Αφηρημένο

Η υπερέκφραση του TOP2A συνδέεται με κίνδυνο συστηματικών εξέλιξης σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη, και τα υψηλότερα επίπεδα TOP2A βρέθηκαν στην ορμόνη ανθεκτικών περιπτώσεων. Για να διαλευκανθεί ο μηχανισμός με τον οποίο τα υψηλά επίπεδα TOP2A συμβάλλουν στην εξέλιξη του όγκου που δημιουργείται TOP2A υπερεκφράζουν κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη. Δείχνουμε ότι TOP2A προάγει την επιθετικότητα του όγκου με την πρόκληση χρωμοσωματικών αναδιατάξεων των γονιδίων που συμβάλλουν σε μια πιο επεμβατική φαινότυπο. Αντι-ανδρογόνα θεραπεία μόνη ήταν αναποτελεσματική στη θανάτωση TOP2A κύτταρα που υπερεκφράζουν οφείλεται στην ενεργοποίηση ενός ανδρογόνου δικτύου υποδοχέα. TOP2A δηλητήρια σκότωσε τα καρκινικά κύτταρα πιο αποτελεσματικά νωρίς στην πορεία της εξέλιξης, ενώ σε μεταγενέστερα στάδια παρείχαν μεγαλύτερο όφελος όταν συνδυάζεται με αντι-ανδρογόνο θεραπεία. Μηχανιστικά, διαπιστώνουμε ότι TOP2A ενισχύει τη σηματοδότηση των ανδρογόνων, διευκολύνοντας την μεταγραφή ανδρογόνων ανταποκρίνεται γονιδίων, προωθώντας έτσι την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων. Αυτές οι μελέτες αποκάλυψαν μια σχέση μεταξύ TOP2A και ανδρογόνων μονοπάτι σηματοδότησης των υποδοχέων που συμβάλλει στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη και προσδίδει ευαισθησία σε θεραπείες

Παράθεση:. Schaefer-Klein JL, Murphy SJ, Johnson SH, Vasmatzis G, Kovtun IV (2015 ) τοποϊσομεράση 2 Η Alpha Συνεργάζεται με ανδρογόνων υποδοχέων να συμβάλλουν στον καρκίνο του προστάτη εξέλιξη. PLoS ONE 10 (11): e0142327. doi: 10.1371 /journal.pone.0142327

Επιμέλεια: Antimo Migliaccio, ΙΙ Università di Napoli, Ιταλία

Ελήφθη: 10 Ιουνίου 2015? Αποδεκτές: 19 Οκτωβρίου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 11 Νοεμβρίου 2015

Copyright: © 2015 Schaefer-Klein et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή υποστηρίζεται από μια επιχορήγηση Waterman βιοδεικτών Discovery και το Κέντρο εξατομικευμένης Ιατρικής στη Mayo Clinic. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τοποϊσομεράσης DNA 2 α (TOP2A) είναι ένα βασικό πυρηνικό ένζυμο, που απαιτούνται για την επίλυση των τοπογραφικών άγχος που συνδέεται με την αντιγραφή του DNA. TOP2A εισάγει παροδική διπλό διαλείμματα σκέλος (ΟΕΔ) στο DNA σε ένα ΑΤΡ-εξαρτώμενο τρόπο για να επιτρέψει αλλαγές στην τοπολογία του DNA και την εξάλειψη των υπερ-εκκαθάρισης [1,2]. λειτουργία TOP2A είναι κρίσιμη σε πολλές βιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της αντιγραφής, μεταγραφής, την επιδιόρθωση του DNA και τη συντήρηση δομής των χρωμοσωμάτων. Εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα σε διαιρούμενα κύτταρα, όπως το επίπεδο της είναι γνωστό ότι ρυθμίζεται μέσω του κυτταρικού κύκλου, και χρησιμοποιείται συχνά ως μία πολλαπλασιαστική δείκτης [3,4]. Οι ανωμαλίες της πρωτεΐνης TOP2A συνδέεται με χρωμοσωμική αστάθεια [5]. TOP2A πιστεύεται ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στην οδοφράγματος decatenation κατά τη διάρκεια της μίτωσης, ένα μηχανισμό που ευθύνεται για τη σωστή χρωμοσωμική διαχωρισμό [6-8]. Υψηλό επίπεδο TOP2A ως δείκτης πιο επιθετική συμπεριφορά και προηγμένο στάδιο αναφέρθηκε για διάφορα καρκίνους [9,10]. Στόχευση TOP2A και επακόλουθο πολλαπλασιασμό των κυττάρων, έχει χρησιμοποιηθεί ως θεραπευτική προσέγγιση για την θεραπεία ρουτίνας ορισμένες κακοήθειες [11]. Φάρμακα που ανήκουν στην κατηγορία των TOP2A δηλητήρια συνθέτουν τα περισσότερα από τα εγκεκριμένα για τους παράγοντες κλινική χρήση. Etoposide και δοξορουβικίνη στόχο τόσο TOP2 ισομορφές του ενζύμου, Α και Β, παρεμβαίνοντας με τον κύκλο διάσπαση του DNA /απολίνωση τους, προκαλώντας DNA DSBs και κυτταρικό θάνατο σκανδάλη [12,13]. Μία δεύτερη κατηγορία ενώσεων που στοχεύουν TOP2, TOP2 καταλυτική αναστολείς, δεν επάγουν σχηματισμό πρωτεΐνης-συνδεδεμένων DNA DSB αλλά δρουν ως μη ανταγωνιστικοί αναστολείς της δραστικότητας ΑΤΡάσης TOP2 [12]. Η αποτελεσματικότητα των δηλητηρίων TOP2A πιστεύεται ότι εξαρτάται από το επίπεδο της πρωτεΐνης TOP2A [5] και ενζυματική δραστικότητα του [14]

. Ένας αριθμός μελετών έχουν δείξει ότι τα αυξημένα επίπεδα του λογαριασμού TOP2A για υψηλότερη ευαισθησία των κυττάρων σε δηλητήρια TOP2A ετοποσίδη και δοξορουβικίνη [15,16]. Δράση του ενζύμου TOP2A ρυθμίζεται από μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις [14-22]. Η φωσφορυλίωση TOP2A στα κατάλοιπα εντός της καταλυτικής περιοχής επηρεάζει την ενζυματική δραστικότητα του [17, 21]? και οι μεταλλάξεις σε μερικές από αυτές τις περιοχές έχουν αναφερθεί να αντιπροσωπεύουν για την αντίσταση των καρκινικών κυττάρων να TOP2A δηλητήρια [14]. Παρά το γεγονός ότι, τα επίπεδα της πρωτεΐνης TOP2A και δραστηριότητα του θεωρείται σημαντικοί συνεισφέροντες στην ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων σε δηλητήρια TOP2A, TOP2A έχει αποδειχθεί επίσης να συνδεθεί με την αντίσταση στη χημειοθεραπεία, τόσο

in vitro

και

in vivo

, μέσω μηχανισμών αλλοίωσης των ενδοκυτταρική κατανομή και η αναστολή της απόπτωσης [23,24]. Τα υψηλά επίπεδα της πρωτεΐνης DLX4 έδειξαν να διεγείρουν την επιδιόρθωση του DNA DSB που προκαλείται από δοξορουβικίνη καθιστά το φάρμακο αναποτελεσματικό [25].

Αντοχή σε δηλητήρια TOP2A, που παρατηρήθηκαν σε κλινικά πυρίμαχα όγκους [26], και την ανάπτυξη των δευτερογενών καρκίνων, όπως μυελογενής λευχαιμία, ως αποτέλεσμα της

de novo

αναδιατάξεις [12,27], είναι οι κύριοι περιορισμοί της θεραπείας αντι-TOP2A. Απαιτείται περαιτέρω έρευνα για να κατανοήσουμε πλήρως παραγόντων και μηχανισμών που διέπουν ανταπόκριση του όγκου σε TOP2A αναστέλλοντας φάρμακα.

TOP2A συχνά υπερεκφράζεται σε επιθετικό καρκίνο του προστάτη (PCA). Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει μια θετική συσχέτιση μεταξύ του επιπέδου έκφρασης TOP2A και σκορ Gleason (GS) [28,29]. Τα καρκινώματα με την υψηλότερη έκφραση της TOP2A ήταν ελάχιστα διαφοροποιείται [28]. Αυξημένα επίπεδα TOP2A βρέθηκαν επίσης σε ορμόνη ανθεκτικά PCA της GS 8-10 [29]. Η ομάδα μας έχει βρει ότι η υπερέκφραση της TOP2A συσχετίστηκε με αυξημένο κίνδυνο συστηματικών εξέλιξη σε ασθενείς με προστάτη [30]. Το επίπεδο της πρωτεΐνης TOP2A ήταν ο ισχυρότερος προγνωστικός δείκτης της έκβασης στο πλαίσιο του

ERG

έκφρασης [31].

TMPRSS2-ERG

σύντηξης, η πιο κοινή αναδιάταξη που παρατηρείται σε προστάτη επηρεάζει μέχρι και το 60% των περιπτώσεων [32,33]. Ο μηχανισμός υποκείμενη γενιά του

ERG

σύντηξης έχει εξετασθεί [34,35]. Haffner et al. έχουν δείξει ότι υποδοχέα ανδρογόνων (AR) και TOP2B είναι συν-προσλαμβάνονται σε ρυθμιστικά στοιχεία του ανδρογόνου γονιδίων που αποκρίνονται κατά την μεταγραφή και σκανδάλη σχηματισμό του DNA DSB. Αυτά τα διαλείμματα πιστεύεται ότι είναι εξαιρετικά ανασυνδυαστικογενική και όταν επισκευάστηκε αποτέλεσμα στην παραγωγή του

de novo

γονίδια σύντηξης, όπως

TMPRSS2-ERG

[35]. Ομοίως, TOP2B έχει προσληφθεί με άλλους υποδοχείς στεροειδών: οιστρογόνων γονιδίων στόχων του υποδοχέα κατά τη σηματοδότηση των οιστρογόνων [36,37]. Παρά το γεγονός ότι, οι πρωτεΐνες TOP2A και Β έχουν παρόμοιες κυτταρικές λειτουργίες στην επίλυση του DNA overwinding με την εισαγωγή DSBs, καμία μελέτη δεν ανέφερε τη συνεργασία της TOP2A με μηχανήματα μεταγραφή με τρόπο ανάλογο με TOP2B. Παρά αναφερθεί συσχέτιση μεταξύ των υψηλών επιπέδων των TOP2A και κακή έκβαση στον καρκίνο, ο ακριβής μηχανισμός υποκείμενες πιο επιθετική φαινότυπο που σχετίζεται με TOP2A δεν είναι γνωστή. TOP2 δηλητήρια, όπως μιτοξαντρόνη και τη δοξορουβικίνη, περιστασιακά συνταγογραφείται για την αντιμετώπιση ευνουχισμό ανθεκτικό μεταστατικό προστάτη έδειξαν να παρέχουν μόνο παρηγορητική οφέλη [38]. Από την άλλη πλευρά, πρότυπο επικουρική θεραπεία στέρησης ανδρογόνων φάνηκε να είναι αποτελεσματική μόνο στην ομάδα των ασθενών των οποίων οι όγκοι εκφράζονται υψηλό επίπεδο TOP2A και είναι θετικοί για

ERG

σύντηξης [30,31]. Παραμένει ασαφές κατά πόσον αυτοί οι ασθενείς μπορούν να επωφεληθούν από τη θεραπεία με αναστολείς TOP2A σε μια επικουρική. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε αναπτύξει ένα μοντέλο κύτταρο να εξεταστεί ο ρόλος του TOP2A στην πρόοδο του όγκου και να αξιολογήσει τη συμβολή του σε κυτταρικό ευαισθησία σε ορμονικές και χημειοθεραπεία. Δείχνουμε ότι TOP2A οδηγεί προστάτη προς μια πιο επεμβατική φαινότυπο επάγοντας αναδιατάξεις DNA. Πρέπει επίσης να παρέχουν αποδεικτικά στοιχεία για το μηχανισμό του χρόνου που σχετίζονται με την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων του προστάτη σε δηλητήρια TOP2A. Έχουμε αποδείξει ότι περισσότερο προηγμένες καρκινικά κύτταρα του προστάτη, ανθεκτικό σε ανδρογόνων, μπορεί να εξαλειφθεί αποτελεσματικότερα με μια θεραπεία συνδυασμού με αντι-ανδρογόνων και δοξορουβικίνη. TOP2A παρεμβαίνει με αντι-ανδρογόνα θεραπεία αυξάνοντας την ευαισθησία στην σηματοδότηση AR διευκολύνοντας την μεταγραφική δραστηριότητα της στα ανδρογόνα στοιχεία απόκρισης.

Αποτελέσματα

Δημιουργία κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη που υπερεκφράζουν TOP2A

Υποθέσαμε ότι τα υψηλά επίπεδα TOP2A, πέραν εκείνων που υπάρχουν κανονικά στα κύτταρα ποδηλασία, προκαλούν επίμονες παραγωγή του DNA DSB οποία στη συνέχεια οδηγούν σε γονιδιωματική αναδιατάξεις που σχετίζονται με το σχηματισμό ενός πιο επιθετικό φαινότυπο (S1A Εικ). Για τη διερεύνηση της συμβολής της TOP2A στην καρκινογένεση του προστάτη και να εξερευνήσουν τα οφέλη της θεραπευτικής στόχευση αυτής της πρωτεΐνης για τους ασθενείς του προστάτη που έθεσε ως στόχο να αναπτύξει κυτταρικές σειρές προστάτη που υπερεκφράζουν σταθερά TOP2A. Αν και TOP2A εκφράζεται εξαιρετικά σε καρκινικά κύτταρα

in vivo

, επιχειρεί να εκφράσει αυτή την πρωτεΐνη εκτοπικά

in vitro

υπήρξαν ανεπιτυχείς λόγω της ταυτόχρονης επαγωγής απόπτωσης [39].

In vivo

, κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου, τα κύτταρα έχουν αναπτύξει μηχανισμούς για να παρακάμψουν τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο που σχετίζεται με το υψηλό επίπεδο των TOP2A. Για παράδειγμα, CKS2 πρωτεΐνη, αυξημένα σε PCa, σε ζωικά μοντέλα και κυτταρικών σειρών προστάτη, δείχθηκε ότι προστατεύει τα κύτταρα από την απόπτωση [40]. Έτσι, για να ξεπεραστεί η απόπτωση που επάγεται από τα υψηλά επίπεδα του TOP2A, δημιουργήσαμε πρώτα προστάτη LNCaP σταθερών κλώνων που υπερεκφράζουν CKS2 (S1B Σχήμα), και οι κλώνοι με το μειωμένο επίπεδο της κασπάσης-3 (S1c Σχήμα), ένα σημαντικό κασπάσης-τελεστές σε αποπτωτικό μονοπάτι [41] . Έκφραση της κασπάσης-3 δηλωθεί η απώλεια ή μειωμένη σε προστάτη [42]. Τα καταλυτικά αδρανείς μορφές της κασπάσης-3, όταν επιμολύνθηκε στα κύτταρα, ήταν ειδικά δειχθεί ότι αναστέλλει τον κυτταρικό θάνατο που προκλήθηκε από απόκριση βλάβη του DNA [43]. Οι προσπάθειες για την παράκαμψη TOP2A απόπτωση που επάγεται από υπερεκφράζουν CKS2 απέτυχε να διασώσει οποιαδήποτε TOP2A υπερεκφράζουν κυτταρικές σειρές. Επελέγησαν Τρεις κλώνοι με μειωμένο επίπεδο της κασπάσης-3 μετά την ενσωμάτωση του TOP2A cDNA και χρησιμοποιήθηκαν σε μεταγενέστερα πειράματα. T14 κλώνου έδειξε το υψηλότερο επίπεδο TOP2A πρωτεΐνης και χρησιμοποιήθηκε ως TOP2A υψηλή εκφραστής, ενώ T25 και T33 είχε ένα ενδογενές επίπεδο TOP2A και χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί μάρτυρες (S1D σχήμα).

Τα υψηλότερα επίπεδα TOP2A αυξήσει εισβολής των κυττάρων του όγκου

για να ανακεφαλαιώσουμε τις αλλαγές που συμβαίνουν

in vivo

κατά την εξέλιξη του προστάτη, συνεχώς καλλιεργούνται κλώνους για να διερευνήσει τον τρόπο με το επίπεδο των TOP2A επηρεάζονται κυτταρικών λειτουργιών. Οι κλώνοι συλλέχθηκαν σε διαφορετικές διόδους και αναλύθηκαν. Ως έκφραση του TOP2A είναι γνωστό ότι συσχετίζεται με τον πολλαπλασιασμό [4] εξετάσαμε πρώτα ρυθμούς πολλαπλασιασμού. Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στα ποσοστά πολλαπλασιασμού βρέθηκε μεταξύ των TOP2A υψηλότερη κλώνος εκφραστής (Τ14) και κάτω κλώνους εκφραστής (T33 και T25) (Σχήμα 1Α). ρυθμούς πολλαπλασιασμού δεν μεταβλήθηκε σημαντικά με την αύξηση πέρασμα του κάθε κλώνου υποδεικνύοντας ότι τα αυξημένα επίπεδα της TOP2A δεν επηρεάζουν την ανάπτυξη του όγκου

per se

στον πολιτισμό. Υψηλότερα επίπεδα TOP2A έκανε, ωστόσο, να επηρεάσουν την κινητικότητα και τη διεισδυτικότητα των LNCaP κλώνων. Γονικών κυττάρων LNCaP, TOP2A υψηλής και χαμηλής εκφραστές της πρώιμης και όψιμης περάσματα συγκρίθηκαν σε προσδιορισμούς θάλαμο Boyden. Τόσο νωρίς (Ρ23) και αργά (Ρ46) χωρία της TOP2A υπερεκφράζουν κλώνο T14 αποδεικνύεται μεγαλύτερη κίνηση μέσα από τη μεμβράνη από συμφωνημένα κλώνους έλεγχό τους ή των γονικών κυττάρων LNCaP (Σχήμα 1Β). Παρομοίως, κύτταρα με υψηλό επίπεδο TOP2A αποδειχθεί πιο επεμβατική ιδιότητες από τους ομολόγους τους με ενδογενές επίπεδο της πρωτεΐνης. Η μορφολογία των κυττάρων που μετανάστευσαν μέσω της μεμβράνης επικαλυμμένη διέφερε μεταξύ Τ14 και T33 κλώνων. Τα TOP2A υπερεκφράζουν κύτταρα Τ14 διέδιδαν με ακανόνιστα σχήματα και αιχμηρός πλέον τις διαδικασίες που μοιάζουν με μεσεγχυματικά φαινότυπο, ενώ τα κύτταρα T33 εμφανίστηκε κολακεύει και πιο στρογγυλεμένο, με σύντομες διαδικασίες (σχήμα 1Γ).

Α) Ο πολλαπλασιασμός των κλώνων που υπερεκφράζουν σταθερά TOP2A (T14) και συνδυάζεται κύτταρα ελέγχου με ενδογενή επίπεδο TOP2A (T25 και T33). Ο πολλαπλασιασμός προσδιορίστηκε σε 96 ώρες μετά κύτταρο επιμετάλλωσης. Β) Η κινητικότητα των TOP2A κλώνων διαφορετικών πέρασμα και γονικών κυττάρων LNCaP προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας δοκιμασία θαλάμου Boyden. Γ) Οι εικόνες των κυττάρων με εν τω βάθει φαινότυπο μετά από 72 ώρες του πολλαπλασιασμού. P ορίζει τον αριθμό πέρασμα? OD, au μετριέται οπτικών πυκνότητας σε αυθαίρετες μονάδες. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD, με βάση 3 ανεξάρτητα πειράματα. * P & lt? 0,00001, και ** p & lt? 0,0001, n = 3.

Η

ευαισθησία των κυττάρων που υπερεκφράζουν TOP2A σε θεραπείες αλλαγές σε παρατεταμένη πολλαπλασιασμό

όγκους υψηλής ποιότητας προστάτη

in vivo

είναι γνωστό ότι αναπτύσσουν αντίσταση σε θεραπεία στέρησης ανδρογόνων με το χρόνο [44]. Δεν υπάρχει στοχευμένη θεραπεία για αυτούς τους ασθενείς. Εμείς, ως εκ τούτου, ερευνήθηκε το πώς η ευαισθησία των παραγόμενων TOP2A υπερεκφράζουν κλώνους σε αντι-ανδρογόνα, δηλητήρια TOP2A και ο συνδυασμός των δύο φαρμάκων αλλάξει με το χρόνο. Στο πρώιμο περάσματα υψηλής TOP2A-εκφραστικά κύτταρα Τ14 ήταν πολύ πιο ευαίσθητα σε δοξορουβικίνη από κύτταρα ομόλογό Τ25 τους (Σχήμα 2Α). Η διαφορά εξαφανίστηκε σε υψηλότερες περάσματα ως κύτταρα πολλαπλασιάστηκαν σε καλλιέργεια, με τα κύτταρα Τ14 όλο και πιο ανθεκτικά στη θεραπεία αντι-TOP2A (Σχήμα 2Β). Παρόμοια τάση παρατηρήθηκε για τις επεξεργασίες με αντι-ανδρογόνο Casodex (Σχ 2Α και 2Β, κάτω πάνελ). Υπήρξε μια συνεπής σημαντική διαφορά στην ευαισθησία προς Casodex μεταξύ Τ14 και Τ25 κλώνοι πρώτα περάσματα. Αν και μικρή (περίπου 10-15%) στα επιλεγμένα δόσεις, αυτή η διαφορά δεν παρατηρήθηκε στις υψηλότερες περάσματα, παρόμοια με μοτίβο ευαισθησίας παρουσιάζονται για δοξορουβικίνη (Σχήμα 2Β, άνω πλαίσιο). Οι διαφορές στην απόκριση δεν είχαν σχέση με τις αλλαγές στο επίπεδο της πρωτεΐνης ως TOP2A αυτών των κυττάρων μετά πολλαπλασιασμό σε καλλιέργεια διατηρείται υψηλότερα επίπεδα TOP2A (Σχήμα 2C). Έτσι, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι τα κύτταρα των πρώιμων περάσματα υπερεκφράζουν TOP2A είναι πιο ευαίσθητα σε θεραπείες, και οι δύο φάρμακα αντι-TOP2A και αντι-ανδρογόνα. Μια πρόσφατη μελέτη διαπίστωσε ότι DLX4, συχνά υπερεκφράζεται σε μαστού και των ωοθηκών, διεγείρει επιδιόρθωση του DNA DSB που προκαλείται από δηλητήρια TOP2A, μειώνοντας έτσι την ευαισθησία των κυττάρων στην θεραπεία [25]. Ως εκ τούτου, σε σύγκριση επίπεδο DLX4 σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη και τα καρκινικά κύτταρα από καρκίνους διαφόρων GS (S2 Εικ). ανάλυση της έκφρασης μικροσυστοιχιών [30] έδειξε ότι δεν υπάρχει επαγωγή DLX4 σε προστάτη, υποδεικνύοντας έτσι ότι DLX4 δεν θα είναι ένας παράγοντας που συμβάλλει στην αντίσταση στην δηλητήρια TOP2A στον προστάτη.

Α) Η επιβίωση των κλώνων TOP2A της έγκαιρης πέρασμα σε απόκριση σε θεραπεία με δοξορουβικίνη (επάνω πάνελ) και Casodex (κάτω πίνακας). Β) Η επιβίωση των TOP2A κλώνων αργά διόδου σε απόκριση σε θεραπεία με δοξορουβικίνη (επάνω πάνελ) και Casodex (κάτω πίνακας). C) κηλίδα Western που δείχνει τα επίπεδα της TOP2A σε δημιουργούνται σταθεροί κλώνοι των πρώιμων και όψιμων περάσματα. Ανίχνευση της ΤΒΡ πυρηνικής πρωτεΐνης χρησιμοποιήθηκε για να επαληθευτεί η ίση φόρτωση. Δ) Ποσοτικοποίηση της έκφρασης TOP2A βασίζονται σε στύπωμα Western σε C. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD, με βάση 3 ανεξάρτητα πειράματα. τιμές P είναι, όπως αναφέρεται, N.S. δεν είναι σημαντική.

Η

Είμαστε δίπλα ελεγχθεί αν η θανάτωση κυττάρων θα ήταν πιο αποτελεσματική αν εφαρμοζόταν ένας συνδυασμός αυτών των δύο φαρμάκων. Στο πρώτο σετ, η θεραπεία με σταθερή δόση doxorubicin και αυξανόμενες συγκεντρώσεις Casodex έδειξε κανένα πλεονέκτημα στη θανάτωση κυττάρων με υψηλό επίπεδο TOP2A σε σύγκριση με ενδογενή μάρτυρα (Σχ 3Α και 3Β, πάνω πάνελ). Στην πραγματικότητα, η έγκαιρη κλώνος πέρασμα Τ14 έδειξε μεγαλύτερη αντίσταση σε αυτό το σύνταγμα σε σύγκριση με το Τ25 (Σχήμα 3Α, πάνω πίνακα). Σε αντίθεση, η αγωγή με σταθερή δόση 50 υΜ του Casodex, η εφαρμογή της οποίας και μόνο είχε ως αποτέλεσμα το 90% των κυττάρων επιβίωση (Σχήμα 2), έδειξε πιο αποτελεσματική θανάτωση αργά κυττάρων πέρασμα υπερεκφράζουν TOP2A σε σύγκριση με την πρώιμη διέλευση και χαμηλή έκφραση του κλώνου T33 ελέγχου ( Σχήμα 3Β, κάτω πλαίσιο). Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η AR θεραπείας συνδυασμού στόχευσης και TOP2A σε TOP2A ιδιαίτερα κύτταρα που εκφράζουν μπορεί να είναι ευεργετική για προχωρημένους όγκους

Α) Επιβίωση TOP2A κλώνους της έγκαιρης πέρασμα στην ανταπόκριση στη θεραπεία συνδυασμού:. Top Panel- σταθερή δόση της doxorubicin και αυξανόμενες συγκεντρώσεις Casodex? κάτω πάνελ-σταθερής δόσης του Casodex και αυξανόμενες συγκεντρώσεις δοξορουβικίνης. Β) Η επιβίωση των TOP2A κλώνων αργά διόδου σε απόκριση σε θεραπεία συνδυασμού, τα ναρκωτικά και οι συγκεντρώσεις είναι όπως στο ένα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD, με βάση 3 ανεξάρτητα πειράματα. τιμές P είναι, όπως αναφέρεται, N.S. δεν είναι σημαντική.

Η

Για να κατανοηθεί καλύτερα η πιθανή αλληλεπίδραση μεταξύ των δράσεων TOP2A και δίκτυο σηματοδότησης ανδρογόνων έχουμε δίπλα σύγκριση των επιπέδων των AR σε κλώνων που υπερεκφράζουν TOP2A με αυτά κλώνους με ενδογενή επίπεδο TOP2A. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσα με μη απογυμνωμένο περιέχουν βασικό επίπεδο στον ορό των ανδρογόνων, χωρίς επιπλέον συμπληρώματα. Τα συνολικά επίπεδα πρωτεΐνης AR συγκρίθηκαν μεταξύ Τ14 και Τ25 κλώνοι των πρώιμων και αργά περάσματα (Σχήμα 4Α). Τ14 κύτταρα και των δύο περάσματα έδειξαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα AR από τα κύτταρα Τ25 έλεγχο αντιστοίχιση (αυξημένα 3 και 8 φορές αντίστοιχα) που υποδηλώνουν συμμετοχή των TOP2A στην επαγωγή της έκφρασης AR στο επίπεδο της μεταγραφής. Τα επίπεδα της πρωτεΐνης TOP2A παρέμεινε υψηλότερη σε κύτταρα Τ14 σε κάθε πέρασμα λαμβάνονται πειράματος (Σχήμα 2C, S3C και S3E σχήμα). Για να διασφαλιστεί ότι η πρωτεΐνη TOP2A ήταν λειτουργική, η δοκιμασία χρησιμοποιώντας TOP2A εκμαγείο ειδικών DNA πραγματοποιήθηκε. Η ενζυματική δραστηριότητα μετράται σε πρωτεϊνικό εκχύλισμα που λαμβάνεται από κύτταρα Τ14 ήταν υψηλότερη από εκείνη των κυττάρων Τ25 (S3 Εικ). Όταν ρυθμιστεί με το ποσό της συνολικής πρωτεΐνης, ήταν 6 φορές μεγαλύτερη (S3b σχήμα), σύμφωνα με τα υψηλότερα επίπεδα των TOP2A σε Τ14 σε σύγκριση με τα κύτταρα Τ25. Σύνολο ενζυματική δραστηριότητα παρέμεινε αυξημένη, συνεπής με υψηλότερα επίπεδα πρωτεΐνης TOP2A, σε μετέπειτα διελεύσεις των κυττάρων Τ14 (Σχήμα S3D), επιβεβαιώνοντας ότι TOP2A παρέμεινε λειτουργικό, και δεν υπήρχαν μεταλλάξεις στην ενεργό θέση εισήχθη μετά διάδοση αυτού του κλώνου.

κηλίδα Western που δείχνει το συνολικό επίπεδο των AR σε κλώνους TOP2A διαφόρων διόδων (όπως αναφέρεται), επάνω πίνακα. Ποσοτικοποίηση της έκφρασης AR ομαλοποιηθεί σε επίπεδο ακτίνης βήτα, κάτω πίνακα. Β) κηλίδα Western που δείχνει την επαγωγή του επιπέδου AR (άνω) κατά την κατεργασία του TOP2A clones.with 5 ηΜ του R1881. Αντίστοιχες ποσοτικοποίηση των επιπέδων TOP2A ομαλοποιήθηκε ως προς τον έλεγχο της ΤΒΡ φόρτωσης απεικονίζεται (κάτω)? nt είναι μη επεξεργασμένα, t αντιμετωπίζεται? κυτταρικών διελεύσεων είναι όπως υποδεικνύεται. C) περιοχή υποκινητή Σχηματική παρουσίαση για

KLK3

PSA) γονίδιο (που χρησιμοποιείται στη δοκιμασία CHIP. DtFw και DtRv απεικονίζουν τις θέσεις της προς τα εμπρός και να αντιστρέψει εκκινητών αντιστοίχως για την περιοχή άπω υποκινητή? PxFw και PxRv -θέσεις για εμπρός και όπισθεν αστάρια της εγγύς υποκινητή. Δ) Ανάλυση CHIP του TOP2A κλώνων διεγέρθηκαν με 5 ηΜ R1881 για 3 ώρες. Εμπλουτισμός του AR και TOP2A στο απώτερο και εγγύς περιοχές προαγωγέα του γονιδίου KLK3 (άνω και μεσαία πλαίσια) και η απουσία τους σε περιοχή κωδικοποίησης του γονιδίου GAPDH (κάτω πίνακας) δεικνύονται. Μ είναι δείκτης μεγέθους DNA, HG-είναι ανθρώπινο γονιδιωματικό DNA χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για την ενίσχυση PCR, EL1 και EL2 είναι διαδοχικά κλάσματα έκλουσης (τα ρυθμιστικά διαλύματα που περιγράφονται στο Μέθοδοι).

Η

TOP2A είναι διαμόρφωση σηματοδότηση AR

τα υψηλότερα επίπεδα AR παρατηρήθηκαν σε TOP2A κύτταρα που υπερεκφράζουν (Σχήμα 4Α). Για να διαλευκανθεί ο μηχανισμός μέσω του οποίου TOP2A μπορεί να συμβάλλει στη ρύθμιση της μεταγραφής, που αντιμετωπίζονται κύτταρα με συνθετικό ανδρογόνο R1881 και σε σύγκριση με την πυρηνική επίπεδα AR. AR μετατοπίζεται στον πυρήνα κατά τη σύνδεση για τη ρύθμιση της μεταγραφής αποκριτικών γονιδίων [45] συνδετήρα. Παρατηρήσαμε σημαντικά υψηλότερο επίπεδο πυρηνικής AR σε απόκριση σε ανδρογόνα διέγερση σε TOP2A υπερεκφράζουν Τ14 κύτταρα νωρίς (σελ.24) πέρασμα σε σύγκριση με κύτταρα Τ25 (Σχήμα 4Β). Το επίπεδο της πυρηνικής AR σε αυτά τα κύτταρα αυξήθηκαν 5 φορές μετά την αγωγή. Αργά πέρασμα κύτταρα (p.55) υπερεκφράζουν TOP2A έδειξε ελαφρώς αυξημένο επίπεδο AR, όχι ως δραματική ως πρόδρομοι τους σε πέρασμα 24. Ενεργός AR αναγνωρίζει και συνδέεται με παλινδρομικούς στοιχείο απόκρισης ανδρογόνων (ARE) αλληλουχίες στο εγγύς γονιδίων για την επαγωγή της μεταγραφής τους [45,46]. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι TOP2A ενεργεί με AR για την ενεργοποίηση της μεταγραφής γονιδίων που αποκρίνονται. Για να δοκιμαστεί τυπικά αυτό εκτελέσαμε χρωματίνης ανοσοκαθίζηση χρησιμοποιώντας μία περιοχή που αντιστοιχεί στο εγγύς και άπω ARE στον υποκινητή του ειδικού προστατικού αντιγόνου (PSA) (γονίδιο KLK3, Σχήμα 4C), ένα καλά χαρακτηριζόμενη μεταγραφικό στόχο του AR [46]. Αντισώματα, να TOP2A και AR, ήταν σε θέση να συλλάβει τα θραύσματα DNA που περιέχει διατρέχουν KLK3 προαγωγού μετά τη θεραπεία με R1881 (Σχήμα 4D). Δεν υπήρχε διαφορά στη σύνδεση του TOP2A ή AR να AREs μεταξύ Τ14 και Τ25 κλώνων. Η σύνδεση ήταν ειδική καθώς δεν πρόσληψη είτε TOP2A ή AR να άσχετη αλληλουχία παρατηρήθηκε (περιοχή κωδικοποίησης του γονιδίου GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι όπως και το ομόλογο TOP2B της, TOP2A προσλαμβάνεται για στεροειδούς ρυθμιστικά στοιχεία για να διεγείρουν τη μεταγραφή και προτείνει συνεργιστική δράσεις με σηματοδότηση των ανδρογόνων στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη.

TOP2A προωθεί την παραγωγή των αναδιατάξεων του DNA στα κύτταρα του προστάτη

Μεγάλες χρωμοσωματικών αναδιατάξεων που παρατηρείται συνήθως σε προστάτη [47,48] και πιστεύεται ότι παίζουν ένα ρόλο στην έναρξη και την εξέλιξη του όγκου. Δείχνουμε εδώ ότι σε ένα τρόπο παρόμοιο με TOP2B, TOP2A προσλαμβάνεται για AREs να διεγείρει μεταγραφή. Είτε επανάληψη αυτής της διαδικασίας οδηγεί σε προοδευτική συσσώρευση αναδιατάξεις DNA δεν διερευνήθηκε. για να ελεγχθεί αυτή, ζεύγος σύντροφος σημείο διακοπής αλληλούχισης διεξήχθη [49,50] για διάφορα περάσματα υψηλής και χαμηλής έκφρασης κλώνοι TOP2A. γονικά κύτταρα LNCaP φιλοξενούν έναν αριθμό γονιδιωματικών μεταβολών που περιλαμβάνουν μετατοπίσεις, και τον αριθμό αντιτύπου αλλαγές (S4A Εικ). Τα κύτταρα που επιλέγονται μετά την ενσωμάτωση των φορέων που φέρουν siRNA να κασπάσης-3 και cDNA για TOP2A έδειξαν σημαντικά μεγαλύτερο αριθμό χρωμοσωμικές ανωμαλίες (S4B Εικ). Αυτό δεν προκαλεί έκπληξη δεδομένου ότι οι χειρισμοί που ενδέχεται οδήγησαν στην επιλογή των κυττάρων με μειωμένη ικανότητα να υφίστανται απόπτωση. κλώνοι Τ25 που εκφράζουν ενδογενές επίπεδο του TOP2A δεν έδειξε αλλαγή στον αριθμό των γονιδιωματικών αναδιατάξεις με πολλαπλασιασμό (Σχ 5Α και 6Α). Ο συνολικός αριθμός μεταβολών σε Τ25 κύτταρα διαφορετικών διόδων ήταν η ίδια όπως στο πρόδρομα κύτταρα που φιλοξενούν μειωμένο επίπεδο της κασπάσης-3 (Σχήμα 6Α). Σε αντίθεση, τα κύτταρα που υπερεκφράζουν Τ14 TOP2A αποδειχθεί προοδευτική συσσώρευση αναδιατάξεις με αυξανόμενη δίοδο (Σχήματα 5Β και 6Β). Το ίδιο το γονίδιο TOP2A επηρεάστηκε επίσης σε Τ14 καθυστερημένης διόδου (Πίνακας 1). Ωστόσο, η διαταραχή του ένα αλληλόμορφο δεν οδήγησε σε σημαντική μείωση της έκφρασης της πρωτεΐνης, γεγονός που υποδηλώνει ότι η εξωγενής ενσωματωμένο αντίγραφο του γονιδίου κυρίως οδήγηση έκφρασης.

Α) Καθυστερημένη πέρασμα του Τ25 κλώνου που εκφράζει ενδογενές επίπεδο του TOP2A . Β) Αργά το πέρασμα του κλώνου Τ14 υπερεκφράζουν TOP2A. Γκρι κουκίδες (μετρήσεις) δείχνουν τη συχνότητα της διανομής των διαβάζει 30KB παράθυρα και σημεία διακοπής για όλα τα χρωμοσώματα (οι αριθμοί που αναφέρονται). Ο άξονας Χ εκτείνεται το μήκος του χρωμοσώματος, ο άξονας Υ δείχνει τον αριθμό των διαβάζει για κάθε παράθυρο. Οι μετρήσεις παράθυρο που φαίνεται σύμφωνα με την πρόβλεψη από τον αλγόριθμο CNV. Γκρι σημεία είναι φυσιολογικά, κόκκινα σημεία αντιστοιχούν σε διαγραφές και μπλε σημεία παρουσιάζουν κέρδη. Γραμμές συνδέουν bioinformatically εντοπίστηκαν σημεία διακοπής. Τα πλάτη των γραμμών συσχετίζονται με τον αριθμό των συνδεδεμένων σύντροφο ζεύγους διαβάζει. Χρώμα των γραμμών σύνδεσης υποδεικνύει πολικότητα του ενώνονται χρωμοσώματος. Για ενδο-χρωμοσωμικό γεγονότα κόκκινο δείχνει προς τα εμπρός κατεύθυνση και για τα δύο κομμάτια, το πράσινο υποδεικνύει αναστροφή για έναν εταίρο και μπλε δείχνει αναστροφή και για τα δύο. Για ενδο-χρωμοσωμικό γεγονότα, κόκκινο συνδέει την ρ-πλευρά κομμάτι από το μεγαλύτερο χρωμόσωμα προς την Q-κομμάτι πλευρά του μικρότερου χρωμοσώματος σε κατεύθυνση προς τα εμπρός, πράσινο συνδέει την Q-πλευρά κομμάτι από το μεγαλύτερο χρωμόσωμα προς την ρ-πλευρά κομμάτι του μικρότερα χρωμόσωμα σε κατεύθυνση προς τα εμπρός, μπλε συνδέει την ρ-πλευρά κομμάτι από το μεγαλύτερο χρωμόσωμα προς την ρ-πλευρά κομμάτι της μικρότερης χρωμοσώματος σε αντίστροφη κατεύθυνση και ματζέντα συνδέει την Q-πλευρά κομμάτι από το μεγαλύτερο χρωμόσωμα προς την Q-πλευρά κομμάτι του μικρότερα χρωμόσωμα σε αντίστροφη κατεύθυνση. Μαύρο δείχνει ισορροπημένη μεταθέσεις. Μπλε αιχμές βελών δείχνουν επιλεγμένα αναδιατάξεις DNA που αποκτήθηκαν κατά τον πολλαπλασιασμό (απουσιάζει από τα αντίστοιχα κύτταρα των προηγούμενων πέρασμα.

Η

Α) Συνολικός αριθμός των σημείων διακοπής που υπάρχει στο Τ25 κύτταρα διαφορετικών διόδων. LNCaP /Casp είναι ένα παράγωγο της κυτταρικής σειράς LNCaP που εκφράζει σταθερά siRNA να γκρεμίσουμε κασπάσης αλλοιώσεις 3. Β) DNA που έχει αποκτηθεί από TOP2A κύτταρα που υπερεκφράζουν Τ14 μετά τον πολλαπλασιασμό. Οι αριθμοί αντιπροσωπεύουν μεταβολές που παρατηρούνται, εκτός από εκείνες που υπάρχουν στα Τ25 έλεγχο κλώνο. C) Σχηματική παρουσίαση προτεινόμενο ρόλο της TOP2A στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη και αντίσταση σε θεραπεία απόσπασης ανδρογόνων.

Η

Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η γονιδιωματική μεταβολές που προκαλούνται από τα υψηλά επίπεδα των TOP2A οδηγούν σε απόκτηση περισσότερων επιθετικό φαινότυπο και μπορεί επίσης να συμβάλει στην ανάπτυξη της ανθεκτικότητας στις θεραπείες και μόνο παράγοντα.

Συζήτηση

Αν και ριζική προστατεκτομή θεραπείες περισσότερα από GS 7-10 ασθενείς, ο κίνδυνος της συστηματικής εξέλιξης και του θανάτου μετά την επέμβαση παραμένει υψηλότερο από 15%. Μια υποομάδα των ασθενών αυτών αναπτύξουν την ασθένεια [44] και μερικοί, μετά την αρχική βελτίωση με τη θεραπεία στέρησης ανδρογόνων, η πρόοδος σε ανθεκτικά ευνουχισμό κατάσταση [51]. Παρά τις προόδους στη θεραπεία των ασθενών με ανθεκτική ευνουχισμό της νόσου [52, 53], την επίτευξη της μακροπρόθεσμης επιβίωσης εξακολουθεί να αποτελεί πρόβλημα. Κατανόηση των μηχανισμών που διέπουν την αντίσταση στην κατάλυση είναι κρίσιμη. Ένας από τους προτεινόμενους μηχανισμούς είναι η ανάπτυξη των αυξημένη ευαισθησία σε χαμηλά επίπεδα ανδρογόνων μετά εκτομή λόγω ενίσχυση AR ή ανύψωση της έκφρασης του [54,55]. Σύμφωνα με αυτό, η μελέτη μας έδειξε ότι TOP2A, συχνά υπερεκφράζεται σε περιπτώσεις προστάτη που διατρέχουν υψηλό κίνδυνο εξέλιξης, οδηγεί την έκφραση του AR. Τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι η θεραπεία ανδρογόνων μπορεί να είναι λιγότερο αποτελεσματική με την παρουσία υψηλού επιπέδου πρωτεΐνης TOP2A (Σχήμα 6C). Περαιτέρω, τα πειράματα θεραπεία υποστηρίζουν την ιδέα ότι η θεραπεία με τη χρήση συνδυασμού αντι-ανδρογόνων και TOP2A δηλητήριο παρέχει ένα ισχυρότερο όφελος. Δείχνουμε επίσης ότι η στόχευση TOP2A με δηλητήριο από μόνη της είναι αποτελεσματική μόνο σε προγενέστερα στάδια, πριν έχουν συμβεί TOP2A με γνώμονα τις αλλαγές του DNA (Σχήμα 6C). Σε συμφωνία με τα ευρήματα αυτά μια πρόσφατη μελέτη χρησιμοποιώντας ένα διαφορετικό μοντέλο για την PCA εντόπισε TOP2A ως αντιγόνο όγκου υποτροπή ειδικά [56]. Ποντίκι όγκους του προστάτη, όταν εκτίθενται σε αναντίστοιχο ανοσοθεραπεία εξελιχθεί σε ένα δραστικά διαφορετικό φαινότυπο, που δείχνει υψηλή έκφραση του TOP2A και την ανταπόκριση στη θεραπεία αντι-TOP2A. Σε αυτό το στάδιο της ελάχιστης υπολειμματικής νόσου, TOP2A-θετικά κύτταρα εμφανίζονται κυττάρων που μοιάζουν με φαινότυπο στελέχους και έδειξε αύξηση της εισβολής [56], μια ιδιότητα, χαρακτηριστικό των κυττάρων TOP2A-υπερεκφράζουν στο μοντέλο μας. Σε μία άλλη μελέτη, χρησιμοποιώντας συγγενικά μοντέλο ποντικού της αυθόρμητης μετάστασης προστάτη [57] οι συγγραφείς απέδειξαν ότι τα υψηλά επίπεδα του TOP2A συσχετίζονται με υψηλά επίπεδα μεθυλοτρανσφεράση ΕΖΗ2, και στόχευση των δύο πρωτεϊνών σε συνδυασμό οδήγησε σε αποτελεσματική κυτταρικό θάνατο.

Εκτός το επίπεδο και η λειτουργικότητα των TOP2A, κυτταρική απόκριση σε αναστολείς του αναφέρθηκε επίσης να εξαρτάται από την δραστηριότητα των άλλων παραγόντων. DLX4, ένα γονίδιο ομοιοακολουθίας, υπερεκφράζεται σε διάφορους καρκίνους [58], έδειξε ότι μειώνει την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων σε δηλητήρια TOP2A διεγείροντας επιδιόρθωση DSB με μη ομόλογο τέλος ενώνει [25]. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι αυτό δεν είναι η περίπτωση PCa, καθώς το επίπεδο των DLX4 δεν αυξάνει με το βαθμό του όγκου, αλλά παραμένει παρόμοια με εκείνη σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα (S2 Εικ).

Συλλογικά, οι μελέτες αυτές δείχνουν ότι η υπάρχει ένα χρονικό παράθυρο κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του προστάτη όπου η θεραπεία αντι-TOP2A μπορεί να είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική. Είτε TOP2A δηλητήρια /αναστολείς ή ανοσοθεραπεία πρέπει να είναι η επιλογή της θεραπείας στην κλινική μένει να καθοριστεί.

Τέλος, δείχνουμε εδώ ότι TOP2A συνεργάζεται με AR για να προκαλέσει τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων (Σχήμα 6C). Το επίπεδο της ίδιας της AR είναι σημαντικά υψηλότερη σε κύτταρα που υπερεκφράζουν TOP2A μετά από διέγερση με ανδρογόνα αγωνιστή. Παρόμοια με την ισομορφή TOP2B του, TOP2A είναι συν-προσληφθεί για να είναι μαζί AR, και είναι πιθανό να ενεργοποιήσει τη μεταγραφή. Προηγουμένως, TOP2B επίσης δειχθεί ότι επάγει DNA DSB σε ρυθμιστικές περιοχές των οιστρογόνων και AR γονίδια στόχους [35,36]. Παρά το γεγονός ότι, στη μελέτη μας δεν είχαμε αντιμετωπίσει αυτό το ενδεχόμενο άμεσα, δεν είχαμε παρατηρούμε μια αύξηση σε μια σειρά από αναδιατάξεις του DNA σε κύτταρα που υπερεκφράζουν TOP2A στον πολλαπλασιασμό. Είτε είναι το αποτέλεσμα κακής επιδιόρθωσης του DNA DSBs που συμβαίνουν στα μεταγραφικά ρυθμιστικά στοιχεία ή ως συνέπεια της περίσσειας της λειτουργίας TOP2A κατά την αντιγραφή μένει να διερευνηθεί περαιτέρω. Εντοπίσαμε μερικές αναδιατάσσονται τα γονίδια που θεωρούμε ως «TOP2A εξαρτάται» (Πίνακας 1). Με βάση τις προγενέστερες παρατηρήσεις που σχετίζονται με την λειτουργία αυτών των γονιδίων, οι αλλαγές στις ιδιότητες των TOP2A υπερεκφράζουν κυττάρων και την ευαισθησία τους σε θεραπείες μπορεί να αποδοθεί στις αλλαγές σε αυτές τις περιοχές του DNA. Για παράδειγμα, Emi1 (FBOX5) (Πίνακας 1) επηρεάζονται σε κύτταρα Τ14 της τελευταίας διόδου είναι ένας γνωστός ρυθμιστής της μιτωτικής εξέλιξης [59,60]. Έχει ενοχοποιηθεί για τον προσδιορισμό της ευαισθησίας στη δοξορουβικίνη [61]. Σε ότι εξάντληση μελέτη του Emi1 οδήγησε σε αύξηση της ευαισθησίας, σε συμφωνία με αυτό, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η επικάλυψη που παρατηρείται σε Τ14 κύτταρα αργότερα δίοδος μπορεί να ευθύνεται για τη μείωση της ευαισθησίας σε δοξορουβικίνη (Σχήμα 2Β). Η διακοπή της PARD3B γονιδίου, που φαίνεται να ελέγχει στενοσυνδέσεων [62], μπορεί να ευθύνονται για την αύξηση στην κινητικότητα και την εισβολή ικανότητα των κυττάρων Τ14. Μείωση στην έκφραση ή απώλεια του Tango, ένα ομόλογο του Tango6, διαταράσσεται σε TOP2A υπερεκφράζουν κύτταρα, επίσης προηγουμένως αποδειχθεί ότι αυξάνουν τη μετανάστευση [63]. Η λειτουργία του Tango6 δεν έχει εξεταστεί ακόμη, αν η απώλεια του μπορεί να έχει παρόμοια επίδραση με τις ιδιότητες των κυττάρων του προστάτη »απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση. Οι μελλοντικές μελέτες για να επεξεργαστεί για την ακριβή λειτουργική συμβολή των κεκτημένων γονιδιωματικής αλλαγές.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων και θεραπείες

Οι κυτταρικές καλλιέργειες διατηρήθηκαν ακόλουθες συστάσεις ATCC. LNCaP (ATCC) και LNCaP σταθερά παράγωγα αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 (Gibco, Life Technologies) καλλιέργειας συμπληρωμένο με 100 μονάδες /ml πενικιλίνης, 1 mg /ml στρεπτομυκίνης, και 10% FBS. Για ανδρογόνων πειράματα θεραπεία κύτταρα καλλιεργήθηκαν στο ίδιο μέσο αλλά αντικαθιστώντας 10% FBS με 5% ξυλάνθρακα-φιλτράρεται FBS (One Shot, Life Technologies) για 48 ώρες πριν από την προσθήκη του 5ηΜ R1881 (ΜΕΘΥΛΤΡΙΕΝΟΛΌΝΗ, RM10, TSZCHEM), και μετά από αυτό επωάστηκαν για επιπλέον 48 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με απόξεση και πρωτεΐνη απομονώθηκε (kit πυρηνικό εκχύλισμα, Active Motif) για ανάλυση στυπώματος Western.