Αφηρημένο

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα (CSC) απομονώθηκαν μέσω μιας δοκιμασίας μη-προσκολλημένα νευροσφαιρών από τρεις κυτταρικές σειρές γλοιώματος: LI, U87, U373 και. Χρησιμοποιώντας μια κλωνική δοκιμασία, δυο κλώνοι επιλέχθηκαν (D2 και F11) από σφαίρες που προέρχεται από κύτταρα LI και χαρακτηρίστηκαν για την: έκφραση των δεικτών των βλαστικών κυττάρων (CD133, νεστίνη, Μουσάσι-1 και Sox2)? πολλαπλασιασμός; δυνατότητα διαφοροποίησης (που καθορίζεται από την έκφραση της ΟαΙΟ, βIII-τουμπουλίνης και GFAP)? Ca

2 + σηματοδότησης και ογκογονικότητα σε γυμνούς ποντικούς. Τόσο D2 και οι κλώνοι F11 εξέφραζαν υψηλότερα επίπεδα όλων των δεικτών των βλαστικών κυττάρων σε σχέση με τη γονική κυτταρική γραμμή. Οι κλώνοι αναπτύχθηκαν πιο αργά από ό, τι τα κύτταρα LI με αύξηση δύο φορές στο χρόνο επικαλύψεις. Δείκτες διαφοροποίησης (βIII-τουμπουλίνης και GFAP) εκφράστηκαν σε υψηλά επίπεδα και στα δύο κύτταρα LI και νευροσφαιρών. Η έκφραση του νεστίνη, Sox2, και βIII-τουμπουλίνης ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω σε D2 και F11 όταν καλλιεργήθηκαν σε μέσο που περιέχει ορό, ενώ Μουσάσι-1 αυξήθηκε. Σε αυτή την κατάσταση, ο χρόνος επανάληψη των D2 και F11 αυξηθεί χωρίς να φθάνει εκείνη των κυττάρων LI. D2, F11 και τα γονικά κύτταρα δεν εκφράζουν την τάση που εξαρτάται από Ca

2 + διαύλους αλλά παρουσίασαν αυξημένη ενδοκυτταρική Ca

2+ επίπεδα ως απάντηση στην ATP. Αυτές Ca

2+ σήματα ήταν μεγαλύτερα σε κύτταρα LI και σε σφαίρες καλλιεργηθεί σε μέσο που περιέχει ορό, ενώ ήταν μικρότερες σε μέσο χωρίς ορό. Η θεραπεία ΑΤΡ δεν επηρέασε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Τόσο D2 και F11 προκάλεσε την εμφάνιση όγκων όταν ortotopically εγχέεται σε αθυμικούς γυμνούς ποντικούς σε πυκνότητα 50 φορές χαμηλότερη από εκείνη των κυττάρων LI. Όλα αυτά τα στοιχεία δείχνουν ότι και οι δύο κλώνοι έχουν τα χαρακτηριστικά της CSC και να μοιράζονται τις ίδιες βλαστική ικανότητα ιδιότητες. Τα ευρήματα σχετικά με την έκφραση των δεικτών διαφοροποίησης και Ca

2 + διαύλους δείχνουν ότι και οι δύο κλώνοι δεν είναι σε θέση να φθάσουν στην τελική διαφοροποίηση. Και οι δύο D2 και F11 μπορεί να αντιπροσωπεύουν ένα καλό μοντέλο για τη βελτίωση των γνώσεων σχετικά με CSC στο γλοιοβλάστωμα και για τον εντοπισμό νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων

Παράθεση:. Iacopino F, Angelucci C, Piacentini R, Biamonte F, Mangiola Α, Μάιρα G, et al. (2014) Απομόνωση καρκινικά βλαστικά κύτταρα από τρεις ανθρώπινου γλοιοβλαστώματος Γραμμές κυττάρων: Χαρακτηρισμός των δύο επιλεγμένων κλώνων. PLoS ONE 9 (8): e105166. doi: 10.1371 /journal.pone.0105166

Επιμέλεια: Giovanni Camussi, Πανεπιστήμιο του Τορίνο, Ιταλία

Ελήφθη: 7 Μαρτίου, 2014? Αποδεκτές: 21 Ιουλίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 14 Αυγούστου 2014

Copyright: © 2014 Iacopino et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο έχει λάβει μια γαλλική κυβερνητική στήριξη που χορηγείται στο εργαστήριο CominLabs αριστείας και διοικείται από την Εθνική Υπηρεσία Ερευνών στην «Επένδυση για το μέλλον» πρόγραμμα πλαίσιο αναφοράς ANR-10-LabX-07-01. Είναι επίσης υποστηρίζεται από το Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Ρεν (COREC έργου που ονομάζεται Connexion, 2012-14). Ευχαριστούμε επίσης το Ευρωπαϊκό Συμβούλιο Έρευνας για το ERC-2011-ADG – Συμφωνία επιχορήγησης Αρ 290.901 – Ακρωνύμιο «NEUCOD». Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις ότι οι όγκοι είναι ιεραρχικά οργανωμένες από ετερογενείς πληθυσμούς που περιλαμβάνει ένα μικρό κλάσμα των καρκινικά βλαστικά κύτταρα (CSC). CSC μοιράζονται πολλές ομοιότητες με φυσιολογικά βλαστικά κύτταρα, όπως αυτο-ανανέωση ικανότητας και σε πολλαπλές ιδιότητες διαφοροποίηση [1]. Επιπλέον, CSC είναι εξαιρετικά ογκογόνα και μπορούν να δημιουργήσουν phenocopies του πρωτεύοντος ανθρώπινη κακοήθεια σε ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς [1]. Από κλινική άποψη, CSC είναι υπεύθυνος για τη συντήρηση του όγκου, διατήρηση, την επανάληψη και την αντίσταση σε συμβατικές θεραπείες [2] – [4].

Ένα κλάσμα CSC έχει απομονωθεί σε πολλούς καρκίνους, συμπεριλαμβανομένων γλοιώματος [2 ] – [5], με τη χρήση διαφόρων προσεγγίσεων [5] – [9]. Οι περισσότεροι CSC γλοίωμα έχουν προέλθει από κλινικά δείγματα όγκων [7], [10], [17], ενώ μόνο λίγες έχουν προέλθει από καθιερωμένες κυτταρικές σειρές: τα κύτταρα αρουραίου C6 και ανθρώπινων κακοήθων κυτταρικών σειρών γλοιώματος (U373, Α172, U87 και SU3 ) έχουν χρησιμοποιηθεί [9], [17] – [23], [24]. Μερικοί συγγραφείς δεν συνιστούμε κυτταρικές γραμμές ως πηγή της CSC επειδή αναπτύσσονται σε μέσο που περιέχει ορό, η οποία οδηγεί σε κύτταρα τα οποία διαφέρουν γενετικά και βιολογικά από εκείνες των πρωτογενών όγκων από το οποίο προήλθαν. [25] Παρ ‘όλα αυτά, καρκινικές κυτταρικές σειρές έχουν κάποια πλεονεκτήματα σε σχέση με ιστό όγκου. Πράγματι, δεν παρουσιάζουν κανένα μολυσματικών φυσιολογικών αρχέγονων κυττάρων, μπορεί να θεωρηθεί ένα ομοιογενές δείγμα και είναι εύκολο να ληφθούν μεγάλες ποσότητες από αυτά [21]. Ως εκ τούτου, την ταυτοποίηση και τον χαρακτηρισμό της CSC από τις καθιερωμένες κυτταρικές σειρές μπορεί να παρέχει σημαντικά εργαλεία για την εξερεύνηση της βιολογίας της CSC [26]. Κανένα μεμονωμένο δείκτη έχει αποδειχθεί ότι είναι επαρκής για να προσδώσει βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με τις ιδιότητες, έτσι ένας συνδυασμός διαφορετικών δεικτών χρησιμοποιείται για την ταυτοποίηση και την απομόνωση CSC σε γλοίωμα, συμπεριλαμβανομένων νεστίνη, Sox2 (SRY σχετίζονται HMG-box γονίδιο 2) και Musashi -1 (MSI-1). Αυτά τα μόρια εκφράζονται σε υψηλά επίπεδα στα νευρικά βλαστικά κύτταρα και συχνά θεωρείται σήμα κατατεθέν της αδιαφοροποίητη κατάσταση [27] – [30]

Όταν εκτίθεται σε εμβρυϊκό βόειο ορό, CSC διαφοροποιούν κάτω από το γενεαλογία του πατρικού. όγκου [6], [9], [12], [16] – [23]. Ως εκ τούτου, CSC που προέρχονται από γλοιώματα προτίμηση διαφοροποιούνται προς αστροκύτταρα, αλλά σε πολλαπλές διαφοροποίηση μπορεί περιστασιακά να παρατηρηθεί με νευρωνική καταγωγές, και μερικά μη φυσιολογικά κύτταρα με ανάμικτα φαινοτύπους. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι αυτές οι γραμμώσεις που χαρακτηρίζεται βάσει των μοριακών δεικτών, όπως το αστροκυτταρικές GFAP δείκτη, το oligodendrocytic GALC δείκτη, και το νευρωνικό δείκτη (βIII-τουβουλίνης) [7], [9], [16] – [ ,,,0],23], [25], και όχι σε λειτουργικών παραμέτρων. Για παράδειγμα, η κρίσιμη δοκιμασία για την αναγνώριση ενός νευρώνα θα πρέπει να είναι να αξιολογήσει την ικανότητα της να παράγει δυναμικά δράσης [31], [32], αλλά η δοκιμή αυτή δεν εκτελείται συνήθως. Επιπλέον, ο σημαντικός ρόλος του Ca

2 + σήματα στην ανάπτυξη του γλοιοβλαστώματος (GBM) έχει πρόσφατα αναθεωρηθεί [33].

Μερικά ενδιαφέροντα αποτελέσματα έχουν ληφθεί χρησιμοποιώντας CSC που προέρχονται από τις καθιερωμένες κυτταρικές σειρές που αφορούν επεμβατική ιδιότητες, χημειοαντίσταση, διαλογή φαρμάκων, απόπτωση, τον πολλαπλασιασμό, ανοσολογικές αποκρίσεις, και γονιδιακή έκφραση [34] – [39].

Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι U87, κυτταρικές σειρές U373 και LI περιέχει ένα κλάσμα της κύτταρα που μπορούν να σχηματίσουν σφαίρες όγκου όταν καλλιεργηθούν σε νευρωνικά μέσο βλαστοκυττάρων χωρίς ορό. Κύτταρα από σφαίρες όγκου διαθέτει την ικανότητα της αυτο-ανανέωσης και σχηματισμός δευτερογενών σφαίρες.

Είναι γνωστό ότι στην GBM υπάρχει ιστολογική μεταβλητότητα και η ανομοιογένεια [40], [41] που έχει ως αποτέλεσμα την απομόνωση των διακριτών CSC υποπληθυσμών που διατηρούν την πρωτογενή φαινότυπο όγκου και γονότυπο, όπως περιγράφηκε πρόσφατα [19], [25]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν σαφώς ότι όλα τα ανθρώπινα γλοιώματος κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν περιλαμβάνουν CSC. Επιπλέον, οι δύο κλώνοι που επιλέγονται από την κυτταρική γραμμή LI χαρακτηρίστηκαν για: έκφραση των δεικτών βλαστική ικανότητα, πολλαπλασιασμός, ικανότητα να διαφοροποιούνται, παρουσία τασεοελεγχόμενων Ca

2+ κανάλια και ΑΤΡ-εξαρτώμενη Ca

2+ σήματα, και ογκογενετικότητας μετά από ορθοτοπική μεταμόσχευση. Για τις γνώσεις μας, δεν υπάρχουν διαθέσιμα στοιχεία στη βιβλιογραφία σχετικά με την παρουσία της CSC σε αυτή την κυτταρική σειρά LI. Αυτοί οι δύο κλώνοι μπορεί να αντιπροσωπεύουν μοντέλα χρήσιμα για μελλοντικές μελέτες για κακοήθη γλοιώματα, με σκοπό να βρουν νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές

Πολιτισμού κυτταρικές σειρές γλοιώματος .

Η ανθρώπινη κυτταρική σειρά U373 (American Type Culture Collection, ATCC, Rockville, MD, USA), βαθμός αστροκύτωμα III /γλοιοβλάστωμα, παραχωρήθηκε ευγενικά από τον καθηγητή Pierluigi Navarra, Ινστιτούτο Φαρμακολογίας, του Καθολικού Πανεπιστημίου της Ιερής καρδιά, Ρώμη.

Η ανθρώπινη κυτταρική σειρά U87 (ATCC, USA), αστροκύτωμα βαθμού III /γλοιοβλάστωμα, παραχωρήθηκε ευγενικά από τον Dr. Emilio Ciusani, Εθνικό Νευρολογικό Ινστιτούτο «Carlo Besta», Μιλάνο [42].

Οι ανθρώπινες LI κυτταρική σειρά, βαθμός αστροκύτωμα IV, ευγενική δωρεά από τον καθηγητή Gabriella Ζυρί, Regina Elena Ινστιτούτο της Ρώμης [43], [44].

Οι τρεις κυτταρικές σειρές (γονική κυτταρικές σειρές ) καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco τροποποιημένο μέσο Eagle /Ham F-12 (DMEM /F12) (Gibco, Carlsbad, CA) που περιέχει 10% ορό εμβρύου βοός (FBS, EuroClone, Μιλάνο, Ιταλία), αντιβιοτικά (πενικιλίνη /στρεπτομυκίνη 100 IU /ml /100 μm /ml, EuroClone), 4-2-υδροξυαιθυλο-1-πιπεραζινυλο-αιθανοσουλφονικό οξύ (10 mM, EuroClone), γλουταμίνη (2 mM, EuroClone) και γλυκόζη (0.3% β /ο, Sigma-Aldrich, St Louis , MO, USA), αποκαλούμενο στο εξής: πρότυπο μέσο. Τα κύτταρα, τα οποία αναπτύσσονται σε μονοστιβάδα, υποκαλλιεργήθηκαν σε συρροή, και διατηρήθηκε στους 37 ° C σε υγροποιημένο αέρα ατμόσφαιρα: CO

2. (95%: 5%)

Νευροσφαιρών (NS) καλλιέργεια

Όλες οι αυξανόμενες κυτταρικές σειρές μονοστρωματική, U373 (22-25

ου πέρασμα), U87-MG (52-55

ου πέρασμα) και LI (93-95

ου πέρασμα) σπάρθηκαν σε πυκνότητα 100.000 κύτταρα /ml, σε ένα ορισμένο μέσο χωρίς ορό, DMEM /F12, συμπληρωμένο με αντιβιοτικά (πενικιλλίνη 100 IU /ml, στρεπτομυκίνη 100 μm /ml), HEPES (10 mM), γλουταμίνη (2 mM), γλυκόζη (0,3% w /v), ανασυνδυασμένο ανθρώπινο επιδερμικό αυξητικό παράγοντα (rhEGF) (20 ng /ml, R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ, USA), βασικός αυξητικός παράγοντας ινοβλαστών (bFGF, 20 ng /ml, R & ? D Systems) και συμπλήρωμα Ν-2 Plus Media (R & amp? D Systems) (Neural μέσο βλαστοκυττάρων, αποκαλούμενο στο εξής: NSCM). Το μέσο αλλάχθηκε κάθε 2 ημέρες. Σφαίρες χωρίστηκαν από μηχανικό διαχωρισμό, όταν φτάσει σε ένα μέγεθος της τάξης των 100-200 κύτταρα.

Ο περιορισμός Αραίωση /όγκου Σφαίρα Κίνηση Ανάλυση

Ένας περιορισμός της αραίωσης /όγκου Σφαίρα Κίνηση ανάλυση πραγματοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση, σε οι τρεις γονικές σειρές, η συχνότητα των όγκων κυττάρων Σφαίρες Έναρξη (TS-IC) σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται από τους Υυ Α et al. [22]. Το ποσοστό των TS-IC και η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε με τη χρήση της L-CALC (Stemsoft, Βανκούβερ, Καναδάς), ένα δωρεάν πρόγραμμα λογισμικού https://www.stemcell.com/Default.aspx.

Ενιαίου σχηματισμός αποικίας ανάλυση

μηχανική διάσταση κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων σε μια θεωρητική πυκνότητα 0.5 κύτταρα ανά φρεάτιο σε NSCM. Μετά από ολονύκτια καλλιέργεια, μικροσκοπική παρατήρηση χρησιμοποιήθηκε για τον εντοπισμό φρεάτια που περιείχαν ένα μόνο κύτταρο. σχηματισμός αποικίας βαθμολογήθηκε 15-20 ημέρες μετά την αρχική σπορά. Το ποσοστό των κυττάρων τα οποία σχηματίζονται σφαίρες προσδιορίσθηκε από τον ακόλουθο τύπο: όπου Χ (n) είναι ο αριθμός των φρεατίων στην οποία ένα μόνο κύτταρο ήταν παρούσα και Y (n) είναι ο αριθμός των πηγαδιών στα οποία ένα NS αναπτύχθηκε από ένα μόνο κύτταρο . Φρεάτια που περιέχουν είτε κανένα ή περισσότερα από ένα κύτταρο εξαιρέθηκαν για την ανάλυση.

δοκιμασίας Διαφοροποίηση των σφαιρών που προέρχεται από ένα μητρικό κύτταρο

σφαίρες γλοιώματος που προέρχεται από ένα μητρικό κύτταρο στον προσδιορισμό subsphere σχηματισμού ήταν μηχανικά διαχωρίζονται σε μονά κύτταρα που σπάρθηκαν σε πρότυπο μέσο ανεκτικό για διαφοροποίηση (χωρίς αυξητικούς παράγοντες και συμπληρωμένο με 10% του FBS) για 1-45 ημέρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα αναλύθηκαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία

Αντισώματα

Για να αξιολογηθεί η έκφραση των βλαστική ικανότητα και διαφοροποίησης δείκτες, χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα αντισώματα:. Αντι-CD133 (κλώνος AC133 ΡΕ συζευγμένο) (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Γερμανία)? αντι-νεστίνη (Chemicon, Tamecula, CA, USA)? αντι-Sox2 μονοκλωνικά, (R &? D System, MAB2018)? αντι-Musashi-1 (μονοκλωνικό, R & amp? D System, MAB2628)? αντι-γαλακτοσερεβροσίδη (ΟαΙΟ, μονοκλωνικά IgG3, Millipore Corp., Bedford, ΜΑ, USA)? αντι-γλοιακή ινώδη όξινη πρωτεΐνη (GFAP, μονοκλωνικά, IgG3, Millipore), αντι-νευρωνικά Class ΙΙΙβ-τουμπουλίνης (μονοκλωνικό IgG2a, Tuj 1 Clone, Covance Research Group Inc.).

Η κυτταρομετρία ροής

Για την αξιολόγηση της έκφρασης CD133 με κυτταρομετρία ροής, τα κύτταρα διαχωρίζονται μηχανικά, πλύθηκαν δύο φορές σε ένα διάλυμα από αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (EDTA) 2 mM σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) που περιέχει 0.5% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA), και στη συνέχεια επωάστηκαν με αντι -CD133 /1 (AC133) ΡΕ αντίσωμα (Miltenyi Biotec, Γερμανία) 1:20 για 30 λεπτά. στους 4 ° C στο σκοτάδι. Τα κύτταρα πλύθηκαν και αιωρήθηκαν σε PBS για ανάλυση. Στη συνέχεια αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής σε ένα μηχάνημα σύστημα PCA-96 (γκουάβα Technologies, Hayward, CA, USA).

Η κυτταρική σειρά Caco-2, μία συνεχής γραμμή ενός ετερογενούς ανθρώπινων επιθηλιακών ορθοκολικό αδενοκαρκίνωμα, ήταν που χρησιμοποιείται ως θετικός μάρτυρας.

Ανοσοκυτοχημεία

κρυοτομής της NS.

Σύνολο NS συλλέχθηκαν από φιάλες καλλιέργειας, πλύθηκαν με PBS για την απομάκρυνση της περίσσειας του μέσου καλλιέργειας, και σταθερή σε 4%

παραφορμαλδεΰδη

(PFA) για 10 λεπτά. σε θερμοκρασία δωματίου. NS στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε ένα PBS /20% σακχαρόζη για όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Στη συνέχεια συναρμολογείται σε OCT ένωση (οπτική θερμοκρασία κοπής) (Sakura, Tissue Tek? Torrance, CA), που ακολουθείται από κατάψυξη στους -80 ° C. Φέτες 10 μm ελήφθησαν σε κρυοστάτη, και τοποθετείται σε διαφάνειες ( «Σούπερ Frost Plus», Menzel-Glaser, Braunschweig, Γερμανία).

Τα κύτταρα που αναπτύσσονται σε μονοστιβάδα σπάρθηκαν για «Σούπερ Frost Plus» διαφάνειες και , στους διάφορους χρόνους καλλιέργειας, αυτά σταθεροποιήθηκαν σε 4% PFA για 10 λεπτά. Μετά την πλύση με PBS, τα πλακίδια διατηρήθηκαν στους -80 ° C έως ότου υπέστησαν επεξεργασία.

Για ανοσοκυτταροχημική ανάλυση, μετά την επανυδάτωση με PBS, η ίδια διαδικασία ακολουθήθηκε για κατεψυγμένες τομές και καλυπτρίδες. Τομές καλύφθηκαν με διάλυμα αποκλεισμού (Super μπλοκ, UCS Diagnostics, Roma, Italia) για 8 λεπτά. ή με 0,3% (ν /ν) TritonX-100, 1% (w /v) BSA και 10% (ν /ν) «κανονικό ορό γάιδαρος» σε PBS για 1 ώρα. Ακολούθως, επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα (αραιωμένα σε διάλυμα αποκλεισμού): αντι-νεστίνη (1:200)? αντι-Sox2 (1:50)? αντι-Msi-1 (1:200)? αντι-GalC (1:100)? αντι-GFAP (1:500)? αντι-βIII-τουμπουλίνης (1:200). Μετά την έκπλυση με ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, φέτες επωάστηκαν με το πολυμερές συζυγές HRP (SuperPicture Polymer Detection Kit, Zymed, San Francisco, CA, USA), και μετά από ένα στάδιο πλύσης, 3,3′-διαμινοβενζιδίνη (Vector, Burlingame, CA, USA ) χρησιμοποιήθηκε ως χρωμογόνο. Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη Harri του. Οι αρνητικοί έλεγχοι πραγματοποιήθηκαν από την παράλειψη του πρωτογενούς αντισώματος.

Western κηλίδας ανάλυση

Τα κύτταρα από δύο καλλιέργειες μονοστιβάδας και NS, μετά από 0-45 ημέρες καλλιέργειας, συλλέχθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (150 mM NaCl, 1% Nonidet Ρ-40, 0,5% Triton Χ-100, 0,5 mM EDTA, 0,1% SDS, 50 mM Tris-HCl, ρΗ 7.6), που περιέχει κοκτέιλ αναστολέων πρωτεάσης (Sigma-Aldrich), και 17,4 μg /ml φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο (Sigma-Aldrich). Εκχυλίσματα πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκαν με δοκιμασία πρωτεΐνης Bradford. Για την ανάλυση Western-κηλίδος, 50 μg ολικών πρωτεϊνών διαχωρίστηκαν σε μετουσίωσης γέλες πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE): 10% (MSI-1, βIII-τουμπουλίνης) και 8% (νεστίνη) και μεταφέρθηκε σε διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF? Immobilon Ρ , Millipore, USA) μεμβράνη με ηλεκτροκηλίδωση. Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν με PBS-T (PBS ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα με 0.1% Tween-20) που περιέχει 5% BSA και στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύχτα με πρωτεύοντα αντισώματα. Μετά την πλύση για 3 × 5 λεπτά., Μεμβράνες ανιχνεύθηκαν 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με δευτερεύον αντίσωμα (προϊόν σύζευξης υπεροξειδάσης IgG αντι-ποντικού, Sigma, 1:10,000). Η αποκάλυψη έγινε με χημειοφωταύγεια

Τα σήματα προσδιορίστηκαν ποσοτικά με πυκνομετρική σάρωση (σύστημα τεκμηρίωσης ChemiDoc /QuantityOne λογισμικό ποσοτικοποίησης? Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)..

Ομοεστιακή Ca

2+ απεικόνισης απεικόνισης

Ομοεστιακή Ca

2 + διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32]. Εν συντομία, τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες επωάστηκαν για 30 λεπτά. στους 37 ° C με το Ca

2 + ευαίσθητου φθορίζουσα χρωστική Fluo-4 ΑΜ (2,5 μΜ, Invitrogen, San Giuliano Milanese, Ιταλία) σε διάλυμα Tyrode που περιείχε: 150 mM NaCl, 4 mM KCl, 2 mM MgCl

2, 10 mM γλυκόζη, 10 mM HEPES και 2 mM ΟαΟ

2. Το ρΗ ρυθμίστηκε στο 7,4 με ΝαΟΗ. Τα κύτταρα χρωστικής φορτωμένα πλύθηκαν και διατηρήθηκαν σε καλυπτρίδες για 30 λεπτά. σε θερμοκρασία δωματίου (23-25 ​​° C) σε διάλυμα του Tyrode φρέσκο ​​για να επιτρέπει πλήρη βαφή de-εστεροποίηση. Οι καλυπτρίδες στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε ένα θάλαμο διάχυσης που διατίθενται στην σκηνή ενός ανεστραμμένου μικροσκοπίου (DM IRE2? Leica Microsystems, Wetzlar, Γερμανία) που συνδέεται με ένα συνεστιακό σύστημα σάρωσης με λέιζερ (TCS-SP2? Leica). Fluo-4-φορτωμένα κύτταρα διεγείρεται με τη γραμμή 488-nm του λέιζερ Ar /ArKr, και το σήμα εκπομπής συλλέχθηκε με έναν φωτοπολλαπλασιαστή εντός ενός παραθύρου κυμαίνεται από 500 έως 535 nm. Ενδοκυτταρικού Ca

2+ μεταβατικών διεγέρθηκαν είτε με έκθεση των κυττάρων σε ΑΤΡ (50 μΜ) ή εκπόλωση της μεμβράνης (που λαμβάνεται με έκθεση των κυττάρων σε ένα τροποποιημένο διάλυμα Tyrode που περιείχε 100 mM KCl). Ενδοκυττάριο Ca

2 + μεταβατικά προκαλούνται από αυτά τα ερεθίσματα αποκτήθηκαν στο 0,5 Hz και πλάτος τους μετρήθηκε από την άποψη της αναλογίας ΔF /F, δηλαδή, όπου F

max αντιπροσωπεύει το φθορισμό καταγράφεται στην κορυφή του Ca

2+ μεταβατικά υπολογίζεται πάνω από όλα την καταγεγραμμένη μέτρηση (διάρκειας 60 s) σε μια περιοχή ενδιαφέροντος εντοπιστεί γύρω από κάθε κύτταρο του σώματος? F

Pre είναι η μέση ένταση φθορισμού που μετρήθηκε κατά τη διάρκεια της περιόδου προ-ερέθισμα (20 s)? και F

bgnd είναι ο φθορισμός υποβάθρου μετράται σε μια περιοχή του πεδίου χωρίς δομές βαφής γεμάτο. Σε ένα υποσύνολο πειράματα που αποσκοπούν στην αξιολόγηση της συμβολής των εξω-vs. ενδο-κυτταρικό Ca

2+ προς τη μετρούμενη ενδοκυτταρικού Ca

2+ μεταβατικών, δύο διαδοχικές διεγέρσεις ΑΤΡ διεξήχθησαν σε κύτταρα σε ημέρες διαφοροποίηση 5. Η πρώτη εφαρμογή του ΑΤΡ πραγματοποιήθηκε σε διάλυμα κανονικής Tyrode. Μετά από 5 λεπτά., ΑΤΡ εφαρμογή επαναλήφθηκε σε ένα τροποποιημένο διάλυμα Tyrode, στην οποία Ca

2 + αφαιρέθηκε (δηλαδή σχεδόν Ca

2 + -δωρεάν λύση). Πριν από τη δοκιμή τα αποτελέσματα του Ca

2 + απομάκρυνση σε ΑΤΡ που προκαλείται από Ca

2 + μεταβατικά, τη σταθερότητα του Ca

2+ απαντήσεις σε δύο διαδοχικές ΑΤΡ ερεθίσματα επαναλαμβάνεται σε 5 λεπτά. διάστημα αξιολογήθηκε: διαφορές μικρότερες από 5% βρέθηκαν

Δοκιμασία πολλαπλασιασμού

κύτταρα LI σπάρθηκαν σε πλάκες με πολλές εκβαθύνσεις σε πρότυπο μέσο ενώ NS κλώνοι εμβολιάστηκαν σε NSCM (25,000 κύτταρα ανά φρεάτιο).. απαριθμήσεις κυττάρων προσδιορίσθηκαν τις ημέρες 2, 4, 6, 8 και 10 μετά τη σπορά χρησιμοποιώντας ένα αυτόματο απαριθμητή κυττάρων (NucleoCounter, ChemoMetec A /S, Allerød, Δανία). Το μέσο αλλάχθηκε κάθε 2 ημέρες.

Η καμπύλη ανάπτυξης δημιουργήθηκε έτσι ώστε η οριζόντια συντεταγμένη δεδομένο ορίζεται ημέρες και κάθετη τεταγμένη δεδομένο οριζόμενο ανωτέρω κύτταρο πυκνοτήτων. Κυττάρων φορές κατά τη διάρκεια της λογαριθμικής αύξησης διπλασιασμού υπολογίστηκαν σύμφωνα με τον τύπο Hayflick είναι: (Τ = χρόνος διπλασιασμού του πληθυσμού? T = καθορισμένη ώρα μετά την υποκουλτούρα? Ν

t = ο αριθμός των κυττάρων κατά την καθορισμένη ώρα? Ν

0 = αριθμός των κυττάρων κατά την έναρξη της υποκαλλιέργειας).

Μια σειρά πειραμάτων κυτταρικής ανάπτυξης πραγματοποιήθηκε για να ελεγχθεί η επίδραση του ΑΤΡ επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Κύτταρα (LI, D2, F11, και D2 και F11 που συλλέγονται μετά από 1 ημέρα και 5 ημέρες υπό μέσο διαφοροποίησης) σπάρθηκαν σε πυκνότητα 50.000 κύτταρα /φρεάτιο σε 1 ml μέσου καλλιέργειας για τρυβλία 24 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΑΤΡ Οι συγκεντρώσεις από 0 έως 100 μg /ml για 0, 1, 2, 3, 4, 5 και 7 ημέρες. Οι μετρήσεις κυττάρων εκτελέστηκαν με ένα κυτταρόμετρο. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν.

In vivo

ανάλυση ογκογένεσης

Ηθική δήλωση.

Όλα τα ζώα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν πειραματίστηκε σε αυστηρά σύμφωνα με το κατευθυντήριες γραμμές για τη θεσμική Animal Care και την Επιτροπή Χρήση σε ισχύ στο Καθολικό Πανεπιστήμιο της Ιερής Καρδιάς και κάθε προσπάθεια να ελαχιστοποιηθεί η ταλαιπωρία. Το έργο πραγματοποιήθηκε υπό την αιγίδα της Επιτροπής Δεοντολογίας των ζώων, «A. Gemelli », Ιατρική Σχολή, Καθολικό Πανεπιστήμιο της Ιερής Καρδιάς, Ρώμη, Ιταλία (εγκεκριμένη άδεια έργου: prot.pdc.CESA /Α /42/2011).

αθυμικά γυμνά ποντίκια (ηυ /ηυ? 6 -8 εβδομάδες παλιά? Charles River Laboratories, Wilmington, ΜΑ, USA) αναισθητοποιούνται με ip κεταμίνης και ξυλαζίνης, και στερεοτακτικά εμφυτεύθηκαν είτε απομονωμένα D2, κύτταρα F11 (10.000 ή 1.000 ανά ποντικό) ή κύτταρα LI (500.000 ή 10.000 ανά ποντικό) σε 3 μΙ PBS στο δεξιό ραβδωτό σώμα. Μία ομάδα ελέγχου έλαβε μόνο έκδοχο (PBS). Τα εμφυτευμένα ποντίκια, 4 ζώα ανά ομάδα, ζυγίστηκαν μία φορά την εβδομάδα, παρακολουθούνται δύο φορές την εβδομάδα και σκοτώθηκαν όταν ανέπτυξε νευρολογικά συμπτώματα (αταξία /έλλειψη συντονισμού /συγκλονιστικό /ασύμμετρη). Τα ποντίκια θυσιάστηκαν με τραχηλική εξάρθρωση υπό μια βαθιά αναισθησία. τομές εγκεφάλου εξετάστηκαν για την παρουσία όγκων, όπως περιγράφεται παρακάτω.

αιματοξυλίνη-ηωσίνη και χρώση ανοσοϊστοχημείας τομών εγκεφάλου

Τα ογκο-κυττάρων-εμφυτευμένα εγκέφαλοι ποντικών μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και κοπεί με μικροτόμο σε τμήματα των κοραλλιών. Για χρώση με αιματοξυλίνη-ηωσίνη, τομές εγκεφάλου τοποθετήθηκαν σε πλακίδια χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη Harri για 2 λεπτά. πρώτα, και στη συνέχεια αντίθετα με αλκοολικό ηωσίνη. Για να χαρακτηριστεί η εγκεφαλικό ιστό με ανοσοϊστοχημεία, οι τομές χρωματίστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα για την ανθρώπινη-ειδικά αντι-νεστίνη (1:200), αντι-βIII-τουμπουλίνη (1:200), και αντι-GFAP (1:500), μετά ο ίδια διαδικασία που περιγράφεται ανωτέρω.

η στατιστική ανάλυση

Όλες οι τιμές στα σχήματα και κείμενο που εμφανίζονται ως μέσες τιμές ± SD. Τυχόν σημαντικές διαφορές μεταξύ των μέσων τιμών εκτιμήθηκαν με t δοκιμασία του Student ή μονόδρομη ANOVA. Ένα διπλής όψης σ ​​& lt? 0.05 έγινε δεκτή ως σημαντική

Αποτελέσματα

Απομόνωση της CSC από νευροσφαίρας (NS) σχηματισμό δοκιμασία

Σύμφωνα με τις συνθήκες καλλιέργειας για NSCM, σφαίρες μοιάζουν. τυπικό NS σχηματίζονται ταχέως πάνω από τις μονοστιβάδες όλες τις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 1Α). Περίπου 3 ημέρες αργότερα, U87 και κυτταρικές γραμμές LI μεγάλωσε εντελώς σφαιρικά (10-20 κύτταρα) χωρίς προσκολλημένα κύτταρα (πρωτογενή NS), ενώ ορισμένοι προσκολλημένα κύτταρα επέμενε στην κυτταρική γραμμή U87. Μετά από 1-2 εβδομάδες καλλιέργειας, ο σχηματισμός σφαιρών όγκου ανιχνεύθηκε και φωτογραφήθηκε κάτω από ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο. Οι σφαίρες θα μπορούσαν να πολλαπλασιάζονται και συνεχώς καλλιεργούνται σε ένα ελεύθερης διακύμανσης μορφή (Σχήμα 1Α). Ως εκ τούτου, όλες οι κυτταρικές σειρές που σχηματίζονται αυτο-ανανεώσιμες σφαίρες σε καλλιέργεια

(Α):. Κορυφή, γονικές κυτταρικές σειρές (LI, U87 και κύτταρα U373) καλλιεργήθηκαν σε πρότυπο μέσο τους προστίθενται 10% ορό. Μέση, σχηματισμός νευροσφαίρες στην κορυφή των μονοστιβάδες U373 κυτταρική γραμμή. Εικόνες ελήφθησαν μετά από 1, 2 και 3 ημέρες σε μέσο νευροσφαιρών. Κάτω, εικόνες του πρωτογενούς NS που παράγεται από LI, U87 και U373 κύτταρα κατά την ημέρα 8. (Β) Οι κλώνοι που προέρχονται από LI (D2 και F11) και U87 (C7 και Ε8) πρωτογενή NS. Αρχική μεγέθυνση 200 × ή 400 ×. μπαρ κλίμακα = 100 μm.

Η

Ο περιορισμός Αραίωση /Σφαίρες όγκου Έναρξη (TS-CI) Ανάλυση

Για τον προσδιορισμό της ικανότητας των τριών κυτταρικών σειρών για να σχηματίσουν NS, μια TS-CI διεξήχθη ανάλυση. Η συχνότητα των TS-IC ήταν 1,56% για τα κύτταρα U373 (1 κύτταρο κάθε 64 έδειξε την ικανότητα να σχηματίζουν πρωτογενή NS), 1,45%, για τα κύτταρα U87-MG (1 κύτταρο κάθε 69 έδειξε την ικανότητα να σχηματίζουν πρωτογενή NS), και 2,74% για τα κύτταρα LI (1 κύτταρο κάθε 36 εμφάνισαν την ικανότητα να σχηματίζουν πρωτογενή NS).

σχηματισμό Ενιαία αποικία ανάλυση

για να εκτιμηθεί η ικανότητα αυτο-ανανέωσης των πρωτογενών NS, μια δοκιμασία κλωνοποίησης διεξήχθη. Η αποτελεσματικότητα σχηματισμού αποικίας ήταν 9,5%, 10,5% και 33,3% για το NS προέρχεται από U373, U87 και LI, αντίστοιχα.

Growing κλώνοι επιλέχθηκαν, αναλυτικά, και διατηρείται για πολλές υποκουλτούρες. Δύο κλώνοι (D2 και F11) λήφθηκαν από πρωτογενή NS προέρχεται από LI και δύο (C7 και Ε8) από U87 που σχηματίζεται αυτο-ανανεώσιμες σφαίρες σε καλλιέργεια (Σχήμα 1Β). Κανένας από τους κλώνους που προέρχονται από U373 ήταν σε θέση να επιμένουν σε καλλιέργεια, ακόμη και όταν χρησιμοποιήθηκε ένα διαφορετικό μέσο. Η μορφολογία των κλώνων ήταν μεταβλητή. F11, C7 και Ε8 μεγάλωσε εντελώς σφαιρικά, ενώ D2 έτειναν να σχηματίσουν τα δύο σφαιρικά ή επιμήκη συσσωματώματα (Σχήμα 1Β).

έκφραση των δεικτών των βλαστικών κυττάρων και γράμμωσης-ειδικούς δείκτες

CD133, νεστίνη, Sox2 και Msi-1 αξιολογήθηκαν για να εκτιμηθεί η φύση βλαστικά επιλεγμένων κλώνων. Χρησιμοποιώντας ανοσοκυτταροχημεία, 50% των κυττάρων LI και 100% των U87 ήταν νεστίνη θετικά και η χρώση βρίσκεται στο κυτταροπλασματικό επίπεδο. Και στις δύο D2 και οι κλώνοι F11 προέρχονται από πρωτογενή NS κυττάρων LI, παρατηρήθηκε μία αύξηση στην έκφραση δείκτη βλαστικών κυττάρων. Περισσότερο από το 80% των κυττάρων από αμφότερους τους κλώνους ήταν θετικοί ως προς τη νεστίνη. Καμία αύξηση στη χρώση νεστίνη παρατηρήθηκε και στα δύο κλώνων που προέρχονται από τα κύτταρα U87 σε σχέση με τη γονική κυτταρική γραμμή (Σχήμα 2).

Τα ενθέματα αναφέρονται σε αρνητικούς μάρτυρες. Αρχική μεγέθυνση 400 ×. μπαρ κλίμακα = 100 μm.

Η

Με βάση αυτά τα στοιχεία και μορφολογική άποψη, έχουν τα επόμενα πειράματα έχουν πραγματοποιηθεί μόνο σε κλώνους D2 και F11 με στόχο να εξακριβωθεί αν οι παρατηρούμενες διαφορές θα μπορούσαν να αντιστοιχούν σε διαφορές στην συμπεριφορά.

Αναλύοντας έκφραση CD133 με κυτταρομετρία ροής, ανιχνεύσαμε 0.04, 0.13, και 1.44% θετικά κύτταρα CD133 σε LI, D2, και τα κύτταρα F11 αντιστοίχως (Σχήμα 3Α). Αυτές οι τιμές διατηρήθηκαν και μετά διαφόρων κύκλων της κρυοσυντήρησης. Χρησιμοποιώντας ανοσοκυτταροχημεία, διαπιστώσαμε ότι το 30% των κυττάρων LI υπάρχουν σε μικρές ομάδες στην καλλιέργεια μονοστοιβάδας ήταν θετικά για Sox-2 που συνήθως εντοπίζεται στους πυρήνες? τελικά 100% των κυττάρων έδειξαν ασθενή LI Msi-1 κυτταροπλασματική χρώση (Σχήμα 3Β). Σε αμφότερες τις D2 και F11 κλώνους, παρατηρήθηκε μία αύξηση της έκφρασης δείκτη βλαστικών κυττάρων. Ογδόντα τοις εκατό των κυττάρων από αμφότερους τους κλώνους ήταν θετικοί ως προς τη νεστίνη και 100% για Sox-2. Μια ισχυρότερη έκφραση του Msi-1 ανιχνεύθηκε στο 100% των κυττάρων (Σχήμα 3Β). Νεστίνη έκφραση σε αμφότερους τους κλώνους επιβεβαιώθηκε με ανάλυση στυπώματος Western. Σχήμα 4C αναφέρεται σε δεδομένα που ελήφθησαν σε F11 κλώνο

Α:. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για τη μέτρηση της CD133 έκφραση κυττάρων που προέρχονται από καλλιέργειες μονοστιβάδας LI και D2 και οι κλώνοι F11. CaCo

2 κύτταρα είναι θετικό έλεγχο. έκφραση CD133 αξιολογήθηκε σε δύο κλώνους σε 5

ου πέρασμα (5

ΤΗΡ) και 16

ου διόδου (16

ΤΗΡ). Β: Τα δεδομένα από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα των ανοσοκυτταροχημική χρώση για MSI-1 και Sox2 έκφρασης στην LI, D2 και τα κύτταρα F11. Τα ένθετα αναφέρονται σε αρνητικούς μάρτυρες. Αρχική μεγέθυνση 400 ×. μπαρ κλίμακα = 100 μm

Η

Α:. Ανοσοκυτοχημική χρώση για νεστίνη, Msi-1, Sox2 και βIII-τουμπουλίνης έκφραση στο D2 και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε F11 μέσο νευρόσφαιρα (χωρίς ορό) ή σε μέσο διαφοροποίησης ( παρουσία ορού) για 5-45 ημέρες. Αρχική μεγέθυνση 400 ×. Κλίμακα bar = 100 μm. Β: Ορισμένα θετικά κύτταρα βIII-τουβουλίνης που παρουσιάζει ένα τυπικό νευρωνική μορφολογία που μοιάζει. Αρχική μεγέθυνση 630 ×. μπαρ κλίμακας = 50 μm. C: Ανάλυση στυπώματος Western των νεστίνη, το MSI-1 και την έκφραση βIII-τουμπουλίνης σε κύτταρα F11 καλλιεργήθηκαν για διαφορετικούς χρόνους σε μέσο διαφοροποίησης. επίπεδα πρωτεΐνες αναλύθηκαν με ανάλυση ανοσοαποτύπωσης και ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρία και τυποποιηθεί έναντι των επιπέδων β-ακτίνης ως ένας έλεγχος φόρτωσης. Οι τιμές είναι ο μέσος όρος ± SD του δέντρου ανεξάρτητα πειράματα. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν από κύτταρα D2. Οι Immunoblottings από αντιπροσωπευτικά πειράματα φαίνονται. * P & lt? 0,05 του Student

t-test

εναντίον γονικών κυτταρικών σειρών, * ρ & lt?. 0,01 έναντι κυττάρων F11

Η

Σφαίρες καλλιεργήθηκαν κάτω από συνθήκες διαφοροποίηση για διαφορετικούς χρόνους και αναλύθηκαν για την έκφραση των δεικτών των βλαστικών κυττάρων και γράμμωσης-ειδικούς δείκτες. Μετά από ολονύκτια επώαση σε μέσο διαφοροποίησης, τα κύτταρα νευροσφαίρας προσκολλημένα στην πλάκα καλλιέργειας και μεγάλωσε σε μονοστοιβάδα. Η έκφραση των νευρωνικών ειδικών βIII-τουμπουλίνης, GFAP, και ΟαΙΟ αξιολογήθηκε με ανοσοκυτταροχημεία. Τόσο βIII-τουμπουλίνης και GFAP ήταν εντόνως εκφρασμένο σε γονική κυτταρική γραμμή και στις δύο κλώνους, ενώ ΟαΙΟ δεν εκφράστηκε (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μετά συνθήκες διαφοροποίησης, η έκφραση των νευρωνικών ειδικών βIII-τουμπουλίνης μειώθηκαν (Σχήμα 4Α), ενώ εκείνη του GFAP δεν μεταβλήθηκε σημαντικά (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αξίζει να σημειωθεί ότι, μερικά από βIII-τουμπουλίνης που εκφράζουν κύτταρα είχαν νευρώνα-όπως μορφολογία (Σχήμα 4Β), ενώ άλλες ήταν πολυπύρηνα κύτταρα.

Η μείωση στην έκφραση βIII-τουβουλίνης αξιολογήθηκε επίσης με ανάλυση στυπώματος Western στα δύο D2 ( τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται) και F11 (Σχήμα 4C) κλώνων.

D2 και οι κλώνοι F11 σε μείωση τόσο νεστίνη και SOx-2 ανοσοθετικότητα μέχρι μη ανιχνεύσιμα επίπεδα παρατηρήθηκε μετά μεγαλύτερης διάρκειας καλλιέργεια κυττάρων NS σε μέσο διαφοροποίησης (Σχήμα 4Α ). Η εντυπωσιακή μείωση των επιπέδων νεστίνη επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με ανάλυση στυπώματος Western (Σχήμα 4C αναφέρεται σε δεδομένα που ελήφθησαν σε F11 κλώνο). Αριθ προφανώς παραλλαγή στην έκφραση Msi-1, αναλύθηκε με ανοσοκυτταροχημεία, παρατηρήθηκε, αλλά η θέση του άλλαξε μεταξύ πυρήνα και του κυτταροπλάσματος, ανάλογα με την ώρα της μονιμότητας σε (Σχήμα 4Α) μέσο που περιέχει ορό. Η ανάλυση στυπώματος Western κατέδειξε ότι τα κύτταρα LI και οι δύο κλώνοι επέδειξαν μία παρόμοια έκφραση του Msi-1, ενώ τα κύτταρα από αμφότερους τους κλώνους υπό διαφοροποίηση έδειξε ένα υψηλότερο επίπεδο της πρωτεΐνης. δεδομένα Σχήμα 4 δείχνει ελήφθη στο F11 κλώνο.

Ομοεστιακή Ca

2 + απεικόνισης

Σε αδιαφοροποίητα κύτταρα (που αναφέρεται ως ημέρα 0 χρονικό σημείο), ΚΟΙ διέγερση που παράγεται Ca

2+ μεταβατικά σε λιγότερο από 10% του συνόλου των κυττάρων (

n

= 9 από 127), και το μέσο πλάτος αυτών των μεταβατικών ήταν 0.36 ± 0.02. Μια χαμηλή ανταπόκριση να αποπόλωσης ερεθίσματα παρατηρήθηκε επίσης στη διαφοροποίηση των κυττάρων. Στην πραγματικότητα, το ποσοστό των κυττάρων που ανταποκρίνονται σε διέγερση ΚΟΙ με Ca

2+ μεταβατικών ήταν χαμηλότερη από 10% την ημέρα-5, ημέρα-15 και την ημέρα-30 επίσης, με μέση πλάτη των 0,75 ± 0,25 [

n

= 7 από 287], 0,42 ± 0,07 [

n

= 10 από 418] και 0,34 ± 0,02 [

n

= 7 από 418], αντίστοιχα. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι LI προερχόμενα ανθρώπινα βλαστικά κύτταρα, είτε αδιαφοροποίητο ή σε διαφορετικά στάδια της διαφοροποίησης, δεν εμφανίζουν λειτουργικά τασεοελεγχόμενων Ca

2+ κανάλια. Ωστόσο, όταν αυτά τα παρασκευάσματα κυττάρων εκτέθηκαν σε 50 μΜ ΑΤΡ, σαφώς ανιχνεύσιμη ενδοκυτταρικού Ca

2+ παρατηρήθηκαν μεταβατικά. Σε αδιαφοροποίητα κύτταρα (ημέρα 0), ΑΤΡ που παράγεται Ca

2 + σήματα σε 16,1 ± 9,8% του συνόλου των κυττάρων (39 από 127), με μέσο πλάτος των 0,79 ± 0,10. Μετά από 1 ημέρα καλλιέργεια στο μέσο διαφοροποίησης, το ποσοστό των αντιδρώντων κυττάρων αυξήθηκε σε 89,2 ± 7,2% (

n

= 115 έξω από 132) και ο μέσος όρος πλάτους των μεταβατικών αυξήθηκε ομοίως (1,49 ± 1,13). Την ημέρα-5, να αυξήσει περαιτέρω το ποσοστό των ανταποκρινόμενων κυττάρων παρατηρήθηκε (86,3 ± 3,5%?

n

= 430 από τους 492), αλλά το πλάτος της παροδικής έφθασε μια μέγιστη τιμή 2,69 ± 0,07. Δεν υπάρχουν σημαντικές αλλαγές στο Ca

2+ πλάτη σήματος παρατηρήθηκαν κατά τη διάρκεια των επόμενων ημερών της διαφοροποίησης μέχρι 30 ημέρες: οι τιμές ΔF /F είναι 2,48 ± 0,07 την ημέρα-15 (77,8 ± 7,1% της ανταπόκρισης των κυττάρων?

n

= 334) και 2,55 ± 0,11 την ημέρα-30 (80,5 ± 5,1% της ανταπόκρισης των κυττάρων?

n

= 306).