MCF-7-TF που εκφράζουν SOX9 ή Snail2 RNAi ή scrRNAi ελέγχους. (G) μικρογραφίες αντίθεσης φάσης των μεσεγχυματικών έναντι επιθηλιακών κυττάρων μορφολογίες των κυτταρικών σειρών που παρουσιάζονται σε (Ε, F). (H) Γραφική απεικόνιση των αναλογιών της SOX9

+ /Snail2

+ κυττάρων μεταξύ NKG2D θετική ή αρνητική CD45

-EpCAM

+

ex vivo

καρκινικών κυττάρων του μαστού (δείγματα Bt 13 έως BT18) καθορίζεται από multi χρώμα κυτταρομετρία ροής.

η

SOX9 δρα συνεργατικά με Snail2 (Slug) και σε μικρότερο βαθμό Snail1 ως κύριος ρυθμιστής της κατάστασης του μαστού βλαστικών κυττάρων [28]. Έτσι, με τη ρύθμιση θετικά SOX9 επιπροσθέτως Snail2 και Snail1 (βλέπε Σχήμα 1Β), NKG2D μπορεί να έχουν την ικανότητα να προωθούν λειτουργική βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με χαρακτηριστικά. Αυτή η αντίληψη υποστηρίχθηκε από τρισδιάστατο Matrigel οργανοειδή πολιτισμών και κλασική δοκιμασίες mammosphere. Σε αμφότερους τους τύπους πειραμάτων, τα κύτταρα MCF-7-TF σχηματίζονται πολυάριθμα μεγάλα (& gt? 100 μm) organoids ενώ ψευδο-επιμολυσμένα ελέγχου ή κύτταρα MCF-7-TF-KO δημιουργείται μόνο λίγες συστάδες κυττάρων που ήταν τυπικά μικρά (Σχήμα 6D). Όπως και με EMT επαναπρογραμματισμό, σχηματισμός οργανοειδή εξαρτιόταν από την PI3K-AKT χωρίς εμφανή συμμετοχή του ΕΚΚ ή JNK (Σχήμα 6D). Αντίστοιχες ενδείξεις για την ικανότητα του να επάγει NKG2D SOX9 και σχηματισμός οργανοειδούς ελήφθη με Dox-επαγόμενα κύτταρα MCF10AT-ΤΡ (Εικόνα 6Β-D).

SOX9 και Snail2 απαιτούνται αμφότερες για επιθηλιακά κύτταρα του μαστού να εισέλθουν και σταθερώς διατηρεί ένα λειτουργικό κράτος βλαστικών κυττάρων [28]. Κατά συνέπεια, μεσολάβηση RNAi εξάντληση των SOX9, και χωριστά από Snail2, ακύρωσε τον σχηματισμό οργανοειδή σε καλλιέργειες mammosphere MCF-7-TF [Εικόνα 6Ε και 6F). Σε αντίθεση με Snail2, η οποία πιστεύεται ότι συμβάλλουν στην βλαστικών κυττάρων επαγωγής

μέσω

ενεργοποίηση ενός EMT, οι επιπτώσεις της SOX9 στα EMT επαναπρογραμματισμό θεωρούνται ήσσονος σημασίας [28]. Κατά συνέπεια, ΕΜΤ-σχετίζεται μορφολογικές μεταβολές των κυττάρων MCF-7-ΤΡ ήταν έτσι αναστρέφεται από μεσολάβηση RNAi εξάντληση των Snail2 αλλά όχι από SOX9 (Σχήμα 6G).

Το καθοριστικό χαρακτηριστικό της βαθύτατης καρκίνος πλαστικότητας κυττάρων είναι αποτελεσματική τους την έναρξη του όγκου κατά την ξενομεταμόσχευση σε ποντικούς με ανοσοανεπάρκεια. νωρίτερα μοντέλο ποντικού μελέτη μας έδειξε σημαντικά μειωμένη λανθάνουσες και αυξημένη συχνότητα εμφάνισης όγκου με μεταμοσχεύεται ορθοτοπικά MCF-7-TF έναντι γραμμών ελέγχου [9]. Τα εν λόγω αποτελέσματα είναι συνεπή με NKG2D μεσολάβηση επαγωγή της SOX9 και Snail2 και συνακόλουθα την απόκτηση των ικανοτήτων CSC. Αυτή η επαγωγή παρέχεται επίσης μια εξήγηση για την παρατηρούμενη αυξημένη την έναρξη του όγκου από κύτταρα μη επιμολυσμένα MCF-7 που εκφράζουν ελάχιστη ενδογενή NKG2D (Σχήμα 1G? Για κυτταρομετρία ροής προφίλ της γονικής MCF-7, MCF-7-NKG2DRNAi και γραμμές MCF-7-scrRNAi βλέπε Εικόνα S1 Α και S1G) [9]. Να εξετάσει για ενδιαφέρον σε ανθρώπινους καρκίνους,

ex vivo

καρκινικά κύτταρα από έξι πρωτογενή επεμβατική δείγματα καρκίνου του μαστού (Bt 13 έως BT18) ελέγχθηκαν για συσχετίσεις μεταξύ NKG2D και SOX9 και Snail2 από πολυχρωματικά κυτταρομετρία ροής. Σε όλους τους όγκους, τις αναλογίες των CD45

-EpCAM

+ κύτταρα συν-εκφράζουν SOX9 και Snail2 ήταν σημαντικά μεγαλύτερη μεταξύ NKG2D

+ σε σύγκριση με NKG2D

– κυττάρων (Σχήμα 6Η). Συνολικά, τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζουν ογκογόνο σημασία της NKG2D

μέσω

Sox9- και Snail2 μεσολάβηση επαγωγή της CSC χαρακτηριστικά.

Συζήτηση

Υψηλή πλαστικότητα καρκινικά κύτταρα θεωρούνται κύριοι ένοχοι των όγκων διάδοση και ριμπάουντ μετά από συμβατική θεραπεία του καρκίνου [2], [29]. Η παρούσα μελέτη δείχνει ότι η συν-επέλεξε την έκφραση του, και τη σηματοδότηση από, NKG2D σε καρκινικά κύτταρα προάγει την πλαστικότητα των κυττάρων του καρκίνου με τη διαφοροποίηση προς φαινοτύπους μεσεγχυματικά και διάδοση-δυνατότητα και τις ικανότητες του όγκου έναρξη της έρευνας. Φυσιολογική σημασία υποστηρίζεται από την ανακεφαλαίωση των EMT και SOX9 υπογραφές που έχουν εγγραφεί με το μοντέλο γραμμές όγκου από πρωτογενείς διηθητικού καρκίνου του μαστού. Είναι πιθανό ότι ο ρόλος του NKG2D ως οδηγός των καρκινικών κυττάρων πλαστικότητα είναι σε γενικές γραμμές ισχύει, εκτείνεται σε τουλάχιστον των ωοθηκών, του παχέος εντέρου, και τα κύτταρα του καρκινώματος του προστάτη [3].

Η σημασία της EMT, και με συναγωγή βλαστική ικανότητα επαναπρογραμματισμού, στην ανάπτυξη των ανθρώπινων όγκων δεν είναι αμφισβητούμενη [30]. Ωστόσο, πρόσφατες κυτταρομετρία ροής με βάση επιδείξεις των κυκλοφορούντων κυττάρων του όγκου με επιθηλιακά, μεσεγχυματικά, ή υβριδικών υπογραφές, και συνδέονται μετάστασης κίνηση ικανότητες, αποτελούν άμεσες αποδείξεις για ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές πλαστικότητα και παθοφυσιολογική σημασία του [21], [31]. πολυ-παραμετρική ανάλυση μονοκύτταροι μας

ex vivo

αναστολές των καρκινικών κυττάρων επεκτείνει αυτά τα στοιχεία σε καρκίνους του μαστού πρωτοβάθμιας και αποκαλύπτει ότι η μικτή επιθηλιακά /μεσεγχυματικά και μεσεγχυματικά-όπως ο καρκίνος του μαστού κυττάρου φαινοτύπων είναι πιο διαδεδομένες και πιθανώς πιο περίπλοκη από ό, τι τι εθεωρείτο μέχρι σήμερα. Επειδή οι περισσότεροι πληθυσμοί του καρκίνου NKG2D

+ κυττάρων του μαστού που εξετάστηκαν λοξή προς τα υβριδικά και μεσεγχυματικών φαινοτύπων και εκπροσωπείται ουσιαστικές αναλογίες όλων των κυττάρων με αυτά τα στάδια διαφοροποίησης, NKG2D μπορεί πολύ πιθανόν να έχει σημαίνοντα ρόλο στην επαγωγή EMT.