Αφηρημένο

Μια σειρά νέων ανθρακενίου L-rhamnopyranosides ενώσεις σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν και αντι-πολλαπλασιαστικές τις δραστηριότητές τους στην καρκινικών κυττάρων γραμμές ερευνήθηκαν. Βρήκαμε ότι ένα παράγωγο S-8 (ΕΜ-ά-Rha) ισχυρά ανέστειλε κύτταρο πολλαπλασιασμού ενός πάνελ διαφορετικών καρκινικών κυτταρικών γραμμών ανθρώπινης συμπεριλαμβανομένων Α549, HepG2, OVCAR-3, κυτταρικές σειρές SGC-790 HeLa και Κ562 και, και εμφανίζονται IC50 τιμές σε χαμηλό μικρο-μοριακή εύρη, τα οποία είναι δέκα πτυχώσεις πιο αποτελεσματική από εμοδίνη. Επιπλέον, βρήκαμε ΕΜ-d-Rha (3-(2”,3”-Di-O-acetyl-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-2’,3’-di-

O

-acetyl-α-L-rhamnopyranosyl)-emodin) ουσιαστικά επαγόμενη κυτταρική απόπτωση HepG2 και OVCAR-3 κύτταρα στο πρώιμο στάδιο της ανάπτυξης. Επιπλέον, ΕΜ-ά-Rha οδήγησε στη μείωση του μιτοχονδριακού διαμεμβρανικού δυναμικού, και επάνω ρυθμισμένη η ρητή κυττάρων απόπτωση παράγοντες σε μια συγκέντρωση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Τα αποτελέσματα έδειξαν το EM-d-Rha μπορεί να αναστέλλει την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων HepG2 μέσω της οδού της επαγωγής απόπτωσης, και η πιθανή μοριακός μηχανισμός μπορεί να οφείλεται στην ενεργοποίηση της εγγενούς αποπτωτικό μονοπάτι σήματος

Παράθεση:. Xing JY, Τραγούδι Gp, Ντενγκ Jp, Jiang Lz, Xiong P, Yang Bj, et al. (2015) Αντικαρκινική Επιδράσεις και Μηχανισμός Μυθιστόρημα Emodin ραμνοζίδιο Παραγώγων εναντίον ανθρώπινων κυττάρων του καρκίνου

In Vitro

. PLoS ONE 10 (12): e0144781. doi: 10.1371 /journal.pone.0144781

Επιμέλεια: Gautam Sethi, Yong Loo Lin Ιατρική Σχολή, Εθνικό Πανεπιστήμιο της Σιγκαπούρης, Σιγκαπούρη

Ελήφθη: 30 Ιουλίου 2015? Αποδεκτές: 22 του Νοέμβρη του 2015? Δημοσιεύθηκε: 18 Δεκεμβρίου 2015

Copyright: © 2015 Xing et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή υποστηρίχθηκε από το μεγάλο πρόγραμμα της Επιστήμης και Τεχνολογίας Πρόγραμμα της Guangzhou (PX, 11C32100704), την Κίνα, την Έρευνα έργο της Κινέζικης Ιατρικής Διοίκησης της επαρχίας Γκουανγκντόνγκ (px, 2010276), την Κίνα και το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών για Νέους (GPS & amp? pX, B020602), Κίνα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Emodin (3-μεθυλ-1, 6, 8-trihydroxyanthraquinone) (Σχήμα 1), ένα ευρέως διαδεδομένο ανθρακινόνης, προέρχεται από τις ρίζες και ριζώματα του

Rheum palmatum L

., και άλλοι φυτά, όπως

Polygonum

,

Rhamnaceae

,

ψυχανθών

, και

Liliaceae

. Εμοδίνη είναι ένα σημαντικό συστατικό των κινεζικών βοτάνων και δομικά παρόμοια με ανθρακυκλίνη. Έχει την ίδια τρικυκλικό σκελετό επίπεδο χρωμοφόρο όπως ορισμένα αντιβιοτικά κατά του όγκου, όπως νταουνορουμπικίνη και μιτοξανθρόνη οποία μπορεί να παρεμβάλλονται DNA των καρκινικών κυττάρων. Η αντικαρκινική δράση της εμοδίνης έχει τεκμηριωθεί καλά. Απεδείχθη ότι εμοδίνη κατέχουν αντιπολλαπλασιαστική, πρόληψη του καρκίνου της μετάστασης [1-3], ευαισθητοποιώντας τα καρκινικά κύτταρα στην ακτινοθεραπεία και χημειοθεραπευτικούς παράγοντες [4-6], αντι-αγγειογενετική ανθεκτικές [7, 8] και αναστροφής πολυφαρμάκου (MDR) των καρκινικών κυττάρων [ ,,,0],9]. Έχει επιβεβαιωθεί ότι εμοδίνη είναι ένας ανασταλτικός παράγοντας ευρέος φάσματος των καρκινικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένης της λευχαιμίας [10, 11], ο καρκίνος του πνεύμονα [12-14], την ανθρώπινη γλώσσα καρκίνο πλακωδών [15, 16], καρκίνος του παχέος εντέρου [17, 18] , καρκίνος της χοληδόχου κύστης [19-21], παγκρεατικό καρκίνο [22-24], του καρκίνου του μαστού [25-27], του τραχήλου της μήτρας καρκίνου στον άνθρωπο [28] και τα κύτταρα ηπατικό καρκίνωμα [29-31]. Τα αντικαρκινικά μηχανισμούς εμοδίνης ενεπλάκησαν σε πολλές βιολογικές οδούς [32-34], όπως κινάση της καζεΐνης Ⅱand ERK1 /2. Ωστόσο, εμοδίνη είναι ένας ανικανοποίητος χημειοθεραπευτικό παράγοντα για τον καρκίνο που οφείλεται σε ανεπάρκεια του στην βιοδραστικότητα, σχετικά φτωχή βιοδιαθεσιμότητα και τοξικότητα in vivo. Παρά το γεγονός αυτό, εμοδίνη, ως φυσική ένωση, παρέχουν εξαιρετική βάση για την ανάπτυξη νέων χημειοπροφύλαξη και χημειοθεραπευτικών παραγόντων έναντι καρκίνων (Σχήμα 1). Από πιθανών υποψηφίων από φυσικά προϊόντα θεωρήθηκαν ως μία από τις πιο παραγωγικές στρατηγικές στην τρέχουσα ανακάλυψη και ανάπτυξη [35] φαρμάκου.

Η

Μέχρι τώρα, οι διαρθρωτικές τροποποίηση εμοδίνης κυρίως αφορούσε την μετατροπή της πλευρικής αλυσίδας , συμπεριλαμβανομένων των μεθύλιο, υδροξύλιο και το τμήμα δακτυλίου αρυλίου. Στην πραγματικότητα, δείχθηκε ότι η εισαγωγή πλευρικών αλυσίδων όπως polymethyleneamine, ζάχαρη ή ετερόκυκλο να εμοδίνη μπορεί ενισχυμένη αντικαρκινική δραστικότητα [36-38]. Επιπλέον, τα άλλα επιτυγχάνονται μέσω της εισαγωγής παράγωγα αμινομάδες και γλυκοσιδικούς δεσμούς έδειξε επίσης υψηλότερη αντικαρκινική δράση [39-41]. Εμοδίνης παράγωγο γλυκοσίδιο έχουν απομονωθεί από το

R

.

nepalensis

,

Rhamnaceae

φυτά [42],

Ραμνούντα frangula L

. [43] και

Rumex japonicus Houtt

. [44]. Μερικά φυσικά παράγωγα γλυκοζίτη εμοδίνη, όπως

frangulin Β

και

2

,

3-δι-O-acetylfrangulin Α

[45-47], έδειξαν σημαντικά υψηλότερη δραστικότητα κατά του όγκου από εμοδίνης. Οι μελέτες αυτές έδειξαν ότι η προσθήκη των αλυσίδων σακχάρου στη θέση C3-ΟΗ επί μόριο εμοδίνη αυξημένη όχι μόνο η διαλυτότητα της, αλλά και σημαντικά βελτιωμένη αντικαρκινική δραστικότητα του [46]. Μέχρι στιγμής, ωστόσο, η έρευνα σχετικά με εμοδίνης παράγωγα τροποποιήσεις γλυκοζυλίωσης είναι σπάνια. Πρόσφατα, έχουμε συντεθεί μία σειρά νέων ανθρακενίου L-rhamnopyranosides παράγωγα εμοδίνης συνδέοντας L-rhamnopyranosides σε ένα επίπεδο αρωματικό μόριο (Σχήμα 2) [48]. Σε αυτή τη μελέτη, σε διαλογή και να αναλυθούν τα αποτελέσματα κατά του όγκου όλων των παραγώγων. Βρήκαμε μια ένωση, ΕΜ-d-Rha, αναστέλλουν ισχυρά την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, τα οποία ήταν σχεδόν δέκα πτυχώσεις ισχυρότερη από εμοδίνη. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε περαιτέρω την αντιπολλαπλασιαστική δραστικότητα του ΕΜ-d-Rha επί των καρκινικών κυττάρων, και διερευνηθεί ο μηχανισμός δράσης του ΕΜ-d-Rha αναστέλλουν την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων HepG2.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Emodin παράγωγα συντίθενται

Η σύνθεση των ενώσεων στόχου S-2, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9 ήταν η ίδια όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Σχήμα 2) [48].

οι κυτταρικές σειρές και τα χημικά αντιδραστήρια

Ανθρώπινο πνευμονικό καρκίνο Α549, ανθρώπινα ηπατικό καρκίνωμα HepG2, Human καρκίνο του μαστού MCF-7 , ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη PC-3, Human καρκίνο του τραχήλου HeLa, Human χρόνιας μυελοειδούς λευχαιμίας Κ562, Human γαστρικό καρκίνο SCG-7901, Madin-Darby Canine Kidney κυττάρων (MDCK), η ανθρώπινη φυσιολογική ηπατικών κυττάρων L02 και Ανθρωπίνων καρκίνου των ωοθηκών OVCAR-3 κύτταρα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). Όλα εκτός από τα κύτταρα Κ562 λευχαιμίας καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε υγρασία ελεγχόμενη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO2 σε Τροποποιημένο κατά Dulbecco Eagle μέσο συμπληρωμένο με διττανθρακικό νάτριο (2,2%, β /ο), L-γλουταμίνη (0,03%, β /ο), πενικιλλίνη (100 μg /mL), στρεπτομυκίνη (100 μg /mL), και βόειο εμβρυϊκό ορό (FBS, 10%). λευχαιμικά κύτταρα Κ562 καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 πλήρες μέσο συμπληρωμένο με 10% FBS.

Η σισπλατίνη (

Tokyo Chemical Industry Co

.

LTD

), HCPT (

SHAANXI Sciphar Φυσικά Προϊόντα Co

.

Ltd

), διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO,

MP Biomedicals LLC

), ορό εμβρύου μόσχου (FBS, Hyclone, USA), ϋυΐββοοο Modified Eagle Medium ( DMEM,

Ηγοίοηε

,

Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

), RPMI Media 1640 (

Ηγοίοηε

,

Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

), πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη διπλό αντιβιοτικό (

SIGMA -ALDRICH

), 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ,

Sigma-Aldrich

), 0,25% θρυψίνη-ΕϋΤΑ (

Gibco

,

Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

), Τρυπάνης κυάνωση (

Sigma-Aldrich

), Hoechst 33342 διαλύματος χρώσης (

Pik ημέρες Ινστιτούτο Βιοτεχνολογίας

,

JiangSu

), απόπτωση-DNA κιτ σκάλα εκχύλισης (

Pik ημέρες Ινστιτούτο Βιοτεχνολογίας

,

JiangSu

), ανίχνευση αννεξίνης απόπτωση Kit V-F1IC /7-AAD (

BD Pharmagen Η εταιρεία

,

Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

), PI /RNase διαλύματος χρώσης (

BD Pharmagen εταιρείας

,

Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

), EZNA

TM ολικό RNA Kit II (

ΩΜΕΓΑ

), M-MLV Reverase μεταγραφάσης (

Promega

), dNTP (

Promega

), ολίγο (

Promega

), GoTaq®qPCR Master Mix (

Promega

).

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων και η βιωσιμότητα των κυττάρων δοκιμασία

Η βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων εκτιμήθηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ. Εν συντομία, τα κύτταρα εμβολιάστηκαν σε πλάκες καλλιέργειας των 96 φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

4 /φρεάτιο με πλήρες μέσο που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου σε τελικό όγκο 0,2 mL. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για τουλάχιστον 24 ώρες για να επιτραπεί η βέλτιστη προσκόλληση. Όταν τα κύτταρα έφθασαν 60% συρροή, αυτά υποβλήθηκαν σε θεραπεία με σισπλατίνη, HCPT και εμοδίνη rhamnopyranosides παράγωγα σε διάφορες συγκεντρώσεις και επωάστηκαν σε μια υγρασία ελεγχόμενη 5% CO

2 επωαστήρα στους 37 ° C για 72 ώρες. Μέσο ανταλλάχθηκαν μία φορά κάθε 24 ώρες. ομάδα ελέγχου κυττάρων και κενό ομάδας είχαν συσταθεί με τον ίδιο τρόπο, με κάθε ομάδα έχει έξι παράλληλες φρεάτια. Η κυτταρική επιβίωση αξιολογήθηκε με άμεση προσθήκη 22 μL από 5 mg /ml ΜΤΤ σε 0,2 mL μέσου. Μετά από τρεις ώρες, το ίζημα φορμαζάνης διαλύθηκε σε 200μL ισοπροπανόλη ανά φρεάτιο, και εντελώς αναμιγνύονται υπό θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, η οπτική πυκνότητα εκάστου φρεατίου ανιχνεύθηκε στα 570 nm μήκος κύματος με iMark αναγνώστη μικροπλάκας (

Bio-rad

,

ΗΠΑ

). Αυτό το πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές.

Η μορφολογική ανάλυση

για μορφολογική παρατήρηση, κύτταρα HepG2 σε λογαριθμική φάση ανάπτυξης σπάρθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων στην πυκνότητα του 1 χ 10

4 /φρεάτιο με 0,2 ml πλήρους θρεπτικού μέσου που περιείχε 10% ορό εμβρύου μόσχου. Τα κύτταρα αφέθηκαν να προσκολληθούν στους 37 ° C για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΕΜ-d-Rha και HCPT σε μια συγκεκριμένη συγκέντρωση. Κάθε ομάδα έχει έξι παράλληλες πηγάδια. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε υγροποιημένο 5% CO2 επωαστή στους 37 ° C για 72 ώρες. Μέσο ανταλλάχθηκαν μία φορά κάθε 24 ώρες. Μετά από 48 ώρες, τα κράτη της ανάπτυξης και μορφολογικές αλλαγές των κυττάρων HepG2 παρατηρήθηκαν με ανεστραμμένο μικροσκόπιο (

Nikon

,

Ιαπωνία

).

δοκιμασίας μικροσκόπιο φθορισμού

HepG

2 κύτταρα εμβολιάστηκαν εις διπλούν σε 3 × 10

5 /πυκνότητα φρεάτιο σε πλάκα 6 φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν στους 37 ° C για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΜ HCPT, 25 μΜ εμοδίνη και ειδική συγκέντρωση ΕΜ-d-Rha (0,1 μΜ, 0.5 μΜ, 2,5 μΜ), αντιστοίχως. ομάδα ελέγχου κυττάρων ορίστηκε με τον ίδιο τρόπο. Στη συνέχεια τα κύτταρα επωάστηκαν σε υγροποιημένο επωαστή με 5% CO

2 στους 37 ° C για 72 ώρες. Μέσο ανταλλάσσονται ήταν όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Στο τέλος, όλοι μέσον απορρίφθηκαν και τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε πέψη με 2 mL 0.25% διαλύματος τρυψίνης-ΕϋΤΑ στους 37 ° C για 5 λεπτά. Μετά τα κύτταρα συλλέχθηκαν, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS δύο φορές ακολουθούμενη από φυγοκέντρηση στα 300 χ g για 5 λεπτά. Τέλος, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 100 μΐ ψυχρού PBS μετά το υπερκείμενο απορρίφθηκε. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στο σκοτάδι για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου μετά την προσθήκη 100μL 1mg mL Hoechst 33342 διαλύματος /χρώσης. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πάλι όπως περιγράφηκε προηγουμένως για να απορρίψει το διάλυμα χρώσης. Πλύνετε τα κύτταρα που συλλέγονται δύο φορές με PBS πριν από την εφαρμογή στις καθαρές γυάλινες πλάκες. Οι μορφολογικές μεταβολές των κυττάρων πυρήνες παρατηρήθηκαν και φωτογραφήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο φθορισμού (

της Olympus

,

Ιαπωνία

) στα 350 nm μήκος κύματος διέγερσης. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές.

σκάλας DNA δοκιμασία

σχηματισμό σκάλα του DNA είναι ένα σημαντικό κριτήριο για τον καθορισμό κύτταρα σε απόπτωση. Για να επιβεβαιώσετε το αποτέλεσμα επαγωγής απόπτωσης, διεξήχθη η ανάλυση του κατακερματισμού του DNA. HepG2 κύτταρα σε λογαριθμική φάση ανάπτυξης εμβολιάστηκαν σε πλάκες καλλιέργειας 10 εκατοστών διαμέτρου σε πυκνότητα 5 χ 10

5 κυττάρων με 12 ml πλήρους θρεπτικού μέσου που περιείχε 10% ορό εμβρύου μόσχου, και αφέθηκαν να προσκολληθούν στους 37 ° C για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΕΜ-d-Rha και Cisplatin σε μια συγκεκριμένη συγκέντρωση. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν και συλλέχθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Τέλος, το DNA όλων των δειγμάτων εξήχθη χρησιμοποιώντας το κιτ ανίχνευσης απόπτωσης σκάλα DNA ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ο κατακερματισμός του DNA προσδιορίστηκε με ηλεκτροφόρηση σε γέλη αγαρόζης 1,5% που περιέχει 0,5 mg /mL βρωμιούχο αιθίδιο (EtBr) σε 5V /cm για 2,5 ώρες και φωτογραφήθηκαν υπό υπεριώδη. Το μέγεθος του κατακερματισμού του DNA συγκρίθηκε με το δείκτη (μοριακό βάρος standard).

Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

κυτταρομετρία ροής προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας αννεξίνη V-APC /7-AAD Apoptosis Detection Kit (

BD Parmagen

,

U

.

S

.

Α

). HepG

2 κύτταρα εμβολιάστηκαν σε πυκνότητα 3 × 10

5 /φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων, και αφέθηκαν να προσκολληθούν στους 37 ° C για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ειδική συγκέντρωση ΕΜ-d-Rha, και καλλιεργήθηκαν και συλλέχθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Κύτταρα από κάθε δείγμα επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό 300 μικρόλιτρα κρύο δεσμευτική πριν από την προσθήκη 2,5 μΙ συζυγούς Annexin V-APC και διάλυμα 5μL 7-AAD. Στη συνέχεια τα κύτταρα επωάστηκαν για 15 λεπτά επί πάγου στο σκοτάδι. εναιώρημα των κυττάρων αραιώνεται σε τελικό όγκο 250 μΐ του ρυθμιστικού διαλύματος με παγωμένο, 1 × δέσμευση αννεξίνης V. Η δοκιμασία διεξήχθη με κυτταρομετρία ροής (

BD FACSCalibur

,

Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

). διαγράμματα διασποράς δημιουργήθηκαν με τη χρήση Cell Quest Pro λογισμικού (

BD Biosciences

,

Σαν Χοσέ

,

CA

). Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές.

Ανάλυση του μιτοχονδριακού δυναμικού μεμβράνης

HepG

2 κύτταρα εμβολιάστηκαν σε πλάκες καλλιέργειας 10 εκατοστών διαμέτρου σε πυκνότητα 5 χ 10

5 κύτταρα, και αφέθηκαν να προσκολληθούν στους 37 ° C για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5,0 μΜ ΕΜ-d-Rha για 0, 24, 48 και 72 ώρες αντίστοιχα. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε υγροποιημένο επωαστή που παρέχεται με 5% CO

2 στους 37 ° C για 72 ώρες. Μέσο ανταλλάχθηκαν μία φορά κάθε 24 ώρες. Τα συλλεχθέντα κύτταρα από κάθε δείγμα εναιωρήθηκαν σε 500μL PBS πριν από την προσθήκη 5 μL Rhodamine123. Στη συνέχεια, τα δείγματα επωάστηκαν στους 37 ° C στο σκοτάδι για 15 λεπτά. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πάλι με φυγοκέντρηση στα 300 χ g για 5 λεπτά και το υπερκείμενο απορρίφθηκε. Τα σφαιρίδια του κυττάρου πλύθηκαν δύο φορές με 4 ° C PBS. Τέλος τα κύτταρα όλων των δειγμάτων επαναιωρήθηκαν σε 500μL PBS. Πριν από την πραγματοποίηση ανάλυσης, ρυθμίζοντας το μήκος κύματος διέγερσης και μήκος κύματος εκπομπής σε 480nm, 520nm αντίστοιχα, οι αλλαγές ΔΨm των HepG2 μιτοχονδριακών μετρήθηκαν με κυτταρόμετρο ροής (

BD FACSCalibur

,

BD Biosciences

,

ΗΠΑ

). Το πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές.

Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου (χρώση ΡΙ)

HepG2 κύτταρα σε λογαριθμική φάση ανάπτυξης εμβολιάστηκαν 10 cm τρυβλία καλλιέργειας σε πυκνότητα 5 × 10

5 κύτταρα και επωάστηκαν όλη τη νύκτα και αφέθηκαν να προσκολληθούν. Αφού εκτεθεί σε EM-d-Rha σε συγκεκριμένες συγκεντρώσεις για 48 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν με ψυχρό PBS δύο φορές. Στη συνέχεια τα συλλεγέντα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 1 ml PBS και 3mL ψυχρού 100% αιθανόλη στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Μετά από αυτό, τα κύτταρα και πάλι συλλέγονται με φυγοκέντρηση στα 300 χ g για 10 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν με ψυχρό PBS και επανα-εναιωρήθηκαν σε 450 μL PBS, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 50 μλ ριβονουκλεάση (ΚΝάση, 10 mg /mL) στους 37 ° C για 15 λεπτά. 500μL ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ, 50 μg /ml) προστέθηκε στα δείγματα. Αφού τα κύτταρα επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 4 ° C στο σκοτάδι, η κατανομή του κυτταρικού κύκλου μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα BD κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur (

BD Biosciences

,

ΗΠΑ

), και 10,000cells μετρήθηκαν για κάθε δείγμα. Το ποσοστό των κυττάρων σε διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με τη ροή Jo (

BD Biosciences

,

Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

). Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές.

ανάλυση Gene με RT-qPCR

HepG

2 κύτταρα εμβολιάστηκαν σε τρυβλία καλλιέργειας 6 φρεατίων σε πυκνότητα 3 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο, και αφέθηκαν να προσκολληθούν στους 37 ° C για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με συγκεκριμένες συγκεντρώσεις του ΕΜ-d-Rha και επωάστηκαν σε υγροποιημένο επωαστή που παρέχεται με 5% CO

2 στους 37 ° C για 48 ώρες. Μέσο άλλαξαν μια φορά κάθε 24 ώρες. Στη συνέχεια, το mRNA εκχυλίστηκε από κάθε ομάδα χρησιμοποιώντας E.Z.N.A.

TM Ολικό RNA Kit II σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το εκχυλισθέν mRNA διαλύθηκε σε 20 μι αναπτυξιακής δυσπλασίας του ισχίου

2O (

Qiagen

) που περιέχει πυροανθρακικό διαιθυλεστέρα (DEPC). Η συγκέντρωση του mRNA ποσοτικοποιήθηκε με μια συσκευή NanoDrop ND-100 (Thermo Fisher Scientific). cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας 3 μg του εκχυλισθέντος mRNA από κάθε δείγμα με σύστημα PCR (

ΒΙΟ-RAD

,

ΗΠΑ

). Η αντίδραση σύνθεσης του cDNA παρασκευάστηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή με ανάμιξη 3 μg mRNA, 4.0μL 5 × ρυθμιστικού MMLV, 3 μί oligodT18, 0,5 μί διαλύματος 10 mM dNTP, αναστολέα 0.8μL RNase, 3.7μL MMLV ΚΤ-άση και 6.0μL DEPC αναπτυξιακής δυσπλασίας του ισχίου

2O σε σωληνάρια PCR. Η προϋπόθεση της αντίδρασης 5 λεπτά στους 70 ° C, 60 λεπτά στους 42 ° C και 10 λεπτά στους 4 ° C. Τα προϊόντα χρησιμοποιήθηκαν για μεταγενέστερη ανάλυση RT-qPCR. Το επίπεδο της έκφρασης mRNA μετρήθηκε με RT-qPCR χρησιμοποιώντας ένα CFX96

TM C1000 Real-Time PCR System (

BIO-RAD

,

Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

) .Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας IDT σύστημα λογισμικού .dna (http //www.idtdna.com). Οι ειδικοί εκκινητές ήταν: Cyto C: 5′-AGATGGTGAGCACAAGGTAAG-3 ‘(προς τα εμπρός), 5′-CTCACTGTCCCACAAAGATACA -3′ (αντίστροφο)? Κασπάσης 3: 5’-CCTACAGCCCATTTC TCCATAC-3 ‘(προς τα εμπρός), 5′-GCCTCACCACCTTTAGAACAT- »(αναστροφή)? β-ακτίνης: 5’-GGACCTGACTGACTACCTCAT-3 ‘(προς τα εμπρός), 5′-CGTAGCACAGCTTCTCCTTAAT-3’ (αντίστροφο). Τα μεγέθη των προϊόντων του Cyto C, κασπάσης 3 και β-ακτίνη ήταν 91ορ, 125bp και 107bp, αντίστοιχα. Η αντίδραση PCR πραγματοποιήθηκε σε έναν τελικό όγκο 20 μΙ με τη χρήση ενός οπτικού δίσκου 96 φρεατίων. Το μίγμα της αντίδρασης αποτελείτο από 10 μί SYBR I πράσινο Mix /GoTaq®qPCR

Master Mix (

Promega

), 0.3μL του κάθε εκκινητή (10μΜ), και 1.0 πρότυπο μι cDNA. PCR κατάσταση ποδηλασίας ήταν ένας κύκλος από 5 λεπτά στους 95 ° C, 39 κύκλοι και καθένα από τα οποία αποτελούνταν από 15 δευτερόλεπτα στους 95 ° C, 15 δευτερόλεπτα στους 62 ° C και 30 δευτερόλεπτα στους 72 ° C, με τελική επέκταση στους 60 ° C για 5 δευτερόλεπτα. Η παράμετρος θερμική τήξη διερευνήθηκε για την αξιολόγηση της ομοιογένειας του PCR. Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τετραπλούν και μέση χρησιμοποιήθηκε για περαιτέρω ανάλυση. Τα επίπεδα έκφρασης του mRNA του κάθε δείγματος ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση των τιμών κατωφλίου κύκλου (CT) των γονιδίων. Οι σχετικές τιμές της έκφρασης γονιδίου στόχου υπολογίστηκαν σύμφωνα με CT τιμές των γονιδίων στόχων και του γονιδίου αναφοράς (β-ακτίνη) εφαρμόζοντας Livak και Schmittgen μέθοδο. Δηλαδή, ισούται με 2

-Δ ΔΟΙ, ΔCt ισούται με το μέσο όρο των Ct για το γονίδιο-στόχο μείον τη μέση τιμή του Ct για το γονίδιο β-ακτίνης, και ΔΔCT ισούται ΔCt του επεξεργασμένου ομάδα μείον ΔCt της ομάδας ελέγχου.

Western ανάλυση κηλίδος

HepG

2 κύτταρα εμβολιάστηκαν, καλλιεργήθηκαν και συλλέχθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Στη συνέχεια, το πείραμα διεξήχθη σε πάγο. Η συγκομίζονται κυτταρικό ίζημα πλύθηκε με ψυχρό PBS πριν να επαναιωρούνται σε 300 μικρόλιτρα ρυθμιστικού διαλύματος λύσεως κυτοσολίου μέσω δίνης. Στη συνέχεια, τα κύτταρα από όλα τα δείγματα υπέστησαν λύση με κατεργασία υπερήχων μέθοδο στον πάγο χρησιμοποιώντας την υπερηχητική διαταραχή κυττάρων (100 W για 30s χ 4 φορές). Η συνολική πρωτεΐνη του κάθε δείγματος μετρήθηκε με δοκιμασία Bradford χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια πρωτεΐνης ποσοτικοποίησης από την Bio-Rad. Όλα τα δείγματα προστέθηκαν 2 × ρυθμιστικό φόρτωσης πριν από την ανάλυση σε 12% πηκτώματα με SDS-PAGE. Στη συνέχεια, οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης με ηλεκτρο-στύπωση. Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε 1% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) ή 5% διάλυμα γάλα σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά, ακολουθούμενη από επώαση με το πρωτεύον αντίσωμα έναντι κουνελιού (

Univ-bio

,

Κίνα

) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Οι μεμβράνες στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές με 1 χ TBST, κάθε φορά διαρκούν για 5 λεπτά. Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με τα δευτερογενή αντισώματα για 3 ώρες στους 4 ° C, ακολουθούμενη από πλύση με 1 χ TBST όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Τέλος, οι ανοσο-αντιδραστικά ζώνες ανιχνεύθηκαν και τεκμηριωμένη χρήση μιας ενισχυμένης χημειοφωταύγειας δυτικό σύστημα κηλίδωσης (

Thermo-επιστημονική

,

Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής)

σε ένα σύστημα απεικόνισης Versa έγγρ.

η στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± SEM Το SPSS στατιστικό λογισμικό για Windows, έκδοση 17.0 χρησιμοποιήθηκε για μονόδρομη ανάλυση ANOVA ακολουθούμενη από τη δοκιμή Tukey HSD για πολλαπλές συγκρίσεις όταν ενδείκνυται. Οι διαφορές στην μετρηθείσες μεταβλητές μεταξύ δύο ομάδες συγκρίθηκαν με t-test του Student. P & lt? 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική. GraphPad Prism 5 λογισμικού (

GraphPad Software

,

Inc

,

Σαν Ντιέγκο

,

CA

,

Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

) χρησιμοποιήθηκε για την η ανάλυση. Για RT-qPCR και κυτταρομετρία ροής των πειραμάτων, τα δεδομένα ήταν αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Αποτελέσματα

δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας

Έχουμε δοκιμάσει τις επιδράσεις διαφόρων συγκεντρώσεων εμοδίνης (S-1) και τα παράγωγά του (S-2, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9) επί των βιωσιμότητες των δοκιμαζόμενων ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα γραμμές (Σχήμα 2 και Πίνακας 1). Έτσι, το ημι-ανασταλτική συγκέντρωση (IC

50) τιμές υπολογίστηκαν από τα δεδομένα αυτά. Τα δεδομένα έδειξαν ότι διαφορετικά παράγωγα αναστέλλουν την ανάπτυξη των διαφόρων κυτταρικών σειρών με διαφορετικό βαθμό (Πίνακας 1).

Η

Σύμφωνα με τα πρότυπα αξιολόγησης της αποτελεσματικότητας των αντικαρκινικών φαρμάκων in vitro δοκιμές, το IC

50 τιμές της ένωσης ή συντίθενται φυτικό εκχύλισμα πρέπει να είναι μικρότερη από 10 μg /mL και η αποτελεσματικότητα θα πρέπει να έχει μια δόση-εξαρτώμενο τρόπο, εν τω μεταξύ το μέγιστο ανασταλτικό αποτέλεσμα θα πρέπει να υπερβαίνει το 80%. Αν το δοκιμαζόμενο ένωση πληρούν όλα τα κριτήρια που περιγράφονται, θεωρήθηκε ότι κατέχουν αντι-πολλαπλασιασμό και την αναστολή της ανάπτυξης επιδράσεις επί καρκινικών κυττάρων in vitro.

Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, μεταξύ όλων των συντεθούν ενώσεις, S-8 και S-9 παράγωγα έδειξαν ισχυρότερη ανασταλτική επίδραση στα καρκινικά κύτταρα δοκιμάστηκαν από γονέα εμοδίνη. Στην πραγματικότητα, S-8 πράξη καλύτερα από S-9. Σε σύγκριση με το IC

50 εμοδίνης, της IC

50 τιμές των S-8 επί Α549, HepG2, OVCAR-3 και HeLa κύτταρα μειώθηκε κατά 7,52, 19,68, 42,3 και 10,56 φορές, αντίστοιχα. Με άλλα λόγια, S-8 ενισχυμένη αντικαρκινική δραστικότητα κατά περίπου δέκα τάξεις μεγέθους. Αξίζει να σημειωθεί ότι, HepG2 και OVCAR-3 κύτταρα βρέθηκαν να είναι ευαίσθητα σε S-8 παράγωγο.

ανάλυση δομής δραστικότητας των εμοδίνης rhamnopyranosides παραγώγων

κυτταρική ανάλυση βιωσιμότητας αποδεικνύεται ότι rhamnopyranosides παράγωγα ενήργησε καλύτερα από γονέα εμοδίνης. Αλλά παραμένει ασαφές πώς οι τροποποιημένες χημικές δομές συνέβαλαν στην αυξημένη δραστηριότητα. Έτσι προκαταρκτική ανέλυσε τη σχέση αντικαρκινική δομής-δραστικότητας (Σχήμα 2 και Πίνακας 1). Από τα in vitro δεδομένα, θα μπορούσε να φανεί ότι η εισαγωγή της ραμνόζης μπορεί να συμβάλει στην ενίσχυση της αντικαρκινικής δράσης (Σχήμα 2). Ωστόσο, η αυξημένη δραστηριότητα σχετίζεται με την εισαχθείσα τρόπο ραμνόζης και υποκατεστημένου θέση ραμνόζης υδροξυλίου με ακετυλομάδες. Εάν υπάρχει μόνο μία ραμνόζη εισήχθη σε εμοδίνη, η διαλυτότητα του παραγώγου βελτιώθηκε, αλλά η αντικαρκινική δράση ήταν κακή (S-3). Περαιτέρω, όταν το υδροξύλιο της ραμνόζης ήταν δισυποκατεστημένων από δύο ακετυλομάδες. Η αντικαρκινική δράση του παραγόμενου παραγώγου από 3, 4-υδροξυλίου του ραμνόζης διυποκατεστημένο από το παρακείμενο ακετύλιο, είναι ανώτερη από εκείνη των 2, 3-υδροξυλίου ή 2, 4-υδροξυλίου παραγώγου διυποκατεστημένο, δηλαδή, η πρώτη έχει μια ισχυρή επίδραση antiprolifertion (S-5). Όταν εμοδίνης rhamnopyranosides παράγωγο είχε παρατεταμένη αλυσίδες ζάχαρης, η αντικαρκινική δράση in vitro ήταν σημαντικά αυξημένη (S-8). Ομοίως, όταν οι ομάδες υδροξυλίου του C-1 και C-8 θέση του εμοδίνης είναι μεθυλιωμένα, αντικαρκινική δράση του επίσης βελτιώθηκε (S-9).

Ανασταλτική δράση του ΕΜ-d-Rha σε πολλαπλά καρκινικό κύτταρο γραμμές

για να επιβεβαιώσετε την ανασταλτική δράση και ανασταλτική δράση του ΕΜ-d-Rha σε καρκινικά κύτταρα in vitro, και να κατανοήσουν τη σχέση δόσης-απόκρισης, πραγματοποιήσαμε περαιτέρω τα πειράματα σε διάφορες συγκεντρώσεις του ΕΜ-d-Rha κατά πολλαπλές καρκινικά κύτταρα. Το IC

50 τιμές υπολογίσθηκαν από αυτά τα δεδομένα.

Όπως φαίνεται στον Πίνακα 2 και τον Πίνακα 3, μπορούμε να δούμε ότι το ΕΜ-d-Rha έχει πολύ σημαντική αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα έναντι διαφόρων καρκινικών κυτταρικών γραμμών σε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο. Ωστόσο, τα μισά-ανασταλτικές τιμές συγκέντρωσης της προς τα φυσιολογικά κύτταρα των ιστών είναι υψηλότερες από ό, τι για τα καρκινικά κύτταρα. Είναι πιθανό ότι τα ανασταλτικά αποτελέσματα αύξησης του ΕΜ-d-Rha σε κύτταρα είναι επιλεκτικά σε κάποιο βαθμό.

Η

καμπύλη δόσης-απόκρισης του ΕΜ-d-Rha κατά HepG2

EM-ά-Rha άσκησαν σημαντική αντι-πολλαπλασιαστική δράση επί των κυττάρων HepG2, τα αποτελέσματα μας οδήγησε σε περαιτέρω διερεύνηση και σύγκριση των καμπυλών δόσης-απόκρισης του ΕΜ-d-Rha με εκείνη της εμοδίνης, της σισπλατίνης και HCPT. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, η επίδραση αναστολής αύξησης του ΕΜ-d-Rha επί κυττάρων HepG2 εμφάνισε μια δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Με την αυξανόμενη συγκέντρωση του log του ΕΜ-d-Rha, το ποσοστό αναστολής των κυττάρων HepG2 αυξήθηκε σημαντικά (Σχήμα 3). Επιπλέον, η δραστικότητα του ΕΜ-d-Rha ήταν ισχυρότερη σε σύγκριση με εκείνη των εμοδίνης έναντι κυττάρων HepG2. Ωστόσο, είναι κατώτερη σε σύγκριση με εκείνη σισπλατίνης και HCPT έναντι κυττάρων HepG2.

Τέσσερις καμπύλες αντιπροσωπεύουν την καμπύλη δόσης-απόκρισης του HCPT, ΕΜ-d-Rha, σισπλατίνη, και Emodin έναντι HepG2 κυττάρων από τα αριστερά προς δεξιά με τη σειρά. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (τρεις επαναλήψεις). Ο οριζόντιος άξονας αναπαριστά τη συγκέντρωση log του ΕΜ-d-Rha, ο κάθετος άξονας αντιπροσωπεύει την ποσοστιαία αναστολή.

Η

Επίδραση του ΕΜ-d-Rha στην μορφολογία των κυττάρων HepG2

για να δείτε άμεσα την ανασταλτική δράση ανάπτυξης του ΕΜ-d-Rha επί κυττάρων HepG2, παρατηρήσαμε τις μορφολογικές μεταβολές των κυττάρων HepG2 μετά κατεργασία (Σχήμα 4). Οι μορφολογικές αλλαγές των κυττάρων μπορεί να αντικατοπτρίζει την ανάπτυξη και το θάνατο κατάσταση. Ως αποτέλεσμα, τα μη επεξεργασμένα κύτταρα HepG2 της ομάδας ελέγχου έδειξε μια υψηλή συμβολή των κυττάρων μονοστοιβάδας και άνθισαν στη λογαριθμική φάση ανάπτυξης, η οποία είχε προφανή μορφολογικά χαρακτηριστικά των ευγονικών κυττάρων όπως ενδοκυτταρικών στεγανών συνδέσεων, σαφείς μεμβράνη, η πλήρης κυτταρόπλασμα και καλή διαθλαστική απόδοση ( Σχήμα 4Α). Σε αντίθεση, τα ΕΜ-ά-Rha επεξεργασμένα κύτταρα έδειξαν σαφώς τις μορφολογικές μεταβολές απόπτωσης, όπως η μείωση του όγκου των κυττάρων και την απώλεια των επαφών κυττάρου-κυττάρου με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 4D-4Η). Όταν υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 12.5 μΜ ΕΜ-d-Rha, οι μορφολογικές μεταβολές των κυττάρων HepG2 έδειξε παρόμοια χαρακτηριστικά με εκείνη του 2,5 μΜ HPLC-αγωγή (Σχήμα 4C).

φωτεινού πεδίου εικόνες μικροσκοπία μετά από επώαση με HCPT για 48h σε 0,5 μΜ? 2,5 μΜ και με ΕΜ-d-Rha για 48 ώρες σε διάφορες συγκεντρώσεις: 0μM (έλεγχος)? 0,1 μΜ? 0,5 μΜ? 2,5 μΜ? 12.5 μΜ? 62.5μM (αρχική μεγέθυνση 100 ×).

Η

Για να διερευνηθεί περαιτέρω κατά πόσον η μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων HepG2 αγωγή με ΕΜ-d-Rha οφείλεται στην επαγωγή της απόπτωσης, θα πραγματοποιηθεί την μορφολογική παρατήρηση με μικροσκόπιο φθορισμού η οποία έχει αυξημένη ευαισθησία και την αντίθεση. κύτταρα HepG2 χρώστηκαν με μια φθορίζουσα χρωστική Hoechst 33342 DNA, το οποίο έχει υψηλή ευαισθησία και χαμηλή κυτταροτοξικότητα. Μπορεί να διαπεράσει τα καρκινικά κύτταρα μεμβράνης και δεσμεύει DNA και εκπέμπουν ένα ισχυρό φθορισμό λουλάκι. Hoechst δεσμεύει DNA στις περιοχές αυλάκι που περιέχουν γενναιόδωρες ΑΤ αλληλουχία βάσης. Έχει καλή υδατοδιαλυτό και σταθερότητα. Ως εκ τούτου, μικροσκοπία φθορισμού συνδυάζει υψηλότερη ευαισθησία με το μοριακό ειδικότητα και εξαιρετική αντίθεση εικόνας. Προκειμένου να εξακριβωθεί αν η δοκιμή είναι επιτυχής ή όχι, έχουμε καθιερώσει HCPT ένωση ως θετικός μάρτυρας.

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5, κύτταρα HepG2 έδειξε την τυπική αποπτωτική πυρηνική μορφολογία μετά από έκθεση σε 2,5 μΜ HCPT για 48 ώρες, και παρουσίασε κύτταρο-προς-κύτταρο απώλεια επαφής, πυρηνική συρρίκνωση, σχηματισμό φυσαλίδων μεμβράνης, συμπύκνωση του DNA και του κατακερματισμού (Σχήμα 5C). Ομοίως, όταν τα κύτταρα HepG2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις του ΕΜ-d-Rha για 48 ώρες, αυτοί έδειξαν σαφώς τα χαρακτηριστικά της πυρηνικής συρρίκνωση και συμπύκνωση DNA, και παρουσίασε μια δοσολογία εξαρτώμενη επιβαρυντική βλάβη (Σχήμα 5D-5F) .Κάποιοι των κυττάρων HepG2 αποσπάται από τη μονοστοιβάδα και επέπλευσε στο μέσο καλλιέργειας, ωστόσο, η αποπτωτική πυρηνική εμφάνιση δεν παρατηρήθηκε σε μη επεξεργασμένο μάρτυρα, κύτταρα HepG2 της ομάδας ελέγχου εμφανίστηκε ομοιόμορφη μπλε φθορισμό (Σχήμα 5Α). HepG2 κύτταρα κατεργασμένα με 25μΜ εμοδίνη εμφανίζεται επίσης αποπτωτικά μορφολογικές αλλαγές (Εικόνα 5Β).

Οι πυρήνες μορφολογικές αλλαγές του HepG2 κυττάρων παρατηρήθηκαν με μικροσκοπία φθορισμού μετά από επώαση με 25.0μM εμοδίνη, 2,5 μΜ HCPT για 48 ώρες και με ΕΜ -d-Rha για 48 ώρες σε διάφορες συγκεντρώσεις: 0μM (έλεγχος)? 0,1 μΜ? 0,5 μΜ? 2,5 μΜ (αρχική μεγέθυνση 400 ×). Οι συνοπτικές και αποσπασματικές φθορισμού πυρήνες (λευκά βέλη) των αποπτωτικών κυττάρων είναι ορατά στα επεξεργασμένα κύτταρα, αλλά όχι στα κύτταρα ελέγχου.

Η

Επίδραση του ΕΜ-d-Rha στο DNA κατακερματισμό των κυττάρων HepG2

για να διερευνηθεί περαιτέρω εάν ΕΜ-d-Rha οδήγησε σε DNA κατακερματισμό των κυττάρων HepG2, η οποία είναι ένα σημαντικό χαρακτηριστικό της κυτταρικής απόπτωσης. Το πυρηνικό DNA ανιχνεύθηκε με αγαρόζη μέθοδο ηλεκτροφόρησης γέλης. Βρήκαμε επίσης ότι η ΕΜ-d-Rha μπορεί να ασκήσει επιδράσεις επαγωγή αποπτωτικού του, όταν τα κύτταρα HepG2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με ΕΜ-d-Rha, το εκχυλισμένο DNA των κυττάρων HepG2 εμφανίστηκαν τυπικές σκάλα ή σχήμα κατακερματισμού (Σχήμα 6), ήταν παρόμοια με ό, τι ο DNA από κύτταρα HepG2 σε επεξεργασία με σισπλατίνη παρουσιάζονται, όμως, ήταν διαφορετική με το σχήμα DNA των μη επεξεργασμένων κυττάρων HepG2 (σχήμα 6). Το αποτέλεσμα πρότεινε ότι EM-d-Rha προκάλεσε διπλής έλικας του DNA θραύση των κυττάρων HepG2 και επαγόμενη απόπτωση στα κύτταρα HepG2

Lane Μ:. DNA Ladder? Λωρίδα 6: Έλεγχος? Lanes1, και 2: Τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 3.0μM και 6.0μm Σισπλατίνη? Οι διαδρομές 3, 4 και 5: Τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 2,5 μΜ, 5,0 μΜ και 10.0μM ΕΜ-d-Rha, αντίστοιχα

Η

Η απόπτωση επιδράσεις επαγωγή του ΕΜ-d-Rha επί HepG2 και OVCAR-3. κύτταρα

Για να καταδειχθεί περαιτέρω ότι ΕΜ-d-Rha μπορεί να αναστέλλει την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων HepG2 και OVCAR-3 κύτταρα μέσω του μηχανισμού της επαγωγής απόπτωσης, εφαρμόσαμε επίσης ανάλυση κυτταρομετρίας ροής με τη μέθοδο της διπλής χρώσης αννεξίνης V-APC και 7-AAD (7-αμινο-ακτινομυκίνη D). Η δραστικότητα επαγωγής απόπτωσης του S-8 ανιχνεύτηκε από τον δεσμεύουν μεταξύ αννεξίνης V και φωσφατιδυλοσερίνη (PS), η οποία διανέμει κυρίως στην κυτταροπλασματική πλευρά των ζωντανών κυττάρων, ωστόσο, κατά την πρώιμη φάση της κυτταρικής απόπτωσης, η PS μεταναστεύουν από την κυτταροπλασματική πλευρά προς την πλευρικό τοίχωμα του κυττάρου, έτσι ώστε αυτό μπορεί να δημιουργήσει ειδικές δεσμεύουν μεταξύ αννεξίνης V και PS. 7-AAD είναι ένας λεκές νουκλεϊκό οξύ, το οποίο μπορεί να διαπεράσει τις κυτταρικές μεμβράνες κατά το τελευταίο στάδιο της κυτταρικής απόπτωσης και τα νεκρά κύτταρα και περαιτέρω βάψει πυρήνα κόκκινο τους. Έτσι, η συνδυασμένη χρήση αννεξίνης V-APC και 7-AAD μπορεί να διακρίνει αργά αποπτωτικά κύτταρα από νωρίς αποπτωτικά κύτταρα. κύτταρα HepG2 και τα κύτταρα OVCAR-3 υπέστησαν απόπτωση μετά από έκθεση σε EM-d-Rha στο 2,5 μΜ, 5 μΜ και 10 μΜ για 48 ώρες (Εικόνα 7 και Εικόνα 8). Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων παρουσιάζεται στον Πίνακα 4 και Πίνακα 5.

HepG2 κύτταρα επωάστηκαν για 72 ώρες με ΕΜ-d-Rha σε 0, 2,5 μΜ, 5 μΜ, 10 μΜ, αντίστοιχα. Και τα κύτταρα βάφτηκαν με συζευγμένο με FITC Annexin V και 7-AAD. Α: Αντιπροσωπευτικά διαγράμματα σημείων της χρώσης αννεξίνης V-FITC /7-AAD. Α: έλεγχος, 72 ώρες? b: 2,5 μΜ EM-d-Rha, 72h? c: 5μΜ EM-d-Rha, 72h? d: 10μΜ EM-d-Rha, 72 ώρες. 3-(2”,3”-Di-O-acetyl-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-2’,3’-di-O-acetyl-α-L-rhamnopyranosyl)-emodin