Abstract

Η ενδογενής δ-Νιτροδοθειόλες, συμπεριλαμβανομένων των S-νιτροζογλουταθειόνη (GSNO), μεσολαβούν νιτρικού οξειδίου (ΝΟ) -με βάση σηματοδότηση, φλεγμονώδεις αποκρίσεις, και τη λειτουργία των λείων μυών. έχουν μειώσει τα επίπεδα GSNO ενοχοποιηθεί σε διάφορες ασθένειες του αναπνευστικού, και η αναστολή της GSNO αναγωγάσης, (GSNOR) το κύριο ένζυμο που μεταβολίζει GSNO, αντιπροσωπεύει μία νέα προσέγγιση για τη θεραπεία φλεγμονωδών ασθενειών του πνεύμονα. Πρόσφατα, μια ένωση μεταξύ μειωμένη έκφραση GSNOR και του κινδύνου καρκίνου του πνεύμονα του ανθρώπου προτάθηκε εν μέρει βασίζεται σε ανοσοϊστοχημική χρώση χρησιμοποιώντας πολυκλωνικό αντίσωμα GSNOR. GSNOR είναι ένα ισοένζυμο της οικογένειας αλκοολικής αφυδρογονάσης (ADH), και δείχνουμε ότι το αντίσωμα που χρησιμοποιείται σε αυτές τις μελέτες διασχίζουν αντιδρά ουσιαστικά με άλλες πρωτεΐνες ADH και δεν μπορεί να είναι ένα κατάλληλο αντιδραστήριο. Αξιολογήσαμε συστοιχίες ανθρώπινου καρκίνου του πνεύμονα ιστού χρησιμοποιώντας μονοκλωνικά αντισώματα πολύ ειδικά για την ανθρώπινη GSNOR με ελάχιστη διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με άλλες πρωτεΐνες ADH. Διαπιστώσαμε την παρουσία GSNOR σε ≥85% των δειγμάτων που εξετάστηκαν, και εκτεταμένη ανάλυση των δειγμάτων αυτών δεν έδειξε καμία διαφορά στην έκφραση της πρωτεΐνης GSNOR μεταξύ καρκινικών και φυσιολογικών ιστών του πνεύμονα. Επιπλέον, GSNOR και σε άλλα επίπεδα ADH mRNA αξιολογήθηκαν ποσοτικά σε συστοιχίες cDNA του καρκίνου του πνεύμονα με qPCR. Συνεπής με ανοσοϊστοχημικά ευρήματα μας, τα επίπεδα mRNA GSNOR δεν άλλαξαν σε ιστούς καρκίνου του πνεύμονα, ωστόσο τα επίπεδα έκφρασης άλλων γονιδίων ADH μειώθηκαν. επίπεδα ADH ΙΒ mRNA μειώθηκαν (& gt? 10 φορές) σε 65% των δειγμάτων cDNA καρκίνου του πνεύμονα. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι τα προηγούμενα αποτελέσματα έδειξαν μια λανθασμένη σύνδεση των GSNOR και τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου των πνευμόνων του ανθρώπου, καθώς και μείωση της ADH ΙΒ, παρά GSNOR, συσχετίζεται με τον καρκίνο του πνεύμονος ανθρώπου

Παράθεση:. Mutka SC, Πράσινο LH, Verderber EL, Richards JP, Looker DL, Chlipala ΕΑ, et al. ΙΒ Έκφραση (2012) ADH, αλλά όχι ADH ΙΙΙ, μειώνεται σε Ανθρώπινο Καρκίνο του Πνεύμονα. PLoS ONE 7 (12): e52995. doi: 10.1371 /journal.pone.0052995

Επιμέλεια: Klaus Roemer, του Πανεπιστημίου του Saarland Ιατρική Σχολή, Γερμανία

Ελήφθη: 23η, Οκτωβρίου 2012? Αποδεκτές: 27 του Νοεμβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 28 του Δεκεμβρίου 2012

Copyright: © 2012 Mutka et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. N30 Pharmaceuticals , Inc είναι μια ιδιωτική εταιρεία. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Όλοι οι συγγραφείς εκτός Elizabeth Chlipala είναι ή ήταν υπάλληλοι του N30 Pharmaceuticals, το χρηματοδότη αυτού του μελέτη. Elizabeth Chlipala (Premier Εργαστήριο) πληρώθηκε για να εκτελέσει το έργο ανοσοϊστοχημεία αναφερθεί σε αυτό το χειρόγραφο. N30 Pharma αναπτύσσει μια νέα τάξη τροποποιητικά της νόσου θεραπειών που διατηρούν ενδοκυτταρική GSNO (Snitrosoglutathione), ένα βασικό ρυθμιστή της επισκευής των οργάνων, την αναγέννηση και την επούλωση. Δεν υπάρχουν περαιτέρω διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα στην ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που σχετίζονται με αυτό το χαρτί για να κηρύξει. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

S-νιτροζογλουταθειόνη (GSNO) είναι μια ενδογενούς δότης νιτρικού οξειδίου που χρησιμεύει ως αποθήκη για το μονοξείδιο του αζώτου (ΝΟ) στο σώμα και διαδραματίζει αναπόσπαστο ρόλο στην επικοινωνία ΝΟ μεσολαβεί λειτουργίες σηματοδότησης. έχουν μειωμένα επίπεδα GSNO έχουν συσχετιστεί με μια ποικιλία ασθενειών και την αποκατάσταση του έχει προταθεί ως θεραπευτική προσέγγιση για την κυστική ίνωση [1] και του άσθματος [2], [3]. Η οξειδοαναγωγάση, S-νιτροζογλουταθειόνη αναγωγάση (GSNOR), είναι το κύριο ένζυμο που εμπλέκεται στον καταβολισμό των ενδοκυτταρικών GSNO, και φαρμακολογικές αναστολή του παρέχει ένα θεραπευτικό μηχανισμό για τη διατήρηση ενδοκυτταρικά επίπεδα GSNO. αναστολείς Υψηλής δραστικότητας GSNOR βρίσκονται υπό κλινική ανάπτυξη [4] – [7].

GSNOR, επίσης γνωστή ως ένζυμο κατηγορίας αφυδρογονάσης αλκοόλης III (ADH III) και αφυδρογονάση φορμαλδεΰδης, είναι εξελικτικά το παλαιότερο μέλος της ADH οικογένεια πρωτεϊνών, και όλοι οι άλλοι ADHS πιστεύεται ότι προέρχεται από GSNOR με διπλασιασμό γονιδίου [8], [9]. Στους ανθρώπους, τα ισοένζυμα ADH είναι ομόλογες και δείχνουν έως και 60% ταυτότητα αλληλουχίας αμινοξέων. Επίσης, είναι εξαιρετικά διατηρημένες μεταξύ των ειδών. Αυτή η υψηλή ταυτότητα αλληλουχίας αμινοξέων δημιουργεί προκλήσεις στην ανάπτυξη ειδικών αντισωμάτων για GSNOR. Πολυκλωνικά αντισώματα έχουν χρησιμοποιηθεί σε αρκετές δημοσιεύσεις [3], [10] – [13], και τα μόνα εμπορικώς διαθέσιμα αντισώματα για GSNOR και πολυκλωνικοί. Για παράδειγμα, Marozkina και οι συνεργάτες του χρησιμοποίησαν εμπορικά διαθέσιμα πολύκλωνα αντισώματα κατά της ανθρώπινης GSNOR που να υποδηλώνουν ότι η μειωμένη δραστηριότητα GSNOR από ένα θεραπευτικό αναστολέα GSNOR θα μπορούσε να αφήσει τον πνεύμονα ευάλωτο σε ογκογόνο επιδράσεις από οξειδωτική καταπόνηση [12]. Έχουμε αποδείξει ότι αυτά τα πολύκλωνα αντισώματα δεν έχουν επαρκή εξειδίκευση στο συμπέρασμα ότι το σήμα που παρατηρήθηκε οφειλόταν σε GSNOR όχι άλλα ισοένζυμα ADH. Έχουμε αναπτύξει διάφορα πολύ ειδικά μονοκλωνικά αντισώματα κατά της ανθρώπινης GSNOR και χρησιμοποιήθηκαν αυτά τα αντισώματα για διαλογή συστοιχίες διαφορετικών δειγμάτων καρκινικό και φυσιολογικό ιστό πνεύμονα. Εκτός από την ανοσοϊστοχημεία, έχουμε ποσοτικά μέτρησαν τα επίπεδα mRNA του GSNOR και άλλα ισοένζυμα ADH. Έχουμε αποδείξει ότι το έχουν αναφερθεί στο παρελθόν σήμα παρατηρήθηκε από Marozkina et al. ήταν πιο πιθανό ADH IB και όχι GSNOR. Τα μονοκλωνικά αντισώματα για να GSNOR παρέχουν ένα πιο κατάλληλο εργαλείο για τον χαρακτηρισμό της έκφρασης της πρωτεΐνης GSNOR.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντισώματα και καθαρισμένες πρωτεΐνες

ADH ΙΑ πρωτεΐνη αγοράστηκε από Abnova (Taipei City , την Ταϊβάν, # H00000124-Q01), αλλά κάποια υποβάθμιση σημειώθηκε σε αυτό το παρασκεύασμα. Άλλες πρωτεΐνες που χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη παρασκευάστηκαν για εμάς με Emerald βιολογικών δομών (νησί Bainbridge, WA) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14]. Εν συντομία, GSNOR, ADH ΙΒ, ADH II, και IV ADH εκφράστηκαν με ένα Ν-τερματικό 6 × ετικέτα -ιστιδίνη συγγένεια και μία αλληλουχία Smt-σύντηξης, η οποία απομακρύνθηκε με ULP-1 διάσπασης μετά από χρωματογραφία Νί συγγένειας για να παραχθεί το πλήρους μήκους ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών. Οι κατά προσέγγιση μοριακά βάρη για τις πρωτείνες ADH πριν και μετά την απομάκρυνση της ετικέτας His-Smt είναι: ADH IB (51 kDa, 40 kDa), ADH II (51 kDa, 40 kDa), και ADH IV (53 kDa, 41 kDa) . Η πρωτεΐνη σύντηξης His-Smt-GSNOR είναι περίπου 50 kDa. Τα παρασκευάσματα πρωτεΐνης GSNOR χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή αντισωμάτων επιβεβαιώθηκε με Emerald βιολογικών δομών να είναι πλήρους μήκους με φασματοσκοπία μάζης [4] με ένα μοριακό βάρος από 39,6 κϋβ. Εμείς και άλλοι [15] έδειξαν ότι GSNOR, είτε καθαρισμένο είτε από λύματα ανθρώπινο κύτταρο, μεταναστεύει με συνέπεια ελαφρώς ταχύτερα από ό, τι προβλεπόμενο μοριακό βάρος του σε SDS-PAGE. Ένα πολυκλωνικό αντίσωμα δημιουργήθηκε από ορό αρουραίων που έχουν ανοσοποιηθεί με καθαρισμένο, ανασυνδυασμένο, πλήρους μήκους ανθρώπινη πρωτεΐνη GSNOR στο Biomodels (Watertown, ΜΑ) για N30 Pharmaceuticals. Τρεις διακριτοί μονοκλωνικά αντισώματα για την ανθρώπινη GSNOR (Ν30-C3 αρουραίου αντι-GSNOR, N30-F6 ποντικού αντι-GSNOR, και N30-G11 ποντικού αντι-GSNOR) δημιουργήθηκαν με ανοσοποίηση ποντικών ή αρουραίων με καθαρισμένο, ανασυνδυασμένο, πλήρους μήκους ανθρώπινο GSNOR πρωτεΐνης σε ProMab Βιοτεχνολογίες (Richmond, CA) για N30 Pharmaceuticals. Ορός τίτλος αξιολογήθηκε με ELISA πριν από την επιλογή για υβριδισμό. σύντηξη υβριδώματος με κύτταρα μυελώματος (ProMab Biotechnologies? Richmond, CA) πραγματοποιήθηκε με τα σπληνοκύτταρα από το ποντίκι ή αρουραίο με τον καλύτερο τίτλο. Τα υπερκείμενα από τα φρεάτια υβριδωμάτων υποβλήθηκαν σε διαλογή με ELISA για θετική αντιδραστικότητα για GSNOR. Τα υπερκείμενα επίσης σε διαλογή με ELISA για αντιδραστικότητα αρνητικό για ADH ΙΒ, ADH II και ADH IV. Υπερκείμενο από 10 κλώνους στην συνέχεια προβλήθηκε σε Ν30 Pharmaceuticals με κηλίδα western για ειδικότητα για το ισοένζυμο GSNOR και ελάχιστη μη ειδική πρωτεΐνη πρόσδεσης. Δύο από τους 10 κλώνους τόσο για το ποντίκι και τον αρουραίο επιλέχθηκαν και στη συνέχεια υποκλωνοποιήθηκε στο ProMab με περιοριστική αραίωση. Για τα μονοκλωνικά αντισώματα ποντικού, μία παροχή αντισώματος παρασκευάστηκε με παραγωγή ασκίτη σε 10 ποντικούς, και το αντίσωμα συλλέχθηκε και καθαρίστηκε με χρωματογραφία IgG. Για το μονοκλωνικό αντίσωμα αρουραίου, αντίσωμα παρήχθη in vitro από καλλιέργεια κυττάρων και IgG καθαρίζεται. Πολυκλωνικός αντι-GSNOR αγοράστηκε από Proteintech (Chicago, IL? # 11.051 έως 1-ΑΡ).

GSNOR ανοσοκηλίδωση

Το καθαρισμένο ADH πρωτεΐνες (22,5 ng /φρεάτιο) αναλύθηκαν με SDS- PAGE και ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιώντας το πολυκλωνικό αντίσωμα (Proteintech? αραίωση 1:50 σε τελική συγκέντρωση 1.4 μg /mL) ή μονοκλωνικά αντισώματα (αντι-αρουραίου GSNOR Ν30-C3, 2,4 μg /mL? ποντικού αντι-GSNOR N30-F6 και N30- G11 10 ng /mL). HRP συζευγμένα δευτερογενή αντισώματα (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση.

GSNOR ανοσοϊστοχημεία

Ανοσοϊστοχημική ανάλυση για GSNOR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας σταθεροποιημένο με φορμαλίνη, εγκλεισμένοι σε παραφίνη ανθρώπινο ιστό πνεύμονα μικροσυστοιχίες (Folio Bioscience, Columbus, OH? # ΕΥΧΕΡΕΙΑΣ-HH0178, # ΕΥΧΕΡΕΙΑΣ-HH0176). Πλάκες αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο και επανυδατώθηκαν σε νερό μέσα από μια σειρά βαθμίδων αλκοόλ. Τα πλακίδια υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία σε ένα 95 ° C κιτρικό ρΗ 6,1 αντιγονική διάλυμα ανάκτησης (Dako, Carpinteria, CA). Αφού αφεθούν τα πλακίδια να κρυώσει σε θερμοκρασία δωματίου, ένα διάλυμα 3,0% υπεροξείδιο του υδρογόνου (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ) προστέθηκε για την απόσβεση της ενδογενούς ενεργότητας υπεροξειδάσης. Τα πλακίδια προεπωάστηκαν με ορό ελεύθερη πρωτεΐνη Block (Dako), ακολουθούμενη από επώαση με ένα αντίσωμα GSNOR ή του κατάλληλου μη ειδικό έλεγχο ανοσοσφαιρίνης: έλεγχος IgG αρουραίου (Abd Serotec, Raleigh, NC), το ποντίκι IgG2B (Dako), ή Ig κλάσμα κουνελιού (Dako). Τα πλακίδια επισημάνθηκαν με το αντίσωμα Ν30-C3 στη συνέχεια επωάστηκαν με ανοσοσφαιρίνη αντι αρουραίου κουνελιού (Dako), και όλες οι πλάκες στη συνέχεια επισημαίνεται με ένα αντι-κουνελιού κατσίκας ή αντι πολυμερές ποντικού (Dako). DAB + (Dako) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση, και πλακίδια μετρητής χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη (Dako).

Ανάλυση των επιπέδων του mRNA σε πνευμονικό ιστό

συστοιχίες cDNA κατασκευασμένο από 23 ζεύγη των φυσιολογικών και καρκινικών πνευμονικού ιστού αγοράσθηκαν από ΟηΟεηε (Rockville, MD? # HLRT504, παρτίδα # 0411). Τα ζεύγη που περιλαμβάνονται ιστό καρκίνου του πνεύμονα που καλύπτουν Στάδιο ΙΑ (n = 4), ΙΒ (n = 4), ΙΙΑ (n = 2), ΙΙΒ (n = 8), ΠΙΑ (n = 3), και ΙΙΙΒ (n = 2) κάθε συνδεδεμένο με παρακείμενο φυσιολογικό ιστό. Ένα δείγμα Stage IV ιστού δεν συνδυάζεται με ένα φυσιολογικό δείγμα, και δεν συμπεριελήφθη στην ανάλυση. γονιδιακή έκφραση του GSNOR (ADH III? όνομα του γονιδίου

ADH5

), ADH ΙΒ (γονίδιο

ADHIB

), ADH II (γονίδιο

ADH4

), ADH IV (γονίδιο

ADH7

), και βήτα-ακτίνης ποσοστώθηκε με qPCR χρησιμοποιώντας σύνολα ανιχνευτή TaqMan εκκινητή (Applied Biosystems, Carlsbad, CA): Ανθρώπινα Β-ακτίνης (Hs00357333_g1), Ανθρώπινο GSNOR (Hs00605185_m1), Ανθρώπινο ADH ΙΒ (Hs00605175_m1) , Ανθρώπινα ADH II (Hs00923466_m1), και την Ανθρώπινη ADH IV (Hs00609447_m1). Ποσοτική PCR (qPCR) εκτελέστηκε με ένα όργανο ΑΒΙ 7300 RT PCR (Applied Biosystems) χρησιμοποιώντας Perfecta qPCR fastmix (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε 1 κύκλο στους 95 ° C για 3 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους στους 95 ° C για 15 sec και 60 ° C για 1 λεπτό. Για την ανάλυση των δεδομένων, συγκριτικές τιμές κύκλου κατωφλίου (C

t) για βήτα-ακτίνη χρησιμοποιήθηκαν για την εξομάλυνση των διακυμάνσεων φόρτωση και υπολογίζει ΔΟ

t τιμές. ΔΔC

t τιμές υπολογίστηκαν με την αφαίρεση του ΔΟ

t αξία για τον έλεγχο (φυσιολογικό) ιστό από το ΔΟ

t αξία για την αντιστοιχισμένη ιστό όγκου. ΔΔC

t τιμές μετατράπηκαν σε διπλώστε διαφορές χρησιμοποιώντας τον τύπο 2

-ΔΔCt.

Αποτελέσματα

Εμπορική πολυκλωνικό GSNOR αντισώματος διασταυρούμενης αντιδρά με άλλες πρωτεΐνες ADH

Πρόσφατες εργασίες εξέταση GSNOR στον καρκίνο του ανθρώπινου πνεύμονα [12] χρησιμοποιούνται ανοσοϊστοχημική χρώση δειγμάτων ανθρώπινου καρκίνου του πνεύμονα με ένα εμπορικά διαθέσιμο πολυκλωνικό αντίσωμα GSNOR (βλέπε υλικά και μέθοδοι). Επειδή η αλληλουχία πρωτεΐνης του GSNOR είναι εντόνως διατηρημένη με άλλα ισοένζυμα ADH, προσδιορίσαμε εξειδίκευση του για GSNOR σε σχέση με την ιδιαιτερότητά του προς άλλα ADHS. Η διασταυρούμενη αντιδραστικότητα εξετάσθηκε με ανοσοστύπωμα χρησιμοποιώντας καθαρισμένο ανθρώπινο ανασυνδυασμένο GSNOR (ADH III), ADH ΙΑ, ΙΒ ADH, ADH II, και /ή ADH IV. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, μια ευρέως χρησιμοποιούμενη εμπορική πολυκλωνικό αντίσωμα έντονα αντιδρά διασταυρωτά με άλλες πρωτεΐνες ADH, ιδιαίτερα ADH ΙΒ, ADH II, και ADH IV. Δοκιμάσαμε και άλλα εμπορικά διαθέσιμα πολυκλωνικά αντισώματα και ένα in-house παρασκευάζεται πολυκλωνικό αρουραίου GSNOR αντίσωμα και βρέθηκαν όλα πολυκλωνικά αντισώματα δοκιμάστηκαν επίσης έντονα διασταυρούμενη αντίδραση με πρωτεΐνες ADH (δεδομένα που δεν δείχνονται και Σχήμα 1Β). Για την αντιμετώπιση αυτού του ζητήματος, μονοκλωνικά αντισώματα ειδικά για GSNOR αναπτύχθηκαν με ανοσοποίηση ποντικών και αρουραίων με καθαρισμένη, πλήρους μήκους, ανασυνδυασμένη ανθρώπινη GSNOR όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Η προσπάθεια αυτή περιλαμβάνει επίσης ένα βήμα αντι-διαλογής για την ελαχιστοποίηση διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με άλλες πρωτεΐνες ADH. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, τρία από τα νέα μονοκλωνικά αντισώματα εναντίον GSNOR είτε έχουν σημαντικά μειωμένη ή καθόλου διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με άλλες πρωτεΐνες ADH. Απ ‘όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη χαρτί για να περιγράφουν αντισώματα με αυτό το επίπεδο εξειδίκευσης προς GSNOR.

22,5 ng καθαρισμένες ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE, και ανοσοστυπώματα εκτελέσθηκαν για προσδιορισμό αντιδραστικότητας αντισώματος προς GSNOR, ADH ΙΑ, ΙΒ ADH, ADH II, και ADH IV. Με την εξαίρεση της ADH ΙΑ, οι καθαρισμένες ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες παρήχθησαν με μια ετικέτα πρωτεΐνη σύντηξης κατά τη διάρκεια της κλωνοποίησης, και η ετικέτα αποσχίζεται κατά την διάρκεια καθαρισμού, όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Τα μοριακά βάρη των πρωτεϊνών σύντηξης είναι περίπου 50-51 kDa, και οι τελικές, καθαρισμένες πρωτεΐνες είναι 39-41 kDa. Ανθρώπινα GSNOR μεταναστεύει συνεχώς ταχύτερα από το υπολογισθέν μοριακό βάρος. Όπως φαίνεται από την παρουσία και των δύο ζωνών 50 και 40 kDa για ADH II, το μεγαλύτερο μέρος της πρωτεΐνης σε αυτό το παρασκεύασμα περιέχει ακόμη την ετικέτα πρωτεΐνη σύντηξης. Ωστόσο, το καθαρισμένο GSNOR πρωτεΐνη που χρησιμοποιείται για ανοσοποίηση επιβεβαιώθηκε να είναι πλήρους μήκους, και χωρίς επιπλέον αλληλουχία tag όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Α) αντίσωμα GSNOR εμπορικά διαθέσιμο πολυκλωνικό κουνελιού (Proteintech # 11051-1-ΑΡ). Β) Στο σπίτι-πολυκλωνικό αντίσωμα που παράγεται από την ανοσοποίηση των αρουραίων με καθαρισμένη, ανασυνδυασμένη, πλήρους μήκους ανθρώπινο GSNOR πρωτεΐνη σε Biomodels (Watertown, ΜΑ) για N30 φαρμακευτικά προϊόντα.

Η

καθαρισμένες ανασυνδυασμένες πρωτείνες διαχωρίστηκαν με SDS- PAGE και ανοσοαποτυπώματα διεξήχθησαν για να προσδιοριστεί η δραστικότητα των αντισωμάτων να GSNOR, ADH ΙΒ, ADH II, και ADH IV. Τρεις ανεξάρτητες μονοκλωνικά αντισώματα ελέγχθηκαν: Α) αντι-GSNOR N30-F6 ποντίκι? Β) N30-G11 αντι-GSNOR? C) N30-C3 αρουραίου αντι-GSNOR.

Η

Τα μονοκλωνικά αντισώματα GSNOR ανιχνευθεί έκφραση σε μια ευρεία ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων του πνεύμονα

Εξετάσαμε τα επίπεδα πρωτεΐνης GSNOR σε διάφορους ιστούς του καρκίνου του πνεύμονα με ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας τις ανωτέρω περιγραφείσες τρεις GSNOR-ειδικά μονοκλωνικά αντισώματα και συγκρίθηκαν το μοτίβο χρώσης ιστού στο εμπορικά διαθέσιμο πολυκλωνικό αντίσωμα που χρησιμοποιείται σε προηγούμενη δημοσίευση [12]. Συγκρίναμε επίσης το σήμα αντισώματος σε φυσιολογικό ιστό πνεύμονα. Χρησιμοποιώντας τα τέσσερα αντισώματα, εμείς βάφονται τέσσερα πανομοιότυπα μικροσυστοιχίες ιστό ανθρώπινου καρκίνου του πνεύμονα που το καθένα περιέχει ανθρώπινο πυρήνες ιστού από πάνω από 100 περιπτώσεις καρκίνου του πνεύμονα σε διάφορα στάδια της εξέλιξης. GSNOR έντονα ανιχνεύθηκε σε φυσιολογικό ανθρώπινο ιστό πνεύμονα συμπεριλαμβανομένων βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα, κυψελιδικά μακροφάγα, και τύπου 2 πνευμονοκύτταρα σε κυψελίδες (Σχήμα 3). GSNOR ανιχνεύθηκε επίσης σε μία ευρεία ποικιλία ιστών καρκίνου του πνεύμονα συμπεριλαμβανομένου του αδενοκαρκινώματος, καρκινώματος πλακωδών κυττάρων, θηλώδες αδενοκαρκίνωμα, και καρκίνωμα μεγάλου κυττάρου όταν ιστοί υπέστησαν χρώση με τα μονοκλωνικά αντισώματα GSNOR (Σχήμα 4, N30-C3, Ν30-F6, N30-G11 ). Χρώση της πνευμονικής καρκινικούς ιστούς ήταν πιο αμυδρά όταν το πολυκλωνικό αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε (Σχήμα 4, 11051 – 1-ΑΡ). Τομές ιστού βαθμολογήθηκαν από τρεις σχολιαστές για χρώση GSNOR για κάθε αντίσωμα (Πίνακας 1). Χρησιμοποιώντας τις τρεις ειδικά μονοκλωνικά αντισώματα, τα επίπεδα πρωτεΐνης GSNOR δεν ήταν διαφορετικές σε δείγματα καρκίνου του πνεύμονα σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό? ενώ το πολυκλωνικό αντίσωμα με αποδεδειγμένη διασταυρούμενη αντιδραστικότητα ADH πρότεινε ότι η έκφραση GSNOR ήταν υψηλότερη σε φυσιολογικό πνευμονικό ιστό.

Κανονικό μικροσυστοιχίες ιστού ανθρώπινου πνεύμονος βάφτηκαν με Ν30-C3 μονοκλωνικό αντίσωμα GSNOR (1 μg /mL) που ακολουθείται από ανίχνευση DAB . Βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα, κυψελιδικά μακροφάγα, και τύπου 2 πνευμονοκύτταρα σε κυψελίδες είναι έντονα χρωματισμένο.

Η

Κανονική μικροσυστοιχίες ιστό ανθρώπινου καρκίνου του πνεύμονα βάφτηκαν με μονοκλωνικά αντισώματα GSNOR (Ν30-C3, N30-F6, N30-G11 ) ή ένα εμπορικά διαθέσιμο πολυκλωνικό αντίσωμα GSNOR (11.051 – 1-ΑΡ) που ακολουθείται από ανίχνευση DAB. Διάφορες ανθρώπινο πνεύμονα καρκινικούς ιστούς βάφονται έντονα από τα τρία μονοκλωνικά αντισώματα GSNOR, αλλά χρώσης είναι λιγότερο σημαντικό όταν χρησιμοποιείται η μη-ειδικό πολυκλωνικό αντίσωμα GSNOR.

Η

επίπεδα GSNOR mRNA δεν μειώθηκε το ανθρώπινο ιστό καρκίνου του πνεύμονα σε σχέση με παρακείμενο φυσιολογικό ιστό

Λόγω της πιθανότητας για την υποκειμενικότητα στη χρώση ταξινόμησης ιστού, GSNOR και τα επίπεδα ADH mRNA αξιολογήθηκαν ποσοτικά σε συστοιχίες cDNA ανθρώπινου καρκίνου του πνεύμονα. Εμπορικά διαθέσιμα συστοιχίες cDNA (βλέπε υλικά και μέθοδοι) χρησιμοποιήθηκαν που περιείχε 23 ζεύγη του φυσιολογικού και καρκινικού ιστού πνεύμονος. Τα ζεύγη περιλαμβάνονται Στάδιο ΙΑ (n = 4), ΙΒ (n = 4), ΙΙΑ (n = 2), ΙΙΒ (n = 8), ΠΙΑ (n = 3), και ΙΙΙΒ (n = 2) σε ιστούς καρκίνου του πνεύμονα κάθε σε συνδυασμό με παρακείμενο φυσιολογικό ιστό. επίπεδα GSNOR mRNA ποσοτικοποιούνται με την χρησιμοποίηση qPCR, και σχετικές ποσότητες των GSNOR σε όγκο έναντι παρακείμενο φυσιολογικό ιστό υπολογίστηκαν όπως περιγράφεται στις συμπληρωματικές μεθόδους. Δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης GSNOR mRNA και καρκίνο του πνεύμονα. Σε αυτή την ανάλυση, 11 από 23 δείγματα όγκων είχαν σχέση όγκου /φυσιολογικό αναλογίες έκφρασης & lt? 1 και 12, της 23ης δείγματα είχαν αναλογίες έκφρασης & gt? 1. Επιπλέον, η απόδειξη της δραματικά μειωμένης έκφρασης GSNOR ήταν σπάνια στα δείγματα δοκιμής με καρκίνο του πνεύμονα? μόνο 3 από τα δείγματα όγκου βρέθηκαν με έκφραση GSNOR μειώθηκε κατά περισσότερο από 3-φορές (αναλογία & lt? 0,33? Σχήμα 5). Αντιστρόφως, όταν η έκφραση του ADH ΙΒ, ADH II, και IV ADH αναλύθηκε, περισσότερα από τα δείγματα που επέδειξε μεγαλύτερη έκφραση μειώνεται στα δείγματα όγκου σε σύγκριση με GSNOR. Επιπλέον, παρατηρήσαμε σημαντικές μειώσεις στην έκφραση ADH ΙΒ σε ιστούς του καρκίνου του πνεύμονα, με 12 από 23 ζεύγη που έχουν ≥10 φορές μείωση της έκφρασης ADH IB στα δείγματα καρκίνου του πνεύμονα (κανονική αναλογία σε σχέση όγκου /έκφραση ≤0.1). Μόνο 3 από 23 ζεύγη είχαν αυξημένη έκφραση του ADH IB στα δείγματα καρκίνου του πνεύμονα σε σύγκριση με τον παρακείμενο φυσιολογικό ιστό (Εικόνα 5).

GSNOR (όνομα γονίδιο

ADH5

), ADH ΙΒ (

ADHIB

), ADH II (

ADH4

), και ADH IV (

ADH7

) επίπεδα mRNA εκτιμήθηκαν από qPCR σε συστοιχίες cDNA ανθρώπινου καρκίνου του πνεύμονα (ΟηΟεηε, # HLRT504, παρτίδα # 0411, Rockville, MD) και κανονικοποιημένα επίπεδα σε β-ακτίνη. Συστοιχίες περιείχε 23 ζεύγη του φυσιολογικού και καρκινικού ιστού πνεύμονος. έκφραση όγκου σε σχέση με το φυσιολογικό δείγμα συμφωνημένα υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ΔΔCt. Σχετική ποσότητες & lt? 1 αντιπροσωπεύουν μειωμένη έκφραση στο δείγμα όγκου. Lung δειγμάτων καρκίνου περιλαμβάνονται Στάδιο ΙΑ (n = 4), ΙΒ (n = 4), ΙΙΑ (n = 2), ΙΙΒ (n = 8), ΠΙΑ (n = 3), και ΙΙΙΒ (n = 2) με κάθε δείγμα σε συνδυασμό με παρακείμενο φυσιολογικό ιστό. Αριθ συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων του mRNA GSNOR και τον καρκίνο του πνεύμονα παρατηρήθηκε, ενώ η έκφραση του ADH ΙΒ μειώθηκε ισχυρά σε δείγματα καρκίνου του πνεύμονα.

Η

Συζήτηση

Στον πνεύμονα, η ενδογενής S-Νιτροδοθειόλες συμπεριλαμβανομένων GSNO μεσολαβούν NO-based σηματοδότηση, φλεγμονώδεις αποκρίσεις, και τη λειτουργία των λείων μυών. Αναστολή της GSNOR αντιπροσωπεύει μια νέα προσέγγιση για τη θεραπεία αναπνευστικής νόσου μέσω διατήρησης ενδογενή GSNO, και ένας νέος αναστολέας GSNOR είναι προς το παρόν σε κλινική ανάπτυξη για τη θεραπεία του άσθματος και της κυστικής ίνωσης. [4]

Στην παρούσα μελέτη, δείχνουμε καμία συνεπής διαφορές στην έκφραση του GSNOR κατά τη σύγκριση των ιστών του καρκίνου του πνεύμονα σε κανονικό πνευμονικό ιστό. Τα ευρήματα αυτά έρχονται σε αντίθεση με προηγουμένως δημοσιευμένο έργο από Marozkina και οι συνεργάτες του [12], ο οποίος ανέφερε ότι η έκφραση GSNOR μειώθηκε σε ιστούς του καρκίνου του πνεύμονα. Στην ανάλυσή τους, οι συγγραφείς παρατήρησαν ότι το 69% του ανθρώπινου βιοψίες καρκίνου του πνεύμονα, έδειξαν μειωμένη σημαντικά τα επίπεδα GSNOR. Στην αξιολόγησή τους, τα επίπεδα GSNOR ήταν σημαντικά χαμηλότερα σε όγκους προχωρημένο στάδιο σε σύγκριση με τους όγκους πρώιμο στάδιο, και κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι η μειωμένη δραστηριότητα GSNOR συσχετίζεται με προχωρημένα στάδια της συντήρησης των όγκων. Είναι πιθανό ότι ένας πρωταρχικός ασυμφωνία μεταξύ έκθεσή μας και τις προηγούμενες εκθέσεις πηγάζει από την έλλειψη ειδικότητας των πολυκλωνικών αντισωμάτων που χρησιμοποιούνται στην ανάλυση τους. Δείξαμε ότι το πολυκλωνικό αντίσωμα αντιδρά έντονα σταυροειδώς με άλλες, στενά συναφείς πρωτείνες, συμπεριλαμβανομένων ADHIB, ADH II, και ADH IV. Στην πραγματικότητα, έχουμε διαπιστώσει ότι κάθε πολύκλωνο αντίσωμα που έχουμε δοκιμαστεί πάσχει από την ίδια έλλειψη εξειδίκευσης, και τα συμπεράσματα σχετικά με την έκφραση GSNOR και εντοπισμού που προέρχονται από πειράματα χρησιμοποιώντας πολύκλωνα αντισώματα έχουν μεγάλες δυνατότητες να παρερμηνευθεί. Η έλλειψη εξειδίκευσης σε πολύκλωνα αντισώματα δεν είναι περίεργο δεδομένου του υψηλού ταυτότητα αλληλουχίας μεταξύ GSNOR και άλλα ισοένζυμα ADH. Κατά την ανάπτυξη ενός μονοκλωνικού αντισώματος προς GSNOR, βρήκαμε ότι είναι απαραίτητο να αντι-οθόνη οι κλώνοι κατά πολλών άλλων καθαρισμένων πρωτεϊνών ADH να ληφθεί η απαιτούμενη ειδικότητα. Χρησιμοποιώντας GSNOR ειδικά μονοκλωνικά αντισώματα, βρήκαμε καμία διαφορά στην κηλίδωση των καρκινικών έναντι κανονικών πνευμονικού ιστού.

Επιπλέον, ερευνήσαμε την έκφραση όχι μόνο GSNOR αλλά και άλλα ADHS σε ιστό καρκίνου του πνεύμονα χρησιμοποιώντας πιο οριστική μεθόδους qPCR. Δεν παρατηρήθηκε μεταβολή στην έκφραση του mRNA GSNOR μεταξύ φυσιολογικού και καρκινικού ιστού πνεύμονος. Αντιστρόφως, όταν αναλύθηκαν έκφραση του ADH ΙΒ, ADH II, και IV ADH, είδαμε περισσότερα και μεγαλύτερα έκφραση μειώνεται στα δείγματα του όγκου. Επιπλέον, παρατηρήσαμε σημαντικές μειώσεις στην έκφραση ADH ΙΒ σε ιστούς του καρκίνου του πνεύμονα με 12 από 23 ζεύγη που έχουν ≥10 φορές μείωση της έκφρασης ADH IB στα δείγματα καρκίνου του πνεύμονα (κανονική αναλογία σε σχέση όγκου /έκφραση ≤0.1).

Η έκφραση ADH ΙΒ δείχνει κάποια σχέση με τον καρκίνο του πνεύμονα, δεν αποτελεί έκπληξη. ADH ΙΒ είναι αναπόσπαστο σε έναν αριθμό οδών με γνωστή επίδραση στον καρκίνο του πνεύμονα, συμπεριλαμβανομένων των λιπαρών οξέων, ρετινόλη και το μεταβολισμό της τυροσίνης, καθώς επίσης και στη γλυκόλυση και γλυκονεογένεση [16]. Σε μια μετα-ανάλυση των δημοσιευμένων μελετών για τη σχέση της ADH ΙΒ στον καρκίνο του πνεύμονα, η έκφραση ADH ΙΒ μειώθηκε στον καρκίνο του πνεύμονα σε ένα συντριπτικό αριθμό των δειγμάτων και την ανάλυση [16] και σαφώς πολυμορφισμοί του ADH ΙΒ έδειξαν συσχετίσεις με άλλους τύπους του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του οισοφάγου [17]. Σε αντίθεση με ADH ΙΒ όπου υπήρξε σημαντική έρευνα στη σχέση του με τον καρκίνο, τα επίπεδα έκφρασης GSNOR έχουν πρόσφατα προταθεί ότι συσχετίζονται με ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [13]. Οι μελέτες αυτές εν μέρει επικαλείται ποντίκια knock-out GSNOR που έχουν σημαντική φαινοτυπική διαφορές σε σύγκριση με ελέγχους άγριου τύπου, και πρόσφατες μελέτες από το εργαστήριο μας έχουν δείξει αυτό οποιαδήποτε υποτιθέμενη σχέση μεταξύ των γενετικών διαγραφή GSNOR και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα δεν έχει δει σε ένα μοντέλο haplosufficient (GRJ και Δ Colagiovanni, χειρόγραφο σε προετοιμασία, N30 Pharmaceuticals).

Εν κατακλείδι, φαίνεται ότι η μείωση των ADH ΙΒ, παρά GSNOR, συσχετίζεται με τον καρκίνο του πνεύμονος ανθρώπου, και το έχει ήδη αναφερθεί αποτελέσματα έδειξαν μια λανθασμένη σύνδεση των GSNOR και τον κίνδυνο ανθρώπινου καρκίνου του πνεύμονα. Σε περαιτέρω στήριξη του συμπεράσματος αυτού, δημοσιεύονται μελέτες των ποντικών με ομόζυγο γενετικό διαγραφή GSNOR έχουν βρει καμία αύξηση στον καρκίνο του πνεύμονα ποντικού και στις δύο ανεπεξέργαστων GSNOR

– /- ποντίκια, ούτε GSNOR

– /- ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με το diethylnitrosamine καρκινογόνο [13]. Έτσι, η έκφραση GSNOR και η αναστολή δεν φαίνεται να σχετίζεται με τον κίνδυνο καρκίνου του πνεύμονα ανθρώπου.

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς ευχαριστήσω Ross Benik για την τεχνική βοήθεια με χρώση ιστού.