Αφηρημένο

Υπάρχει μια αυξανόμενη τάση για τους ερευνητές να χρησιμοποιούν

in vitro

3D μοντέλα στις μελέτες του καρκίνου, δεδομένου ότι μπορούν καλύτερα ανακεφαλαιώνουν το συγκρότημα

in vivo

κατάσταση. Και το γεγονός ότι η πρόοδος και η ανάπτυξη των όγκων συνδέονται στενά με στρωματικά μικροπεριβάλλον του αναγνωρίζεται ολοένα και περισσότερο. Η δημιουργία τέτοιων όγκων υποστηρικτική θέση είναι ζωτικής σημασίας για την πρόοδο της κατανόησης του όγκου και των μεταστάσεων. Η μεσεγχυματικά προέλευση πολλά κύτταρα που κατοικούν στην κόγχη του καρκίνου παρέχει τη λογική για να συμπεριλάβει MSCs σε μιμούνται τη θέση στην νευροβλάστωμα. Εδώ είμαστε συν-ενθυλακώνουν και συγκαλλιέργεια NBCs και MSCs σε ένα 3D

in vitro

μοντέλο και τη διερεύνηση της μορφολογίας, κινητική ανάπτυξη και αναδιαμόρφωση της μήτρας στην ανασύσταση περιβάλλον του στρώματος. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ενσωμάτωση των MSCs στο μοντέλο οδηγούν σε επιταχυνόμενη ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, καθώς και ανακεφαλαίωση των τουλάχιστον μερικώς μικροπεριβάλλον του όγκου

in vivo

. Ως εκ τούτου, η παρούσα μελέτη αποδεικνύει τη σκοπιμότητα για την μικροσφαιριδίων κολλαγόνου για να ενεργήσει ως 3D

in vitro

μοντέλο καρκίνου για διάφορα θέματα σε μελέτες καρκίνου

Παράθεση:. Γιουνγκ P, Sin ΕΣ, Chan S, Chan GCF, Chan BP (2015) μικροενθυλάκωση Νευροβλάστωμα κύτταρα και μεσεγχυματικά στρωματικά κύτταρα κολλαγόνου Μικροσφαιρίδια: ένα μοντέλο 3D για Cancer Cell Μελέτη θέσεων. PLoS ONE 10 (12): e0144139. doi: 10.1371 /journal.pone.0144139

Συντάκτης: Stan Gronthos, Το Πανεπιστήμιο της Αδελαΐδα, Αυστραλία

Ελήφθη: 21 Αυγούστου 2015? Αποδεκτές: 14 Νοεμβρίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: 14 Δεκεμβρίου, 2015

Copyright: © 2015 Yeung et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

χρηματοδότηση:.. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν αντικρουόμενα συμφέροντα

Εισαγωγή

Χρησιμοποιώντας 2D μονοστρωματικές καλλιέργειες κυτταρικών σειρών καρκίνου ως ένα απλό μοντέλο για τη μελέτη έρευνα για τον καρκίνο θα μπορούσαν να αναχθούν σε 1950 [1, 2]. Ωστόσο, παρόμοια με υγιείς ιστούς, τους ιστούς όγκου είναι 3D οντότητες με κύτταρα, εξωκυτταρική μήτρα και άλλα μικροπεριβάλλον. Μέχρι σήμερα, είναι γενικά αποδεκτό ότι ο πολιτισμός μονοστρωματική κυτταρική γραμμή αντιπροσωπεύει κακώς η

in vivo

φαινόμενο [3], όπου υπάρχουν κυττάρου-κυττάρου και κυττάρου-μήτρας, ως εκ τούτου, περιορίζει την ικανότητά της να προβλέψουν την ανταπόκριση των καρκινικών κυττάρων στην πραγματικότητα [4].

Τα τελευταία χρόνια, υπάρχει μια αυξανόμενη τάση για τους ερευνητές να χρησιμοποιούν

in vitro

3D μοντέλα σε μελέτες για τον καρκίνο [3, 5, 6] σχετικά με θέματα όπως μικροπεριβάλλον του όγκου [7], η αγγειογένεση [8] και μετάσταση [9]. Αυτά τα μοντέλα περιλαμβάνουν σφαιροειδή [10] και μικροσφαίρες [11, 12]. Υποστηρίζουν συν-καλλιέργειας των πολλαπλών τύπων κυττάρων, επιτρέπει κυττάρου-κυττάρου και των αλληλεπιδράσεων κυττάρου-μήτρας, και έτσι καλύτερα διατήρηση των

in vivo

χαρακτηριστικά του ιστού του όγκου. Μερικά μοντέλα είναι σε θέση να αποδείξει τη δομική ποικιλομορφία των καρκινικών ιστών με ζώνες πολλαπλασιάζονται, ηρεμίας ή νεκρωτικών κυττάρων [4]. Η ικανότητα αυτών των μοντέλων 3D για να συμπεριλάβει πολλαπλούς παράγοντες κόγχη επιτρέπει μερική ανακεφαλαίωση και στενή ομοιότητα της

in vivo

μικροπεριβάλλον των καρκινικών κυττάρων [4, 13, 14], συμβάλλοντας στην μοντελοποίηση ασθένεια όγκου και εξατομικευμένες διαλογής χημειοθεραπείας στην μακροπρόθεσμα.

οι όγκοι είναι μη ομογενές όργανα, αλλά πολύ σύνθετους ιστούς που περιλαμβάνουν διάφορους τύπους κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων αλλά δεν περιορίζονται σε καρκινικά κύτταρα, ο καρκίνος προγονικά κύτταρα, ενδοθηλιακά κύτταρα, φλεγμονώδη κύτταρα και τον καρκίνο που σχετίζεται με ινοβλάστες [3, 15-17 ]. Εκτός από τα πολλαπλασιαζόμενα νεοπλασματικά κύτταρα παρεγχύματος (τα καρκινικά κύτταρα), το υποστηρικτικό στρώμα που αποτελείται από κύτταρα μεσεγχυματικής προέλευσης θα μπορούσαν να αντιπροσωπεύουν το ήμισυ της μάζας στρωματικών [3]. Η εξέλιξη του καρκίνου δεν εξαρτάται αποκλειστικά από τα καρκινικά κύτταρα, αλλά και επί των στρωματικών κυττάρων που κατοικούν στο μικροπεριβάλλον του όγκου [18, 19]. Έχει δειχθεί ότι πολυδύναμα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα (MSC) κατοικούν σε ενήλικες ιστούς [20, 21]. Ακόμα κι αν κατά πόσο τα κύτταρα αυτά προέρχονται από τον μυελό των οστών παραμένει αμφιλεγόμενο, αλλά η στενή ομοιότητα της MSC με περικύτταρα κατά μήκος του τοίχου αιμοφόρων αγγείων που παρέχουν μια άλλη ελκυστική εξήγηση [22, 23]. Αυξανόμενη αποδεικτικά στοιχεία δείχνουν ότι ο καρκίνος σχετίζεται στρώμα ιδιαίτερα ινοβλαστικά κύτταρα επιτάχυνση της ανάπτυξης των όγκων [3] και προώθησε μια ανεκτική μικροπεριβάλλον για την μετάσταση του καρκίνου [24, 25]. Κάποια ευρήματα δείχνουν ότι τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα (MSCs) θα διέρχονται από το μυελό των οστών του όγκου κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των όγκων [26-29]. Παρ ‘όλα αυτά, ο ρόλος της MSC στην ογκογένεση παραμένει αμφιλεγόμενη [26, 30-33]. Μία πολύ γνωστή ιδέα είναι ότι, ο ετεροτυπική αλληλεπίδραση μεταξύ πολλαπλών κυτταρικών τύπων είναι αναγκαίο για την ακριβή ομοιότητα του

in vivo

αποκρίσεις. Προκειμένου να επιτευχθεί αυτός ο στόχος, 3D μοντέλα που επιτρέπουν οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ πολλών τύπων κυττάρων είναι ελκυστικά για τη μελέτη αυτών των περίπλοκων αλληλεπιδράσεων.

Έχουμε αναπτύξει στο παρελθόν μια πλατφόρμα μικροεγκλεισμό κολλαγόνου, το οποίο παγιδεύει τα ζωντανά κύτταρα μέσα σε ένα πλέγμα ανασυσταθεί nanofibrous κολλαγόνου [34 ]. Το πλέγμα κολλαγόνου είναι βιοσυμβατό, παρέχοντας ένα φυσιολογικώς σχετικό μικροπεριβάλλον ανεκτική προς προσκόλληση κυττάρου, τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και τη διαφοροποίηση σε ένα ευρύ φάσμα κυττάρων συμπεριλαμβανομένων MSCs [34-37], κύτταρα ΗΕΚ293 [38], τα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα [39], τα χονδροκύτταρα [ ,,,0],40], πυρήνας κύτταρα πηκτοειδούς [41] και οστεοβλαστών [42]. Ένα σημαντικό πλεονέκτημα του μοντέλου μικροενθυλάκωσης κολλαγόνο είναι το γεγονός ότι το πλέγμα πρότυπο κολλαγόνο υποστηρίζει αναδιαμόρφωση μήτρας, το οποίο αναφέρεται σε ταυτόχρονη αποικοδόμηση και εναπόθεση εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, όταν καλλιέργεια ώριμα κύτταρα και αρχέγονα κύτταρα διαφοροποιούνται σε 3D. Αυτό δικαιολογεί σθεναρά τη χρησιμότητά της να ενεργεί ως μοντέλο ανακεφαλαιώνοντας το

in vivo

κυτταρικό μικροπεριβάλλον κατά το σχηματισμό δομικών και λειτουργικών ιστών. Ένα δεύτερο σημαντικό πλεονέκτημα της μικροεγκλεισμού κολλαγόνου είναι ελεγχόμενη και μικρογραφία (εκατοντάδες μικρά σε διάμετρο) του μεγέθους [34] ότι ένα μικρο-ιστός αποτελείται από αρκετές εκατοντάδες κυττάρων επιτρέπει την ικανότητα για οικονομική, εξατομικευμένη και λεπτομερή εξέταση υψηλής απόδοσης.

το νευροβλάστωμα (ΝΒ) είναι ένα παιδιατρικό καρκίνο αντιπροσωπεύοντας το 6% όλων των κακοηθειών που βρέθηκαν στα παιδιά [43]. ΣΗΜ μικροπεριβάλλον αποτελείται από εξωκυττάριας μήτρας, στρωματικό ινοβλάστες, αγγειακά κύτταρα και κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος [3]. Συγκεκριμένα, έχουν στρωματικών ινοβλαστών έχει αποδειχθεί ότι ενισχύει την ανάπτυξη του όγκου, αγγειογένεση και μετάσταση [44, 45]. Οι εκθέσεις δείχνουν επίσης ότι η συν-καλλιέργεια των κυττάρων νευροβλαστώματος (NBCs) με άλλους τύπους κυττάρων θα οδηγήσει σε σημαντικά διαφορετικές συμπεριφορές. Για παράδειγμα, μη-επαφής συγκαλλιέργεια των NBCs με ηπατοκύτταρα να οδηγήσει σε λιγότερη δραστηριότητα απόπτωση και υψηλότερη έκφραση του VEGF [46, 47]. Σε ένα άλλο παράδειγμα, η συν-καλλιέργεια των NBCs με HUVEC μείωσε την ανιχνευσιμότητα των καρκινικών κυττάρων να ουδετερόφιλα [48]. Επιπλέον, έχουν διασταυρούμενη συνομιλίες μεταξύ των κυττάρων NBCs και Schwann έχει αποδειχθεί ότι διεγείρει NB διαφοροποίηση, μειώνοντας την επιθετικότητα του όγκου [49, 50] ρίχνοντας τα φώτα στις νέες θεραπευτικές στρατηγικές. Από την άλλη πλευρά, μερικές αναφορές έχουν δείξει ότι η παρουσία του MSC θα αυξήσει την διεισδυτικότητα του νευροβλάστωμα [27, 51, 52]. Αν και ο ρόλος της MSC επί νευροβλαστώματος δεν είναι πλήρως γνωστή, η παρουσία του MSC δεν οδηγεί σε αλλαγή της συμπεριφοράς σε NBCs. Εν τω μεταξύ, αν και όλες αυτές οι μελέτες έχουν δείξει ότι NBCs αλληλεπιδρούν ενεργά με άλλους τύπους κυττάρων, αυτά τα πειράματα διεξάγονται όλα σε 2D μοντέλα. Ένα 3D μοντέλο ανεκτική στην ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό NBCs, καθώς και αλληλεπιδράσεις με τα στρωματικά κύτταρα δεν έχει ακόμη αναφερθεί. Σε αυτή τη μελέτη, υποθέτουμε ότι η συν-μικροενθυλάκωση NBCs με MSCs στα μικροσφαιρίδια κολλαγόνου θα ανακεφαλαιώσω, τουλάχιστον εν μέρει, το μικροπεριβάλλον του όγκου

in vivo

. Συγκεκριμένα, έχουμε ως στόχο να διερευνήσει τη μορφολογία, την κινητική ανάπτυξη και αναδιαμόρφωση της μήτρας στο περιβάλλον συν-μικροενθυλάκωσης.

Το νευροβλάστωμα (ΝΒ) είναι ένα παιδιατρικό καρκίνο αντιπροσωπεύοντας το 6% όλων των κακοηθειών που βρέθηκαν στα παιδιά [43]. ΣΗΜ μικροπεριβάλλον αποτελείται από εξωκυττάριας μήτρας, στρωματικό ινοβλάστες, αγγειακά κύτταρα και κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος [3]. Συγκεκριμένα, έχουν στρωματικών ινοβλαστών έχει αποδειχθεί ότι ενισχύει την ανάπτυξη του όγκου, αγγειογένεση και μετάσταση [44, 45]. Οι εκθέσεις δείχνουν επίσης ότι η συν-καλλιέργεια των κυττάρων νευροβλαστώματος (NBCs) με άλλους τύπους κυττάρων θα οδηγήσει σε σημαντικά διαφορετικές συμπεριφορές. Για παράδειγμα, μη-επαφής συγκαλλιέργεια των NBCs με ηπατοκύτταρα να οδηγήσει σε λιγότερη δραστηριότητα απόπτωση και υψηλότερη έκφραση του VEGF [46, 47]. Σε ένα άλλο παράδειγμα, η συν-καλλιέργεια των NBCs με HUVEC μείωσε την ανιχνευσιμότητα των καρκινικών κυττάρων να ουδετερόφιλα [48]. Επιπλέον, έχουν διασταυρούμενη συνομιλίες μεταξύ των κυττάρων NBCs και Schwann έχει αποδειχθεί ότι διεγείρει NB διαφοροποίηση, μειώνοντας την επιθετικότητα του όγκου [49, 50] ρίχνοντας τα φώτα στις νέες θεραπευτικές στρατηγικές. Από την άλλη πλευρά, μερικές αναφορές έχουν δείξει ότι η παρουσία του MSC θα αυξήσει την διεισδυτικότητα του νευροβλάστωμα [27, 51, 52]. Αν και ο ρόλος της MSC επί νευροβλαστώματος δεν είναι πλήρως γνωστή, η παρουσία του MSC δεν οδηγεί σε αλλαγή της συμπεριφοράς σε NBCs. Εν τω μεταξύ, αν και όλες αυτές οι μελέτες έχουν δείξει ότι NBCs αλληλεπιδρούν ενεργά με άλλους τύπους κυττάρων, αυτά τα πειράματα διεξάγονται όλα σε 2D μοντέλα. Ένα 3D μοντέλο ανεκτική στην ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό NBCs, καθώς και αλληλεπιδράσεις με τα στρωματικά κύτταρα δεν έχει ακόμη αναφερθεί. Σε αυτή τη μελέτη, υποθέτουμε ότι η συν-μικροενθυλάκωση NBCs με MSCs σε μικροσφαίρες κολλαγόνου θα Ανακεφαλαιώνοντας, τουλάχιστον εν μέρει, το μικροπεριβάλλον του όγκου in vivo. Συγκεκριμένα, έχουμε ως στόχο να διερευνήσει τη μορφολογία, την κινητική ανάπτυξη και αναδιαμόρφωση της μήτρας στο περιβάλλον συν-μικροενθυλάκωσης.

Μέθοδοι

καλλιέργεια κυττάρων Νευροβλάστωμα

κυτταρική σειρά νευροβλαστώματος ήταν ένα δώρο είδος από τον Δρ NKV Cheung από το Memorial Sloan Kettering Cancer Center, USA. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε επωαστήρα CO2 5% σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (DMEM) με υψηλή γλυκόζη (Gibco), με συμπληρώματα από 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (Gibco), 1% πενικιλλίνη στρεπτομυκίνη (Gibco), 1% glutar-max (Gibco).

τα μεσεγχυματικά βλαστικά /στρωματικών κυττάρων (MSC) του πολιτισμού

Ανθρώπινα MSCs από το μυελό των οστών [53] ήταν ευγενική προσφορά από τον καθηγητή ΕΣΟ Chan, Τμήμα Παιδιατρικής και Εφηβικής Ιατρικής, Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ και καλλιεργήθηκαν ως μονοστοιβάδες όπως περιγράφηκε προηγουμένως [53]. Το ισχύον πρωτόκολλο έχει εγκριθεί από τη συνδυασμένη Κλινική Επιτροπή Ηθικής του Πανεπιστημίου του Χονγκ Κονγκ και το Χονγκ Κονγκ West Cluster Νοσοκομεία Νοσοκομείο Αρχής. Εν συντομία, MSCs καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 επωαστήρα σε DMEM με χαμηλά επίπεδα γλυκόζης (Gibco), με συμπλήρωμα 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (Gibco), 1% πενικιλλίνη στρεπτομυκίνη (Gibco) και 1 % glutar-max (Gibco). Το μέσο ανάπτυξης αντικαταστάθηκε κάθε 3-4 ημέρες. Σε περίπου 80% συρροή, hMSCs απομονώθηκαν με αγωγή με θρυψίνη με 0,05% θρυψίνη-ΕϋΤΑ (1Χ) (Gibco) για λίγο πριν από την εκ νέου εναιώρηση σε πλήρες μέσο για τα επόμενα πειράματα. Κύτταρα σε P6 χρησιμοποιήθηκαν για τα επόμενα πειράματα.

Το κολλαγόνο μικροενθυλάκωσης

Τα κύτταρα μικροενθυλακωθούν όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [34]. Εν συντομία, hMSC και NBCs καλλιεργήθηκαν σε υπο-συρροή και στη συνέχεια αποσπάται με επεξεργασία NBCs και MSCs με 0,25% και 0,05% trypsin- EDTA (1Χ) (Gibco) για 5 λεπτά. NBCs και MSCs αναμίχθηκαν σε διαφορετικές προκαθορισμένες αναλογίες (NBCs: 100, 80, 50, 20 και 0%) πριν μικροενθυλάκωσης. τύπου ουράς αρουραίου Ι κολλαγόνου (Becton Dickenson Biosciences, Bedford, ΜΑ) εξουδετερώθηκε με 0.1 Ν ΝαΟΗ και αραιώνεται σε διαφορετικές τελικές συγκεντρώσεις (0.5, 1 και 2 mg /ml). μείγματα κυττάρων αιωρήθηκαν σε εξουδετερωμένο διάλυμα κολλαγόνου να συνθέτουν μίγματα μήτρας-κυττάρων με διαφορετικές πυκνότητες τελικό κυττάρων (2.5x10e5, 5x10e5 κύτταρα /ml και 1x10e6 κύτταρα /ml, που ισοδυναμεί με 1.250, 2.500 και 5.000 κύτταρα /5 μΙ σταγονιδίων, αντίστοιχα). Υγρά σταγονίδια μειγμάτων μήτρας-κυττάρων διανεμήθηκαν σε ένα μη-κολλητική επιφάνεια, η οποία είναι UV-ακτινοβολημένα parafilm σε ένα διαμέτρου 90-mm τρυβλίο Petri (Sterilin, Λονδίνο, Ηνωμένο Βασίλειο), και στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37 ° C με 5% CO

2 για 45 λεπτά για να προκληθεί ζελατινοποίηση. Πήξει μικροσφαιρίδια κολλαγόνου που περιέχει τόσο NBCs και MSCs σε προκαθορισμένες αναλογίες ήπια ξεπλένονται με ένα μέσο συν-καλλιέργειας σε ένα τρυβλίο Petri για ελεύθερης διακύμανσης καλλιέργειες εναιωρήματος για διαφορετική διάρκεια (7, 14 και 21 ημέρες). Ένα σύνολο 100 μικροσφαιρών καλλιεργήθηκαν σε κάθε τρυβλίο Petri. Το μέσο συν-καλλιέργειας αναμίχθηκε με NBC και MSC μέσον καλλιέργειας σύμφωνα αναλογία κυττάρων ενθυλάκωση σε, αναπληρώνονται κάθε 2-3 ημέρες.

Μέτρηση της διάστασης των μικροσφαιρών μήτρας-κυττάρων

Η χρονική μορφολογική αλλαγή των NBC-MSC-κολλαγόνου μικροσφαιρίδια καταγράφηκε κάτω από ένα μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης μέχρι 21 ημέρες. Οι διάμετροι των περίπου 10% των πληθυσμών μικροσφαίρας επιλέχθηκαν τυχαία και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικρόμετρο μάτι-κομμάτι.

κινητική ανάπτυξη των κυττάρων

Κάθε 200 μικροσφαιρίδια ενθυλακώθηκαν με 2.5e5 κυττάρων με διαφορετικές NBC : αναλογίες MSC την ημέρα 0, και καλλιεργήθηκαν για 7, 14, και 21 ημέρες. Σε κάθε χρονικό σημείο, 200 μικροσφαιρίδια από κάθε ομάδα υποβλήθηκαν σε πέψη ενζυματικά με κολλαγενάση από Clostridium histolyticum (Sigma) σε 200 μονάδες /ml για 45-60 λεπτά. Αιωρήματα μονών κυττάρων ελήφθησαν με κατεργασία των πέψη συσσωματώματα με 0,25% θρυψίνη-ΕϋΤΑ (1Χ) (Gibco), πριν από την καταμέτρηση με trypan blue δοκιμασίας. Η ανάπτυξη των κυττάρων σε μικροσφαίρες θα μπορούσε στη συνέχεια να υπολογιστεί.

Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για την αναλογία των NBCs

εναιωρήματα μονών κυττάρων (1x10e6 κύτταρα) ελήφθησαν από κολλαγενάσης-θρυψίνης πέψη του NBC-MSC- μικροσφαιρίδια κολλαγόνου επαναιωρήθηκαν σε 500 μΐ μέσου συν-καλλιέργειας, επωάζεται σε θερμοκρασία δωματίου για μία ώρα για να επιτραπεί η ανάκτηση της έκφρασης πρωτεΐνης επιφανείας κυττάρου, και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν κατά 0,01% PFA για 15 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια μπλοκαριστεί από 2% ορό κατσίκας (Vector Laboratories) σε PBS για 30 λεπτά πριν από την έμμεση χρώση των αντισωμάτων. Για κάθε δείγμα, 1 μ.λίτρο μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού έναντι νευροβλάστωμα (NB84a, Abcam) σε 2% Goat ορός (αραίωση 1: 100) προστέθηκε. έλεγχοι ισοτύπου (IgG αντίσωμα κανονικού ποντικού, Millipore) πραγματοποιήθηκαν σε κάθε χρονικό σημείο. Μετά από χρώση σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά, 1 ml PBS προστέθηκε σε κάθε σωλήνα για να ξεπλύνετε το πλεόνασμα αντισωμάτων. Μετά από φυγοκέντρηση στις 2000 rpm για 5 λεπτά, το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και 0.5 μΐ του Alexa Fluor 647 κατσίκας δευτερογενές αντίσωμα αντι-ποντικού (Invitrogen) σε 2% ορό κατσίκας (αραίωση 1: 200) προστέθηκε σε κάθε δείγμα. Μετά από χρώση σε σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά, 1 ml PBS προστέθηκε σε κάθε σωλήνα για να ξεπλύνετε το πλεόνασμα αντισωμάτων. Μετά από φυγοκέντρηση στις 2000 rpm για 5 λεπτά, το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και οι σβώλοι κυττάρων επαναιωρηματοποιήθηκαν και διατηρούνται σε 500 μΐ 1% ΡΡΑ σε κυτταρική πυκνότητα όχι μικρότερη από 4x10e5 κύτταρα /ml για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής σε FACSCanto II Κυτταρόμετρο Ροής (BD Biosciences, Bedford , ΜΑ). 10.000 συμβάντα από κάθε δείγμα αναλύθηκαν. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με Ρέει λογισμικού 2.5.1.

Ιστολογία και ανοσοϊστοχημεία του NBC-MSC-κολλαγόνου μικροσφαιρίδια

NBC-MSC-κολλαγόνου μικροσφαιρίδια μονιμοποιήθηκαν σε 4% PFA σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι για 30 λεπτά και αφυδατώνονται χρησιμοποιώντας μια σειριακή επεξεργασία αιθανόλη κλίση πριν από την επεξεργασία για τομές παραφίνης πάχους 5 μm. Ρουτίνας αιματοξυλίνης και ηωσίνης χρώση (Sigma) διεξήχθη για να αποκαλυφθεί η μορφολογία των κυττάρων στα μικροσφαιρίδια. Για να αξιολογηθεί η παρουσία NBCs, ένα πρωτογενές αντίσωμα (ab49501, Abcam) χρησιμοποιήθηκε. Αντι-ποντικού δευτερογενές αντίσωμα (BA-1000, εργαστήρια Vector) χρησιμοποιήθηκε στην ανοσοϊστοχημεία, που ακολουθείται από χρώση ABC, διαμινοβενζιδίνη επισήμανση και αντικηλίδωση χρησιμοποιώντας αιματοξυλίνη. Για να αξιολογηθεί η παρουσία του κολλαγόνου τύπου Ι, ένα πρωτεύον αντίσωμα (C2456, Sigma), χρησιμοποιήθηκε. Αντι-ποντικού δευτερογενές αντίσωμα (BA-1000, εργαστήρια Vector) χρησιμοποιήθηκε στην ανοσοϊστοχημεία, που ακολουθείται από χρώση ABC, διαμινοβενζιδίνη επισήμανση και αντικηλίδωση χρησιμοποιώντας αιματοξυλίνη. Για να αξιολογηθεί η παρουσία του Matrix-μεταλλοπρωτεϊνάσης 9, ένα πρωτεύον αντίσωμα (ab38898, Abcam) χρησιμοποιήθηκε. δευτερογενές αντίσωμα αντι-κουνελιού (BA-2000, εργαστήρια Vector) χρησιμοποιήθηκε στην ανοσοϊστοχημεία, που ακολουθείται από χρώση ABC, την επισήμανση διαμινοβενζιδίνη και αντικηλίδωση χρησιμοποιώντας αιματοξυλίνη.

Ανάλυση δεδομένων και στατιστικών στοιχείων

Ποσοτικά αποτελέσματα, συμπεριλαμβανομένων διάσταση μικροσφαίρας, οι αριθμοί των κυττάρων και NBC αναλογίες παρουσιάστηκαν ως μέσος όρος ± πρότυπες αποκλίσεις αν δεν αναφέρεται διαφορετικά. Αμφίδρομη ANOVA με δοκιμασίες κατάλληλες post hoc χρησιμοποιήθηκαν για να αποκαλύψουν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των διαφόρων ομάδων. Το επίπεδο σημαντικότητας ορίστηκε στο 0,05 και SPSS 19.0 (IBM, NY, USA) χρησιμοποιήθηκε για να εκτελέσει για στατιστική ανάλυση.

Αποτελέσματα

μορφολογικό χαρακτηρισμό NBC-MSC-κολλαγόνου μικροσφαιρίδια

το σχήμα 1A1-1E6 δείχνει το ακαθάριστο εμφάνιση του NBC-MSC-κολλαγόνου μικροσφαιρίδια σε διαφορετικές ομάδες. Τα σφαιρικά εμφανίσεις ήταν παρόμοιες στην αρχή του πολιτισμού, αλλά έγινε διαφορετικές σε μεταγενέστερο στάδιο, όπως μικροσφαιρίδια σε ομάδες με υψηλότερο αρχικό ποσοστό NBC έχασε σταδιακά σφαιρικό σχήμα τους και έγιναν ακανόνιστο διάπλαση, γεγονός που υποδηλώνει υπερανάπτυξη. Κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας, μικροσκοπικά μικρο-μάζες σε εναιώρημα παρατηρήθηκαν στο NBC 100%, 80% και 50% των ομάδων μετά την πρώτη εβδομάδα. Ενώ στο NBC 20% ομάδα, παρατηρήσιμη μάζες εμφανίστηκε μετά τη δεύτερη εβδομάδα. Το NBC 80% της ομάδας είχαν σχετικά μεγαλύτερη ποσότητα μικρο-μαζών σε σχέση με άλλες ομάδες. Δεν υπήρχε καμία υπερανάπτυξη μικρο-μαζών στο NBC 0% της ομάδας (100% της ομάδας MSC). Το σχήμα 1F δείχνει την αλλαγή στη διάσταση των μικροσφαιρών κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας. Υπήρξε σημαντική συρρίκνωση των μικροσφαιριδίων κατά την πρώτη εβδομάδα για όλες τις ομάδες, που ακολουθείται από αυξήσεις σε διάμετρο σε όλα τα καρκινικά κύτταρα που περιέχουν ομάδες, γεγονός που υποδηλώνει την ογκογόνο αύξηση. Εν τω μεταξύ, σύντηξης και συσσωμάτωση μικροσφαιρών παρατηρούνται. Το γράφημα δείχνει επίσης ότι η έκταση της συρρίκνωσης και της διεύρυνσης εξαρτάται από την περιεκτικότητα σε NBCs. Όλες οι ομάδες, εκτός από το NBC 100% ενός μειωθεί δραματικά σε μέγεθος κατά την πρώτη ημέρα μετά την ενθυλάκωση. Μικροσφαιριδίων που περιέχουν υγιή MSCs μόνο (NBC 0%) πτώση συνεχώς σε μέγεθος την πάροδο του χρόνου. Η% ομάδα NBC 20 έδειξαν μία σταθερή διάσταση μετά την αρχική πτώση σε μέγεθος ενώ οι ομάδες με 50% ή περισσότερο NBCs άρχισαν να αυξάνονται σε μέγεθος μετά από 7 ημέρες, γεγονός που υποδηλώνει ταχεία ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων. Αμφίδρομη ANOVA έδειξε ότι τόσο ο παράγοντας χρόνος (p & lt? 0.001) και το NBC: αναλογία MSC (p & lt? 0.001) επηρέασε σημαντικά τη διάσταση των μικροσφαιριδίων. Bonferroni post hoc δοκιμές έδειξαν ότι εκτός από την day1-day14 (p = 0,518) και το day3-Ημέρα 7 (p = 1.000) ζευγάρια, όλες οι άλλες συγκρίσεις ήταν στατιστικά σημαντικά διαφορετική από τους άλλους (p & lt? 0.001), ενώ όλα τα NBC: ομάδες αναλογία MSC ήταν στατιστικά σημαντικά διαφορετική από τους άλλους (p & lt? 0.001)

Τα μικροσφαιρίδια με διαφορετικό ποσοστό των NBCs και ως εκ τούτου NBC:. αναλογίες MSC: (Α): 0% NBC (100% MSC)? (Β): 20% NBC (80% MSC)? (C): 50% NBC (50% MSC)? (D): 80% NBC (20% MSC) και (Ε): 100% NBC (0% MSC) καλλιεργήθηκαν για διαφορετικά χρονικό διάστημα: 0 (Α1, Β1, C1, D1, E1)? 1 (Α2, Β2, C2, D2, Ε2)? 3 (Α3, Β3, C3, D3, Ε3), 7 (Α4, Β4, C4, D4, Ε4), 14 (Α5, Β5, C5, D5, Ε5) και 21 (Α6, Β6, C6, D6, Ε6 ) ημέρες (κλίμακα μπαρ: 100 μm: Α2, Α3, Α4, Α5, Α6, Β2, Β3, Β4, Β5, Β6, C2, C3, C4, C5, D2, D3, D4? 500 μm: Α1, D5, Ε3, Ε4, Ε6? 1.000 μm: B1, C1, C6, D1, D6, Ε1, Ε2, Ε5)? (F): Γραμμικό γράφημα που δείχνει τη χρονική μεταβολή της διάστασης (μέσος όρος ± 1 SD) των NBC-MSC-κολλαγόνου πληθυσμούς μικροσφαιριδίων κατά τη διάρκεια των πολιτισμών

Η

μορφολογικές αλλαγές του NBC-MSC-κολλαγόνου μικροσφαιρίδια σε διαφορετικές. NBC: αναλογίες MSC, τα χρονικά σημεία, η αρχική πυκνότητα κυττάρων και συγκέντρωση κολλαγόνου

το σχήμα 2 δείχνει το η &? Ε χρώση των NBC-MSC-κολλαγόνου μικροσφαίρες με διαφορετικές αναλογίες ενθυλάκωση και σε διαφορετικά χρονικά σημεία κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας. Το NBC (καθαρό MSC) ομάδα 0% εμφάνισε όλο και συμπαγείς δομές με τυχαία κατανεμημένα MSCs για μέχρι και 2 εβδομάδες (Σχήμα 2Α1 και 2Α2), ενώ τα περισσότερα από τα μικροσφαιρίδια έδειξε πλήρη φθορά στα 21 ημέρες καλλιέργειας. Ομάδες με αυξανόμενη NBC: αναλογίες MSC (20, 50 και 80%) (Σχ 2B1-2D3) έδειξε μια παρόμοια τάση που διαχωρίζονται σε δύο διαφορετικά στρώματα των ιστών. Εν συντομία, σε 7 ημέρες καλλιέργειας, ένα στρώμα κυττάρων που συσκευάζονται στα περίχωρα της μικροσφαιρίδια κολλαγόνου στην οποία τα κύτταρα με χαμηλότερη πυκνότητα ήταν παρόντες (Εικ 2Β1, 2C1 και 2D1). Στο 20% της ομάδας NBC, φαίνεται να υπάρχει μια μεγαλύτερη αναλογία των κυττάρων με επιμήκη μορφολογία στις 7 ημέρες (Σχ 3Β1), ενώ σχετικά στρογγυλεμένα κύτταρα με υψηλή κυτταρική πυκνότητα και χαμηλή πυκνότητα μήτρα ήταν κυρίαρχη σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία (Σχήμα 2Β2 και 2B3) εκεί . Επιπλέον, οι μάζες μικρο-ιστό ήταν ακόμη σε μεγάλο βαθμό σφαιρικά σε σχήμα. Στο 50% της ομάδας του NBC, τα σχήματα των μικρο-μαζών ήταν παράτυπες και υψηλής κυτταρικής πυκνότητας του πληθυσμού φαίνεται να ξεπεράσει το μικροσφαιριδίων κολλαγόνου και περισσότερα κύτταρα εισέβαλαν στα μικροσφαιρίδια κολλαγόνου σε αύξηση του χρόνου (Εικ 2C1-2C3). Στο 80% της ομάδας NBC, ένα λεπτό στρώμα κυττάρων υψηλής πυκνότητας ήταν εγκλεισμού των μικροσφαιριδίων, το οποίο περιέχει πολλές ομάδες κυττάρων και «κενά» στο 7 ημέρες καλλιέργειας (Σχήμα 2D1). Στα 14 και 21 ημέρες, οι δομές ήταν ιδιαίτερα ακανόνιστο σχήμα και εξαιρετικά πορώδη με κύτταρα συσκευάζονται σε υψηλή πυκνότητα σε όλη δομές ενώ τα μικροσφαιρίδια κολλαγόνου φαίνεται να αποσυντεθεί (Σχ 2D2 και 2D3). Μια μεγεθυμένη όψη του Σχ 2D3 έδειξε σαφώς την κυτταρική στιβάδα υψηλή πυκνότητα και το λιγότερο πυκνό περιοχή (Εικ 2F). Στο 100% ομάδα NBC, η δομή ήταν ακόμα σφαιρικό αλλά εξαιρετικά συμπιεσμένο σε 7 ημέρες (σχ 2Ε1), ενώ τα μικροσφαιρίδια κολλαγόνου εντελώς σπαράσσεται σε μετέπειτα χρονικά σημεία με πολύ πορώδες και ακανόνιστες δομές με χαμηλή κυτταρική πυκνότητα (Σχ 2e2 και 2Ε3) .

(Α): 0% NBC (100% MSC)? (Β): 20% NBC (80% MSC)? (C): 50% NBC (50% MSC)? (D): 80% NBC (30% MSC)? (Ε): 100% NBC (0% MSC). Α1, Β1, Γ1, Δ1, Ε1: ημέρα 7? A2, B2, Γ3, Δ2, Ε2: ημέρα 14? B3, C3, D3, D3a, Ε3: την 21η ημέρα μετά από καλλιέργεια (Κλίμακα μπαρ: 100 μm)

Η

(Α1-Α3):. 1250 κύτταρα /μικροσφαιριδίων? (Β1-Β3): 2500 κύτταρα /μικροσφαίρας? (C1-C3): 5000 κύτταρα /μικροσφαίρας? 1: 7 ημέρες? 2: 14 ημέρες? 3: 21 ημέρες (κλίμακα μπαρ: 100 μm)

Η

Το σχήμα 3 δείχνει την H & amp? Χρώση Ε των NBC-MSC-κολλαγόνου μικροσφαιρίδια σε διαφορετικές πυκνότητες κυττάρων ενθυλάκωσης όταν το NBC είχε καθοριστεί σε 80%.. Στο 1250 κύτταρα ανά μικροσφαίρας, τα κύτταρα φαίνεται να ενθυλακώνονται εντός της μικροσφαίρας κολλαγόνου ενώ ένα λεπτό στρώμα κυττάρων που καλύπτει την περιφέρεια της μικροσφαίρας σε πρώιμα χρονικό σημείο (7 ημέρες) (Σχήμα 3Α1), αλλά σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία, ακανόνιστη κυτταρική outgrowths βρέθηκαν αφήνοντας μόνο πολύ λίγα κύτταρα εντός της μικροσφαίρας (Σχ 3A2 και 3Α3). Σε υψηλότερες πυκνότητες κυττάρου (2500 και 5000 κύτταρα ανά μικροσφαίρας), προφανή κενά βρέθηκαν στα μικροσφαιρίδια κολλαγόνου με πυκνά συσκευασμένα κύτταρα σε ακανόνιστο σχήμα αποφύσεις που περιβάλλει την μικροσφαίρα στις 7 ημέρες (Σχ 3Β1 και 3C1). . Σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία, οι αποφύσεις έγιναν μεγαλύτερα και πιο πορώδη (σχήμα 3Β2, 3Β3, 3C2 και 3C3)

Το Σχήμα 4 δείχνει το Η &? Ε χρώση των NBC-MSC-κολλαγόνου μικροσφαίρες με διαφορετικές συγκεντρώσεις κολλαγόνου. Μια υψηλότερη συγκέντρωση κολλαγόνου φαίνεται να ενθυλακώσει τα κύτταρα καλύτερα εντός της μικροσφαίρας ενώ ένα λεπτό στρώμα κυττάρων αυξάνεται στην περιφέρεια της μικροσφαίρας (Εικ 4Β1). Σε 14 ημέρες, ακανόνιστη και μαζική έκφυση βρέθηκε στην ομάδα χαμηλότερη συγκέντρωση κολλαγόνου (Εικ 4Α2), αλλά πυκνές αποικίες κυττάρων και κενά βρέθηκαν εντός των μικροσφαιρών στην υψηλότερη συγκέντρωση κολλαγόνου (Εικ 4Β2).

(Α ): 1 mg /ml? (Β): 2 mg /ml? 1: 7 ημέρες? 2: 14 ημέρες (κλίμακα ράβδους: 100 μm).

Η

κινητική ανάπτυξη στην NBC-MSC-κολλαγόνου μικροσφαιρίδια

Το σχήμα 5Α δείχνει το γράφημα γραμμή για τον αριθμό των κυττάρων σε NBC-MSC -collagen μικροσφαιρίδια με διαφορετικές NBC: αναλογίες MSC σε διαφορετικά χρονικά σημεία κατά τη διάρκεια της συγκαλλιέργειας. Μικροσφαιρία με 0% NBC, δηλαδή 100% MSCs έδειξε μια συνεχής μείωση του αριθμού των κυττάρων. Από την άλλη πλευρά, όλες οι ομάδες που περιέχουν τα καρκινικά κύτταρα παρουσίασαν θετική ανάπτυξη σε βάθος χρόνου. Η ομάδα του 20% παρουσίασαν σταδιακή αύξηση τις πρώτες 2 εβδομάδες και όλα σε μια ξαφνική ο αριθμός αυξήθηκε δραματικά εκθετικά την ημέρα 21. Το 100% NBC ομάδα (0% MSC) έδειξαν σημαντική αύξηση στις αρχές καλλιέργειες την ημέρα 7 σε σχέση με άλλες ομάδες, αλλά ότι δεν παρέχουν αυτό του ομίλου οποιαδήποτε περαιτέρω πλεονέκτημα ανάπτυξης σε επόμενες ημέρες. Παρόμοιες τάσεις βρέθηκαν στα 50% και 80% NBC: ομάδες MSC. Αμφίδρομη ANOVA έδειξε ότι τόσο ο παράγοντας χρόνος (p & lt? 0.001) και το NBC: συντελεστής αναλογίας MSC (p & lt? 0.001) επηρέασε σημαντικά τον αριθμό των κυττάρων. Bonferroni post hoc δοκιμές έδειξαν ότι το 0% NBC (100% MSC) σημαντικά διαφορετική από όλες τις άλλες ομάδες (p & lt? = 0,003). Το 20% της ομάδας NBC έδειξαν σημαντικές διαφορές από 0% (p = 0,003), 80% (p = 0.033) και 100% (ρ = 0.008), αντίστοιχα. Το 50% της ομάδας του NBC, και το 80% και στη συνέχεια το 100% δεν διέφεραν σημαντικά μεταξύ τους (p & gt? = 0,342). Το 100% της NBC έδειξε μόνο σημαντική διαφορά από το 0% και 20% NBC: αναλογίες MSC (p & lt? = 0.008). Είναι ενδιαφέρον ότι, ξεκινώντας με τον ίδιο αριθμό κυττάρων, ο 20% ομάδα NBC έδειξε μια πολύ χαμηλότερη (~ 2 ημέρες) χρόνος διπλασιασμού, ο οποίος μετρά το χρόνο που απαιτείται για τον κυτταρικό πληθυσμό στον εαυτό διπλασιαστεί, σε σύγκριση με υψηλότερη NBC: αναλογία MSC (Σχήμα 5Β ). Το NBC (100% MSC) ομάδα 0% δεν παρουσίασαν αύξηση, ενώ το 100% του NBC (0%) έδειξε πολύ χαμηλότερο χρόνο διπλασιασμού (& gt? 6 ημέρες).

Κατά την ημέρα 7, ημέρα 14 και την ημέρα 21, 200 μικροσφαιρίδια υποβλήθηκαν σε πέψη για να μετρήσει τον αριθμό των κυττάρων. (Α): Ανάπτυξη κινητικές καμπύλες που δείχνουν τις μεταβολές στον αριθμό των κυττάρων συναρτήσει του χρόνου σε διαφορετικές αναλογίες ενθυλάκωσης (μέση ± 1 SD)? (Β):. Πληθυσμός χρόνος διπλασιασμού για διαφορετικές ομάδες

Η

Χρονική μεταβολή στο ποσοστό των NBC στα μικροσφαιρίδια

Το σχήμα 6Α δείχνει τα ποσοστά των NBCs μεταξύ των διαφορετικών ομάδων πάροδο του χρόνου. Στο 20% της ομάδας NBC, το ποσοστό των NBCs διατηρήθηκαν σε περίπου 20% κατά την ημέρα 7 και 14, αλλά αυξήθηκε δραματικά σε 33% κατά την ημέρα 21 (Σχήμα 6Α). Από την άλλη πλευρά, το 50% και 80% NBC ομάδες έδειξαν παρόμοιο επίπεδο NBCs πάροδο του χρόνου. Σχήμα 6C δείχνει το αντιπροσωπευτικό ιστόγραμμα της κυτταρομετρίας ροής-βάση απαρίθμηση των NBCs σε διαφορετικές ομάδες. Το σχήμα 6Β δείχνει το ποσοστό των NBCs υπολογίζεται από δεδομένα που λαμβάνονται με κυτταρομετρία ροής. Δύο Way ANOVA έδειξε ότι NBC: συντελεστής αναλογίας MSC (p & lt? 0.001) επηρέασε σημαντικά το ποσοστό του NBC υπερωρίες, αλλά δεν είναι ο παράγοντας χρόνος (p = 0.85). Bonferroni post hoc δοκιμές έδειξαν ότι το 20% NBC ομάδα σημαντικά διαφορετική από το 50% (ρ & lt? 0.001) και 80% (ρ & lt? 0.001) αντίστοιχα. Το 50% της ομάδας του NBC και το 80% δεν ήταν σημαντικά διαφορετικά μεταξύ τους (p = 0,366)

(Α):. Σφάλμα ιστογράμματα δείχνουν το ποσοστό των NBCs προσδιορίζεται μέσω κυτταρομετρίας ροής (μέση τιμή ± 1 SD)? (Β): Πίνακας που δείχνει το μέσο ποσοστό NBCs σε διαφορετικές ομάδες και σε διαφορετικά χρονικά σημεία? (C): Αντιπροσωπευτικές ιστόγραμμα που δείχνει τα κύτταρα χρωματίστηκαν με αντίσωμα ελέγχου ισοτύπου και τα κύτταρα βάφτηκαν με NB84a αντίσωμα σε διαφορετικές ομάδες σε διαφορετικά χρονικά σημεία

Η

Ανοσοϊστοχημεία του κολλαγόνου Τύπου Ι

Σχήμα 7. παρουσιάζει την ανοσοϊστοχημική ανάλυση του κολλαγόνου τύπου Ι στα NBC-MSC-κολλαγόνου μικροσφαίρες. Στην ομάδα 0% NBC (100% MSC), το κολλαγόνο τύπου Ι θετικός μικροσφαίρας παρέμεινε σφαιρικές μολονότι γίνεται πιο πορώδες σε 14 ημέρες (Σχήμα 7Α και 7Β). Στα 20% ομάδες NBC, η μικροσφαίρα ήταν άθικτο κατά την ημέρα 7, αλλά άρχισε να αποσυντίθεται κατά την ημέρα 14 και ήταν σχεδόν πλήρως αποσυντεθεί κατά την 21η ημέρα (Σχ 7Β2 και 7B3). Για το 50% της ομάδας NBC, οι μικροσφαίρες ήταν ακόμα ανέπαφα κατά την ημέρα 7 (Σχήμα 7C1), αλλά περισσότερο πορώδης σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία (Σχήμα 7C2 και 7C3). Αυτή η τάση ήταν παρόμοια στο 80% της ομάδας του NBC (Σχήμα 5Β). Κολλαγόνο Τύπου Ι εκφράζοντα κύτταρα, τα οποία είναι πιθανό να είναι MSCs, ήταν κυρίως περιορίζεται εντός των μικροσφαιρών αν και μερικοί εντοπίστηκαν κατά καιρούς στην έκφυση έξω από τα μικροσφαιρίδια (Σχ 7F και 7G)

(Α):. 0% NBC (100% MSC)? (Β): 20% NBC (80% MSC)? (C): 50% NBC (50% MSC)? (D): 80% NBC (30% MSC)? (Ε): 100% NBC (0% MSC). Α1, Β1, Γ1, Δ1, Ε1: ημέρα 7? A2, B2, Γ3, Δ2, Ε2: ημέρα 14? B3, C3, D3, D3a, Ε3: την 21η ημέρα μετά από καλλιέργεια (Κλίμακα μπαρ: 100 μm).

Η

Η ανοσοϊστοχημεία της ΜΜΡ9

Το σχήμα 8 δείχνει την ανοσοϊστοχημική χρώση των ΜΜΡ9 του NBC-MSC-κολλαγόνου μικροσφαιρίδια με σταθερό 80% NBCs και με διαφορετικές πυκνότητες κυττάρων και συγκεντρώσεις κολλαγόνου. Οι περιοχές κολλαγόνου έδειξε θετική χρώση, ενώ κύτταρα ΜΜΡ9 εκφράζουν βρέθηκαν τόσο στο έξω-ανάπτυξη και των περιφερειακών στρώματα κυττάρων μαζών (Σχήμα 8Α1, 8β1, 8β2 και 8C1)

(Α):. 5000 κύτταρα /ml? (Β): 2.500 κύτταρα /ml? (C): 1.250 κύτταρα /ml? 1: 0,5 mg /ml? 2: 1 mg /ml? 3: 2 mg /ml (ράβδοι κλίμακας: 100 μm).

Η

Συζήτηση

In vitro μοντέλα καρκίνου

Για να επιταχυνθεί προκλινικές διαλογής φαρμάκων και για την επίτευξη εξατομικευμένη ιατρική στο μέλλον, η ανάπτυξη της νόσου ή ειδικά για τον ασθενή in vitro μοντέλο είναι μεγάλης σημασίας [54]. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, οι συμβατικές 2D μοντέλα μονοστρωματική επικρίνεται για τη μη φυσιολογικό περιβάλλον τον πολιτισμό τους και δεν είναι σε θέση να ανακεφαλαιώσω την in vivo κατάσταση, ως εκ τούτου παράγουν αναξιόπιστα στοιχεία. Με την εκ των προτέρων στον τομέα της μηχανικής των ιστών, η χρήση ενός τρισδιάστατου μοντέλου in vitro σε μιμούνται όγκους γίνεται όλο και πιο δημοφιλής. [55-57]. Ένα σημαντικό ζήτημα στην κατασκευή ενός in vitro μοντέλο θα ήταν η επιλογή των βιοϋλικών, η οποία θα μπορούσε να είναι φυσικής προέλευσης ή τεχνητά συντεθεί. Πολυάριθμες μελέτες έχουν δείξει ελπιδοφόρα αποτελέσματα με τη χρήση φυσικών βιοϋλικά όπως το κολλαγόνο, ινώδες, Matrigel [58] και το υαλουρονικό οξύ. Με άμεση διαθεσιμότητα τους, την ευκολία χρήσης και την υψηλή βιοδραστικότητα, είναι δημοφιλής και ελκυστική επιλογές για τους ερευνητές. Το κολλαγόνο έχει μια εξαιρετική βιοσυμβατότητα και αμελητέα ανοσογονικότητα. Αυτές οι ιδιότητες επιτρέπουν στους επιστήμονες να χρησιμοποιούν κολλαγόνο ως κατάλληλο υλικό για την in vitro μοντέλο καρκίνου. Ωστόσο, η ευκολία της αποικοδόμησης, σύνθεση απροσδιόριστες μήτρας και αδύναμα μηχανικές ιδιότητες είναι τα προβλήματά τους. Επιπλέον, οι υψηλές παρτίδα σε παρτίδα ετερογένειας στην σύνθεση καθιστά σύγκριση μεταξύ διαφορετικών μελετών πολύ δύσκολη. Από την άλλη πλευρά, τα συνθετικά υλικά όπως ΡΑ, πολυεστέρα, PEG διαθέτει ρυθμιζόμενους παραμέτρους και επιτρέπει πιο ακριβή έλεγχο των ιδιοτήτων των υλικών [59], που οδηγεί σε μικρότερη πολυπλοκότητα, η υψηλή επαναληψιμότητα και η συγκρισιμότητα μεταξύ διαφορετικών μελετών. Ωστόσο, κάποια από αυτά είναι τοξικά και απαιτούν πιο εξελιγμένα στάδια επεξεργασίας πριν να μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη μοντελοποίηση. υδρογέλη PEG-based, για παράδειγμα, έχει δομή μη ινιδικό και απαιτεί είτε φυσικές ή χημικές διεργασίες εγκάρσιας σύνδεσης [60-62]. Αυτές θα επηρεάσουν την κυτταρική συμπεριφορά και την ευκολία χρήσης, σε σύγκριση με τα φυσικά πολυμερή όπως κολλαγόνο. Στην πραγματικότητα, μια καθολική βιοϋλικό κατάλληλος για όλα τα μοντέλα της νόσου δεν υπάρχει.