Αφηρημένο

μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (SCLC) είναι μια επιθετική κακοήθεια με περιορισμένες θεραπευτικές επιλογές. Έχουμε διαπιστώσει προηγουμένως ότι PARP υπερεκφράζεται σε SCLC και ότι η στόχευση PARP μειώνει κυτταρική γραμμή και την ανάπτυξη του όγκου σε προκλινικά μοντέλα. Ωστόσο, SCLC κυτταρικές γραμμές με την ενεργοποίηση της οδού ΡΙ3Κ /mTOR ήταν σχετικά λιγότερο ευαίσθητα στην αναστολή PARP. Σε αυτή τη μελέτη, ερευνήσαμε τις πρωτεομική αλλαγές στην PI3K /mTOR και άλλα μονοπάτια που συμβαίνουν μετά την αναστολή PAPR και /ή νοκ ντάουν

in vitro

και

in vivo

. Χρησιμοποιώντας συστοιχία πρωτεΐνη αντίστροφης φάσης, βρήκαμε οι πρωτεΐνες υπερεκφράζονται πιο σημαντικά μετά από θεραπεία με τους αναστολείς PARP olaparib και rucaparib ήταν στην ΡΙ3Κ /mTOR μονοπάτι (ρ-mTOR, ρ-ΑΚΤ, και PS6) (p≤0.02). Επιπλέον, ανάμεσα στα πιο σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται πρωτεΐνες ήταν LKB1 και τους στόχους ΑΜΡΚ και TSC, η οποία ρυθμίζει αρνητικά την οδό PI3K (p≤0.042). Μετά PARP νοκ ντάουν σε κυτταρικές σειρές, φωσφορυλιωμένη mTOR, ΑΚΤ και S6 ήταν αυξημένα και σηματοδότηση LKB1 είχε μειωθεί. Παγκόσμια συγκεντρώσεις ΑΤΡ αυξήθηκαν μετά την αναστολή PARP (p≤0.02) μας οδηγεί να υποθέσουμε ότι η παρατηρούμενη αυξημένη ενεργοποίηση μονοπατιού PI3K /mTOR ακόλουθα αποτελέσματα αναστολής PARP από μειωμένη ATP χρήση και μια επακόλουθη μείωση στην αντίδραση στο στρες σηματοδότηση μέσω LKB1. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, τότε διερευνήσαμε εάν συν-στόχευση με PARP και ΡΙ3Κ αναστολέα (BKM-120) θα μπορούσε να λειτουργήσει καλύτερα από ό, τι είτε απλός παράγων μόνος. Η πλειοψηφία των SCLC κυτταρικές γραμμές ήταν ευαίσθητα σε BKM-120 σε κλινικά επιτεύξιμες δόσεις, και η έκφραση cmyc ήταν ο ισχυρότερος βιοδείκτης της απόκρισης. Σε κλινικά εφικτό δόσεις talazoparib (ο πιο ισχυρός αναστολέας PARP σε SCLC κλινικές δοκιμές) και BKM-120, ένα προσθετικό αποτέλεσμα παρατηρήθηκε

in vitro

. Όταν δοκιμάστηκε σε δύο SCLC ζωικά μοντέλα, μεγαλύτερη από την αθροιστική αλληλεπίδραση παρατηρήθηκε (p≤0.008). Τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ δείχνουν ότι ο συνδυασμός αναστολείς PARP και PI3K ενισχύει την επίδραση του κάθε παράγοντα μόνο σε προκλινικά μοντέλα SCLC, που δικαιολογούν περαιτέρω διερεύνηση τέτοιων συνδυασμών σε ασθενείς με SCLC

Παράθεση:. Cardnell RJ, Feng Υ, Mukherjee S , Diao L, Tong P, Stewart CA, et al. (2016) η ενεργοποίηση του μονοπατιού PI3K /mTOR παρακάτω PARP Αναστολή σε μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 11 (4): e0152584. doi: 10.1371 /journal.pone.0152584

Επιμέλεια: Javier Σ Castresana, Πανεπιστήμιο της Ναβάρα, Ισπανία

Ελήφθη: 9 Νοεμ 2015? Αποδεκτές: 15, Μαρ 2016? Δημοσιεύθηκε: 7 του Απριλίου 2016

Copyright: © 2016 Cardnell et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το MD Anderson Cancer Center Grant υποστήριξης (ΝΙΗ P30 CA016672)? Πανεπιστήμιο του Τέξας-Νοτιοδυτική και MD Anderson Cancer Center του πνεύμονα σπορίων (5 Ρ50 CA070907)? μέσω γενναιόδωρη φιλανθρωπική εισφορές στο Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson καρκίνο του πνεύμονα Σελήνη Shot Πρόγραμμα? ΝΙΗ 1R01 CA168484-01 (JVH)? David Bruton, Jr., Προικισμένο πρόεδρος (JVH)? Ίδρυμα Rexanna για καταπολέμηση του καρκίνου του πνεύμονα (https://www.rexannasfoundation.org/) (JVH)? Βραβείο Επιστήμονας MD Anderson Cancer Κέντρο Ιατρός (LAB)? Lee Clark υποτροφία του Πανεπιστημίου του Τέξας MD Anderson Κέντρο Καρκίνου, που υποστηρίζονται από το Ταμείο Υποτροφιών Jeane ΣΤ Shelby (LAB)? ένας Καρκίνος NCI κλινικός ερευνητής Team Βραβείο Ηγεσίας (Ρ30 CA016672) (LAB)? Ο Sheikh Khalifa Bin Zayed Al Nahyan Ινστιτούτο για την εξατομικευμένη θεραπεία του καρκίνου του (IPCT του) Κέντρο Επαγγελματικής Εκπαίδευσης και Κατάρτισης (LAB)? το Εθνικό πνεύμονα Cancer Research εταιρικής σχέσης, που κατέστη δυνατή από την Βόρεια Καρολίνα Καρκίνο του Πνεύμονα Εταιρικής Σχέσης (https://www.freetobreathe.org/) (LAB)? το Ίδρυμα Πνεύμονα Cancer Research (https://www.lungcancerresearchfoundation.org/) (LAB)? LUNGevity Ίδρυμα (https://www.lungevity.org/) (LAB)? και Το Ίδρυμα Sidney Kimmel για την Έρευνα του Καρκίνου (https://kimmel.org/) (LAB). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. YF και YS είναι υπάλληλοι της BioMarin Pharmaceutical Inc. JVH σερβίρει των συμβουλευτικών επιτροπών της AstraZenica, Abbvie, Novartis και Genentech. Αυτό δεν αλλάζει προσήλωση μας στην PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (SCLC) είναι η πιο επιθετική μορφή καρκίνου του πνεύμονα, με 5-ετή ποσοστό επιβίωσης μόλις 6% [1]. Υπάρχουν περίπου 30.000 θάνατοι από SCLC ετησίως στις Ηνωμένες Πολιτείες (η οποία αποτελεί το 13% των καρκίνων του πνεύμονα), καθιστώντας SCLC και μόνο το 8

ου κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στις ΗΠΑ το 2011 [2, 3]. Οι περισσότερες περιπτώσεις SCLC ανταποκρίνονται στη χημειοθεραπεία και ακτινοβολία αρχικά. Ωστόσο, η υποτροπή είναι σχεδόν καθολική, και στην πλειονότητα των ασθενών περαιτέρω συστηματική θεραπεία δεν παράγει απόκριση. Σε αντίθεση με μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα σήμερα δεν έχει εγκριθεί στοχευμένες θεραπείες με αποδεδειγμένο όφελος για τους ασθενείς. Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη νέων, ενεργό, και ενδεχομένως στοχευμένη φάρμακα για τη θεραπεία του μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα αντιπροσωπεύει μια σημαντική ανικανοποίητη ιατρική ανάγκη.

αναφερθεί στο παρελθόν ότι το πολυ-ΑϋΡ ριβόζης πολυμεράσης 1 (PARP1) υπερεκφράζεται σε SCLC, προσδιορίζοντας PARP ως δυνητικό θεραπευτικό στόχο σε αυτόν τον καρκίνο [4]. Περαιτέρω εργασία από την ομάδα μας έχει δείξει ότι η /2 αναστολείς PARP1 talazoparib (BMN 673), olaparib (AZD2281), και rucaparib (CO-338, AG 014.699) έχουν δράση μονοθεραπεία σε προκλινικά μοντέλα [4, 5]. Ενώ οι αναστολείς PARP είναι σε τελικό στάδιο ανάπτυξης για τη θεραπεία των καρκίνων των ωοθηκών (olaparib εγκριθεί, rucaparib Φάση 3), με βάση αυτή προκλινικά δεδομένα, αρκετές κλινικές μελέτες των αναστολέων PARP διεξάγονται σε SCLC να διερευνήσει την επίδραση αυτών των φαρμάκων σαν απλούς παράγοντες ή σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία (Φάση Ι-talazoparib, Phase II olaparib και veliparib) [6]. Στη μελέτη Φάσης Ι της talazoparib μονοθεραπεία, παρατηρήσαμε μερικές ανταποκρίσεις σε μια υποομάδα ασθενών με υποτροπιάζον [7] SCLC. Ωστόσο, όπως και με άλλα στοχευμένα φάρμακα, τον εντοπισμό των μηχανισμών που σχετίζονται με την έμφυτη και επίκτητη αντίσταση στο φάρμακο και ορθολογική συνδυασμούς για να αυξηθούν τα ποσοστά απόκρισης ή /και η διάρκεια είναι κρίσιμη για τη βελτιστοποίηση της κλινική εφαρμογή αυτών των φαρμάκων [7, 8].

σε προηγούμενες προ-κλινικές εργασίες, χρησιμοποιώντας ένα πάνελ από 8 κυτταρικές σειρές μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα που σχετίζεται ευαισθησία κυτταρική γραμμή στην αναστολή PARP με πρωτεομική προφίλ κάθε κυτταρική γραμμή [5]. Κυτταρικές σειρές με τη μεγαλύτερη ενεργοποίηση της οδού ΡΙ3Κ /mTOR ήταν η λιγότερο ευαίσθητη σε talazoparib? με φωσφορυλιωμένη (p) -Akt (T308) και ρ-ΑΚΤ (S473), όπως τα κορυφαία δείκτες της αντίστασης [5]. Γενετικές αλλοιώσεις στο PI3K /mTOR μονοπάτι δεν είναι ασυνήθιστες στην SCLC [9, 10], με συνήθως αλληλοαποκλείονται αλλαγές στο

PIK3CA

,

PTEN

,

ΑΚΤ2

,

ΑΚΤ3

,

RICTOR

, ή

mTOR

βρέθηκε σε 36% των ασθενών [10]. Προκλινικές μελέτες έχουν δείξει αναστολείς PI3K, όπως PIK75 και PF-4989216 για να έχουν δραστηριότητα σε SCLC μοντέλα με

PIK3CA

μεταλλάξεις, αλλά όχι

PTEN

ανεπάρκεια, υποδεικνύοντας μια πιθανή ρόλο για την PI3K /mTOR στοχευμένες θεραπεία σε SCLC [11, 12]. Σχετικά με αυτό το εύρημα, προηγούμενες αναφορές στον καρκίνο του μαστού έχουν δείξει ότι η θεραπεία με μια αύξηση του όγκου καθυστερημένη αναστολέα ΡΙ3Κ αλλά αυξήθηκε δεικτών της βλάβης του DNA όπως πολυ-ΑϋΡ ριβόζης (PAR) [13, 14]. Ενώ η αναστολή PARP μόνη της σε αυτά τα μοντέλα καρκίνου του μαστού μόνο μέτρια εξασθενημένη ανάπτυξη, ο συνδυασμός της PARP και της αναστολής της ΡΙ3Κ ήταν ιδιαίτερα ισχυρή στην καταστολή της ανάπτυξης [13, 14].

Όπως πρωτεομική ανάλυση αποκάλυψε μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ της δραστηριότητας της PI3K /mTOR μονοπάτι και την αντιμετώπιση της talazoparib

in vitro

[5], υποθέσαμε ότι η προσθήκη της PI3K αναστολής /mTOR μπορεί να ευαισθητοποιήσει περαιτέρω SCLC στους αναστολείς PARP. Αρχικά διερευνήθηκαν σε SCLC κυτταρικές γραμμές την ενδοκυτταρική απόκριση προς την αναστολή της PARP, παρατηρώντας αυξημένη ΡΙ3Κ /σηματοδότηση mTOR μετά την αναστολή PARP.

Σε αυτή τη μελέτη δείξαμε για πρώτη φορά ότι ΡΙ3Κ /mTOR αυξήσεις σηματοδότηση μετά την αναστολή της ΡΑΚΡ σε SCLC και ότι αυτό μπορεί να οδηγηθεί μέσω της μείωσης του ήπατος κινάση Β1 (LKB1) σηματοδότησης-αλλαγές επικυρωθεί από PARP1 νοκ ντάουν. Συνεπώς, ερευνήσαμε τις κατά του όγκου αποτελέσματα του συνδυασμού ενός αναστολέα PARP με ΡΙ3Κ-ειδικό αναστολέα σε προκλινικά μοντέλα SCLC. μελέτες συνδυασμού στόχευση PARP και PI3K

in vitro

αποκάλυψε μια προσθετική αλληλεπίδραση μεταξύ αυτών των δύο αναστολέων σε δοκιμασίες πολλαπλασιασμού. Οι μελέτες σε ζώα αποκάλυψαν ότι ο συνδυασμός αυτός έχει μεγαλύτερη επίδραση από κάθε φάρμακο μόνο στη μείωση του όγκου του όγκου, προσφέροντας έναν ισχυρό λόγο για την προώθηση αυτού του συνδυασμού σε κλινικές μελέτες σε ασθενείς με SCLC.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές

κυτταρικές σειρές ανθρώπινου SCLC ΕΤΠ-L88, DMS1114, DMS 153, DMS 53, DMS 79, H1048, H1092, H1105, H128, H1341, H1417, H1436, H146, H1672, H1836, H187, H1876 , H1930, H196, H1963, H2081, Η209, H211, H2141, H2171, Η2195, H2227, H2330, H250, Η345, H378, H446, H510, H524, H526, H69, H719, H748, H774, H82, H841, H847 , H865, H889, και SHP-77 ελήφθησαν από την ATCC (Manassas, VA) ή τη Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ)? GEMM κυτταρικές γραμμές που παράγονται KP1, Kp3, Kp11, και Kp12 [15] και ανθρώπινο ασθενή που προέρχεται ξενομόσχευμα (PDX) κυτταρική γραμμή που λαμβάνεται NJH29 ήταν όλα γενναιόδωρα από τον Dr. Julien Sage (Πανεπιστήμιο του Στάνφορντ, Stanford CA). Όλα τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε προτεινόμενες μέσο συμπληρωμένο με βόειο εμβρυϊκό ορό και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα περάστηκαν για λιγότερα από 6 μηνών από την παραλαβή.

ανάλυση Πρωτεΐνη

Για RPPA και ανάλυση κηλίδας western, κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή εις διπλούν με 1 μΜ olaparib (Σέλεκ Chemicals, Χιούστον TX), rucaparib ( Σέλεκ Chemicals, Χιούστον TX), ή talazoparib (BioMarin Pharmaceutical Inc, Novato CA). Western κηλίδες ανιχνεύθηκαν για PARP1 (cs9542), mTOR pS2448 (cs2971), mTOR (cs2983), ΑΚΤ pT308 (cs9271), ΑΚΤ (cs9272) S6 pS240,244 (cs2215), S6 (cs2217), LKB1 (cs3050), AMPKα pT172 (cs2532), AMPKα (cs2532) (Cell Signaling technlogy, Danvers ΜΑ), και ακτίνης (sc1616, Santa Cruz Biotechnology, Ντάλας Τέξας).

αντίστροφη σειρά πρωτεΐνης φάση

πρωτεΐνη λύματα ήταν συλλέγονται σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 1% Triton Χ-100, 50 mmol /L HEPES (ρΗ 7.4), 150 mmol /L NaCl, 1,5 mmol /L MgCl

2, 1 mmol /L EGTA, 100 mmol /L NaF, 10 mmol /L NaPPi, 10% γλυκερόλη, 1 mmol /L PMSF, 1 mmol /L Na

3νο

4, και 10 mg /mL απροτινίνης. Τα δείγματα προσδιορίστηκαν ποσοτικά και συστοιχίες τυπώθηκαν πρωτεΐνη από προϊόντα λύσης και χρωματίστηκαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [4, 16]. Εν συντομία, οι εικόνες slide ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας MicroVigene 4.0 (VigeneTech, Carlisle, ΜΑ). Τα ανεπεξέργαστα δεδομένα επιπέδου σημείο υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τη χρήση του πακέτου R SuperCurve [17-19], η οποία επιστρέφει την εκτιμώμενη συγκέντρωση πρωτεΐνης (πρώτες συγκέντρωση) και ένα σκορ ποιοτικού ελέγχου (QC) για κάθε διαφάνεια. Μόνο διαφάνειες με QC βαθμολογία & gt? 0.8 χρησιμοποιήθηκαν για τους μεταγενέστερους ανάλυση. Τα μη επεξεργασμένα δεδομένα συγκέντρωσης ομαλοποιήθηκαν με διάμεση-κεντράρισμα κάθε δείγμα σε όλες τις πρωτεΐνες για τη διόρθωση φόρτωσης προκαταλήψεις.

δοκιμασίες πολλαπλασιασμού

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε 2000 κύτταρα ανά φρεάτιο εις τριπλούν για κάθε κυτταρική γραμμή. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα σε κάθε φρεάτιο έλαβαν θεραπεία για 24 ώρες με έναν αναστολέα PARP (talazoparib) και /ή αναστολέα ΡΙ3Κ (BKM-120, Σέλεκ Chemicals, Houston ΤΧ) ή με έλεγχο του οχήματος. Τέσσερις ημέρες αργότερα, ο πολλαπλασιασμός αναλύθηκε με Κυττάρων Titer Glo (Promega, Fitchburg, WI). Για αγωγές ενός μόνο φαρμάκου, μέση ανασταλτική συγκέντρωση (IC

50) τιμές υπολογίστηκαν από το λογισμικό drexplorer [20]. Συγκεκριμένα, για κάθε συνδυασμό φαρμάκων (σε κάθε επίπεδο δόσης), η παρατηρούμενη (ή πειραματική) επίδραση του συνδυασμού συγκρίθηκε με την προβλεφθείσα προσθετικό αποτέλεσμα. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται στη συνέχεια ως ποσοστό της πειραματικής αποτελέσματος σε σχέση με το προβλεπόμενο προσθετικό αποτέλεσμα (1,1 = + 10%? 1 = 0%? 0,9 = -10%). Για παράδειγμα, αν το φάρμακο Α μειώνει σχετικός πολλαπλασιασμός έως 0,8 και του φαρμάκου Β στο 0.7, τότε η προβλεπόμενη προσθετικό αποτέλεσμα θα είναι 1 – ((1-0.8) + (1-0.7)) = 0,5. Εάν η παρατηρηθείσα (πειραματική) επίδραση του συνδυασμού στη σχετική πολλαπλασιασμός είναι τότε 0,3, τότε η παρατηρούμενη επίδραση είναι μεγαλύτερη από το προβλεπόμενο αποτέλεσμα του συνδυασμού [(1-0.3) /(1-0.5) = 1,4]. Χρησιμοποιώντας 10% πάνω ή κάτω από το προβλεπόμενο πρόσθετο αποτέλεσμα με ένα cut-off, μπορούμε στη συνέχεια αποδίδονται οι ακόλουθες ομάδες: Παρατηρήθηκε /προέβλεψε & gt? 1.1 = μεγαλύτερο από προσθετικό? Παρατηρούμενη /προέβλεψε & lt? 0,9 = λιγότερο από το πρόσθετο? Παρατηρηθεί /προέβλεψε ≤1.1 και ≥0.9 = πρόσθετο. Για συνδυασμούς φαρμάκων, η προσέγγιση MacSynergy II [21] με βάση το μοντέλο Bliss Ανεξαρτησίας [22] εφαρμόστηκε για τον υπολογισμό διάφορες μετρήσεις, συμπεριλαμβανομένων συνεργιστική όγκο, ανταγωνιστική όγκο, συνολικού όγκου, και επιπλέον ποσοστό kill [23].

Gene νοκ ντάουν

Για σταθερή νοκ ντάουν πρωτεΐνη, λεντοϊού σωματίδια που κωδικοποιούν δύο διαφορετικές μικρής φουρκέτα RNAs (Τα siRNAs) που στοχεύουν PARP1 και ελέγχου αγωνίζομαι shRNA (pGIPZ φορέα λεντοϊού, Open Biosystems ένα τμήμα της Dharmacon /GE Healthcare, Lafayette CO) επελέγησαν και ορίζονται ως PARP1-shRNA-1, PARP1-shRNA2, και SCR-shRNA, αντίστοιχα. Οι αλληλουχίες PARP1 shRNA ήταν ως εξής:

PARP1

-shRNA1: 5′-TAGTTGAACACACTTTCTT-3 ‘? PARP1-shRNA2: 5’-TGATGTTCCAGATCAGGTC-3 ‘. Οι

STK11

(LKB1) shRNA αλληλουχίες ήταν ως εξής LKB1-shRNA1: 5′-GCATTAAAGCAGCGTATC-3 ‘? LKB1-shRNA2: 5 ‘ATTTATTGCCAAATTTGGG-3’. Τα σωματίδια λεντοϊού shRNA επωάστηκαν με κύτταρα στόχους για 24 ώρες, και στη συνέχεια τα κύτταρα επιλέχθηκαν σε κατάλληλο μέσο καλλιέργειας που περιείχε πουρομυκίνη (2 μg /mL) για 3 εβδομάδες. Οι ανθεκτικές αποικίες επεκτάθηκαν και νοκ ντάουν αποτελεσματικότητα επικυρώθηκε από qRT-PCR και κηλίδωση western.

ATP ποσοτικοποίηση

Για την αξιολόγηση της διαθεσιμότητας του ATP, την παγκόσμια συγκεντρώσεις ΑΤΡ μετρήθηκαν σε κύτταρα επεξεργασμένα ή όχι κατεργάζεται με έναν αναστολέα PARP. Οι συγκεντρώσεις ΑΤΡ δοκιμάστηκαν από το Σύστημα ATPLite φωταύγεια σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (PerkinElmer Inc., Waltham ΜΑ).

Poly ADP-ριβόζη (PAR) δοκιμασία

Για να αξιολογηθεί η επίδραση της PARP /η αναστολή της ΡΙ3Κ στην δραστικότητα PARP1

in vivo

, προϊόντα λύσης παρασκευάστηκαν από ξενομοσχεύματα 2 ώρες μετά την παροχή φαρμάκου την ημέρα 3 της θεραπείας. Τα ξενομοσχεύματα παρήχθησαν με τη μέθοδο που περιγράφεται στο επόμενο τμήμα. επίπεδα PAR προσδιορίστηκαν με ELISA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Trevigen, Inc., Gaithersburg, MD).

Ζωικά μοντέλα

Θηλυκά Balb /c γυμνά ποντίκια ελήφθησαν από την Shanghai Lingchang Βιοτεχνολογία Co LTD (Σαγκάη, Κίνα) ή Harlan Laboratories (Houston, TX). Η μελέτη αυτή πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Όλες οι διαδικασίες που σχετίζονται με το χειρισμό των ζώων, τη φροντίδα και τη θεραπεία σε αυτή τη μελέτη είχαν εγκριθεί από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση (IACUC) της Σαγκάης Chempartner (αριθμός πρωτοκόλλου A998HL0001) ή από το Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Cancer Center IACUC (αριθμός πρωτοκόλλου RM00001191-RN01). Όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιηθεί η ταλαιπωρία των ζώων. Ανθρώπινα κύτταρα NCI-Η209 SCLC (5 × 10

6 κύτταρα) ή ΝΟΙ-H1048 καρκινικά κύτταρα (3 χ 10

6 κύτταρα) σε 0,2 mL ενός μίγματος 1: 1 μέσου και matrigel ενέθηκαν υποδορίως σε ο δεξί πλευρό του κάθε ποντικού (36 ζώα ανά κυτταρική σειρά). Όταν οι όγκοι έφθασαν ~ 150 mm

3 μέσο όγκο, τα ζώα (6 ανά ομάδα) υποβλήθηκαν σε αγωγή από του στόματος με έκδοχο, talazoparib (0,25 mg /kg), ή BKM-120 (25 mg /kg) ημερησίως για 28 ημέρες. Ο όγκος του όγκου και το βάρος των ζώων μετρήθηκαν κάθε 2 με 3 ημέρες. Ένα επιπλέον 3 ζώα για κάθε ομάδα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 3 ημέρες? ξενομοσχεύματος όγκοι συλλέχθηκαν από και καταψύχθηκαν 2-3 ώρες μετά τη θεραπεία στις ημέρες 3 για περαιτέρω ανάλυση. Η αποτελεσματικότητα της θεραπείας προσδιορίστηκε με τη σύγκριση του όγκου του όγκου από ποντικούς χορηγήθηκε φάρμακο (ΔΤ) με εκείνη από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με φορέα (ΔΟ) χρησιμοποιώντας την αναλογία (ΔΤ /ΔΟ) κατά την ημέρα 19 για NCI-H1048 και την ημέρα 25 για ΝΟΙ-Η209 [ ,,,0],24] (τελευταία μέτρηση των όγκων αντιμετωπίζονται οχήματος).

Αποτελέσματα

αναστολή PARP

in vitro

αυξάνει σηματοδότησης ΡΙ3Κ σε SCLC

Για τον εντοπισμό οδών διαμορφώνονται από αναστολή PARP, εκτελέσαμε συστοιχία αντίστροφης πρωτεΐνη φάσης (RPPA), το οποίο μετράται αλλαγές στο 137 στο σύνολο και φωσφορυλιωμένων πρωτεϊνών σε βασικούς ογκογόνο οδούς συμπεριλαμβανομένων ΡΙ3Κ, ΜΕΚ και την επιδιόρθωση του DNA σε ένα πάνελ SCLC κυτταρικών γραμμών αγωγή είτε με όχημα ή ένα το olaparib αναστολείς PARP ( AZD2281), rucaparib (CO-338, AG 014 699), ή talazoparib (BMN 673) για 24 ώρες. Ανάλυση των κυτταρολυμάτων που συλλέγονται πριν και μετά τη θεραπεία έδειξε ότι η φωσφορυλίωση (ενεργοποίηση) των πρωτεϊνών στο μονοπάτι ΡΙ3Κ /mTOR αυξήθηκε σε επεξεργασία κυτταρικές σειρές. ανάλυση RPPA αποκάλυψε ότι, από 137 στο σύνολο και φωσφορυλιωμένες πρωτεΐνες μετρήθηκαν, έξι από τις οκτώ πρωτεΐνες που πλέον σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω σε απόκριση προς την αναστολή της PARP (FDR ≤0.1) ήσαν στο μονοπάτι ΡΙ3Κ /mTOR (συμπεριλαμβανομένων π-mTOR, ρ-ΑΚΤ, και p-S6 [p≤0.02] (Σχήμα 1Α και 1Β) τα συνολικά επίπεδα πρωτεΐνης ήταν αμετάβλητα από RPPA (p≥0.27)). Talazoparib, η οποία έχει περίπου 10 φορές χαμηλότερη IC

50 σε SCLC από olaparib ή rucaparib, προκάλεσε μία παρόμοια απόκριση σε Η69 κυττάρων, όπως παρουσιάζεται από αυξημένη ρ-ΑΚΤ T673 και ρ-S6 S240,244 μετά τη θεραπεία (S1 Εικ ).

(Α) Ιεραρχική συσταδοποίηση των πρωτεϊνών προσδιορίζονται σε προϊόντα λύσης από SCLC κυτταρικές γραμμές (Η69, Η82, H841) υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όχημα ή olaparib επί 24 ώρες αποκάλυψε αυξημένη δραστηριότητα της ΡΙ3Κ /μονοπατιού mTOR μετά την αναστολή PARP ( FDR≤0.1, ισοδύναμο π-value≤0.037). (Β) Ατομική φωσφορυλιωμένες πρωτεΐνες στο PI3K /mTOR μονοπάτι (p-mTOR, π-ΑΚΤ και p-S6 κινάση) αυξάνονται μετά από αγωγή είτε με olaparib ή rucaparib (p≤0.02). (C) Κυτταρολύματα από κυτταρικές σειρές που έλαβαν θεραπεία με olaparib ή rucaparib έναντι του οχήματος για 24 ώρες δείχνουν αδρανοποίηση της οδού LKB1 (LKB1, pAMPKα και pTSC2? P≤0.042).

Η

αναστολή PARP οδηγεί PI3K /ενεργοποίηση mTOR μέσω ΑΤΡ /LKB1

προηγούμενες μελέτες μας έδειξαν ότι εκτός από την PARP, SCLC κυτταρικές σειρές υπερεκφράζουν επίσης ήπατος κινάση Β1 (LKB1) [4]. Η οδός LBK1 είναι ένας μηχανισμός στρες-απόκρισης που ενεργοποιείται σε απόκριση μεταβολικών καταπονήσεις όπως εξάντληση του ΑΤΡ για την προστασία του κυττάρου [25]. Μία συνέπεια της δραστηριότητας LKB1 είναι η καταστολή της οδού της mTOR [25]. ανάλυση RPPA του SCLC κύτταρα που κατεργάζονται με olaparib αποκάλυψε μια μείωση στην δραστηριότητα του LKB1 οδού (Σχήμα 1Α). Περαιτέρω ανάλυση (Σχήμα 1 C) έδειξαν ότι η θεραπεία με είτε olaparib ή rucaparib μείωσε σημαντικά την έκφραση LKB1 (ρ & lt? 0.001). Φωσφορυλίωση του κατάντη στόχους LKB1 του, pAMPKα και pTSC2, μειώθηκε επίσης σημαντικά μετά από θεραπεία με αναστολείς PARP (p = 0,022 και p = 0,042 με olaparib? P = 0,013 και p = 0,034 με rucaparib για pAMPKα και pTSC2, αντίστοιχα? Συνολικό ΑΜΡΚ και TSC επίπεδα πρωτεΐνης ήταν αμετάβλητα όπως μετράται με RPPA, p≥0.81).

αναστολείς PARP λειτουργούν μέσω τόσο την καταλυτική αναστολή της PARP και ενός φαινομένου που ονομάζεται παγίδευσης PARP-DNA όπου PARP παγιδεύεται στη θέση ενός κλώνου διακοπή διπλό (ΟΕΔ) στην πρόληψη ότι η DSB από το να επισκευαστεί και προκαλώντας την άμεση κυτταροτοξικότητα [26]. Ως εκ τούτου, για να εξετάσει την επίδραση της PARP καταλυτική αναστολή συγκεκριμένα, γκρέμισε το

PARP1

γονίδιο από λεντοϊού μεταγωγή shRNA σε ένα πάνελ SCLC κυτταρικές σειρές που περιλαμβάνουν έναν εκπρόσωπο κυτταρική γραμμή από τη φαρμακοκινητική ανάλυση in vitro και κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται στις μελέτες σε ζώα (περιγράφεται παρακάτω). PARP νοκ ντάουν μας επέτρεψε να δούμε όχι μόνο άμεσα στην καταλυτική αναστολή της PARP1, αλλά για να αποφύγει και το δυναμικό off-στόχο επιδράσεις των φαρμακολογικών αναστολέων. Όπως φαίνεται στο σχήμα 2Α, η παρούσα knockdown σημαντικά μειωμένη έκφραση PARP1 σύγκριση με σκαρφάλωμα shRNA (έλεγχος). Περαιτέρω ανάλυση κηλίδος western των

PARP1

knockdown κυτταρικές σειρές shRNA έδειξαν αυξημένη mTOR, ΑΚΤ, και S6 δραστικότητα σε σχέση με τον έλεγχο ανακατώσει shRNA σε όλες τις κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν, παρά Η69 και H1048 έχοντας ενεργοποίηση μεταλλάξεων στο

PIK3CA

. Επιβεβαιώσαμε τις παρατηρήσεις μας σε Η69 νοκ ντάουν κύτταρα χρησιμοποιώντας έναν περιορισμένο πίνακα RPPA ανάλυση επιλεγμένων πρωτεϊνών (S2 σχήμα). Σε αυτή την ανάλυση, η δεύτερη και η τρίτη πιο σημαντικές διαφορές μεταξύ scramble- και

PARP1

shRNA μεταγωγή κύτταρα μειώθηκαν PARP1 και αυξημένη p-S6 (35 χτυπήματα σε

PARP1

Kd1 και 52 Kd2 σε FDR≤0.05). Η παρατηρούμενη αυξημένη σε ΡΙ3Κ /mTOR σηματοδότηση με βραχυπρόθεσμα φαρμακολογική και μακροπρόθεσμη γενετική απώλεια της λειτουργίας PARP1 ενισχύει την ιδέα ότι η ενεργοποίηση /mTOR ΡΙ3Κ είναι μια επίδραση που σχετίζεται με την καταλυτική αναστολή της PARP αντί PARP-DNA παγίδευσης. Το μυθιστόρημα παρατήρηση ότι η αναστολή της PARP ή νοκ ντάουν ενεργοποιεί το μονοπάτι PI3K /mTOR σε μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (Σχήμα 1) είναι συνεπής με προηγουμένως δημοσίευσε την έκθεσή μας ότι αυτή η οδός είναι ο ισχυρότερος δείκτης της βασικής γραμμής αντίστασης στην αναστολή PARP [5].

(Α) Κυτταρολύματα από PARP1 νοκ ντάουν από shRNA στο SCLC κυτταρικές σειρές (Η69, H1048, Η209) οδηγεί σε αυξημένη δραστηριότητα της PI3K /mTOR μονοπάτι σε σχέση με αγωνίζομαι (SCR) shRNA, όπως προσδιορίζεται με κηλίδα western. (Β)

PARP1

νοκ ντάουν κύτταρα shRNA (Kd1 και Kd2) είχαν χαμηλότερα LKB1 και της έκφρασης pAMPKα από αγωνίζομαι κύτταρα shRNA. (Γ) Η69 και H1048 κύτταρα επεξεργασμένα με olaparib έδειξαν αυξημένη [ΑΤΡ], όπως μετράται με τη δοκιμασία ΑΤΡϋίβ. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM? ** P & lt? 0,02, *** p & lt? 0,01. (Δ) Ένα προτεινόμενο μοντέλο της ενεργοποίησης της οδού PI3K μετά την αναστολή PARP.

Η

Η περαιτέρω ανάλυση της δραστηριότητας PARP1 επί της οδού LKB1 στο SCLC κυτταρικές σειρές έδειξαν ότι η έκφραση LKB1 και φωσφορυλίωση AMPKα ήταν τόσο χαμηλότερα σε

PARP1

knockdown κύτταρα σε σχέση με κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με σκαρφάλωμα shRNA (Σχήμα 2Β).

PARP καταλύει τον πολυμερισμό του ADP-ριβόζης από NAD + να προσκολληθούν πολυ ΑϋΡ-ριβόζη (PAR) με τις πρωτεΐνες του δότη σε μια διαδικασία ονομάζεται PARylation [27]. Όπως PARylation από PARP είναι ένα ΑΤΡ έντασης γεγονός, υποθέσαμε ότι τα αποτελέσματα της αναστολής PARP σε αύξηση των διαθέσιμων ΑΠΑ, το οποίο στα αποτελέσματα με τη σειρά σε μειωμένη δραστηριότητα LKB1 μονοπάτι και ως εκ τούτου μια απώλεια της καταστολής /mTOR ΡΙ3Κ. Χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία φωταύγειας που βασίζεται, μετρήσαμε παγκόσμιο επίπεδο ΑΤΡ σε SCLC κυττάρων πριν και μετά τη θεραπεία με έναν αναστολέα PARP. Όπως φαίνεται στο Σχ 2C, οι συγκεντρώσεις ΑΤΡ αυξήθηκαν μετά από αγωγή με olaparib (1 μΜ, ρ & lt? 0.001 σε 1 ώρα). Ο προτεινόμενος μηχανισμός για το πώς η αναστολή ΡΑΚΡ μπορεί να τονώσει την οδό ΡΙ3Κ /mTOR μέσω της αυξημένης διαθεσιμότητας ΑΤΡ και καταστολή της οδού LKB1 εμφανίζεται ως Σχήμα 2D. Οι παρατηρήσεις αυτές συμφωνούν με πρόσφατη έκθεση ότι PARP1 μεσολάβηση ιονίζουσα ακτινοβολία που προκαλείται από αυτοφαγία εμφανίζεται μέσω της ενεργοποίησης του LKB1 /ΑΜΡΚ /mTOR μονοπάτι [28], καθώς και τις εκθέσεις που δείχνουν ότι η ενεργοποίηση των PARP1 παρακάτω αλκυλιωτικών βλάβη του DNA ενεργοποιεί το μονοπάτι LKB1 να καταστείλει PI3K σηματοδότηση μέσω της εξάντλησης των ΑΤΡ-ένα αποτέλεσμα που χάνεται μετά την αναστολή PARP1 [29, 30].

Talazoparib και ένας αναστολέας ΡΙ3Κ συνδυάζουν προσθετικά στο SCLC

η επέκταση στις προηγούμενες παρατηρήσεις μας ότι 1 ) ευαισθησία στην αναστολή PARP σχετίζεται αντιστρόφως με τη δράση ΡΙ3Κ /mTOR μονοπάτι [5] και 2) αναστολή PARP αυξημένη σηματοδότηση ΡΙ3Κ /mTOR, δοκιμάσαμε την αποτελεσματικότητα αντι-πολλαπλασιασμού ενός αναστολέα PI3Kα (BKM-120) στον πίνακα μας 50 SCLC κυτταρικές γραμμές. BKM-120 (μια παν-class-1 ρ110α /β /γ /δ αναστολέα) επιλέχθηκε επειδή χρησιμοποιήθηκε σε μια μελέτη ενός συνδυασμού αναστολέα PARP /PI3K στον καρκίνο του μαστού /ωοθηκών (ClinicalTrial.gov Identifier: NCT01623349) και επειδή άλλος P110-ειδικός αναστολέας (PIK75) έχει δειχθεί ότι έχει δραστικότητα μονοθεραπεία σε ορισμένες SCLC κυτταρικές γραμμές [12]. Όπως φαίνεται στο σχήμα 3Α, IC

50 επιτεύχθηκε στην πλειοψηφία των κυτταρικών σειρών που δοκιμάστηκαν (44/50), 35 από αυτούς σε μια κλινικώς επιτεύξιμη δόση μικρότερη από την αναφερόμενη ημέρα 1 C

max της 2.3μM [31 δοκιμασίες διάδοσης].

(Α) έδειξε μια σειρά από ευαισθησίες για να BKM-120 σε όλη την SCLC πίνακα κυτταρική σειρά. Κυτταρικές σειρές με

PTEN

μεταλλάξεις /διαγραφές είναι χρωματισμένα κόκκινα και τα άτομα με

PIK3CA

μεταλλάξεις πράσινο? κλινική C

max υποδεικνύεται με μια διακεκομμένη οριζόντια γραμμή. # Υποδεικνύει IC

50 δεν έφτασε σε δόσεις που δοκιμάστηκαν. (Β) περίληψη των

PI3K /mTOR

μετάλλαξη και

MYC

ενίσχυση καθεστώς των κυτταρικών σειρών (βλέπε S3 Εικ για τα ονόματα κυτταρική σειρά). (C) Οι κυτταρικές σειρές είτε με μετάλλαξη στο μονοπάτι ΡΙ3Κ /mTOR (ΜΤ) ή ενός

MYC

ενίσχυση (ΑΜΡ) ήταν πιο ευαίσθητα σε BKM-120 από τα κύτταρα χωρίς μετάλλαξη ή ενίσχυση (WT και μη AMP? ** p & lt?. 0.02). ανακάλυψη (D) βιοδεικτών χρησιμοποιώντας τα προφίλ RPPA των 47 SCLC κυτταρικές σειρές συσχετίζονται έκφραση της πρωτεΐνης με BKM-120 IC

50 για να προσδιορίσει τους δείκτες πρόβλεψης της ανταπόκρισης. Τα δεδομένα του πολλαπλασιασμού παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM.

Η

Για τον προσδιορισμό του ρόλου που μπορούν να διαδραματίσουν οι μεταλλάξεις PI3K /mTOR μονοπάτι στην ευαισθησία σε BKM-120, εντοπίσαμε κυτταρικές σειρές με τέτοιες μεταλλάξεις. Κύτταρα με

PIK3CA

μεταλλάξεις (n = 3, εμφανίζεται πράσινο στο σχήμα 3Α) συσχετίστηκαν με χαμηλότερες IC

50 τιμές, αναφέροντας, όπως ήταν αναμενόμενο, ότι τα κύτταρα που εξαρτώνται περισσότερο από την PI3K /mTOR σηματοδότηση για επιβίωση είναι πιο ευαίσθητα σε έναν αναστολέα ΡΙ3Κ. Πρέπει επίσης να προσδιορίζονται

ΑΚΤ2

,

RICTOR

, και

mTOR

μεταλλάξεις σε κυτταρικές σειρές που ήταν ευαίσθητα σε BKM-120. Κύτταρα με

PTEN

αλλοιώσεις (n = 7, που αναφέρεται σε κόκκινο στο σχήμα 3Α) διανεμήθηκαν σε όλο το φάσμα της ευαισθησίες, πράγμα που σημαίνει ότι

PTEN

αλλαγές δεν συσχετίζονται με την ευαισθησία. Οι συχνότητες των μεταλλάξεων σε αυτά τα πέντε γονίδια (που συνοψίζονται στο Σχήμα 3Β και S3 Εικ) είναι παρόμοια με εκείνα που δημοσιεύονται σε μια πρόσφατη μελέτη του SCLC δειγμάτων βιοψίας [10]. Όταν ομαδοποιημένοι, κυτταρικές σειρές με μεταλλάξεις μονοπατιού PI3K /mTOR είχαν σημαντικά χαμηλότερη IC

50 τιμές για BKM-120 από τους μη-μεταλλαγμένων κυττάρων (Σχήμα 3C, p = 0.01).

Για τον εντοπισμό πιθανών πρωτεομική δείκτες ανταπόκρισης σε BKM-120, αναλύσαμε τη συσχέτιση μεταξύ IC

50 έως BKM-120 και τα βασικά επίπεδα έκφρασης του 146 συνολικού ή φωσφορυλιωμένες πρωτεΐνες με RPPA. Όπως φαίνεται στο Σχ 3D, Spearman συσχέτιση προσδιορίζονται έκφρασης πρωτεΐνης cMyc ως η κορυφαία δείκτης ευαισθησίας προς BKM-120 (ρ & lt? 0.001)? άλλα σημαντικά (ρ & lt? 0,05) δείκτες ευαισθησίας περιλαμβάνονται ρ-cMyc, ρ-AMPKα, και ρ-ACC1. Περαιτέρω ανάλυση των στοιχείων ευαισθησίας BKM-120 αποκάλυψε ότι κυτταρικές σειρές με μία γνωστή

MYC

ενίσχυση είχαν σημαντικά χαμηλότερη IC

50 (ρ = 0,01, Σχήμα 3C), επιβεβαιώνοντας την πρωτεομική δείκτη. Μεταξύ τους ισχυρότερους δείκτες αντίστασης στην BKM-120 ήταν οι πρωτεΐνες που εμπλέκουν την ΜΑΡΚ /ΕΚΚ οδού (pERK1 /2 (T202, Y204) Rho = 0,358, p = 0,014? PGSK3α /β (S21,9) Rho = 0,318, p = 0,032 ? pMAPK (T202, Y204) Rho = 0.317, p = 0.032). Η ενεργοποίηση του μονοπατιού ΜΑΡΚ /ΕΚΚ μετά την αναστολή της ΡΙ3Κ έχει παρατηρηθεί σε έναν αριθμό καρκίνων [32], συμπεριλαμβανομένων NSCLC [33] και του καρκίνου του μαστού [32, 34]? Αυτό το αποτέλεσμα μπορεί να προκαλείται μέσω της απώλειας του ανασταλτικού αποτελέσματος AKT σχετικά Raf [35]. Πέρα από το μονοπάτι ΜΑΡΚ /ΕΚΚ, οι ισχυρότεροι δείκτες της αντίστασης στην BKM-120 ήταν ΑΚΤ και π-BAD (ρ & lt? 0.001) Είναι ενδιαφέρον ότι, BKM-120 IC

50 τιμές δεν δείχνουν μια ισχυρή συσχέτιση με το παρελθόν που δημοσιεύθηκε βαθμολογία PI3K μας [5] (Rho = 0.101, p = 0.51), η οποία είναι συνεπής με δημοσιευμένες παρατηρήσεις ότι η ευαισθησία προς pictilisib (GDC0941, ένας αναστολέας /δ PI3Kα) δεν έδειξε συσχέτιση με το σκορ ΡΙ3Κ σε ένα πάνελ 60 κεφαλής και λαιμού καρκίνωμα από πλακώδες επιθήλιο κυτταρικές γραμμές [36]. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι η ενεργοποίηση της ΜΕΚ (ή άλλων οδών αντισταθμιστικές /διαφυγής) μπορεί να είναι πιο σημαντική από την βασική δραστικότητα οδού ΡΙ3Κ τον προσδιορισμό της ευαισθησίας σε αναστολή ΡΙ3Κ.

Ο συνδυασμός των αναστολέων PARP και ΡΙ3Κ έχει αναφερθεί ότι είναι δραστηριοποιείται έντονα σε προκλινικά μοντέλα (ξενομοσχεύματα ασθενή που προέρχεται και ένα

γονιδίων BRCA1 /Trp53

νοκ-άουτ αυθόρμητη γενετικά μοντέλο ποντικού) του καρκίνου του μαστού [13, 14]. Βάσει αυτών των αποτελεσμάτων, μια κλινική δοκιμή εξετάσεως του συνδυασμού της olaparib αναστολέα PARP και έναν αναστολέα της ΡΙ3Κ (παν-P110 BKM-120 ή ρ110α συγκεκριμένες BYL719) κινήθηκε για καρκίνο του μαστού και των ωοθηκών (NCT01623349). Τα προκαταρκτικά στοιχεία καταδεικνύει την ανεκτικότητα του συνδυασμού [37] και κλινικό όφελος σε όλα τα επίπεδα δόσης τουλάχιστον στην olaparib + BKM-120 κλάσης [38]. Ως εκ τούτου, εξέτασαν τα αποτελέσματα ενός συνδυασμού talazoparib (αναστολέας PARP) και BKM-120 (αναστολέας ΡΙ3Κ) σε κλινικά εφικτό δόσεις σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών SCLC με μια σειρά από ευαισθησίες (ευαίσθητες, ενδιάμεση και ανθεκτικά) τόσο BKM-120 και talazoparib (ευαισθησία σε talazoparib φαίνεται στο Σχ S4). Έξι δόσεις talazoparib (εύρος 0,1-30 ηΜ) και τρεις δόσεις BKM-120 (εύρος 0,1-1 μΜ) ελέγχθηκαν σε κάθε κυτταρική σειρά. Σε κάθε επίπεδο δόσης, συγκρίναμε την επίδραση επί του πολλαπλασιασμού με το προβλεπόμενο προσθετικό αποτέλεσμα. ρυθμούς πολλαπλασιασμού που ήταν εντός του 10% της προβλεπόμενης προσθετικό αποτέλεσμα όταν θεωρούνται «πρόσθετο», ενώ του οποίου με ποσοστά πολλαπλασιασμό περισσότερο από 10% πάνω ή κάτω από το προβλεπόμενο προσθετικό αποτέλεσμα θεωρήθηκαν «λιγότερο από προσθετική» ή «μεγαλύτερη από προσθετική» (Σχ 4Α ). Ως παράδειγμα, το Σχήμα 4Α δείχνει αντιπροσωπευτικές κυτταρικές γραμμές με μια απάντηση «πρόσθετο» (H211, DMS-79) ή μία απόκριση (H1930) «μεγαλύτερο από προσθετικό». Χρησιμοποιώντας αυτή την προσέγγιση, δείξαμε ένα προσθετικό αλληλεπίδραση σε 49 από τις 50 SCLC κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν.

(Α) δοκιμασίες πολλαπλασιασμού χρησιμοποιώντας κλινικά επιτεύξιμες δόσεις talazoparib (6 δόσεις, εύρος 0,1-30 ηΜ) και BKM-120 (3 δόσεις, εύρος 0.1-1 μΜ) έδειξαν μία αλληλεπίδραση πρόσθετο στα περισσότερα από τα 50 SCLC κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν. Παραδείγματα δείχνουν προσθετικό απαντήσεις (H211, DMS-79), και μια μεγαλύτερη-από-προσθέτου απόκρισης (H1930). (Β) Βαθμός (ποσοστό) της αναστολής ανωτέρω (πράσινο) ή κάτω (ροζ) την προβλεπόμενη πρόσθετη επίδραση (μωβ) για κάθε κυτταρική σειρά σε όλες τις κλινικά επιτεύξιμες δόσεις. (Γ) Παρατηρήθηκε πολλαπλασιασμός σε σχέση με την προβλεπόμενη αθροιστική δράση σε επιμέρους δόσεις της BKM-120.

Η

Για να τραβήξετε μια σφαιρική άποψη της αλληλεπίδρασης μεταξύ των δύο φαρμάκων για κάθε κυτταρική σειρά σε όλες τις δόσεις, θα πραγματοποιηθεί μια περαιτέρω ανάλυση που συνδύαζε τον βαθμό (ποσοστό) της αναστολής πάνω ή κάτω από το προβλεπόμενο προσθετικό αποτέλεσμα από όλους τους πιθανούς συνδυασμούς. Χρησιμοποιώντας την περιοχή κάτω από την καμπύλη (όγκος), συγκρίναμε το παρατηρούμενο και η προβλεπόμενη προσθετικές τιμές (ως ποσοστό σε σχέση με το προβλεπόμενο) σε κάθε συνδυασμό (με μια μονάδα μΜ

2%) οι θετικές και αρνητικές τιμές στη συνέχεια χωριστά αθροίζονται για κάθε κυτταρική σειρά (Σχήμα 4Β). Για όλους τους αλλά τρεις κυτταρικές σειρές, το συνολικό αποτέλεσμα της talazoparib + BKM120 συνδυασμός ήταν μέσα σε έναν όγκο ± 10%, η οποία εμπίπτει στην προβλεπόμενη προσθετική δράση, υποστηρίζοντας περαιτέρω το συμπέρασμα ότι τα φάρμακα αυτά ήταν κυρίως πρόσθετο

in vitro

Δρχ.