Αφηρημένο

Ιστορικό

terpinen-4-όλη, ένα φυσικό μονοτερπένιο είναι η κύρια βιοενεργά συστατικό του τσαγιού λάδι δέντρο και έχει αποδειχθεί ότι έχει πολλές βιολογικές δραστηριότητες.

Στόχος

για να μελετηθούν οι επιδράσεις κατά του όγκου των terpinen-4-όλης και ο μηχανισμός δράσης της στον προστάτη και GI κακοήθειες , μόνο και σε συνδυασμό με χημειοθεραπευτικούς και βιολογικούς παράγοντες.

Μέθοδοι

τερπινεν-4-όλη χορηγήθηκε μόνο του ή σε συνδυασμό με την κλασική χημειοθεραπεία (οξαλιπλατίνη, φθοροουρακίλη, γεμσιταβίνη, Tarceva) και βιολογικό παράγοντα ( cetuximab). Ήταν, επίσης, σε συνδυασμό με ανθρωποποιημένα CD24 αντι-μονοκλωνικά αντισώματα (αναπτύχθηκε από εμάς). Killing επιδράσεις μετρήθηκαν ποιοτικώς με μικροσκοπία φωτός και ποσοτικά με τη χρήση του ΜΤΤ και την ανάλυση FACS, μετά από τη θεραπεία του ορθοκολικού, του παγκρέατος, του στομάχου και του καρκίνου του προστάτη κύτταρα. Τερπινεν-4-όλης επίδραση στην ανάπτυξη του όγκου αξιολογήθηκε σε μοντέλο ξενομοσχεύματος.

Αποτελέσματα

τερπινεν-4-όλης επάγει μία σημαντική αναστολή της ανάπτυξης του ορθοκολικού, του παγκρέατος, του προστάτη και γαστρικό καρκίνο κυττάρων σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (10-90% σε 0.005-0.1%). Τερπινεν-4-όλη και διαφόρων αντικαρκινικών παραγόντων (0.2μΜ οξαλιπλατίνη και 0,5 μΜ φθοριοουρακίλη) έδειξε ένα συνεργιστικό ανασταλτικό αποτέλεσμα (83% και 91%, αντιστοίχως) επί του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων. Στις

KRAS

μεταλλαγμένα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου, τα οποία είναι ανθεκτικά σε αντι-EGFR θεραπεία, συνδυάζοντας του terpinen-4-όλης με cetuximab (1 μΜ) οδήγησε σε εντυπωσιακή αποτελεσματικότητα 80-90% αναστολή αύξησης. Υπο-τοξικές συγκεντρώσεις terpinen-4-όλης ενισχύουν αντι-CD24 mAb (150μg /ml) επαγόμενης αναστολής της ανάπτυξης (90%). Σημαντική μείωση στον όγκο του όγκου παρατηρήθηκε μετά terpinen-4-όλη (0,2%) μόνο και με cetuximab (10mg /kg) (40% και 63%, αντίστοιχα) θεραπεία ως σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου.

Συμπέρασμα

τερπινεν-4-όλης ενισχύει σημαντικά την επίδραση διαφόρων χημειοθεραπευτικών και βιολογικών παραγόντων. Η πιθανή μοριακός μηχανισμός για τη δράση του περιλαμβάνει επαγωγή κυτταρικού θανάτου καθιστώντας αυτήν την ένωση ως μόνη δυνητικό αντικαρκινικό φάρμακο και σε συνδυασμό στην αγωγή πολυάριθμων κακοηθειών. Terpinen-4-όλη αποκαθιστά τη δραστηριότητα του cetuximab σε καρκίνους με μεταλλαγμένο KRAS

Παράθεση:. Shapira S, Pleban S, D Kazanov, Tirosh P, Arber Ν (2016) terpinen-4-ol: A Novel και υποσχόμενος θεραπευτικός παράγοντας για τα Ανθρώπινα γαστρεντερικού καρκίνου. PLoS ONE 11 (6): e0156540. doi: 10.1371 /journal.pone.0156540

Επιμέλεια: Ajay Goel, Πανεπιστήμιο Baylor Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 26 του Φλεβάρη, 2016? Αποδεκτές: 16 Μαΐου του 2016? Δημοσιεύθηκε: 8, Ιουνίου του 2016

Copyright: © 2016 Shapira et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. EMERALD ΒΙΟ-LABS LTD παρέχεται στήριξη με τη μορφή των μισθών για τους δημιουργούς SP & amp? PT, αλλά δεν έχουν κανένα πρόσθετο ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, η συλλογή και ανάλυση δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Οι συγκεκριμένοι ρόλοι αυτών των συγγραφέων αρθρωτά στο τμήμα «συγγραφέας εισφορές»

Αντικρουόμενα συμφέροντα: EMERALD BIO-LABS LTD παρέχεται στήριξη με τη μορφή των μισθών για τους δημιουργούς SP & amp?. PT, αλλά αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και Υλικά |

Συντομογραφίες:. CRC, ο καρκίνος του παχέος εντέρου? DMSO, διμεθυλοσουλφοξείδιο? EGFR, υποδοχέα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα? FACS, ενεργοποιημένων με φθορισμό διαλογή κυττάρων? Luc,

λουσιφεράση

Εισαγωγή

Τα αιθέρια έλαια και τα συστατικά τους που προέρχονται από φυτικές ύλες έχουν βρεθεί να εμφανίζουν αντι-μικροβιακή, αντι-ιική, αντι-μυκητιασική, αντι-οξειδωτικό, αντι-φλεγμονώδη και δραστηριότητες κατά του καρκίνου [1-3].

τα μονοτερπένια είναι σημαντική φυτικής προέλευσης δευτερογενών μεταβολιτών που βρέθηκαν ευρέως σε φυσικά προϊόντα, συμπεριλαμβανομένων των φρούτων, των λαχανικών και βοτάνων και είναι γνωστό ότι σχετίζονται με τους μηχανισμούς των φυτών άμυνας. Τα μονοτερπένια αποτελούνται από δύο μονάδες ισοπρενίου, και βρίσκονται σε μεγάλες ποσότητες σε αιθέρια έλαια [4,5]. Επιπλέον, πολλές μονοτερπένια προταθεί ότι ασκούν ισχυρή αντικαρκινική δράση. Μερικά από αυτά σύμφωνα με πληροφορίες που εμφανίζονται ελπιδοφόρα αποτελέσματα στην πρόληψη και θεραπεία διαφόρων τύπων λευχαιμίας και καρκίνων, όπως καρκίνων του μαστού, του δέρματος, του παγκρέατος και του παχέος εντέρου σε τρωκτικά [6]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, αρκετές από αυτές τις ενώσεις, μεταξύ των οποίων υπεραλλυλική αλκοόλ και λιμονένιο, είναι υπό δοκιμή σε τρέχουσες ανθρώπινες μελέτες [7-9].

τερπινεν-4-όλη, ένας από τους κύριους δραστικών συστατικών του ελαίου τεϊόδεντρου , αποτελείται από ένα μίγμα από περισσότερα από 100 διαφορετικές ενώσεις, και βρίσκεται σε μια ποικιλία από αρωματικά φυτά (πορτοκάλια, μανταρίνια, ρίγανη, δέντρο LEMONWOOD Νέα Ζηλανδία, Ιαπωνικά cedarand μαύρο πιπέρι) [10]. Τερπινεν-4-όλης είναι ένας ισχυρός βακτηριοκτόνος παράγοντας [11] που διαθέτουν αντιμυκητιακές ιδιότητες [12]. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον του

in vitro

δράση ενάντια

Staphylococcus aureus

και

C

.

albicans

[13,14]. Αποδείχθηκε ότι ο συνδυασμός αυτής της φυσικής ουσίας και τα συμβατικά φάρμακα μπορεί να βοηθήσει στην αντιμετώπιση ανθεκτικών ζύμης και βακτηριδιακών μολύνσεων.

Αρκετές πρόσφατες αναφορές έχουν προτείνει ότι terpinen-4-όλης επάγει αντικαρκινική δράση με επιλεκτική προκαλώντας νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο και του κυτταρικού κύκλου σύλληψης σε κυτταρικές γραμμές μελανώματος, ή με ενεργοποίηση κασπάσης-εξαρτώμενη απόπτωση σε κύτταρα ανθρώπινου μελανώματος, ιδιαίτερα σε φάρμακο (αδριαμυκίνη) ανθεκτικών κυττάρων [15,16]. Επιπλέον, τερπινεν-4-όλη δείχθηκε να αποσπάσει μια δοσοεξαρτώμενη κυτταροτοξική απόκριση στην ανθρώπινη μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα, πιθανώς μέσω της συμμετοχής της μιτοχονδριακής αποπτωτικό μονοπάτι [17].

CD24 είναι ένα μικρό , βαριά γλυκοζυλιωμένη βλεννίνη σαν πρωτεΐνη κυτταρικής επιφάνειας αγκυροβολημένο στη μεμβράνη μέσω γλυκοσυλ φωσφατιδυλινοσιτόλη (GPI) [18]. CD24 είναι γνωστό ότι υπερεκφράζεται σε διάφορους ανθρώπινους κακοηθειών, τόσο στερεά και αιματολογικές [19], και είναι συνήθως δεμένο με μια πιο επιθετική πορεία της νόσου [18,20,21]. Δείξαμε ότι το αντι-CD24 που βασίζονται ανοσοθεραπεία καρκίνου έχει δυνατότητες κλινικής εφαρμογής σε στερεούς όγκους [21-23]. Ως εκ τούτου, ο συνδυασμός του terpinen-4-όλης μαζί με θεραπεία αντι-CD24 αξιολογήθηκε σε αυτό το έργο.

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε ως στόχο να δείξει τις αντικαρκινικές δράσεις της terpinen-4-όλης σε διάφορους τύπους καρκίνου κύτταρα

in vitro

και

in vivo

. Είναι, επίσης, αποδειχθεί ότι τερπινεν-4-όλης μπορεί να αποκαταστήσει τη δραστικότητα του cetuximab σε όγκους με μεταλλαγμένο RAS.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

Όλα τα αντιδραστήρια αγοράστηκαν από την Sigma, Ισραήλ εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Τα μέσα κυτταρικής καλλιέργειας και τα πρόσθετα ελήφθησαν από Beit-Haemek, Ισραήλ. Αννεξίνη V και ιωδιούχο προπίδιο αγοράστηκαν από Biotium

Τα ακόλουθα υλικά δοκιμάστηκαν:.

τερπινένιο-4-όλη

Μείγμα 1 = γ-τερπινένιο, α-τερπινένιο, 1,8-κινεόλη, ρ-κυμένιο, τερπινένιο-4-όλης

Μείγμα 2 = γ-τερπινένιο, α-τερπινένιο, 1,8-κινεόλη, ρ-κυμένιο,

Η

Η αναλογία της κάθε ένωσης περιγράφεται στον πίνακα 1.

Η

Τα παρακάτω φάρμακα χημειοθεραπείας και τα αντισώματα δοκιμάστηκαν:

οξαλιπλατίνη

® (οξαλιπλατίνη) σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονται μεταξύ 0,2 -0.5 μΜ

5-FU (φθοριοουρακίλη) -.. 0,3-0,5 μΜ

GEMZAR (γεμσιταβίνη) – 0.1-1 μΜ

Tarceva (0,05-0,1 μΜ) .

Erbitux (Cetuximab) σε μια κλίμακα συγκεντρώσεων από 1 μΜ.

εξανθρωπισμένα αντι-CD24 mAb (εξανθρωπισμένο αντίσωμα IgG1 που δεσμεύεται με την πρωτεΐνη της κυτταρικής επιφανείας CD24) σε συγκεντρώσεις 75-150 μg του /ml.

Η

Οι κυτταρικές σειρές

Ανθρώπινο CRC (ΗΤ29, HCT116, COLO320), γαστρικό καρκίνωμα (AGS), του παγκρέατος (COLO357, Panc-1, MIA-PACA) γραμμές κυττάρων αναπτύχθηκαν σε μέσο Dulbecco υψηλής γλυκόζης τροποποιημένο Eagle (ϋΜΕΜ) συμπληρωμένο με 5% θερμο-απενεργοποιημένο (HI) ορό εμβρύου μόσχου (FBS), 1% γλουταμίνη και στρεπτομυκίνη /πενικιλίνη. Ένα ανεξάρτητο από ανδρογόνο προστάτη (DU145, CL-1), και ορθοκολικό καρκίνο κύτταρα DLD1 αναπτύχθηκαν σε μέσο RPMI-1640 συμπληρωμένο με 5% ΗΙ-FBS.

ΜΤΤ βιωσιμότητα κυττάρου δοκιμασία

Cells σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων (1×10

4 κύτταρα /φρεάτιο) σε πλήρες μέσο. Την επόμενη ημέρα, διαφορετικές συγκεντρώσεις των ανωτέρω περιγραφείσες παράγοντες προστέθηκαν στα κύτταρα εις τριπλούν. Στις 72 ώρες αργότερα, το μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο (100 μΐ ανά φρεάτιο) που περιέχει 1 mg /ml 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ) και επωάστηκαν για 2 -4 h. ΜΤΤ-φορμαζάνης κρύσταλλοι διαλύθηκαν με την προσθήκη 100 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος εκχύλισης. Η απορρόφηση στα 570 nm και ένα μήκος κύματος αναφοράς 690 nm καταγράφηκε σε ένα αυτοματοποιημένο αναγνώστη μικροπλακός. Ο σχετικός αριθμός των βιώσιμων κυττάρων σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα.

Επιμόλυνση και λουσιφεράσης δοκιμασία

Οι επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας jetPEI

™ (Polyplus επιμόλυνση Inc, ΝΥ, USA) σύμφωνα με την τις οδηγίες του κατασκευαστή. 5 χ 10

5HCT116 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων για Luc δοκιμασίες. Την επόμενη μέρα, όταν τα κύτταρα ήταν περίπου 50% συρροή, συν-μορφομετατροπή με 3 μg φορέα ΡΥ4-SV40-LUC συν 0,3 ng του pRL-CMV (Promega) διεξήχθη. 24 ώρες μετά την διαμόλυνση μέσο αντικαταστάθηκε και τα κύτταρα εκτέθηκαν σε cetuximab, διαφορετική συγκέντρωση terpinen-4-όλης ή αφεθεί χωρίς θεραπεία. δοκιμασία Luc εκτελέστηκε 48 ώρες μετά μετά τη θεραπεία. Εν συντομία, τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με PBS και στη συνέχεια λύθηκαν σε 250 ~ μΙ ρυθμιστικού διαλύματος λύσεως για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν στις 14.000 rpm για 5 λεπτά, και 20 μΐ από κάθε προϊόν λύσης χρησιμοποιήθηκαν για να μετρηθεί η έκφραση του γονιδίου αναφοράς Luc. Η δραστηριότητα Luc κανονικοποιήθηκε σε δραστικότητα Renilla Luc από έναν παράλληλο συν-επιμόλυνση του pRL-CMVDual σύστημα Luc, Promega).

Ανίχνευση κυτταρικού θανάτου

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 12-φρεατίων ( 1×10

5 κύτταρα /φρεάτιο) σε πλήρες μέσο και υποβάλλεται σε επεξεργασία με terpinen-4-όλης σε διάφορες συγκεντρώσεις για 72 ώρες. Annexin V ανιχνεύθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και στη συνέχεια επωάζονται σε ένα διάλυμα του ιωδιούχου προπιδίου πυρηνική βαφή μεμβράνη αδιαπέραστη. Τα κύτταρα στη συνέχεια αναλύθηκαν αμέσως με κυτταρομετρία ροής [FACSCalibur (Becton Dickinson, CA)], και τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με το πρόγραμμα CELLQuest (Becton Dickinson).

μοντέλο ξενομοσχεύματος για τη μέτρηση

in vivo

αντικαρκινική δραστικότητα του μόνο και σε συνδυασμό με βιολογικούς παράγοντες terpinen-4-όλης

Αρσενικά αθυμικά γυμνά ποντίκια, ηλικίας 6-8 εβδομάδων, (Harlan Laboratories) στεγάστηκαν σε αποστειρωμένα κλουβιά και αντιμετωπίζεται με ασηπτικές προφυλάξεις. Είχαν τρέφονται κατά βούληση. Για τη δοκιμή το θεραπευτικό δυναμικό terpinen-4-όλης, εκθετικά αναπτυσσόμενα καρκινικά κύτταρα συλλέχθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε μία τελική συγκέντρωση 5×10

6 κύτταρα ανά 0,1 ml PBS ανά ένεση. Τα κύτταρα εγχύθηκαν υποδορίως στο πλευρό των ποντικών. Όταν οι όγκοι ήταν ψηλαφητοί (~ 0,3 cm

3), οι ποντικοί χωρίστηκαν τυχαία σε ομάδες και άρχισε η θεραπεία (ενδοπεριτοναϊκή και /ή ενδοογκική ενέσεις). Τα ζώα υποβλήθηκαν σε αγωγή δύο φορές την εβδομάδα για 3 εβδομάδες. Μπορούν ζυγίστηκαν και ο όγκος του όγκου μετρήθηκε με παχύμετρο και χαράσσεται κάθε 3 ημέρες ξεκινώντας από την έναρξη της θεραπείας. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε ως 4 /3π ∙ ένα ∙ β

2. Στο τέλος του πειράματος, οι ποντικοί αναισθητοποιούνται και θανατώνονται με αυχενική εξάρθρωση και οι όγκοι αποκόπηκαν.

Στατιστικά

Δεδομένα από το

in vitro μελέτες

παρουσιάζονται ως σημαίνουν ± SD συνόλων δεδομένων όπως προσδιορίζεται εις τριπλούν. Η στατιστική σημαντικότητα μεταξύ των αγωγών προσδιορίστηκε με t-test του Student, και

P

τιμές & lt? 0.05 θεωρήθηκαν σημαντικές. Στο

στο

vivo μελέτες, οι ποντικοί που φέρουν όγκο τυχαιοποιήθηκαν σε 5 ομάδες θεραπείας και οι όγκοι των όγκων περιοδικώς παρακολουθήθηκε και υπολογίστηκε ως 4 /3π ∙ ένα ∙ b

2. Σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων και σε διαφορετικά χρονικά σημεία προσδιορίστηκαν από t-test του Student.

έγκριση Μελέτη

Η μελέτη εγκρίθηκε από την θεσμική επιτροπή για την καλή διαβίωση των ζώων στο Τελ-Αβίβ Sourasky Medical Center.

Αποτελέσματα

Αναγνώριση terpinen-4-όλη ως το αποτελεσματικό συστατικό

Δύο μίγματα με σύνθεση διαφορετική monoterpens εξετάστηκαν (Πίνακας 1). Μείγμα 1 ήταν σημαντικά πιο αποτελεσματική και τοξικό από το μείγμα 2 (

P & lt?. 0

005

). Η κύρια διαφορά μεταξύ των δύο ήταν τερπινεν-4-όλη. Τα αποτελέσματα (Σχήμα 1Α) ενδείκνυται για σημαντικές διαφορές στην επιβίωση των κυττάρων μεταξύ των μειγμάτων, που μας επιτρέπει να εντοπίσει terpinen-4-όλης και η συμβολή του στην κυτταροτοξική δράση.

Α. Ταυτοποίηση και απομόνωση του terpinen-4-όλη. Δύο μείγματα (σύνθεση τους περιγράφεται στον Πίνακα 1) του monoterpens δοκιμάστηκαν σε ορθοκολικό (HCT116, DLD1, COLO320), γαστρικό (AGS), του παγκρέατος (PANC-1, COLO357, MIA-PACA) και του προστάτη (CL-1, DU145 ) καρκινικές κυτταρικές γραμμές. 1×10

4 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων σε πλήρες μέσο. 0.05% των μιγμάτων προστέθηκαν στα κύτταρα για την επόμενη ημέρα. Η επιβίωση των κυττάρων αξιολογήθηκε με ενζυματική ΜΤΤ assay72 ώρες μετά τη θεραπεία. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD από ένα σύνολο δεδομένων προσδιορίζεται εις τριπλούν. *

P

& lt? .

05

, **

P

& lt? .

005

. Β τερπινεν-4-όλη δραστηριότητα δεν εξαρτάται από την παρουσία του DMSO. 1×10

4CRC, κύτταρα γαστρικού, του παγκρέατος και του καρκίνου του προστάτη σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πλήρη medium.0.05% των terpinen-4-όλης με ή χωρίς 0,01% DMSO προστέθηκε στα κύτταρα για την επόμενη ημέρα. Η επιβίωση των κυττάρων αξιολογήθηκε με ενζυματική ΜΤΤ assay72 ώρες μετά τη θεραπεία. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD από ένα σύνολο δεδομένων προσδιορίζεται εις τριπλούν. *

P

& lt? .

05

, **

P

& lt? .

005

.

Η

Καμία επίδραση του DMSO στη δραστηριότητα της terpinen-4-όλη

Ένα από τα εμπόδια που συναντούν κατά τη χρήση κυτταροτοξικών ενώσεων ως θεραπευτικών παράγοντες είναι χαμηλή διαλυτότητά τους σε διαλύματα φαρμακευτικά και χαμηλή ικανότητά τους να διεισδύουν εντός των κυττάρων. Στο μέτρο αυτό, εξετάσαμε αν terpinen-4-όλη θα είναι ενεργός απουσία διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO). Το DMSO χρησιμοποιείται για τη διάλυση terpinen-4-όλη και την επίδρασή της αξιολογήθηκε. Προέκυψε ότι η κυτταροτοξική δραστικότητα του terpinen-4-όλης δεν εμποδιζόταν από την προσθήκη DMSO (Σχήμα 1Β). Αρκετές συγκεντρώσεις terpinen-4-όλης (0,005% -0,1%) με και χωρίς DMSO ελέγχθηκαν (τα δεδομένα δεν φαίνονται) και η διαφορά στην επίδραση της DMSO παρατηρήθηκε κυρίως σε υψηλότερες δόσεις terpinen-4-όλη. DMSO φάνηκε παρεμβαίνουν ή αναστέλλουν τη βιολογική δράση του terpinen-4-όλης, ίσως εμποδίζοντας την απορρόφηση αυτού του βιολογικά δραστικού μορίου.

τερπινεν-4-όλη ως ένα αντικαρκινικό παράγοντα

τερπινεν -4-όλη ανέστειλε την ανάπτυξη του παχέος (Σχήμα 2Α), του παγκρέατος (σχήμα 2Β), γαστρικό (Σχήμα 2C) και του προστάτη (Σχήμα 2D) καρκίνων σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο [10% (σε 0,005%) – 90 (σε 0,1%) αναστολή ανάπτυξης)], όπως μετρήθηκε ποιοτικώς με μικροσκοπικές παρατηρήσεις (τα δεδομένα δεν φαίνονται) και ποσοτικά με τον προσδιορισμό ενζυματική ΜΤΤ (Σχήμα 2).

1×10

4 HCT116, DLD1, ΗΤ29 και Colo320 CRC (Α), MIA-PACA, Colo357 και Panc-1 παγκρεατικού (Β), AGS γαστρικό (C), και DU145 και CL-1 καρκίνου του προστάτη κύτταρα (D) σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων σε πλήρες μέσο. Αρκετές συγκεντρώσεις terpinen-4-όλη [0,005%, 0,01%, 0,05% και 0,1 (ν /ν)] προστέθηκαν στα κύτταρα για την επόμενη ημέρα. Η επιβίωση των κυττάρων αξιολογήθηκε με δοκιμασία ενζυματικής ΜΤΤ 72 ώρες μετά τη θεραπεία. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD από ένα σύνολο δεδομένων προσδιορίζεται εις τριπλούν. *

P

& lt? .

05

, **

P

& lt? .

005

Η

terpinen-4-όλη επάγει την απόπτωση και όχι νέκρωσης

Οι χαμηλές συγκεντρώσεις της terpinen-4-όλη (0,005 έως 0,01%) ανέστειλε κυττάρων HCT116 πολλαπλασιασμό σε ένα μέτριο τρόπο (20-30%) όπως μετράται με την ΜΤΤ δοκιμασία βιωσιμότητας. Υψηλές συγκεντρώσεις (0,05-0,1%), που προκαλείται από μαζικό θάνατο των κυττάρων (75-90%). Όπως μπορεί να φανεί στο Σχήμα 3, η απόπτωση είναι ο μηχανισμός κυτταρικού θανάτου υπεύθυνο για την κυτταροτοξική δράση που προκαλείται από τερπινεν-4-όλη. Πρόωρη αποπτωτικό θάνατο προκλήθηκε με χαμηλή δόση terpinen-4-όλης, ενώ τα ποσοστά των καθυστερημένων απόπτωσης αυξήθηκε σε υψηλότερες συγκεντρώσεις. Δεν παρατηρήθηκαν νεκρωτικών κυττάρων.

1×10

5 κύτταρα HCT116 σπάρθηκαν σε πλάκες 12-φρεατίων σε πλήρες μέσο και εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις terpinen-4-όλη επί 72 ώρες. Ο θάνατος των κυττάρων μετρήθηκε με FACS μετά από χρώση με Annexin V και ΡΙ βαφές. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD από ένα σύνολο δεδομένων προσδιορίζεται εις τριπλούν. *

P

& lt? .

05

, **

P

& lt? .

005

Η

Ενίσχυση της terpinen-4-όλης

αποτελεσματικότητα

τερπινεν-4-όλης συνδυάστηκε με διαφορετικούς τύπους συμβατική χημειοθεραπεία, ανάλογα με τον τύπο του υπό θεραπεία καρκίνου. Για θεραπεία CRC, τερπινεν-4-όλης συνδυάστηκε με οξαλιπλατίνη (Σχήμα 4Α) και 5-FU (Σχήμα 4Β). Μια εντυπωσιακή συνεργική επίδραση αναστολής της ανάπτυξης επιτεύχθηκε (83% και 91%, για οξαλιπλατίνη και 5-FU, αντίστοιχα) στη συνδυασμένη αγωγή σε σύγκριση με κάθε παράγοντα μόνο του [12% (οξαλιπλατίνη), 25% (terpinen-4-όλη) και 20% (5-FU)]. Τα αποτελέσματα αυτά έχουν επιτευχθεί στατιστική σημαντικότητα,

P & lt? 0

005

.. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα (Σχήμα 4C-4F). Terpinen-4-όλης αύξησε εντυπωσιακά την αποτελεσματικότητα της gemcitabine και του Tarceva (60-85% κυτταρικό θάνατο).

1×10

4 κύτταρα CR DLD1 (Α, Β), και του παγκρέατος MIA-PACA ( C, D) και Panc-1 (Ε, F κύτταρα) σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων σε πλήρες μέσο. Την επόμενη ημέρα, οξαλιπλατίνη σε συγκέντρωση 0.2μΜ και terpinen-4-όλης σε συγκέντρωση 0,01% (Α), 5-FU σε συγκέντρωση 0.3μΜ και terpinen-4-όλης σε συγκέντρωση 0,01% ( Β), γεμσιταβίνη σε συγκέντρωση 0,1 μΜ και terpinen-4-όλης σε συγκέντρωση 0,01%, (C) gemcitabine σε μία συγκέντρωση 0,1 μΜ, υδροχλωρικά erlotinib (Tarceva

®) σε συγκέντρωση 0,1 μΜ, και terpinen-4-όλης σε συγκέντρωση 0,01% (D), γεμσιταβίνη σε συγκέντρωση 1 μΜ και terpinen-4-όλης σε συγκέντρωση 0,01% (Ε), γεμσιταβίνη σε μια συγκέντρωση 1 μΜ, anderlotinib υδροχλωρικά (Tarceva

®) σε συγκέντρωση 0,1 μΜ, και terpinen-4-όλης σε συγκέντρωση 0,01% (F) προστέθηκαν για 72 ώρες. Η επιβίωση των κυττάρων αξιολογήθηκε με τη δοκιμασία ενζυματική ΜΤΤ. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD από ένα σύνολο δεδομένων προσδιορίζεται εις τριπλούν. *

P

& lt? .

05

, **

P

& lt? .

05

Η

Ενισχυμένη κυτταροτοξικότητα της terpinen-4-όλη με βιολογικούς παράγοντες

Συνδυάζοντας terpinen-4-όλης είτε με εξανθρωπισμένο αντι-CD24 αντίσωμα ωριμασμένης (Arber του εργαστήριο, το Τελ Αβίβ, Ισραήλ) ή το χιμαιρικό anti EGFR αντισώματα (το cetuximab, Merck Serono) είχε ως αποτέλεσμα μια αξιοσημείωτη συνεργιστική δράση αναστολής της ανάπτυξης (85-90%,

P & lt?. 0

005

) στην ανθρώπινη CRC (Σχήμα 5Α και 5Β) και κύτταρα καρκίνου του προστάτη (Σχήμα 5C και 5D).

1×10

4 CR DLD1 και κύτταρα HCT116 (Α, Β, Ε), και του προστάτη CL-1 κύτταρα (C, D) σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων σε πλήρες μέσο. Την επόμενη ημέρα, τερπινεν-4-όλης σε συγκέντρωση 0,01% και τα εξανθρωπισμένα αντισώματα αντι-CD24 (150μg /ml) (A, C), και terpinen-4-όλης σε συγκέντρωση 0,01% και cetuximab σε ένα συγκέντρωση 1 μΜ (B, D, E) προστέθηκαν για 72 ώρες. Η επιβίωση των κυττάρων αξιολογήθηκε με τη δοκιμασία ενζυματική ΜΤΤ. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD από ένα σύνολο δεδομένων προσδιορίζεται εις τριπλούν. (F) 0.4X10

6 κύτταρα HCT116 σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων εις τριπλούν. Την επόμενη ημέρα, συν-μορφομετατροπή με φορέα ΡΥ4-SV40-LUC και pRL-CMV εκτελέσθηκε. 24 ώρες μετά την διαμόλυνση μέσο αντικαταστάθηκε και τα κύτταρα εκτέθηκαν σε cetuximab, διαφορετική συγκέντρωση terpinen-4-όλης ή αφεθεί χωρίς θεραπεία. δοκιμασία Luc εκτελέστηκε 48 ώρες μετά μετά τη θεραπεία. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD από ένα σύνολο δεδομένων προσδιορίζεται εις τριπλούν. *

P

& lt? .

05

, **

P

& lt? .

05

Η

terpinen-4-όλη αποκαθιστά την ευαισθησία του

K-ras

μεταλλαγμένα καρκινικά κύτταρα να ceteximub

Τα κύτταρα DLD1 CRC φέρουν μια μετάλλαξη στο

KRAS

ογκογονίδιο. Ως εκ τούτου, είναι ανθεκτικά στην (EGFR) θεραπεία αντι-επιδερμικού αυξητικού παράγοντα. Συνδυάζοντας terpinen-4-όλης (0,01%) με cetuximab (1 μΜ) οδήγησε σε μια μάλλον εντυπωσιακό αποτελεσματικότητα ενός αναστολής ανάπτυξης 85-90%. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν σε άλλο

KRAS

μεταλλαγμένο κύτταρο CRC γραμμή (HCT116) (Σχήμα 5Ε), με μια αναστολή 80% της ανάπτυξης (

P & lt?. 0

005

) για τη συνδυασμένη θεραπεία.

Μειωμένη δραστικότητα του

K-ras

μονοπάτι με terpinen-4-όλης

σηματοδότησης προς τούτο χρησιμοποιήσαμε το (Ets /Αρ1)

4 RAS-αποκριτικού στοιχείου (ΡΥ4) κατασκεύασμα, το οποίο είχε προηγουμένως κατασκευαστεί [24-26]. Η δραστικότητα του

KRAS

μονοπάτι αξιολογήθηκε σε μεταλλαγμένα κύτταρα CRC (HCT116) (Εικ 5F). Η επιμόλυνση με δραστικότητα ΡΥ4-SV40-Luc παρουσία terpinen-4-όλης (0,005 και 0,01%) ήταν 1,3 και 1,5 φορές μικρότερη σε σύγκριση με την δραστηριότητα εν τη απουσία του (

P & lt?. 0

05

) _. Δεν παρατηρήθηκε καμία επίδραση μετά την έκθεση σε cetuximab (1 μΜ).

Αναστολή της υποδόριας ανάπτυξης όγκου DLD1 σε ποντικούς με terpinen-4-όλης

Στη συνέχεια, ελέγξαμε το δυναμικό αντικαρκινική δραστικότητα του terpinen-4-όλη

in vivo

. Η ενδονεοπλασματική ενέσεις (5 ενέσεις) της ενώσεως (0,1% και 1%) δόθηκαν δύο φορές την εβδομάδα για γυμνούς ποντικούς (η = 6) που φέρουν ξενομοσχεύματα κυττάρων CRC DLD1. Η θεραπεία ξεκίνησε όταν οι όγκοι ήταν 0,3-0,5 cm

3. Παρατηρήθηκε σημαντική αναστολή της ανάπτυξης του όγκου? 40% και 70% μείωση στον όγκο του όγκου και περίπου 25% και 50% μείωση του βάρους του όγκου (Σχήμα 6Α). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν σε ένα άλλο πείραμα (Εικόνα 6Β). Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές ανεπιθύμητες επιδράσεις παρατηρήθηκαν (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Εκθετικά αναπτυσσόμενα DLD1 καρκινικά κύτταρα συλλέχθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε μία τελική συγκέντρωση 5×10

6 κύτταρα ανά 0,1 ml PBS ανά ένεση. Όταν οι όγκοι ήταν ψηλαφητοί, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε ομάδες και η θεραπεία ξεκίνησε [εντός του όγκου εγχύσεις terpinen-4-όλης (Α, Β) ή εντός του όγκου εγχύσεις terpinen-4-όλης και ενδοπεριτοναϊκές ενέσεις του cetuximab (C)] . Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή δύο φορές την εβδομάδα. Μπορούν ζυγίστηκαν και ο όγκος του όγκου μετρήθηκε με παχύμετρο κάθε 3 ημέρες ξεκινώντας από την έναρξη της θεραπείας με terpinen-4-όλη. Ο όγκος του όγκου συναρτήσει του χρόνου της θεραπείας σχεδιάστηκαν. Στο τέλος του πειράματος, οι ποντικοί αναισθητοποιούνται και θανατώνονται με αυχενική εξάρθρωση και οι όγκοι αποκόπηκαν και μετρήθηκαν για τον όγκο και το βάρος. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD. *

P

& lt? .

05

, **

P

& lt? .

005

Η

συνδυασμένη αναστολή της ανάπτυξης των υποδόριων όγκων σε ποντίκια

Όταν κάποιος διαμέτρου του όγκου έφθασε το μέγεθος 0,5 mm εντός του όγκου ενέσεις terpinen-4-όλη (0,1%) μαζί με συστηματική (ΙΡ) χορήγηση του cetuximab (10 mg /kg) είχε ως αποτέλεσμα μια σημαντική μείωση στον όγκο του όγκου (62% ± 2,5%,

P & lt?. 0

05

) και το βάρος (62,5% ± 3%,

P & lt?. 0

05

) (Σχήμα 6C)

Σχεδιασμός μια πιο αποτελεσματική διαμόρφωση των τερπινεν-4- ol

αξιολογήθηκαν δύο διαφορετικές τυποποιήσεις του terpinen-4-όλης

in vivo

, ένα νανο και σκευάσματα εναιωρήματος. Η τελευταία προέκυψε ως πιο αποτελεσματικά και ασφαλή (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η συστηματική χορήγηση του εναιωρήματος (1 και 4 mg) σε ποντικούς που φέρουν ξενομοσχεύματα του CRC κυττάρων (HCT116) είχε σαν αποτέλεσμα μια εντυπωσιακή μείωση στον όγκο του όγκου (32% ± 1,1%,

P & lt?. 0

05

και 72% ± 0,7%,

P & lt?. 0

005

, αντίστοιχα) και βάρους (26% ± 1,19 και 70% ± 0,71%,

P & lt? 0

.

005

, αντίστοιχα) σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 7).

Εκθετικά αναπτυσσόμενα HCT116 κύτταρα καρκίνου συλλέχθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε μία τελική συγκέντρωση 5×10

6 κύτταρα ανά 0,1 ml PBS ανά ένεση. Όταν οι όγκοι ήταν ψηλαφητοί, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε 3groups και τη θεραπεία, που αποτελείται από ενδοπεριτοναϊκές ενέσεις terpinen-4-όλης (1 και 4 mg /kg), ξεκίνησε. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή δύο φορές την εβδομάδα. Μπορούν ζυγίστηκαν και ο όγκος του όγκου μετρήθηκε με παχύμετρο κάθε 3 ημέρες ξεκινώντας από την έναρξη της θεραπείας με terpinen-4-όλη. Ο όγκος του όγκου συναρτήσει του χρόνου της θεραπείας σχεδιάστηκαν. Στο τέλος του πειράματος, οι ποντικοί αναισθητοποιούνται και θανατώνονται με αυχενική εξάρθρωση και οι όγκοι αποκόπηκαν και μετρήθηκαν για τον όγκο και το βάρος. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD. *

P

& lt? .

05

, **

P

& lt? .

005

Η

Συζήτηση

Οι αντικαρκινικές δράσεις της terpinen-4-όλης είναι εντυπωσιακά σε διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων, τόσο

in vitro

και

in vivo

.

τερπινεν-4-όλης είναι ένα σημαντικό συστατικό του αιθέριου ελαίου που προέρχεται από διάφορα αρωματικά φυτά. Χρησιμοποιείται ως ένα αντι-φλεγμονώδη και αντιοξειδωτικό παράγοντα [27-29]. Η συμβολή των terpinen-4-όλης ως ένας παράγοντας κατά του καρκίνου και οι υποκείμενες μονοπάτια σηματοδότησης των διαφόρων τύπων κυτταρικού θανάτου είναι άγνωστα. Εδώ, φαίνεται ότι ο μηχανισμός δράσης της terpinen-4-όλης είναι η επαγωγή της απόπτωσης και όχι νέκρωση. Είναι, επίσης, αποδειχθεί ότι terpinen-4-όλη και διαφόρων αντικαρκινικών παραγόντων επιδεικνύουν μια συνεργιστική ανασταλτική δράση ανάπτυξης με μείωση της επιβίωσης των διαφόρων καρκινικών κυτταρικών γραμμών. Τέτοιοι συνδυασμοί ίσως αναμένεται να είναι πιο αποτελεσματικές και λιγότερο τοξικές από το χαμηλότερες συγκεντρώσεις του φαρμάκου μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία ενός ευρέος φάσματος καρκίνων.

Αξίζει να σημειωθεί, αποκατάσταση της ευαισθησίας έναντι αντι-EGFR θεραπείες (π.χ. cetuximab), σε περιπτώσεις CRC που μεταφέρουν το

KRAS

μετάλλαξη, όταν χορηγείται μαζί με terpinen-4-όλη έχει ένα πλεονέκτημα κλινική σημασία. Αποδεικνύεται με μέτρηση της δραστικότητας του προαγωγού που ανταποκρίνεται ras πριν και μετά την έκθεση σε τερπινεν-4-όλη. Έχει αποδειχθεί ότι η δραστικότητα προαγωγέα ήταν σημαντικά μειωμένη κατά την έκθεση σε Terpenin-4-όλη. Αυτή η ενδιαφέρουσα και σημαντική παρατήρηση πρέπει να επιβεβαιωθεί με περαιτέρω εργαστηριακές μελέτες πριν οδηγώντας σε οποιαδήποτε κλινική χρήση του terpinuin-4-όλη.

Ένεση terpinen-4-όλης εντός του όγκου της ανάπτυξης αξιοσημείωτα ανέστειλε όγκου, χωρίς σημαντικές αρνητικές υπάρχοντα. Σε αναζήτηση για πιο βολικό οδούς χορήγησης, δύο φαρμακευτικά σκευάσματα παρασκευάστηκαν και δοκιμάστηκαν για συστηματική χορήγηση, σκεύασμα νανο και την ανάρτηση. σκευάσματα Νάνο αύξησε το εμβαδόν της επιφάνειας και επομένως δραματικά βελτιωμένη διαλυτότητα στο νερό, βιοδιαθεσιμότητα, αποτελεσματικότητα και αποδοτικότητα. Η μορφή εναιώρημα που αποτελείται από μικρές σταγόνες /μόρια του θεραπευτικώς δραστικό συστατικό (το λάδι) σε ένα μέσο αιώρησης. Δεδομένου ότι οι νανοσταγονίδια συσχετίστηκαν με σοβαρή τοξικότητα (απώλεια σωματικού βάρους, της θνησιμότητας), η προσέγγιση ανάρτηση που ήταν στερείται παρενεργειών επιλέχθηκε για περαιτέρω διερεύνηση. Η συστηματική χορήγηση του terpinen-4-όλης με εναιώρημα συσχετίστηκε με μια σημαντική μείωση του μεγέθους του όγκου στα πειραματικά γυμνά ποντίκια.

Συνοπτικά, η χρήση ενός συνδυασμού φυτικής προέλευσης αντικαρκινικές ουσίες και χημειοθεραπευτικούς ή βιολογικούς παράγοντες για τη θεραπεία διαφόρων τύπων καρκίνου υπόσχεται, με συνεργική αποτελεσματικότητα που επιτρέπουν μια χαμηλότερη συγκέντρωση της χημειοθεραπείας και βιολογικών παραγόντων που μπορούν όχι μόνο να αυξήσει την αποτελεσματικότητα, αλλά μπορεί να ελαχιστοποιηθεί η τοξικότητα, καθώς και. Το πιο σημαντικό terpinen-4-όλης σημαντικό πλεονέκτημα είναι η δυνατότητα να αποκαταστήσει την ευαισθησία σε ανταγωνιστές EGFR σε όγκους με

Ras

μεταλλάξεις.

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς είναι ευγνώμονες προς Εσθήρ Eshkol, το θεσμικό ιατρική copyeditor, για σχολαστική επεξεργασία χαρτιού μας.