Αφηρημένο

Σκοπός

p16

μεθυλίωση συμβαίνει συχνά στην καρκινογένεση. Ενώ έχει διατυπωθεί η υπόθεση ότι οι

p16

μεθυλίωσης κράτη δυναμικά διατηρούνται σε καρκινικά κύτταρα, άμεσες αποδείξεις που υποστηρίζουν αυτή την υπόθεση δεν ήταν διαθέσιμα μέχρι τώρα.

Μέθοδοι

Μια μείξη μοντέλο κύτταρο καθορίστηκε η οποία επαναπρογραμματιστούν της φυσικής διάταξης μεθυλίωσης του DNA των κυττάρων. Η κατάσταση μεθυλίωσης των

ρ16

αλληλόμορφα ήταν τότε επανειλημμένα ποσοτικά αναλύεται στο μονοκλωνικό σύντηξη, γονικές καρκινικές κυτταρικές σειρές (

ρ16

-Εντελώς μεθυλιωμένα-AGS και μη μεθυλιωμένου-MGC803) και HCT116 μη σύντηξη κυττάρων χρησιμοποιώντας DHPLC και όξινο θειώδες αλληλουχίας. Ιστονών μεθυλίωση αναλύθηκε χρησιμοποιώντας χρωματίνης ανοσο-καθίζηση (μάρκας) -PCR. κατάσταση έκφρασης Ρ16 προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ανοσο-χρώση και RT-PCR.

Αποτελέσματα

Η κατάσταση μεθυλίωσης για την πλειονότητα του

p16

αλληλόμορφα ήταν διατηρείται σταθερά στον μονοκλωνικό σύντηξης κύτταρα μετά από μέχρι και 60 περάσματα. Το πιο σημαντικό, εστιακή de novo μεθυλίωση, απομεθυλίωση, και υδροξυμεθυλίωση παρατηρήθηκαν με συνέπεια μέσα σε περίπου 27% των

ρ16

αλληλόμορφα στα μονόκλωνα σύντηξης, αλλά όχι τις μεθυλιωμένες ομόζυγο ή μη μεθυλιωμένα γονικά κύτταρα. Επιπλέον, υποκλώνοι των μονόκλωνα διατήρησε σταθερά την ίδια

μοτίβο p16

μεθυλίωσης. Ένα παρόμοιο φαινόμενο παρατηρήθηκε επίσης χρησιμοποιώντας το

p16

ημι-μεθυλιωμένης HCT116 μη σύντηξης καρκινικής κυτταρικής γραμμής. Είναι ενδιαφέρον ότι, η μεταγραφή δεν παρατηρήθηκε σε

ρ16

αλληλόμορφα που υδροξυμεθυλιωθεί με αντιπληροφοριακό-στελέχους συγκεκριμένο μοτίβο. Επίσης, τα επίπεδα της H3K9 και H3K4 trimethylation στα κύτταρα σύντηξης βρέθηκαν να είναι ελαφρώς χαμηλότερη από ό, τι τα πατρικά AGS και MGC803 κύτταρα, αντίστοιχα.

Συμπέρασμα

Η παρούσα μελέτη παρέχει την πρώτη άμεση απόδειξη επιβεβαιώνοντας ότι οι μεθυλίωση κράτη της

p16

νησίδες CpG δεν είναι μόνο ομοιοστατικώς διατηρηθεί, αλλά και συνοδεύεται από μια δυναμική διαδικασία παροδικά εστιακά μεθυλίωσης, απομεθυλίωση, και υδροξυμεθυλίωση στα καρκινικά κύτταρα

Παράθεση:. Qin S, Li Q, Zhou J, Liu Zj, Su Ν, Wilson J, et al. (2014) Ομοιοστατική Συντήρηση των συγκεκριμένων αλληλόμορφων

p16

μεθυλίωση στα καρκινικά κύτταρα Συνοδευόμενος από Dynamic Focal μεθυλίωση και υδροξυμεθυλίωση. PLoS ONE 9 (5): e97785. doi: 10.1371 /journal.pone.0097785

Επιμέλεια: Jindan Yu, του Πανεπιστημίου Northwestern, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6 Φεβ, 2014? Αποδεκτές: 22 του Απρίλη 2014? Δημοσιεύθηκε: May 14, 2014

Copyright: © 2014 Qin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίζεται από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας [Grant 31261140372 και 81171900], Εθνικό πρόγραμμα βασικής έρευνας της Κίνας [Grant 2011CB504201 και 2010CB529303], και το Πεκίνο Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας [Grant 7122033]. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Dajun Ντενγκ είναι μια Συντακτική μέλος του Διοικητικού Συμβουλίου PLoS ONE. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE Editorial πολιτικές και κριτήρια.

Εισαγωγή

Η μεθυλίωση του DNA θεωρείται ότι είναι μία από τις πιο σταθερές επιγενετικές τροποποιήσεις στα θηλαστικά. Οι μεθυλίωση καταστάσεις των γονιδίων που σχετίζονται με τη διαφοροποίηση των κυττάρων έχει αποδειχθεί ότι είναι ιδιαίτερα δυναμική κατά τη διάρκεια των γεννητικών κυττάρων και την ανάπτυξη της προεμφυτευτικής, αλλά να γίνει σχετικά στατική κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των σωματικών ιστών [1] – [3]. Αντιθέτως, η μεθυλίωση μέλη των γονιδίων που σχετίζονται με την προσαρμογή ξενιστή παραμείνουν δυναμικές στους σωματικούς ιστούς, προκειμένου να καταστεί δυνατή η σωστή απάντηση στην έκθεση στο περιβάλλον παράγοντας και μετέπειτα παθογένεση [4] – [6]. Υδροξυμεθυλίωση του DNA είναι στενά συνδεδεμένος με την αλλαγή κατάστασης του γονιδίου μεθυλίωσης και έχει βρεθεί ότι όχι μόνο διαδραματίζει βασικό ρόλο στο DNA απομεθυλίωση, αλλά επίσης να χρησιμεύσει πολλές από τις δικές τις λειτουργίες [7], [8].

ογκοκατασταλτικά Ρ16 που κωδικοποιείται από το ΙΝΚ4 /ΤΑΠ τόπο εντός του ανθρώπινου χρωμοσώματος 9ρ21 είναι ένας ρυθμιστής του κυτταρικού κύκλου που εμπλέκονται στην αναστολή της μετάβασης φάσης G1 → S μέσω του μονοπατιού Ρ16-CDK4 /6-RB [9]. Ο τόπος είναι μεταγραφικά σιγήσει σε εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα, και παίζει ένα ρόλο περιορισμού του ρυθμού στον επαναπρογραμματισμό της πολυδύναμα κύτταρα [10]. Αν και μια διαγραφή θραύσμα 9p21 είναι η πιο συχνή γενετική μεταβολή βρέθηκαν σε όλους τους καρκίνους [11], υπερμεθυλίωση των CpG νησίδων εξακολουθεί να είναι ο κύριος μηχανισμός για την απενεργοποίηση ρ16 σε πολλαπλούς ανθρώπινους καρκίνους [12] – [14]. Στην πραγματικότητα, ένας αριθμός μελετών κοόρτης έχουν δείξει ότι η μεθυλίωση ρ16 εμφανίζεται νωρίς στην καρκινογένεση και έχει αποδειχθεί ότι αυξάνει σημαντικά τον κίνδυνο κακοήθους μετασχηματισμού των επιθηλιακών δυσπλασίας [15] – [21]. Ακόμα κι αν δεν έχει αποδειχθεί ο αιτιολογικός ρόλος του p16 μεθυλίωσης στην καρκινογένεση, τα στοιχεία δείχνουν έντονα ότι p16 μεθυλίωση μπορεί να συμβάλει σημαντικά στην ανάπτυξη του καρκίνου και θα μπορούσε να εξελιχθεί σε ένα δυναμικό βιοδείκτη [4]. Αν και ρ16 μεθυλίωση είναι ένα από τα πιο ιδιαίτερα μελετηθεί επιγενετικές τροποποιήσεις, τη σταθερότητά του σε καρκινικά κύτταρα και ο μηχανισμός μέσω του οποίου διατηρείται δεν έχει ακόμη διευκρινιστεί [22] – [26]. Μια λεπτομερής κατανόηση των μηχανισμών που εμπλέκονται στην διατήρηση DNA μεθυλίωση είναι ένα κρίσιμο στάδιο για την ανάπτυξη των βιολογικών δεικτών μεθυλίωσης και επιγενετικές θεραπεία παρέμβασης.

Ο επιπολασμός του ρ16 μεθυλίωσης σε ανθρώπινους ιστούς χρόνια γαστρίτιδα συσχετίζεται ισχυρά με λοίμωξη Helicobacter pylori, και δραματικά μειώθηκαν μετά H. pylori eradiation, προτείνοντας ότι τα περισσότερα αλληλόμορφα μεθυλιωμένα-ρ16 μπορεί να μην είναι σταθερός [27], [28]. Σε αντίθεση, ρ16 μεθυλίωση σε καλλιεργημένα φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα είναι πιθανόν πολύ σταθερός όπως είχε αποτελεσματικά ανακτήθηκε μετά τον αναστολέα μεθυλίωσης DNA (5-αζα-CDR) απομακρύνθηκε [29]. Ωστόσο, η επανενεργοποίηση των γονιδίων σε μεθυλίωση σιγήσει παρατηρήθηκε σε μια ορισμένη αναλογία των κυττάρων αναστολέα κατεργασμένα μεθυλοτρανσφεράσης DNA. Είναι δύσκολο να αποκλειστεί η πιθανότητα ότι η παρατηρούμενη ανάκαμψη της ρ16 μεθυλίωσης αποτελέσματα από μια πλεονέκτημα επιλογής που διαθέτουν προς κύτταρα που δεν υποβάλλονται σε p16 επανενεργοποίηση /απομεθυλίωση κατά τη διάρκεια της θεραπείας αναστολέα. Επιπλέον, έχει πρόσφατα αναφερθεί ότι μεθυλιωμένες CpG θέσεις εντός της ρ16 οι νησίδες CpG κυρίως βρίσκεται στο ρ16 εξόνιο-1 κωδικοποιητική περιοχή νουκλεοσώματος σε ανθρώπινο βλάβες γαστρίτιδα και εκτείνονται εντός των περιοχών 5’UTR και νουκλεοσώματος προαγωγό κατά την ανάπτυξη των γαστρικών καρκινωμάτων [26]. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι οι πλήρως αλληλόμορφα μεθυλιωμένα-ρ16 μπορεί να είναι πιο σταθερά από τα εστιακά μεθυλιωμένη αλληλόμορφα? Ωστόσο, η υπόθεση αυτή πρέπει να ελέγχονται περαιτέρω με χρήση μονοκλωνικών κύτταρα που περιέχουν αλληλόμορφα ρ16 με ποικίλα μοτίβα μεθυλίωσης, συμπεριλαμβανομένων εστιακό μεθυλίωση.

Σύντηξη κυττάρων έχει χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη των μηχανισμών πίσω ρύθμιση μεταγραφής γονιδίου και μεθυλίωση DNA μεταβολή [24], [30]. Προκειμένου να καθοριστεί ένα μοντέλο κυττάρου που περιέχει διάφορα πρότυπα ρ16 μεθυλίωση, ένας γαστρικός καρκίνος κυτταρική γραμμή με εντελώς μεθυλιωμένη ρ16 (AGS) συνδυάστηκε με ένα ρ16-δραστικό γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή (MGC803) μέσω κυτταρικής σύντηξης. Στη συνέχεια, αυτά τα κύτταρα σύντηξης κλωνοποιήθηκαν και υποκλωνοποιήθηκαν πριν από τη διανομή των μεθυλιωμένων και υδροξυμεθυλιωμένης CpG θέσεις εντός της p16 CpG νησίδων χαρακτηρίστηκε. Η κατάσταση μεθυλίωσης των περισσότερων αλληλόμορφων ρ16 στα κύτταρα σύντηξης παρέμεινε το ίδιο με τα γονικά κύτταρα. Χαμηλά επίπεδα των εστιακών de novo μεθυλίωση, απομεθυλίωση, και υδροξυμεθυλίωση παρατηρήθηκαν επίσης στα κύτταρα της σύντηξης? Ωστόσο, οι αλλαγές αυτές βρέθηκαν να είναι ασταθή γεγονότα. Ένα παρόμοιο φαινόμενο παρατηρήθηκε επίσης χρησιμοποιώντας το ρ16 ημι-μεθυλιωμένη κυτταρική γραμμή HCT116. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η μεθυλίωση κράτη της p16 CpG νησίδων είναι ομοιοστατικώς διατηρούνται σε καρκινικά κύτταρα. Για το καλύτερο της γνώσης μας, αυτή είναι η πρώτη έκθεση που να υποδηλώνουν ότι η κατάσταση μεθυλίωσης των CpG νησίδων έχει ομοιοστατικώς διατηρείται στα καρκινικά κύτταρα δεν υφίστανται διαφοροποίηση.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων

Ανθρώπινα γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή MGC803 καλλιεργήθηκε σε RPMI 1640 με 10% FBS. AGS καλλιεργήθηκε σε μέσο F12 με 10% FBS. MGC803 [31] και AGS (ATCC CRL-1739) κυτταρικές σειρές ευγενώς από τον καθηγητή Yang Ke στο Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Αντικαρκινικό Νοσοκομείο και Ινστιτούτο. κύτταρα HCT116 παρεσχέθησαν ευγενώς από τον Dr. Yuanjia Chen, Νοσοκομείο Peking Ένωση (ATCC CCL-247), και καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 με 10% FBS.

Παραγωγή των σταθερών κυτταρικών κλώνων σύντηξης

pBabe-puro (αντίσταση στην υγρομυκίνη) και pIRES2-EGFP (αντίσταση σε νεομυκίνη /G418) φορείς επιμολύνθηκαν σε AGS και MGC803 κύτταρα, αντίστοιχα, με χρήση LipofectamineTM 2000 (Invitrogen, 11668-027) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Πουρομυκίνης (πουρομυκίνης

r + -AGS) και G418 (νεομυκίνη

r + -MGC803) επιλογής διεξήχθη σε ΕΕΑ και κυτταρικές σειρές MGC803 ακολουθείται από καλλιέργεια σε μέσο F12 με 10% FBS και πουρομυκίνης (0,25 μg /ml) και RPMI 1640 με 10% FBS και νεομυκίνη (700 μg /mL), αντίστοιχα. Η σύντηξη πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας PEG8000 όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32]. Μετά τη συγχώνευση, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο επιλογής που περιέχει τόσο νεομυκίνη (700 μg /mL) και πουρομυκίνη (0.25 μg /mL). Μετά την επιλογή, οι μεμονωμένες αποικίες μονο-κλωνοποιήθηκαν, και μετά από τρεις γύρους επακόλουθη κλωνοποίηση, ελήφθησαν πέντε μονόκλωνα. Δύο από τους πέντε μονόκλωνα επιλέχθηκαν για περαιτέρω μονο-κλωνοποίηση.

μικροδορυφόροι

D9S974

και

D9S1749

ανάλυση

Το σύνολο αστάρι για

D9S974

(sense, 5′-gagcc tggtc tggat cataa-3 ‘? αντινόημα, 5′-aagct tacag aacca gacag-3’) και

D9S1749

(sense, 5′-AGGAG agggt acgct tgcaa-3 «? αντίθετης φοράς, 5′-tacag ggtgc gggtg cagat aa-3 ‘) χρησιμοποιήθηκαν για να ενισχύσουν το

p16

αλληλόμορφα (Σχήμα S1 α). Γονοτύπων της micorsatellites αναλύθηκαν στους 80 ° C με DHPLC χρήση ανιχνευτή UV (260 nm) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [33].

Καρυότυπος ανάλυση

Μία φιάλη των 25 cm σε 60% κυτταρική συρροή υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 0.2 μg /mL κολχικίνη για 4 ώρες. Τα κύτταρα ανακτήθηκαν μετά θρυψινοποίηση και κατεργασία με διάλυμα /L ΚΟΙ 75 mmol για 25 λεπτά. Τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν (3:01 μεθανόλη: οξικό οξύ)., Και χρωματίστηκαν με χρώση Giemsa

παρασκευή DNA, το διθειώδες και ΤΑΒ θεραπεία

Γενωμικό DNA εκχυλίστηκε από δείγματα ιστού με φαινόλη /χλωροφόρμιο . Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 mol /L του όξινου θειώδους νατρίου επί 16 ώρες στους 50 ° C [34]. Για την ανάλυση 5hmC, γονιδιωματικό DNA υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τη χρήση του TAB Kit σύμφωνα με τις προδιαγραφές του κατασκευαστή (WiseGene, Cat # K001) [35].

υδροξυμεθυλιωμένη DNA-ειδική ανοσοκαταβύθιση (hMeDIP)

Γενωμικό DNA κατεργασία με υπερήχους σε 200 bp και 600 bp θραύσματα χρησιμοποιώντας Bioruptor υπερήχων (Diagenode). 100 ng σε υπερήχους DNA αποθηκεύτηκε ως έλεγχος εισόδου. Κάθε δείγμα αποτελείτο από 1 μα σε υπερήχους DNA αραιώνονται σε ρυθμιστικό IP και επωάζονται με 4 μΐ αντι-hydroxymethylcytosine (5hmC) αντίσωμα (Active Motif) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Τα σύμπλοκα αντισώματος-ϋΝΑ συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας πρωτεΐνη A /G σφαιρίδια στη συνέχεια καθαρίζεται. Η PCR εκτελείται σε όλα τα δείγματα χρησιμοποιώντας 35 κύκλους με τους εκκινητές 5′-agtcct ccttc cttgc CAAC-3 ‘και 5′-tccga gcact tagcg aatgt g-3’. Μη μεθυλιωμένα κυτοσίνης, 5-μεθυλκυτοσίνη, και 5hmC DNA θραύσματα χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες PCR για την επαλήθευση εμπλουτισμό 5hmC.

χρωματίνης-ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) δοκιμασίες

Επίπεδα τροποποιήσεις των ιστονών H3K9me3 και H3K4me3 προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασίες ChIP όπως περιγράφεται [36].

ενισχύσεις PCR

το 392 bp αμπλικόνιο της αντίθετης φοράς το σκέλος του

p16

εξόνιο-1 ενισχύθηκε με το CpG-free εκκινητή σετ (sense, 5′-ttttt AGAGG atttg aggga Tagg-3 ‘? αντινόημα, 5′-ctacc taatt CCAAT tcccc tacaa acttc-3’) όπως περιγράφεται [37]. Το 588 bp αμπλικόνιο του αντινοηματικού κλώνου του

p16

εξόνιο-1 και προαγωγό ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας το σετ εκκινητή SMSP (sense, 5′-ctacct ΑΑΤΤΟ caatt cccct ACA-3 ‘? Antisenses, 5’- CCAAT tcccc tacaa acttc g-3 ‘, 5′-CCAAT tcccc tacaa acttc atcct ακόλουθες: CCAAA ATCG-3′ και 5’-CCAAT tcccc tacaa acttc atcct ακόλουθες: CCAAA atcac CCG-3 ‘) [26]. Το 369 bp της αίσθησης σκέλος του

p16

εξόνιο-1 ενισχύθηκε με το σύνολο αστάρι CpG-free (νόημα, 5′-gttgt agatt ΤΤΤΤΑ tttat ttgga t-3 ‘? Αντίθετης φοράς, 5’ tcccc ttacc taaaa ΑΑΑΤΑ CC-3 ‘) σε θερμοκρασία ανόπτησης 56 ° C. Τα 284 bp και 346 bp αναδιπλασιασμού των αντίθετης φοράς-κλώνων του

p16

εξόνιο-2 και ιντρόνιο-2 αντίστοιχα ενισχύονται με το σύνολο αστάρι CpG-free (νόημα, 5′-tggta ggtta TGATG atgggt αδρανών 3 ‘? αντινόημα, 5′-AACAT aatta ctacc tctaa taccc C-3′) και (sense, 5’-tttgt gggtt tgtag aagta ggtat g-3 ‘? αντινόημα, 5′-cctaa tccaa caact AATCC actac c-3’) σε θερμοκρασία ανόπτησης 57 ° C.

Η μεθυλίωση ποσοτικοποίηση των CpG νησιά με DHPLC

το 392 bp, 369 bp, 284 bp, 346 bp PCR προϊόντων ενισχύθηκε με καθολική εκκινητές διαχωρίζονται με τη χρήση του DNA WAVE Σύστημα θραύσμα ανάλυση με μια -detector φθορισμού (FL) (Transgenomic, Inc., ΟΜ, USA) στους 57,6, 55,0, 58,0, και 57 ° C, αντίστοιχα [37], [38]. Το ρυθμιστικό WAVE-HS1 FL-χρωστικής (Transgenomic, Inc.) χρησιμοποιήθηκε για την ενίσχυση της FL-ένταση των PCR προϊόντων (καθολική επισήμανση μετά τη στήλη). Γονιδιωματικό HCT116 DNA χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο ελέγχου.

Clone αλληλούχιση

PCR πραγματοποιήθηκε σε μετατραπέντος με όξινο θειώδες DNA. Τα αμπλικόνια κλωνοποιήθηκαν εντός του pCR-αμβλύ φορέα (Invitrogen), μετασχηματίστηκε σε

E. coli

, και η αλληλουχία του χρησιμοποιώντας ένα ΑΒΙ 3730 αναλυτή.

p16

RT-PCR

p16

mRNA ανιχνεύθηκε όπως περιγράφεται [12] .

P16 ανοσοφθορισμού χρώση

χρώση ανοσοφθορισμού διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [39]. Εν ολίγοις, τα κύτταρα σύντηξης μονιμοποιήθηκαν σε 4% φορμαλδεΰδη /PBS για 10 λεπτά πριν από μια 5-λεπτών έκπλυση σε PBS. Σταθερή δείγματα αποκλείστηκαν για 30 λεπτά με 0,5% Triton Χ-100 /PBS σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα επωάστηκαν με αντι-Ρ16 αντισώματος (Abcam, ab54210) για 1 ώρα στους 37 ° C, μετά πλύθηκαν με 0,5% Triton Χ-100 /PBS, κατόπιν επωάστηκαν με αντίσωμα κατσίκας αντι IgG αντίσωμα κουνελιού επισημασμένο με ροδαμίνη για 1 ώρα στους 37 ΝΤΟ. DAPI (1:2000) χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση του πυρήνα του κυττάρου. Φωτογραφίες τραβήχτηκαν σε μια Leica ομοεστιακό μικροσκόπιο.

Αποτελέσματα

Δημιουργία και χαρακτηρισμός ενός μοντέλου κυτταρικής σύντηξης με ποικιλοτρόπως μεθυλιωμένο

p16

αλληλόμορφα

Έχει ανέφεραν ότι ετεροκάρυα μπορεί να προκαλέσει μεταβολή της μεθυλίωσης DNA μέσω κυττάρου σύντηξη δύο κυτταρικών σειρών [30]. Υποθέσαμε ότι ένα μοντέλο σύντηξης κυττάρων που περιέχουν διαφορετικές καταστάσεις μεθυλίωση του p16 CpG νησίδων θα μπορούσε να επαναλάβει τις de novo διαδικασίες μεθυλίωσης ή απομεθυλίωση. Έτσι, πουρομυκίνη

-AGS κύτταρα r + περιέχουν πλήρως αλληλόμορφα μεθυλιωμένα-p16 και η νεομυκίνη

r -MGC803 + κυττάρων που περιέχουν μη μεθυλιωμένα αλληλόμορφα-p16 κατασκευάστηκαν, αντίστοιχα. Αυτές οι δύο κυτταρικές σειρές μετά συντήχθηκαν και καλλιεργήθηκαν σε μέσο επιλογής που περιέχει τόσο πουρομυκίνη και νεομυκίνη. Μετά από τρεις γύρους κλωνοποίησης, τα μονόκλωνα σύντηξης χαρακτηρίστηκαν χρησιμοποιώντας δύο μικροδορυφόρων (D9S974 και D9S1749) κοντά στον τόπο ρ16 (Σχήμα S1A). Δύο D9S1749 πρότυπα μικροδορυφορικού χρωματογράφημα (C7 /C9 /E10 και Δ3 /Ε3) και ένα πρότυπο D9S974 παρατηρήθηκαν σε 5 δοκιμαστεί μονόκλωνα που διέφεραν από τα πρότυπα των γονικών κυττάρων τους. Λειτουργία χρωμόσωμα ήταν επίσης διαφορετική μεταξύ του εκπροσώπου κλώνο E10 (σχεδόν τετραπλοειδούς) και γονικών κυττάρων του (σχεδόν διπλοειδή) (Σχήμα S1B).

Σταθερή συντήρηση εντελώς μετουσιωμένο και unmethylated-

p16

αλληλόμορφα σε καρκινικά κύτταρα

Η κατάσταση μεθυλίωσης των νησιών ρ16 CpG (392 bp) αναλύθηκε ποσοτικά σε αυτούς τους κλώνους σύντηξης χρησιμοποιώντας δοκιμασία DHPLC όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [37]. Όπως παρατηρήθηκε στα κύτταρα HCT116 ημι-μεθυλιωμένο ρ16, η αναλογία methylated- σε μόρια μη μεθυλιωμένου-p16 ήταν περίπου 1:01 σε αυτούς τους κλώνους σύντηξης (Σχήμα 1Α-αριστερά). Η αναλογία των αλληλομόρφων μεθυλιωμένων-p16 ήταν διατηρείται σταθερά σε ένα αντιπροσωπευτικό κλώνο από διόδους 45, 50, 55, και 60 (Σχήμα 1Α-δεξιά). Επιπλέον, RT-PCR ανιχνεύεται mRNA p16 σε όλες τις 5 δοκιμάστηκαν κλώνοι (Εικόνα 1Β). Nucleoplasmic πρωτεΐνη Ρ16 παρατηρήθηκε επίσης μέσα σε κάθε κύτταρο σε δύο αντιπροσωπευτικές μονόκλωνα (C9 και Ε3) (Σχήμα 1 C). Βάσει αυτών των πληροφοριών, είναι προφανές ότι η μεταγραφή /μεθυλίωση πολιτείες των αλληλομόρφων ρ16 στα κύτταρα σύντηξης πιθανό διατηρείται σε ένα παρόμοιο πρότυπο σε γονικά κύτταρα τους.

(Α) η μεθυλίωση καταστάσεις του

p16

CpG νησίδες στα μονόκλωνα σύντηξης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας DHPLC (αριστερά). Η αναλογία των methylated-

ρ16

στην monoclone-E10 ήταν σταθερά διατηρείται σε περάσματα 45, 50, 55, και 60 (δεξιά). (Β) RT-PCR δείχνει διαφορετικό έκφραση του mRNA της

p16

στα μονόκλωνα σύντηξης και γονικών MGC803 τους και κυτταρικές σειρές AGS. (Γ) Ομοεστιακή ανοσοκυτταροχημεία χρώση δείχνει διαφορετικό έκφραση Ρ16 στις διάφορες κυτταρικές γραμμές.

Η

εστιακά μεθυλιωμένα

ρ16

αλληλόμορφα δεν είναι σταθερά σε καρκινικά κύτταρα

Είναι ενδιαφέρον ότι, ενώ περισσότερα μόρια p16 παρέμεινε στα πλήρως μεθυλιωμένα ή μη μεθυλιωμένα κράτη, οι αντιπροσωπευτικές κλώνοι σύντηξης περιείχε περίπου 27% (13/48) εστιακά methylated- (ή demethylated-) μορίων p16 στην περιοχή εξόνιο-1 (Σχήμα 2Β). Ωστόσο, οι ομόζυγο μεθυλιωμένα ή μη μεθυλιωμένα γονικά κύτταρα δεν εμφανίζουν τις ίδιες αλλαγές μεθυλίωσης. Για να επιβεβαιωθεί ότι ο κλώνος δοκιμάστηκε ήταν στην πραγματικότητα μονοκλωνικά, αυτός ο κλώνος περαιτέρω υποκλωνοποιήθηκε. Περαιτέρω ανάλυση αποκάλυψε ότι τα μοτίβα ρ16 μεθυλίωσης σε δύο υποκλώνους με συνέπεια παρέμεινε παρόμοια με τη γονική κλώνους τους (Σχήμα 2C και το σχήμα S2).

(Α) Bisulfite κλώνος αλληλουχίας του θραύσματος 392 bp του

ρ16

νησί CpG στο AGS και MGC803 κύτταρα? Κάθε πράσινη γραμμή αντιπροσωπεύει ένα site CpG. Νουκλεοσωματική τοποθεσία στο εξόνιο-1 επίσης σημειώνονται (26). (Β και Γ) Bisulfite αλληλούχιση στη σύντηξη monoclone-E3 και υποκλώνους. Focal αλλαγές μεθυλίωσης (κίτρινο-σκιασμένες)? μεθυλιωμένο CpG θέσεις (red dot)? μη μεθυλιωμένα CpG θέσεις (ανοιχτή dot)? εστιακά methylated- ή demethylated-

p16

μόρια (μαύρα βέλη). (D) Ομοιοστατική μοντέλο μεθυλίωση για ένα μόνο νησί CpG στα τετραπλοειδούς κύτταρα.

Η

Ένα ενιαίο πολυμορφισμός νουκλεοτιδίου (SNP) (rs36228836) αναγνωρίστηκε στην περιοχή του p16 υποκινητή. Προσδιορίστηκε ότι ο γονότυπος αυτού του SNP διέφερε μεταξύ των δύο γονικών κυτταρικών σειρών (Τ /Α για MGC803 και Τ /Τ για AGS), καθιστώντας έτσι δυνατό τον προσδιορισμό των MGC803 ειδικά p16 A-αλληλόμορφα στα κύτταρα της σύντηξης (Εικόνα S3). Προκειμένου να διευκρινιστεί κατά πόσον αυτά τα εστιακά μεθυλιωμένο θραύσματα ήταν το αποτέλεσμα της de novo μεθυλίωση ή απομεθυλίωση, τα κράτη μεθυλίωση μέσα σε ένα τμήμα 588 bp που καλύπτει αυτό το SNP αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μια PCR δοκιμασία σπορά μεθυλίωσης-ειδική (SMSP). Ανακαλύφθηκε ότι CpG μεθυλίωση των αλληλόμορφα ρ16 στις θέσεις μεθυλίωσης «σπορά» εντός ιντρόνης-1 ήταν ουσιαστικά εμπλουτισμένο [26]. Αποτελέσματα θειώδους-αλληλουχίας επιβεβαίωσε ότι εστιακό de novo μεθυλίωση παρατηρήθηκε στις MGC803 ειδικά Α-αλληλόμορφα monoclone-D3 (Σχήμα S3).

Για να διερευνηθεί αν η παροδική εστιακά υπάρχουν αλληλόμορφα μετουσιωμένο-p16 σε κύτταρα μη-σύντηξης, το πρότυπο μεθυλίωσης του ρ16 ημι-μεθυλιωμένη HCT116 κυτταρική γραμμή αναλύθηκε επίσης. Ομοίως, το 16% (8/49) των μορίων ρ16 έδειξε εστιακές μεθυλίωση στα κύτταρα HCT116 (Σχήμα 3). Επιπλέον, με τη χρήση ενός del /ins ανάγνωσης μετάλλαξης μετατόπισης πλαισίου που βρέθηκαν στην περιοχή κωδικοποίησης εξονίου-1 ως γενετικό δείκτη, προσδιορίστηκε ότι τόσο εστιακή de novo μεθυλίωση στα μεταλλαγμένα αλληλόμορφα G-εισαγωγής (κυρίως μη μεθυλιωμένων) και απομεθυλίωση στην αλληλόμορφα άγριου τύπου (κυρίως μεθυλιωμένα) εμφανίζονται επίσης σποραδικά στα κύτταρα HCT116 (4/26 και 4/23 αντίστοιχα). Αυτό δείχνει ότι η εστιακή μεθυλίωση και απομεθυλίωση αλληλόμορφα ρ16 όντως υπάρχουν σε καρκινικά κύτταρα μη-σύντηξης. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ενώ εστιακό μεθυλίωση και απομεθυλίωση είναι σχετικά κοινές εκδηλώσεις, οι περισσότερες από τις εντελώς methylated- και μη μεθυλιωμένων αλληλίων-p16 διατηρούνται σταθερά σε καρκινικά κύτταρα.

(Α) Bisulfite κλώνος αλληλουχίας του 392 bp θραύσμα του p16

νησί CpG σε κύτταρα HCT116. Άγριου τύπου (

διαγραφή

) /μεταλλαγμένο (G-

εισαγωγή

)

p16

αλληλόμορφα? εστιακά demethylated-

p16

μόρια (μαύρα βέλη)? εστιακά

de novo

μεθυλιωμένα μόρια (κόκκινα βέλη). (Β) Ομοιοστατική μοντέλο μεθυλίωση για ένα μόνο νησί CpG στα διπλοειδή κύτταρα.

Η

Για να μελετηθεί αν το εστιακό μεθυλίωσης /απομεθυλίωσης συμβαίνει στο σώμα γονίδιο, αναλύσαμε τα μεθυλίωση κράτη της CpG νησίδων εντός η ρ16 εξόνιο-2 και ιντρόνιο-2. ανάλυση DHPLC αποκάλυψε ότι αυτές οι δύο νησίδες CpG πλήρως μεθυλιωμένα σε AGS, MGC803 και κύτταρα HCT116 (Σχήμα S4A & amp? Β), και όξινο θειώδες αλληλουχίας του ιντρονίου-2 CpG νησίδα επιβεβαίωσαν τα αποτελέσματα DHPLC (Σχήμα S4C), υποδηλώνοντας το σώμα γονίδιο είναι ομοιογενή και σταθερά μεθυλιωμένο σε αυτά τα κύτταρα και δεν συνοδεύεται εστιακό μεθυλίωσης /απομεθυλίωσης.

υπάρχει ταυτόχρονη 5-υδροξυμεθυλίωση στο

p16

αλληλόμορφα των κυττάρων σύντηξης

μεθυλίωσης του DNA και υδροξυμεθυλίωση δεν μπορούν να διαφοροποιηθούν εύκολα χρησιμοποιώντας τακτικές αναλύσεις μεθυλίωση θειώδους-based. Ο ρόλος της υδροξυμεθυλίωση στο εστιακό μεθυλίωση p16 ή απομεθυλίωση διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία hMeDIP-PCR (Εικόνα 4Α, αριστερά διάγραμμα). Τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης έδειξαν ότι η ποσότητα του υδροξυμεθυλιωμένη-ρ16 DNA στα δύο κλώνους σύντηξης ήταν σημαντικά υψηλότερη από τις μητρικές τους κύτταρα (Σχήμα 4Α, δεξιά διάγραμμα).

(Α) Ανοσο-καταβύθιση και PCR ανάλυση του συνθετικά και κυτταρικά 5hmC που περιέχουν

p16

ακολουθίες. Οι ΕΕΑ και σύντηξη monoclone-D3 και Ε3 κύτταρα παρουσιάζουν σημαντικά επίπεδα 5hmC. (Β) TAB-επόμενα ανάλυση αποκαλύπτει πλήρως hydroxymethylated-

p16

αλληλόμορφα στους υποκλώνους σύντηξης, αλλά δεν τα γονικά κύτταρα. (C) TAB-επόμενα ανάλυση των κυττάρων HCT116 δείχνει η πλειοψηφία του άγριου τύπου

p16

αλληλόμορφα είναι εντελώς υδροξυμεθυλιωμένη.

Η

Tet-βοηθός θειώδους αλληλουχίας (ΟΤΑ-seq) είναι σε θέση να συγκεκριμένα ανίχνευση 5-υδροξυ-μεθυλκυτοσίνη (5hmC) στο DNA σε ένα ενιαίο ψήφισμα βάση [35]. Χρησιμοποιώντας αυτή τη δοκιμασία για να αναλύσει το περιεχόμενο 5hmC στο ρ16 νησίδες CpG σε λεπτομέρειες, βρέθηκε ότι τα κύτταρα AGS εμφανίζουν σποραδικές υδροξυμεθυλιωμένη CpGs σε πολύ χαμηλή συχνότητα (21/700), ενώ τα κύτταρα MGC803 δεν έδειξε καμία υδροξυμεθυλίωση. Όπως αναμενόταν, τόσο πλήρης και εστιακή υδροξυμεθυλίωση αλληλομόρφων ρ16 ανιχνεύθηκαν στα κύτταρα αυτά σύντηξης (Σχήμα 4Β). Τα αποτελέσματα των δύο δοκιμασιών με συνέπεια υποδεικνύουν ότι υδροξυμεθυλίωση μπορεί να παίζει ρόλο στην ομοιοστατική διατήρηση της ρ16 μεθυλίωσης στα κύτταρα σύντηξης.

Ανάλυση των κυττάρων HCT116 αποκάλυψε απροσδόκητα συχνές και πλήρεις υδροξυμεθυλίωση εντός των αντινόημα-κλώνους του άγριου τύπου ρ16 (del) αλληλόμορφα (11/14), αλλά όχι στα μεταλλαγμένα αλληλόμορφα G-εισαγωγής (Σχήμα 4C). Ενώ μεθυλίωση ανιχνεύθηκε στο θραύσμα 369 bp της αίσθησης κλώνου του ρ16 εξονίου-1 σε κύτταρα HCT116 όπως αναμενόταν (Σχήμα 5Α-C), κυρίως, το πλήρες υδροξυμεθυλίωση δεν παρατηρήθηκε στα έννοια-κλώνων τόσο ΤΑΒ-DHPLC ανάλυση και TAB-αλληλουχίας (Σχήμα 5C και D), γεγονός που υποδηλώνει ο αντινοηματικός κλώνος συγκεκριμένη υδροξυμεθυλίωση.

(Α) Θέση του 369 bp προϊόν ενίσχυσης της αίσθησης κλώνου

p16

εξόνιο-1. (Β) Ανίχνευση των 369 bp PCR προϊόντων χρησιμοποιώντας DHPLC (λειτουργία ταξινόμηση κατά μέγεθος) στους 48 ° C. (C) Ανίχνευση υδροξυμεθυλιωμένη μορίων ενισχύθηκε από το

p16

αίσθηση κλώνου μετά από τροποποίηση ΤΑΒ χρησιμοποιώντας DHPLC (ανιχνευτής FL) κατά το μερικό θερμοκρασία μετουσίωσης 55 ° C. Υπό αυτές τις συνθήκες, οι hydroxymethylated- και unhydroxymethylated-

p16

μόρια είναι μερικώς και πλήρως μετουσιωμένη, αντίστοιχα. Οι τακτικές πρότυπα κατεργασμένου με όξινο θειώδες χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι αναφοράς. (Δ) Τα αποτελέσματα της TAB-αλληλουχίας των 369 bp PCR προϊόντων ενισχύθηκε από κύτταρα HCT116.

Η

Για να προσδιοριστεί εάν οι εντελώς υδροξυμεθυλιωμένη αλληλόμορφα άγριου τύπου p16 είναι μεταγραφικά ενεργή, το αλληλόμορφο προέλευσης των μεταγραφών ρ16 χαρακτηρίστηκε από τον κλώνο αλληλούχιση. Αποτελέσματα της αλληλουχίας αποκάλυψαν ότι κανένα από τα μόρια 48 ρ16 mRNA μεταγράφηκαν από αλληλόμορφα άγριου τύπου ρ16 που ήταν ασύμμετρα μεθυλιωμένα και υδροξυμεθυλιωμένη (M:H) (Σχήμα 6). Αυτή η πληροφορία αποδεικνύει ότι υδροξυμεθυλίωση στον κλώνο αντινόημα από τα αλληλόμορφα ρ16 δεν μπορεί να οδηγήσει σε μεταγραφική ενεργοποίηση του γονιδίου.

(Α) RT-PCR κλώνος αλληλούχιση της κυτταρικής σειράς 293Τ ελέγχου (del) δείχνει άγριου τύπου

p16

mRNA. Η HCT116 (G-ins) κυτταρική γραμμή αποκάλυψε μόνο μεταλλαγμένα

p16

κλώνων mRNA. (Β) τα αποτελέσματα αλληλουχίας Κλώνος δείχνουν τόσο άγριου τύπου και του mRNA μεταλλαγμένο p16.

Η

Η ταυτόχρονη ιστόνης H3K4 και H3K9 trimethylation στο

p16

αλληλόμορφα σε κύτταρα σύντηξης

ChIP -PCR χρησιμοποιήθηκε για τον ποσοτικό προσδιορισμό των επιπέδων των ενεργών H3K4me3 και κατασταλτικών H3K9me3 στα κύτταρα της σύντηξης (Σχήμα 7). Το επίπεδο H3K4me3 στα ετερογενώς μεθυλιωμένα αλλήλια ρ16 των υποκλώνων σύντηξης βρέθηκε να είναι σημαντικά χαμηλότερη από ό, τι παρατηρήθηκε στα εντελώς μη μεθυλιωμένων αλληλίων των κυττάρων MGC803. Επιπλέον, το επίπεδο των H3K4me3 στο εξόνιο 1-χρωματίνης προσδιορίστηκε να είναι υψηλότερη από ό, τι βρέθηκε στην χρωματίνη υποκινητή. Ενώ η H3K4me3 δεν ανιχνεύθηκε στα AGS κύτταρα, το επίπεδο H3K9me3 ήταν σημαντικά υψηλότερη σε αυτή την κυτταρική σειρά από ό, τι άλλες κυτταρικές σειρές. επίπεδο H3K9me3 έδειξε μια αντίστροφη συσχέτιση με το επίπεδο H3K4me3 μεταξύ αυτών των κυτταρικών σειρών.

(Α) Η δραστική επίπεδο H3K4me3 εντός του

p16

CpG νησίδες στα υποκλώνους σύντηξης και MGC803 κυττάρων ήταν σημαντικά υψηλότερη από ό, τι κύτταρα AGS, ιδιαίτερα στην περιοχή εξονίου-1 (μονόκλωνα vs. AGS, Ρ & lt? 0,01). (Β) Η κατασταλτική επίπεδο H3K9me3 στους υποκλώνους σύντηξης και AGS κύτταρα ήταν σημαντικά υψηλότερη από ό, τι MGC803 κύτταρα, ειδικά στην περιοχή του υποκινητή (μονόκλωνα εναντίον MGC803, P & lt? 0,01).

Η

Συζήτηση

το μοτίβο μεθυλίωσης DNA είναι γνωστό ότι αλλάζει δυναμικά κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων και την ανάπτυξη των ιστών στα σπονδυλωτά. Ωστόσο, παραμένει ένα μυστήριο πώς οι μεθυλίωση μέλη του γονιδιώματος διατηρείται σε κύτταρα δεν είναι πλέον υφίστανται διαφοροποίηση. Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώθηκε ότι η μεθυλίωση κράτη εντελώς methylated- και unmethylated-

p16

αλληλόμορφα παρέμεινε σταθερή κατά τη διάρκεια του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Επιπλέον, τα χαμηλά επίπεδα του εστιακού απομεθυλίωσης, υδροξυμεθυλίωση, και

de novo

μεθυλίωση εμφανίστηκε σχετικά συχνά σε δύο είδη

ρ16

μοντέλα καρκινικού κυττάρου ημι-μεθυλιωμένη, αλλά όχι σε ομοιογενώς μεθυλιωμένα ή μη μεθυλιωμένα κύτταρα. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η ομοιογενής μεθυλίωση μπορεί να ασκήσει πίεση στην καταστολή στο

p16

γονίδιο που μπορεί να επηρεάσουν τουλάχιστον μερικώς πρώην μη μεθυλιωμένα CpG νησίδες. Αντίθετα, η πίεση που ασκείται από μεταγραφή πλήρης απομεθυλίωση του γονιδίου είναι ικανό να προκαλεί και διατηρεί απομεθυλίωση

ρ16

CpG νησιά. Η υδροξυμεθυλίωση του

ρ16

CpG αλληλόμορφα Ανακαλύφθηκε επίσης ότι παίζει ένα ρόλο στην ομοιοστατική διατήρηση του γονιδιώματος μεθυλίωσης. Απ ‘όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη αναφορά για να δείξει ότι η κατάσταση μεθυλίωσης ενός γονιδίου καταστολής του όγκου είναι ομοιοστατικώς διατηρείται σε καρκινικά κύτταρα.

Η σταθερότητα των μεθυλιωμένων αλληλίων ρ16 δεν έχει ακόμη εξηγηθεί. Σε γαστρίτιδα βλάβες, η μεθυλίωση μέλη των περισσότερων αλληλόμορφων ρ16 είναι ασταθή και H. pylori εξαρτώμενη [27], [28]? Ωστόσο, σε κυτταρικές σειρές καρκίνου έχουν αποδειχθεί να παραμείνει αξιοσημείωτα σταθερή [29]. πρόσφατες εκτεταμένες μελέτες προσδιορισμού αλληλουχίας μας αποκάλυψαν ότι οι μεθυλιωμένες θέσεις CpG σε γαστρίτιδα βρίσκεται εντός του εξονίου 1-περιοχή του γονιδίου ρ16, αλλά εκτείνονται εντός της περιοχής του υποκινητή μετά την ανάπτυξη του γαστρικού καρκινώματος. Αυτό συνεπάγεται ότι εντελώς αλληλόμορφα μεθυλιωμένα-p16 είναι σημαντικά πιο σταθερό από εστιακά μεθυλιωμένα αντίστοιχά τους [26]. Έχει επίσης αναφερθεί ότι ετεροκάρυα μπορεί να προκαλέσει διακυμάνσεις της μεθυλίωσης DNA μέσω κυττάρου σύντηξη δύο κυτταρικών σειρών, και, επιπλέον, ότι μερικά μόρια σιγήσει-ρ16 σε καρκινικά κύτταρα ποντικού μπορεί να επανενεργοποιηθεί αφού συντήκονται με p16-ενεργό βλαστικά κύτταρα ποντικού εμβρυϊκών [30], [39]. Στην παρούσα μελέτη, τα κύτταρα σύντηξης που περιέχει μια μεγάλη ποικιλία προτύπων μεθυλίωσης ρ16 καθορίστηκαν από ομόζυγο μεθυλιωμένων και μη-μεθυλιωμένων γονικές κυτταρικές γραμμές ώστε να διερευνηθεί η σταθερότητα των εστιακά και εντελώς αλληλόμορφα μεθυλιωμένων-ρ16 εντός του ίδιου κυττάρου. Όπως ήταν αναμενόμενο, τα αλληλόμορφα ρ16 των κυττάρων σύντηξης έδειξαν μια πλήρη και μεταβλητό φάσμα μεθυλίωσης. Τα αλληλόμορφα ρ16 στους κλώνους σύντηξης και υποκλώνων τους παρέμειναν σταθερά ημι-μεθυλιωμένη κατά την διάρκεια κυτταρικών διελεύσεων, τα οποία υποδεικνύουν ότι αυτά τα εντελώς μεθυλιωμένων και μη μεθυλιωμένων αλληλίων p16 είναι σχετικά σταθερά. Από την άλλη πλευρά, ημι-μεθυλιωμένη κλώνοι σύντηξης και κύτταρα HCT116 εμφάνισαν χαμηλά επίπεδα εστιακά μεθυλιωμένων /αλληλόμορφα απομεθυλιώνεται-p16, οι οποίες παρέχουν άμεση απόδειξη ότι οι ημι-μεθυλιωμένη αλληλόμορφα ρ16 είναι λιγότερο σταθερά από τα ομοιογενώς μεθυλιωμένα αλλήλια ρ16. Αυτή η δυναμική, αλλά ακόμα ομοιοστατική, πρότυπο μεθυλίωσης του p16 CpG νησίδων μπορεί να προσφέρει ένα κοινό μηχανισμό που εξηγεί τη συντήρηση της μεθυλίωσης του DNA στη διαφοροποίηση στατική κύτταρα. Επιπλέον, δύο CpG νησιά του p16 εξόνιο-2 και ιντρόνιο-2 ομοιογενώς μεθυλιωμένος εις HCT116, AGS, και MGC803 κύτταρα, ως εκ τούτου, είναι πιθανό η ομοιοστατική διατήρηση του ρ16 μεθυλίωσης θα μπορούσε να παρατηρηθεί μόνο σε υποκινητή /εξονίου-1 περιοχή του σε αυτά τα κύτταρα. Επειδή υπάρχουν πολλές ημι-μεθυλιωμένη περιοχές στο γονιδίωμα, όπως οι Χ-χρωμοσώματα θηλυκά κύτταρα και εντυπωμένα γονίδια, περαιτέρω μελέτη για το κατά πόσον εστιακή, παροδικό μεθυλίωση και απομεθυλίωση είναι η γενική φαινόμενα στην ομοιοστατική διατήρηση της μεθυλίωσης του DNA είναι σίγουρα δικαιολογημένη.

5hmC διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην ενεργό απομεθυλίωση DNA ως ενδιάμεσο στη σειριακή οξείδωση μεθυλκυτοσίνη. Ωστόσο, ένα ορισμένο ποσοστό των 5hmC δεν οξειδώνεται περαιτέρω, αλλά αντίθετα διατηρείται στο γονιδίωμα των ενήλικων ιστών όπως ο εγκέφαλος και του παχέος εντέρου. Αν και οι πρόσθετες λειτουργίες του 5hmC στο γονιδίωμα παραμένουν άγνωστες, είναι πιθανό να εξυπηρετούν ένα σημαντικό σκοπό. Έχει αναφερθεί ότι η υδροξυμεθυλίωση σε δύο τοποθεσίες υποκινητή και ενδογονικοί συσχετίζεται θετικά με την έκφραση του γονιδίου [40]. Σε γενικές γραμμές, οι νησίδες CpG δεν μεθυλιώνονται σε περιοχές γύρω από θέσεις έναρξης της μεταγραφής σε ενεργά μεταγραφεί γονίδια, αλλά μεθυλιώνονται στο σώμα του γονιδίου. Πρόσφατα, έχει αναφερθεί ότι υδροξυμεθυλίωση στο γονιδίωμα του εγκεφάλου είναι TET2-εξαρτώμενη και περισσότερο υδροξυμεθυλίωση ανιχνεύεται στους έννοια-κλώνων από τους αντινόημα-κλώνους ενεργά μεταγράφεται φορέων γονίδιο [41], [42]. Στην παρούσα μελέτη, βρέθηκε ότι η αντινόημα κλώνους των κυττάρων HCT116 περιείχε ένα ορισμένο ποσοστό των «μεθυλιωμένων» αλληλόμορφα άγριου τύπου ρ16 που ήταν στην πραγματικότητα εντελώς υδροξυμεθυλιωμένη?