Αφηρημένο

αλληλούχισης επόμενης γενιάς (NGS) μελέτες για τον καρκίνο περιορίζεται από την ποσότητα, την ποιότητα και την καθαρότητα των δειγμάτων ιστού. Σε αυτήν την κατάσταση, οι πρωτογενείς ξενομοσχεύματα έχουν αποδειχθεί χρήσιμα προκλινικά μοντέλα. Ωστόσο, η παρουσία στρωματικών κυττάρων ποντικού προερχόμενα αντιπροσωπεύει μια τεχνική πρόκληση για τη χρήση τους σε μελέτες NGS. Εξετάσαμε αυτό το πρόβλημα σε μια καθιερωμένη πρωταρχικό μοντέλο ξενομοσχεύματος του μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (SCLC), μια κακοήθεια συχνά διαγιγνώσκεται από μικρή βιοψία ή αναρρόφηση βελόνας δείγματα. Χρησιμοποιώντας ένα

in silico

στρατηγική που αναθέτουν διαβάζει ανάλογα με το είδος της προέλευσης, που προοπτικά σε σύγκριση με τα δεδομένα NGS από την πρωτοβάθμια μοντέλα ξενομοσχεύματος με συμφωνημένα κυτταρικές σειρές και με τα δημοσιευμένα σύνολα δεδομένων. Δείχνουμε εδώ ότι η χαμηλή-κάλυψη ανάλυση ολόκληρου του γονιδιώματος επέδειξε αξιοσημείωτη σύμπτωση των δημοσιευμένων δεδομένων γονιδιώματος και των εσωτερικών ελέγχων, παρά την παρουσία του ποντικιού γονιδιακού DNA. αλληλουχίας σύλληψη exome αποκάλυψε ότι αυτή η διαδικασία εμπλουτισμού ήταν πολύ συγκεκριμένα είδη, με λιγότερο από το 4% των διαβάζει ευθυγράμμιση με το γονιδίωμα του ποντικού. Ανθρώπου-ειδική έκφραση προφίλ με RNA-Seq αναπαραχθούν πειράματα γονιδιακής έκφρασης σειρά που βασίζεται, ενώ τα προφίλ μεταγραφής του ποντικιού ειδικά συσχετίζεται με τα δημοσιευμένα σύνολα δεδομένων από ανθρώπινο στρώμα καρκίνο. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η πρωτογενής ξενομοσχευμάτων αντιπροσωπεύουν μια χρήσιμη πλατφόρμα για σύνθετη ανάλυση NGS στην έρευνα για τον καρκίνο για όγκους με περιορισμένους πόρους του δείγματος, ή εκείνων με εξέχοντα στρωματικών κυτταρικών πληθυσμών

Παράθεση:. Rossello FJ, Tothill RW, Britt Κ, Marini KD , Falzon J, Thomas DM, et al. Ανάλυση (2013) Next-Generation Ακολουθία του Καρκίνου Μοντέλα ξενομοσχεύματος. PLoS ONE 8 (9): e74432. doi: 10.1371 /journal.pone.0074432

Συντάκτης: William B. Coleman, του Πανεπιστημίου της Βόρειας Καρολίνας Σχολή Ιατρικής, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 29 Απριλίου, 2013? Δεκτές: 1 Αυγούστου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 26 Σεπτέμβρη 2013

Copyright: © 2013 Rossello et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Χρηματοδότηση το έργο αυτό παρέχεται από το Εθνικό Σύστημα Υγείας και Ιατρικής Έρευνας του Συμβουλίου της Αυστραλίας (Πρόγραμμα επιχορήγησης 546.204), την κυβέρνηση της Βικτόριας Πρόγραμμα υποστήριξης λειτουργική υποδομή, και η βικτοριανή Οργανισμού Καρκίνου. Η χρηματοδότηση για την ανοικτή πρόσβαση χρέωση: Victorian Οργανισμού Καρκίνου. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα: ο κ. Erwin Tantoso απασχολείται από Partek ΓΓ Pte. Ε.Π.Ε. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών. Οι άλλοι συγγραφείς που αποκαλύπτονται δεν πιθανές συγκρούσεις συμφερόντων.

Εισαγωγή

Αν και η εφαρμογή της τεχνολογίας NGS για την έρευνα του καρκίνου έχει οδηγήσει σε δραματική πρόοδοι στην κατανόηση της γονιδιωματικής βάσης των ασθενειών αυτών, το βάθος και η πολυπλοκότητα των δεδομένων αλληλούχισης συσχετίζεται αρνητικά με την ποσότητα και την ποιότητα του δείγματος όγκου που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση [1]. Επιπλέον, πολλά κοινά όγκους, όπως ο καρκίνος του παγκρέατος, που χαρακτηρίζονται από εκτεταμένη διήθηση του στρωματικά στοιχεία, μειώνοντας έτσι το όριο ανίχνευσης για σπάνιες, καρκίνο ειδικές παραλλαγές [2]. Ως αποτέλεσμα, κοινούς καρκίνους διαγνωστεί με μικρές βιοψίες είναι πολύ υποεκπροσωπούνται σε μελέτες NGS, οι οποίες βασίζονται κυρίως σε δείγματα χειρουργικά-εκτομή ιστού.

Μια προσέγγιση για την αντιμετώπιση αυτού του προβλήματος είναι η χρήση των πρωτογενών μοντέλα ξενομοσχεύματος, στο οποίο μικρές δείγματα ιστού μπορεί να μεταμοσχευμένα άμεσα, επεκτάθηκε και περάστηκαν σε ανοσοανεπαρκείς ποντικούς χωρίς έκθεση σε συμβατικές συνθήκες καλλιέργειας ιστού [3]. Αν και οι καρκινικά κύτταρα διατηρούνται σε ανοσοανεπαρκείς ποντικούς, εμείς [4], και άλλοι [5] – [7], έχουν δείξει ότι διατηρούν σημαντικά χαρακτηριστικά του πρωτογενούς όγκου που, το σημαντικότερο, είναι μη αναστρέψιμη, σε κυτταρική καλλιέργεια [2], [ ,,,0],4]. Επιπλέον, παρά το γεγονός ότι το συστατικό στρωματικά είναι προερχόμενα από ποντικό, πρωτεύον μοντέλα ξενομοσχεύματος έχουν χρησιμοποιηθεί επιτυχώς για την προκλινική έρευνα μιας ποικιλίας αυτόνομων και στρωματικών προέρχονται συστήματα κυτταρική σηματοδότηση του θεραπευτικού συνάφεια με τον καρκίνο [7].

με βάση αυτά τα δεδομένα, οι πρωτογενείς ξενομοσχεύματα θα μπορούσε να αποτελέσει μια χρήσιμη βάση για την ανάλυση NGS, όταν ο καρκίνος ιστός είναι περιοριστική. Ding

et al.

[8], σε μια μελέτη που είχε ως στόχο να εντοπίσει σωματικές μεταλλάξεις και δομικές παραλλαγές της βασικής-όπως ο καρκίνος του μαστού, που υπολογίζεται με τεχνικές παθολογία της σύνθεσης των όγκων στη συνέχεια να υπολογίσει και να ρυθμίσετε τον αριθμό των όγκων διαβάσει. Με βάση τις εκτιμήσεις παθολογία, οι συγγραφείς χρησιμοποιούν ένα ντετερμινιστικό διόρθωση της μόλυνσης των όγκων με φυσιολογικούς αριθμούς ανάγνωσης, η οποία επηρεάζει το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο συχνότητα, και την εφάρμοσε μόνο τα δείγματα πρωτογενούς όγκου και μετάσταση. Θεωρήθηκε ότι, λόγω του χαμηλού ποσοστού χαρτογράφηση της υποδοχής ειδικά διαβάζει στο γονιδίωμα του μοσχεύματος, καμία διόρθωση βάθος ανάγνωσης ήταν υποχρεωμένη να το δείγμα ξένου μοσχεύματος.

Κατά την άποψή μας, η παρουσία μολυσματικών DNA ποντικού και RNA επηρεάζει η ευαισθησία και η ειδικότητα της ανάλυσης NGS σε αυτά τα μοντέλα όγκων η οποία δεν θα πρέπει να βασίζεται σε εκτιμήσεις κυτταρικότητα, αλλά θα πρέπει να αντιμετωπιστεί με ακρίβεια και συστηματικό τρόπο. Επιπλέον, δεδομένου ότι οι περισσότερες σημερινές τεχνικές NGS χρησιμοποιούν τη μεθοδολογία κυνηγετικό όπλο-αλληλουχίας, ανάλυση όλων των πιθανών τεχνούργημα θα μπορούσε να εκτελεστεί

post-hoc

κατά τη διάρκεια της βιοπληροφορικής αναλύσεων, η οποία κατηγορηματικά την αναγνώριση των ειδών της προέλευσης διαβάζει. Το θέμα αυτό έχει ήδη συζητηθεί για εξαιρετικά υψηλής απόδοσης cDNA αλληλουχίας (RNA-Seq) από Conway

et al.

[9] και Raskatov

et al.

[10], ο οποίος βρήκε μεταβλητή ποσότητες αλληλούχιση προέρχονται από ξενιστή διαβάζει. Εδώ, έχουμε μελλοντικά ανέλυσε την ικανότητα ενός

in silico

ροή εργασίας σχεδιαστεί για να εκχωρήσετε οριστικά ειδών προέλευσης σε NGS διαβάζει σε πολλά προηγούμενα χαρακτηρίζεται μοντέλα ξενομοσχεύματος πρωτοβάθμιας και κυτταρική γραμμή που προέρχεται από SCLC, και σε σύγκριση με τα αποτελέσματα αυτά δημοσιευθεί σύνολα δεδομένων.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Όλα τα πειράματα με ζώα έχουν εγκριθεί εκ των προτέρων από την Επιτροπή Δεοντολογίας των ζώων στο Πανεπιστήμιο Monash και διεξήχθησαν σύμφωνα με το » Αυστραλιανό Κώδικας πρακτικής για την Φροντίδα και Χρήση των ζώων για επιστημονικούς σκοπούς. «

Cells

Τα SCLC γραμμές πρωτογενούς ξενομοσχεύματος LX22, LX33 και LX36 περάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [4]. Εν συντομία, εκτομή ιστών από ασθενείς με SCLC χημειο-αφελή χρησιμοποιήθηκαν για να δημιουργήσουν δείγματα πρωτογενούς ξενομοσχεύματα. δείγματα όγκου υποβλήθηκαν ψιλοκομμένο με αποστειρωμένο ξυραφάκια, κονιορτοποιήθηκε εντός 1 χ PBS, διηθείται μέσω ενός φίλτρου πλέγματος 60 μm, φυγοκεντρήθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε 500 μL του Matrigel (BD Biosciences) στους 4 ° C. Επεξεργασμένα κύτταρα στη συνέχεια εγχέονται υποδορίως στα πλευρά των μη παχύσαρκων διαβητικών /σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια ποντικούς. Άπαξ και οι όγκοι P0 έφθασαν μια διάμετρο 1 cm, ο ποντικός θυσιάστηκε και ο εκτομή του όγκου διαιρέθηκε σε τμήματα για θραύση πάγωμα ή σειριακή δίοδο. Ξενομοσχεύματος όγκοι παρασκευάστηκαν για σειριακές διελεύσεις

in vivo

όπως περιγράφεται παραπάνω και τα κύτταρα εγχύθηκαν στα πλευρά αθυμικών γυμνών ποντικών σε Matrigel. Περάστηκαν και snap κατεψυγμένα δείγματα όγκοι συνήθως χαρακτηρίζονται για ιστοπαθολογικές και ανοσοϊστοχημική χαρακτηριστικά της μητρικής όγκου [4].

Authenticated ΝΟΙ-Η209 κυτταρική γραμμή αγοράστηκε από την ATCC, εκ νέου προέρχεται από ένα μοναδικό κλώνο κυττάρων που χρησιμοποιούν το ενιαίο κύτταρο κλωνοποίησης με σειριακή αραίωση (Corning, Tewksbury, MA, USA) και στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν

in vitro

και in vivo, όπως περιγράφεται στο Watkins

et al.

[11]. DNA από δείγματα εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας DNAeasy Tissue και αίμα Kit (Qiagen, Santa Clara, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. RNA καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας miRNeasy Mini Kit χρησιμοποιώντας QIAzol (Qiagen, Santa Clara, CA, USA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Παρασκευή Sequencing Βιβλιοθήκες

exome και χαμηλής κάλυψη ολόκληρου του γονιδιώματος DNA επαν αλληλουχίας: στόχος του DNA (3ug) ήταν αρχικά ψαλιδισμένα χρησιμοποιώντας ένα κομβικό ακουστική συσκευή (Covaris, Woburn, MA, USA). βιβλιοθήκες θραύσμα DNA για exome εκ νέου προσδιορισμό αλληλουχίας και χαμηλής κάλυψη αλληλούχιση ολόκληρου του γονιδιώματος κατασκευάστηκαν από διατμημένο DNA από διαδοχικά στάδια των τελικών επισκευή, A-ουράς και απολίνωση του με ευρετήριο lllumina αλληλουχιών συμβατό προσαρμογέα (TruSeq DNA, Illumina, San Diego, CA , ΗΠΑ). Για exome εκ νέου προσδιορισμό αλληλουχίας, PCR ενισχυμένο βιβλιοθήκες τεμαχίου εμπλουτισμένα για εξονικές DNA με σύλληψη υβριδισμού ολιγονουκλεοτίδιο μήκους σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (SeqCap EZ exome Βιβλιοθήκη v3.0, Roche Nimblegen, Madison, WI, USA). Για τις χαμηλής κάλυψη ολόκληρου του γονιδιώματος, ενισχυμένο με PCR βιβλιοθηκών ήταν μέγεθος επιλέγεται για να συλλάβει το DNA του 500-700nt μήκους, χρησιμοποιώντας ένα αυτοματοποιημένο πλατφόρμα ηλεκτροφόρησης (Pippen Prep, Sage Science Inc., Beverly, ΜΑ, USA). Όλες οι βιβλιοθήκες αλληλούχιση ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου έναντι μιας βιβλιοθήκης γνωστής συγκέντρωσης και στη συνέχεια σε επεξεργασία για την παραγωγή του συμπλέγματος και αλληλούχιση σύμφωνα με πρότυπα πρωτόκολλα (HiSeq 2000, Illumina, San Diego, CA, USA).

RNA- επ.

ολικού RNA ελέγχθηκε για την ποιότητα και την απόδοση από την αυτοματοποιημένη μικρορευστονικής ηλεκτροφόρηση (Bioanalyzer 2100, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) και φασματοφωτόμετρο (NanoDrop, Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA). Μη κατευθυντική RNA-Seq βιβλιοθήκες δημιουργήθηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο των κατασκευαστών (Truseq RNA-Seq Βιβλιοθήκη Prep Kit v2, Illumina, San Diego, CA, USA). Εν συντομία η μέθοδος αυτή εμπλέκονται διαδοχικά βήματα εμπλουτισμού mRNA από 3ug ολικό RNA, RNA κατακερματισμός με θέρμανση υπό την παρουσία δισθενών κατιόντων, ένα τυχαία γεμάτοι αντίστροφης μεταγραφής και σύνθεσης δεύτερου κλώνου cDNA που ακολουθείται από παρασκευή βιβλιοθηκών θραύσματος DNA χρησιμοποιώντας Illumina συμβατό προσαρμογείς και ενίσχυση PCR όπως περιγράφηκε προηγουμένως για τις βιβλιοθήκες DNA.

Όλα τα δείγματα αξιολογήθηκαν ξεχωριστά για την συνολική ποιότητα ανάγνωσης χρησιμοποιώντας FASTQC (https://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc) και χαμηλής ποιότητας διαβάζει διηθούνται και ήταν δύσκολο στολισμένα με χρήση Trimmomatic (μέση ελάχιστη βαθμολογία Phred, 6 συνεχόμενες βάσεις, των 20 και ένα ελάχιστο διαβάσετε μήκος 50nt, Πίνακας S1) [12].

Πρώτες σύνολα δεδομένων βαθιά αλληλουχίας είναι διαθέσιμα στο κοινό στο Εθνικό Κέντρο Πληροφορίες βιοτεχνολογίας Σύντομη Διαβάστε Αρχείο (αριθμός προσχώρησης SRA082685).

στρατηγική για την απομόνωση και την αναγνώριση των ειδών προέλευσης NGS διαβάζει

Η προτεινόμενη στρατηγική μοιάζει με αυτή που περιγράφεται από τους Conway

et al.

[9], αλλά διαφέρει σε διάφορες σημαντικές απόψεις. Πρώτον, μια πρωτογενή ευθυγράμμιση με το γονιδίωμα του μοσχεύματος, σε αυτή την περίπτωση το ανθρώπινο γονιδίωμα, εκτελείται, όπου διαβάζει χωρίζονται σε μοσχεύματος χαρτογραφηθεί και μόσχευμα-unmapped διαβάζει? δεύτερη, τόσο μοσχεύματος χαρτογραφηθεί και μοσχεύματος unmapped ανάγνωση σύνολα ευθυγραμμισμένο με το γονιδίωμα του ξενιστή, στην περίπτωση αυτή, το γονιδίωμα του ποντικού, να προσδιοριστούν περαιτέρω κοινές μοσχεύματος-ξενιστή και ξενιστή-ειδικών διαβάζει αντίστοιχα? Τέλος, οι κοινοί μοσχεύματος ξενιστή διαβάζει φιλτράρονται από το σύνολο ανάγνωσης που λαμβάνεται στην πρωτογενή ευθυγράμμιση για να ληφθεί μοσχεύματος-ειδικά διαβάζει. Σε αυτή τη μελέτη, οι διαδικασίες αναγνώρισης και κατάταξης πραγματοποιήθηκαν

μέσω

συλλογή και τη σύγκριση των ανάγνωσης ταυτότητες των μοσχεύματος ευθυγραμμίσεις υποδοχής /, παράγοντας διαβάζει σε μορφή FASTQ. Ως αποτέλεσμα, εντοπίστηκαν μοσχεύματος ειδικά διαβάζει εκ νέου ευθυγραμμισμένη με το γονιδίωμα του μοσχεύματος.

Οι επόμενες ευθυγραμμίσεις που παράγονται τρία ξεχωριστά ευθυγραμμισμένες σειρές δεδομένων,

i. ε.

, αναφέρει ότι θα μπορούσε να χαρτογραφηθεί μόνο στο ανθρώπινο γονιδίωμα, αναφέρει ότι χαρτογραφήθηκαν αποκλειστικά στο γονιδίωμα του ποντικού και διαβάζει ότι αντιστοιχίζονται με τα δύο γονιδιώματα. Εκτός από την ανάλυση του RNA-Seq διαβάσετε σύνολα, έχουμε την περαιτέρω επαλήθευση αυτή τη στρατηγική για πειράματα αλληλουχίας χαμηλής κάλυψης ολόκληρου του γονιδιώματος και exome σύλληψης. Μια πλήρης επισκόπηση που περιγράφει όλα τα βήματα που περιλαμβάνονται στην προτεινόμενη στρατηγική φαίνεται στο Σχήμα 1. Για κάθε ευθυγράμμιση, χαρτογραφηθεί και unmapped διαβάζει περιέχονται στο SAM /αρχεία BAM διαμορφωθεί [13] διηθούνται με βάση την bitwise κατάσταση σημαία τους χρησιμοποιώντας Samtools [13], μια προσαρμοσμένη δέσμη ενεργειών Perl που συλλέγονται μοναδική ανάγνωση ταυτότητες από το ευθυγραμμισμένο /δεν ευθυγραμμίζεται με SAM σχηματοποιημένα αρχεία και τους φιλτράρεται από τα αρχεία πρώτες fastq, [Simon Andrews, 2010, Seqanswers.com [14]. Διαθέσιμο σε: https://seqanswers.com/forums/showpost.php?p=25302 postcount=3] και το λογισμικό cmpfastq_pe, ότι σε σύγκριση πρώτες ζεύγος τέλος αρχεία fastq και ανέφερε κοινή και μοναδική διαβάζει (http: //compbio .brc.iop.kcl.ac.uk /λογισμικού /cmpfastq_pe.php).

Τα στοιχεία λογισμικού που χρησιμοποιούνται σε κάθε στάδιο καθορίζονται επίσης. Συμπαγείς γραμμές αντιπροσωπεύουν το κύριο αναλυτική διαδρομή που ακολούθησε και διακεκομμένες γραμμές αντιπροσωπεύουν βοηθητικά βήματα.

Η

βαθμολογίες Χαρτογράφηση χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση της ποιότητας χαρτογράφηση των επεξεργασμένων δειγμάτων και να απορρίψει περαιτέρω πολλαπλών χτύπημα διαβάζει. Κατά γενικό κανόνα, θεωρήθηκε ότι μια υψηλότερη ποιότητα χαρτογράφησης σημαίνει μια πιο «μοναδικό» ευθυγραμμίζονται ανάγνωσης και για τα περισσότερα από τα δείγματα, ένα υψηλό ποσοστό των read-ζεύγη είχαν μια ποιότητα χαρτογράφηση πάνω από 20 (Πίνακας S2).

ανάλυση μεταγραφικό

Όλη η ανάλυση μεταγραφικό τριών SCLC πρωτογενούς ξενομοσχευμάτων έγινε μέσω RNA-Seq χρησιμοποιώντας τα 2000 πλατφόρμες αλληλουχίας GAIIX και HiSeq (Illumina, San Diego, CA, USA). Το πείραμα σε συνδυασμό τέλος με 100nT μήκους ανάγνωσης (300nt μέσο μέγεθος ενθέματος). Η στοχευμένη ελάχιστος αριθμός διαβάζει ανά δείγμα ήταν 40 εκατομμύρια διαβάζει (Πίνακας S1).

Για τον εντοπισμό και κατηγορηματικά ξεχωριστό μόσχευμα (ανθρώπινη) και υποδοχής (ποντίκι) διαβάζει, επεξεργασία του δείγματος διαβάζει διαδοχικά ευθυγραμμίζονται τόσο μόσχευμα [πλήρης hg19 ανθρώπινο γονιδίωμα (UCSC έκδοση, Φεβρουάριος 2009)] και υποδοχής [πλήρες γονιδίωμα mm9 ποντίκι (έκδοση UCSC, Ιούλιος 2007)] γονιδιώματα χρησιμοποιώντας Bowtie-ΤΟΡΗΑΤ C [έκδοση 2.0.4, τμήμα μήκους 29nt, 1 αναντιστοιχία στην κατηγορία επιτρέπεται, για μέγιστη ευαισθησία, αναζήτηση κάλυψη πραγματοποιηθεί [15], [16]. Αριθ de-επικάλυψη εκτελέστηκε για την μετα-συναρμολόγηση RNA-Seq ανάλυση.

ποσοτικοποίηση mRNA για όλες σχολιασμένα γονίδια από το ανθρώπινο γονιδίωμα διεξήχθη χρησιμοποιώντας λογισμικό Partek® (Partek Inc. (1993) Genomics Partek® Suite ™) . Διαβάζει ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το διαβάζει ανά κιλοβάσεων μοντέλου εξόνιο ανά εκατομμύριο χαρτογραφηθεί διαβάζει μέθοδο [17].

Ένα ανθρώπινο ειδικό σύνολο δεδομένων έκφραση πρωτογενούς μικροσυστοιχιών ξενομόσχευμα (GSE15240) [4] ανακτήθηκε από το Εθνικό Κέντρο Πληροφορίες βιοτεχνολογίας (NCBI) έκφραση γονιδίων Omnibus (GEO) αποθετήριο [18].

για να συγκρίνετε το ποντίκι ειδικά διαβάζει προηγουμένως δημοσιευθεί υπογραφές γονίδιο του καρκίνου στρωματικά, ο καρκίνος του μαστού σχετίζεται ινοβλάστες σύνολο δεδομένων [19] ανακτήθηκε από το GEO αποθετήριο (GSE10797). [18]

για όλες τις αναλύσεις των μικροσυστοιχιών, ανιχνευτές γονιδίων ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας quantile κανονικοποίηση (log βάσης 2 και μεσαίο βερνίκι για το μετασχηματισμό probeset και περιλήψεων, αντίστοιχα) και η διόρθωση υποβάθρου πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το ισχυρό multi -array μέθοδο του μέσου (RMA) [20].

η σύγκριση των αποτελεσμάτων της γονιδιακής έκφρασης μικροσυστοιχιών και RNA-Seq πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας γραμμική συσχέτιση (Spearman του r) μεταξύ της βάσης log 2 των ποσοτικοποιημένων γονιδίου αυθαίρετες μονάδες ένταση και η log βάση 2 RPKM όπως περιγράφεται στο Mortazavi

et al

[17].

exome επανεύρεση της αλληλουχίας ανάλυση

ανάλυση ολόκληρου-exome των δειγμάτων που λαμβάνονται από περιφερικό αίμα, NCI-Η209 κυττάρων γραμμή και παράγωγο ξενομοσχεύματος του έγινε με ολόκληρο exome αλληλουχία υπερ-υψηλής απόδοσης χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα αλληλούχισης HiSeq 2000 (llumina, San Diego, CA, USA). Το πείραμα σε συνδυασμό τέλος με 101nt μήκους ανάγνωσης (200 bp ένθετο μέγεθος). Η μέση στοχευμένη βάθος της κάλυψης τέθηκε σε 50x (βλέπε πίνακα S1 για το συνολικό αριθμό των διαβάσει ακολουθία).

Τα μεταποιημένα δείγματος διαβάζει διαδοχικά ευθυγραμμίζονται τόσο μοσχεύματος [να συμπληρωθεί hg19 ανθρώπινο γονιδίωμα (UCSC έκδοση, Φεβρουάριος 2009)] και υποδοχής [πλήρες γονιδίωμα mm9 ποντίκι (UCSC έκδοση, Ιούλιος 2007)] γονιδιώματα χρησιμοποιώντας το εργαλείο Burrows-Wheeler Ευθυγράμμιση [(BWA), BWA αλγόριθμο ALN που χρησιμοποιούνται, το μήκος των σπόρων των 22nt? μέγιστη απόσταση επεξεργασία στο σπόρο του 0 [21].

Ενιαία παραλλαγές νουκλεοτιδίων (SNVs) ανακάλυψη έγινε χρησιμοποιώντας ένα σύνολο εργαλείων που περιλαμβάνονται στο Picard (https://picard.sourceforge.net) και GATK [22 ], [23]. Κατ ‘αρχάς, εις διπλούν διαβάζει απομακρύνθηκαν από τις ευθυγραμμισμένο αρχεία BAM χρησιμοποιώντας τα MarkDuplicates εντολή από Picard (https://picard.sourceforge.net). Τα εκτιμώμενα επίπεδα επικάλυψη που περιγράφονται στον Πίνακα S3. Στη συνέχεια, de-διπλές αρχεία BAM ήταν τοπικά ευθυγραμμισμένο γύρω μυθιστόρημα και είναι γνωστή indels χρησιμοποιώντας το RealignerTargetCreator και τους περιπατητές IndelRealigner από GATK [23]. Τέλος, τα αποτελέσματα βάση της ποιότητας ήταν αναβαθμονομηθούν χρησιμοποιώντας τα CountCovariates και περιπατητές TableRecalibration από GATK [23]. Η διαδικασία αυτή πραγματοποιείται για κάθε ένα από τα τρία δείγματα που αναλύθηκαν.

Πρώτες SNP κλήσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του UnifiedGenotyper περιπατητή από GATK [23] με τις ελάχιστες απαιτήσεις ποιότητας βασική βαθμολογία Phred του 20, ένα όριο εμπιστοσύνης κλήση των 50 (Phred -scaled) και ένα όριο εμπιστοσύνης emmition 10 (Phred κλίμακας). Πρώτες ονομάζεται SNPs διηθούνται χρησιμοποιώντας το VariantFiltration περιπατητή με τις ακόλουθες παραμέτρους: SNP μέγεθος συμπλέγματος = 10? Κάλυψη: ≥ 5? Ποι: ≥ 50? Δέσμη προκατάληψη: το ακριβές τεστ του Fisher, ≥ 60. Δείγμα συγκεκριμένες νέα SNP,

i. Ε.

, Εκείνοι που δεν υπάρχουν στη βάση δεδομένων του ενός νουκλεοτιδίου πολυμορφισμών (dbSNP) (Bethesda (MD): National Center for Biotechnology Information, Εθνική Βιβλιοθήκη Ιατρικής (dbSNP 137:. 137? Http: //www.ncbi. nlm.nih.gov/SNP/), σχολιάστηκαν και τις επιπτώσεις της προβλεπόμενης χρησιμοποιώντας SnpEff [24] και την variantAnnotator περιπατητή από GATK [23].

Γονιδιώματος οπτικοποίηση έγινε με τη χρήση του προγράμματος περιήγησης Integrative Γονιδιώματος (IGV) [ ,,,0],25], [26]. multispecies κομμάτια τοπική ευθυγράμμιση ανακτήθηκαν από τον εξυπηρετητή δεδομένων IGV.

Ολόκληρο-γονιδιώματος ανάλυση

Μια χαμηλή κάλυψη ολόκληρου του γονιδιώματος αλληλούχιση των δειγμάτων που λαμβάνονται από περιφερικό αίμα, Η209 κυτταρική σειρά και προέρχεται πρωτογενούς ξενομοσχεύματος του έγινε με καραμπίνα ολόκληρο το γονιδίωμα ακολουθία υπερ-υψηλής απόδοσης με τη χρήση της πλατφόρμας αλληλουχίας HiSeq 2000 (llumina, San Diego, CA, USA). το πείραμα σε συνδυασμό τέλος με 101nt μήκους ανάγνωσης (ένθετο 200 bp μέγεθος) . Η μέση στοχευμένη βάθος της κάλυψης τέθηκε σε 4x (βλέπε πίνακα S1 για το συνολικό αριθμό των διαβάσει ακολουθία).

Τα μεταποιημένα δείγματος διαβάζει διαδοχικά ευθυγραμμίζονται τόσο μοσχεύματος [να συμπληρωθεί hg19 ανθρώπινο γονιδίωμα (UCSC έκδοση, Φεβρουάριος 2009) ] και υποδοχής [πλήρες γονιδίωμα mm9 ποντίκι (UCSC έκδοση, Ιούλιος 2007)] γονιδιώματα χρησιμοποιώντας το εργαλείο Burrows-Wheeler Ευθυγράμμιση [(BWA), BWA αλγόριθμο ALN που χρησιμοποιούνται, το μήκος των σπόρων των 22nt? μέγιστη απόσταση επεξεργασία στο σπόρο του 0 [21]. Εκτιμώμενα επίπεδα επικάλυψη βρέθηκαν να είναι οριακή και περιγράφονται στον Πίνακα S3.

ενδο- και δια-χρωμοσωμικές αναδιατάξεις ανακάλυψη του εντοπίστηκαν ανθρώπινα συγκεκριμένη διαβάζει διεξήχθη χρησιμοποιώντας FusionMap [διάρκεια και διάσπαση διαβάσετε όριο καταμέτρηση των 3 και διάσπαση ελάχιστη άγκυρα 4 διαβάζει [27]. Εντοπίστηκε συντήξεις παρίστανται γραφικώς έναντι μιας κυκλικής αναπαράσταση του ανθρώπινου γονιδιώματος (οικόπεδο Circos) χρησιμοποιώντας Circos [28].

παραλλαγές αριθμός αντιγραφής (CNV) και το περιεχόμενο αλληλόμορφων σε γονιδιωματικές περιοχές ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας Control-Freec [29]. Το δείγμα περιφερικού αίματος χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος βασικής γραμμής. Circos οικόπεδα της ανιχνεύονται CNV χτίστηκαν χρησιμοποιώντας Circos [28].

Αποτελέσματα

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, οι αξιολογηθούν στρατηγικές NGS αποκάλυψε διαφορετικές αναλογίες της υποδοχής ειδικά διαβάζει. σύλληψη exome και RNA-Seq παράγεται το χαμηλότερο ποσοστό των ειδικών ποντίκι διαβάζει, που κυμαίνονται από 4% έως 7%. Σε αντίθεση, κυνηγετικό όπλο ολόκληρο γονιδιώματος παράγεται το μεγαλύτερο αριθμό αναφέρει ότι μοναδικά ευθυγραμμίζεται με το γονιδίωμα του ποντικού, το οποίο αντιστοιχούσε στο 20% του συνολικού αριθμού των διαβάζει (Σχήμα 2). Ο ομόλογος αριθμός των διαβάζει,

δηλαδή

, εκείνοι αναφέρει ότι ευθυγραμμίζεται με αμφότερα το ανθρώπινο και το γονιδίωμα του ποντικού, βρέθηκε να είναι παρόμοιο για όλες τις μεθόδους, που κυμαίνονται από 4% (RNA-Seq) έως 1,5% (exome -πιάνω). Μια πλήρης περίληψη των ευθυγραμμίσεις που εκτελούνται περιγράφεται στον Πίνακα S2.

Για καθένα να διαβάσει την κατηγορία, το ποσοστό (%) του συνολικού αριθμού των διαβάζει έχει καθοριστεί.

Η

Ολόκληρο-γονιδιώματος ανάλυση

Όπως ήταν αναμενόμενο, το βάθος της κάλυψης ακολουθία των δειγμάτων υποβλήθηκαν σε χαμηλή κάλυψη αλληλούχιση ολόκληρου του γονιδιώματος ήταν πάνω από 3 φορές για όλα τα δείγματα που αναλύθηκαν (Πίνακας S3 Α). Ωστόσο, το βάθος της κάλυψης του δείγματος ξενομόσχευμα είχε πληγεί σοβαρά από τη μόλυνση του ποντικιού και παράγεται η χαμηλότερη τιμή των 3 δειγμάτων τόσο για το μέσο βάθος της κάλυψης (3,3 φορές) και το ποσοστό των διαβάζει καλύπτεται τουλάχιστον 3 φορές (Πίνακας S3 A).

Αντιγραφή αριθμού ανάλυση διακύμανσης τόσο της κυτταρικής γραμμής και ξενομοσχεύματος δείγματα που παράγονται πολύ παρόμοια αποτελέσματα όταν το δείγμα περιφερικού αίματος χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος (Σχήμα 3 Α). Ένα σύνολο 578 και 470 σωματικώς απέκτησε αντίγραφο αριθμός αλλοιώσεις παρατηρήθηκαν για την κυτταρική γραμμή και τα δείγματα ξενομοσχεύματος αντίστοιχα. Οι διαφορές αυτές οφείλονται κυρίως στις λεπτές διαφορές στο βάθος της κάλυψης των γονιδιακών περιοχών αξιολογούνται και οι περισσότεροι από αυτούς αντιστοιχούν σε εστιακό κέρδη αριθμό αντιγράφων ή ζημίες στη μέση του διπλοειδή περιοχών (Εικόνα 3 Β). Όπως παρατηρήθηκε στην Εικόνα S1, τόσο η κυτταρική γραμμή (Σχήμα S1 Α) και ξενομοσχεύματος (Σχήμα S1 Β) δείγματα που παράγονται πολύ παρόμοια προφίλ CNV για όλες τις αναλύθηκαν χρωμοσώματα. Μια λεπτομερής προφίλ CNV και των δύο δειγμάτων μπορεί να βρεθεί στο Σύνολα Δεδομένων S1 και S2. Ένα παρόμοιο μοτίβο παρατηρήθηκε για

β

προφίλ συχνότητας αλληλόμορφου και για τους δύο τύπους δείγματος (Σχήμα 3 C).

(Α) Circos οικόπεδο που εκπροσωπούν αντίγραφο παραλλαγές αριθμό, μεταξύ και εντός χρωμοσωμικές αναδιατάξεις του NCI -H209 κυτταρική γραμμή και ένας όγκος ξενομοσχεύματος που προέρχεται από αυτό. παραλλαγές αριθμού αντιγράφων (κόκκινο, το κέρδος? πράσινο, απώλεια) υπολογίστηκαν με βάση την κάλυψη χρησιμοποιώντας τον ανταποκριτή του περιφερικού αίματος ως μάρτυρες. Οι δια- και ενδο-χρωμοσωματικών αναδιατάξεων που εκπροσωπούνται στο μπλε (μεταξύ χρωμοσωμικές) και σκούρο μπλε (ενδο-χρωμοσωμικό). (B, C) Λεπτομερής προφίλ του αντιγράφου παραλλαγές αριθμού και Β-αλληλόμορφο συχνότητες του χρωμοσώματος 1 από τον αναλύθηκε κυτταρική γραμμή και ξενομοσχεύματος. Όπως περιγράφεται παραπάνω, ο ανταποκριτής του περιφερικού αίματος χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος και για τον τύπο της ανάλυσης. προφίλ αριθμό αντιγράφων εμφανίζονται με κόκκινο χρώμα (κέρδος), πράσινο (ζημία) και γκρι (καμία μεταβολή). ΑΕ φαίνονται γαλάζιο.

Η

Τα συγκρίσιμα αποτελέσματα θα μπορούσε να παρατηρηθεί για ενδο- και δια-χρωμοσωμικές αναδιατάξεις (Σχήμα 3 Α), όπου εντοπίστηκαν πάνω από 70 ανακατατάξεις και για τα δύο δείγματα. Ένα παράδειγμα μεταξύ χρωμοσωματικών αναδιατάξεων βρέθηκε μεταξύ

BAGE4

, ένα καρκινικά αντιγόνα υποψήφιο γονίδιο που κωδικοποιεί, και

MLL3

, ένα μέλος της μυελοειδούς /λεμφοειδών ή μικτής γράμμωσης οικογένειας λευχαιμία (MLL) . Ένας πλήρης κατάλογος των ενδο- και δια-χρωμοσωματικών αναδιατάξεων κοινό τόσο κυτταρική γραμμή και τα δείγματα ξένου μοσχεύματος μπορεί να βρεθεί σε Σύνολα S3.

Τα στοιχεία που παρουσιάζονται παραπάνω υποστηρίζει την υπόθεσή μας ότι η ενδελεχής CNV και την ανάλυση των διαρθρωτικών παραλλαγή μπορεί να πραγματοποιηθεί όταν χρησιμοποιήθηκαν τόσο η κυτταρική γραμμή και ξενομοσχεύματος δείγματα. Βρήκαμε ότι όταν σωστά αντιπροσωπεύοντας το ποντίκι ειδικά για τη μόλυνση, τα αποτελέσματα που λαμβάνονται χρησιμοποιώντας αμόλυντα κυτταρικές σειρές μπορεί να αναπαραχθεί με ακρίβεια χρησιμοποιώντας ξενομόσχευμα δείγματα, με τα πρόσθετα οφέλη από τη χρήση του

in vivo

μοντέλο.

αλληλουχίας exome ανάλυση

Ένα μέσο βάθος ακολουθία της κάλυψης στις στοχευμένες κατέλαβε περιοχές σε όλα τα δείγματα πάνω από 100 φορές επιτεύχθηκε, με περισσότερο από το 80% των βάσεων που καλύπτει τουλάχιστον 30 φορές (Πίνακας S3 Β) . Στην κυτταρική γραμμή και τα δείγματα ξενομοσχεύματος, 68,5 και 74,7 τοις εκατό των στοχευόμενων περιοχών exome καλύφθηκαν τουλάχιστον 50 φορές, με μέσο βάθος αλληλουχία κάλυψης 109 και 136 φορές αντίστοιχα. Η ανάλυση της αλληλουχίας σε όλες τρία δείγματα (

i. ε.

, περιφερικό αίμα, κυτταρική σειρά και ξενομοσχεύματος) ανιχνεύθηκαν συνολικά 53.186 (52.429 γνωστά και 757 μυθιστόρημα) SNPs. Αυτές οι παραλλαγές που βρέθηκαν στο περιφερικό αίμα θεωρήθηκαν της βλαστικής σειράς προέλευσης, και δεν ήταν σε περαιτέρω επεξεργασία για την τριτοβάθμια ανάλυση.

Ένα σύνολο 946 σωματικών παραλλαγές, 351 αυτών των νέων, ήταν κοινή τόσο για την κυτταρική σειρά και ξενομόσχευμα δείγματα (Σχήμα 4 Α). Από αυτά, 886 ήταν απλές αντικαταστάσεις βάσεων, 28 ήταν ενθέσεις και 32 ήταν διαγραφές (Σχήμα 4 Β). Ένας πλήρης κατάλογος των σωματικών μεταλλάξεων ανιχνεύονται περιγράφεται στο Σύνολα Δεδομένων S4. ταξική ανάλυση μετάλλαξης έδειξε G & gt? A /C & gt? T μεταβάσεις ήταν η πιο συνηθισμένη (33%), ακολουθούμενη από την A & gt? G /T & gt? C μεταβάσεις (23%) και το G & gt? T /C & gt? Α μεταστροφές (20%) (Σχήμα 4 ΝΤΟ). Συνολικά, αυτό το πρότυπο ήταν παρόμοιο με αυτό που αναφέρθηκε από Pleasance

κ.ά.

[30] .Η περιγράφηκε προηγουμένως ΤΡ53 δέκτη ματίσματος διαταράξει και σημειακή μετάλλαξη RB1 C706F, χαρακτηριστικό του SCLC, [30], ανιχνεύθηκαν τόσο στο κύτταρο δείγματα γραμμή και ξενομοσχεύματος.

αριθμό γνωστών και νέων παραλλαγών (Α) και των τύπων παραλλαγή (Β) βρέθηκε να είναι κοινές τόσο στην κυτταρική γραμμή και ξενομοσχεύματος και εκείνων που διαπιστώνονται μόνο στην κυτταρική σειρά και ξενομοσχεύματος. . (Γ) Ποσοτικοποίηση των έξι πιθανές τάξεις μετάλλαξη

Η

Για τις 946 παραλλαγές που είναι κοινές στα δύο κυτταρική σειρά και ξένου μοσχεύματος, η επίδραση προγνωστικός SnpEff ανέφεραν συνολικά 1806 (amp Σχήμα 5 A &? Β). Για τους σκοπούς της παρούσας ανάλυσης, αναφέραμε την επίδραση για όλες τις πιθανές μεταγραφές γονίδιο, έτσι ο συνολικός αριθμός των αναφερόμενων παραλλαγών διαφέρει από το συνολικό αριθμό των αποτελεσμάτων που βρέθηκαν. Οι πιο αντιπροσωπευτικές κατηγορίες επιπτώσεων, όταν ταξινομούνται κατά είδος, ήταν εκείνα που αντιστοιχούν σε εσώνια (721), μη συνώνυμες κωδικοποίησης (305) και συνώνυμο της κωδικοποίησης (170) (Σχήμα 5 Α). Όταν τα αποτελέσματα παραλλαγής ταξινομήθηκαν κατά περιφέρεια, ιντρονίου και εξονίου περιοχές, όπως αναμενόταν, ήταν τα πιο σημαντικά παριστάνεται (Σχήμα 5 Β). Μια περιγραφή της μέτριας και υψηλής αντίκτυπο SNPs προβλεπόμενες επιπτώσεις για την πρώτη επηρεάζονται μεταγραφή περιγράφεται στο Σύνολα S5.

Η

Εντοπίστηκαν Εξήντα τέσσερα σωματικά παραλλαγές μοναδική για το ξενομόσχευμα (Σχήμα 4 Β). Από αυτές, μόνο 15 ήταν μη-συνώνυμη παραλλαγές κωδικοποίησης. Σε όλες τις περιπτώσεις, οι παραλλαγές ήσαν ετερόζυγα, και SnpEff προέβλεψε μια μέτρια επίδραση επί της λειτουργίας της πρωτεΐνης (Πίνακας S4 Α). Αυτές οι παραλλαγές που επηρεάζονται γονίδιο μεταγραφές από τα ακόλουθα γονίδια:

ESPN, KAZN, APEH, MUC20, MUC17, AQP7, ZNF808

και

LUZP4

. Προκειμένου να προσδιορίσει την αιτία αυτών των διαφορών μεταξύ των παραλλαγών ανιχνεύεται στην κυτταρική γραμμή και τα ξενομοσχεύματος δείγματα, εξετάστηκαν οι περιοχές του γονιδιώματος που περιβάλλουν τις παραλλαγές ανιχνευθεί. Για να αποκλειστεί η πιθανότητα ότι αυτές οι παραλλαγές προέκυψε από μολυσματικές ακολουθία ποντικού, πραγματοποιήσαμε την ακόλουθη ανάλυση. Πρώτον, απομονώσαμε το αλληλούχιση διαβάζει δίπλα στην περιοχή ενδιαφέροντος μέσα σε μία κλίμακα από 1,000bp (Βλέπε Σχήμα S2 για λεπτομερή παραδείγματα). Ζεύγη τοπικές ευθυγραμμίσεις των περιοχών αυτών μεταξύ των ανθρώπου και ποντικού γονιδιωμάτων έδειξε ότι μια παγκόσμια ευθυγράμμιση δεν θα μπορούσε να ήταν δυνατή μεταξύ του ανέλυσε αλληλουχίας διαβάζει και το γονιδίωμα του ποντικού (Εικόνα S2). Στη συνέχεια, επιχειρήσαμε να ευθυγραμμίσει αυτά διαβάζει στο γονιδίωμα ποντικού. Δεν ευθυγραμμίσεις παρήχθησαν. Τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι η κωδικοποίηση περιοχής παραλλαγές μοναδική για το ξενομόσχευμα ήταν ανθρώπινης προέλευσης

Δεδομένου ότι η γενετική ετερογένεια θεωρείται σήμερα ένα χαρακτηριστικό του ορίζοντα πολλών τύπων καρκίνου [31] – [33]., Αναρωτηθήκαμε εάν αυτά ξενομόσχευμα -ειδικές παραλλαγές θα μπορούσαν να ανιχνευθούν στον αρχικό σύνολο δεδομένων κυτταρική γραμμή. Λεπτομερή επιθεώρηση της αλληλουχίας διαβάζει και βάθους κάλυψης των σχετικών περιοχών αλληλουχίας αποκάλυψε ότι η μεγάλη πλειοψηφία (9 στους 15) από αυτές τις παραλλαγές ήταν ανιχνεύσιμη, αλλά ήταν κάτω από το όριο της συχνότητας αλληλόμορφου των 0,2 (Σχήμα S3 & amp? Πίνακας S4 Α ). Για παραλλαγές δεν ανιχνεύθηκε στην κυτταρική σειρά, είτε το βάθος αλληλουχία της κάλυψης ήταν κάτω από 10 φορές ή το εναλλακτικό νουκλεοτίδιο αλληλόμορφο δεν παρατηρήθηκε (Πίνακας S4 Α). Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν το συμπέρασμα ότι οι μοναδικές στο ξενομόσχευμα παραλλαγές προέκυψε ως αποτέλεσμα της κλωνική επέκταση από έναν ετερογενή πληθυσμό κυτταρική γραμμή, ή νέες παραλλαγές που προκύπτουν από αυθόρμητες μεταλλάξεις φόντο.

Ένα επιπλέον 74 παραλλαγές εντοπίστηκαν στο κελί γραμμή, αλλά όχι στο δείγμα ξενομόσχευμα (Σχήμα 4 Β). Από αυτούς, 9 (

RhoA, MUC17, TRIM22, UNC93B1, MAML2, HIF1A, FAM18B2 και GPR64

) οδήγησε σε μη-συνώνυμη κωδικοποίησης αλλαγές περιοχή με προβλεπόμενη μέτρια επίδραση στη λειτουργία της πρωτεΐνης (Πίνακας S4 Β). Όλες αυτές οι παραλλαγές ασύμφωνα βρέθηκαν να είναι ετερόζυγοι (Πίνακας S4 Β). Μια σύγκριση της αλληλούχισης διαβάζει και βάθος αλληλουχία της κάλυψης των περιοχών αυτών αποκάλυψε παρόμοια κάλυψη τόσο κυτταρική γραμμή και δείγμα ξενομοσχεύματος (Πίνακας S4 B & amp? Σχήμα S4). Χρησιμοποιώντας μια παρόμοια προσέγγιση με εκείνη που για τις παραλλαγές ξενομοσχεύματος-ειδική, διαπιστώσαμε ότι σε όλες εκτός από μία περίπτωση, η γραμμή-ειδική παραλλαγή κύτταρο θα μπορούσε να ανιχνευθεί εύκολα στο ξενομοσχεύματος, αλλά ήταν και πάλι κάτω από το ίδιο κατώφλι συχνότητας αλληλόμορφου. Από αυτά διαβάζει εντοπίστηκαν σε έναν καθαρό πληθυσμό ανθρώπινη κυτταρική γραμμή, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι τα κύτταρα που περιέχουν αυτά τα αντιφατικά παραλλαγές που εκπροσωπούνται στη χαμηλότερη συχνότητα στην ξενομόσχευμα, όχι ως αποτέλεσμα της μόλυνσης του ποντικιού ή τροποποίηση σε βάθος ανάλυση της αλληλουχίας.

ο αριθμός των ασύμφωνα παραλλαγές ανιχνεύονται για κάθε δείγμα – 64 ξενομόσχευμα ειδικές

έναντι

74 κυτταρική σειρά συγκεκριμένες παραλλαγές – μπορεί να επηρεάσουν τον γνωστό-για-μυθιστόρημα αναλογία που παρατηρείται στο ξενομόσχευμα (Σχήμα 4 Β). Αυτή η αναλογία του δείγματος είναι κοντά στο 1:01, υψηλότερα από ό, τι η παρατηρούμενη για την κυτταρική σειρά συγκεκριμένων και κοινών κυτταρική σειρά -. Ξενομόσχευμα παραλλαγές που είναι κάτω από το 1 (Σχήμα 4 Β)

Τα στοιχεία που από το δείγμα ξενομόσχευμα παράγεται το υψηλότερο μέσο βάθος αλληλουχία κάλυψης και το 75% των βάσεων αλληλουχία καλύφθηκαν τουλάχιστον 50 φορές. Η μεγάλη πλειοψηφία των σωματικών παραλλαγές ανιχνεύθηκαν τόσο κυτταρική γραμμή και ξενομοσχεύματος, ενώ οι παραλλαγές που μοναδικά ανιχνεύθηκαν είτε στην κυτταρική γραμμή ή το ξενομόσχευμα αντιπροσώπευε μια μικρή αναλογία χωρίς σημαντική επίδραση στην μετάφραση του mRNA ματίσματος. Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι αλληλουχίας exome σύλληψης σε μοντέλα ξενομοσχεύματος αποδίδει εξαιρετικά ακριβή και αναπαραγώγιμη ανίχνευση των σημαντικών παραλλαγές κωδικοποίησης περιοχής.

μεταγραφικό ανάλυση

ανάλυση του Ανθρώπου-ειδικό μεταγραφικό τριών SCLC πρωτογενούς μοντέλα ξενομοσχεύματος (LX22, LX33 και LX36) έδειξε ισχυρή συσχέτιση (Spearman συσχέτισης = 0,75, P & lt? 0.001) με παλαιότερα δημοσιευμένα στοιχεία συστοιχία έκφρασης των γονιδίων που στα ίδια μοντέλα όγκων με χρήση ανθρώπινων ειδικά probesets cDNA [4] (Σχήμα 6 Α), έτσι ανεξάρτητα επικύρωση της στρατηγικής μας για συγκεκριμένα είδη

(Α) Σύγκριση της γονιδιακής έκφρασης ανιχνεύεται από την RNA-Seq και Affymetrix πλατφόρμες σειρά έκφρασης για πανομοιότυπα SCLC δείγματα (μέση, η = 3, P & lt?. 0.01) . (Β) Σύγκριση της γονιδιακής έκφρασης μεταξύ SCLC πρωτογενείς όγκους [34] (άξονας Υ, σημαίνουν, n = 15) και πρωτογενή ξενομοσχεύματα (άξονας Χ, σημαίνει, n = 3) (Ρ & lt? 0,01). (C) Σύγκριση της γονιδιακής έκφρασης ανιχνεύεται με Affymetrix συστοιχία μικρο-ανατομή ανθρώπινο στρώμα του καρκίνου [19] (άξονας Υ, σημαίνουν, n = 28) και ποντικού-ειδικά δεδομένα έκφραση RNA-Seq στους SCLC μοντέλα ξενομοσχεύματος (άξονας Χ, σημαίνουν , n = 3) (Ρ & lt?. 0.01)

η

Μια ανάλυση συσχέτισης της έκφρασης του γονιδίου ανάμεσα σε πρόσφατα δημοσιευμένη SCLC πρωτοπαθείς όγκους RNA-Seq πείραμα [34] και το ανθρώπινο ειδικό RNA-Seq διαβάζει του SCLC πρωτοβάθμια μοντέλα ξένου μοσχεύματος, έδειξε θετική συσχέτιση μεταξύ των δύο συνόλων δεδομένων (Spearman συσχέτισης = 0,68, P & lt? 0.001) (Σχήμα 6 Β).