Αφηρημένο

Συσσωρευμένα στοιχεία δείχνουν ότι η μετφορμίνη, ένα διγουανίδιο κατηγορία αντιδιαβητικών φαρμάκων, έχει αντικαρκινικές ιδιότητες. Ωστόσο, οι περισσότερες από τις μελέτες για την αξιολόγηση της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας της μετφορμίνης έχουν σε πρωτογενή καρκίνο. Δεν είναι γνωστό κατά πόσον η μετφορμίνη μπορεί να χρησιμοποιηθεί αποτελεσματικά για υποτροπιάζοντα καρκίνο, ειδικά καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) που επηρεάζει μέχρι και το 50% των ασθενών που έλαβαν θεραπεία με συμβατικές χημειοθεραπείες. Αν και οι λόγοι για υποτροπή δεν είναι πλήρως κατανοητοί, πιστεύεται ότι οφείλεται σε επανεμφάνιση της χημειοθεραπείας του καρκίνου ανθεκτικού στελέχους /βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με (ΚΕΠ /CSLCs). Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη στρατηγικών θεραπείας μη-τοξικά στόχευση ΚΕΠ θα είναι σημαντικό θεραπευτικό όφελος.

Κατά την τρέχουσα έρευνα, έχουμε εξετάσει την αποτελεσματικότητα της μετφορμίνης, σε συνδυασμό με 5-φθοριοουρακίλη και οξαλιπλατίνη (FuOx), η στυλοβάτης των θεραπευτικών του καρκίνου του παχέος εντέρου, στην επιβίωση του χημειο-ανθεκτικά κύτταρα καρκίνου κόλου που είναι εντόνως εμπλουτισμένα σε ΚΕΠ /CSLCs. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η μετφορμίνη δρα συνεργιστικά με FuOx (α) επάγουν κυτταρικό θάνατο σε χημειο ανθεκτικά (CR) ΗΤ-29 και HCT-116 κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου, (β) αναστέλλει τον σχηματισμό colonospheres και (γ) ενίσχυση colonospheres αποσύνθεση.

In vitro

μελέτες κυτταρικής καλλιέργειας έχουν δείξει περαιτέρω ότι η συνδυαστική θεραπεία αναστέλλει τη μετανάστευση των CR καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα. Αυτές οι αλλαγές συσχετίστηκαν με αυξημένη miRNA 145 και μείωση miRNA 21. Wnt /β-κατενίνης οδού σηματοδότησης επίσης ρυθμίζεται προς τα κάτω υποδεικνύοντας σημαντικό ρόλο της στην ρύθμιση της ανάπτυξης του καρκίνου του παχέος εντέρου CR κύτταρα. Δεδομένα από το μοντέλο ξενομοσχεύματος SCID ποντίκια CR HCT-116 και CR κύτταρα ΗΤ-29 δείχνουν ότι ο συνδυασμός μετφορμίνης και FuOX είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική στην αναστολή της ανάπτυξης των όγκων του παχέος εντέρου, όπως αποδεικνύεται από -50% αναστολή στην ανάπτυξη μετά 5 εβδομάδες θεραπείας συνδυασμού , σε σύγκριση με τους ελέγχους που έλαβαν φορέα. τρέχοντα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι η μετφορμίνη σε συνδυασμό με τη συμβατική χημειοθεραπεία θα μπορούσε να είναι μια αποτελεσματική θεραπευτική αγωγή για επαναλαμβανόμενες καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC)

Παράθεση:. Nangia-Makker P, Yu Υ, Vasudevan Α, Farhana L, Rajendra SG, Levi Ε, et al. (2014) Μετφορμίνη: Ένας πιθανός θεραπευτικός παράγοντας για υποτροπιάζοντα καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 9 (1): e84369. doi: 10.1371 /journal.pone.0084369

Επιμέλεια: Shrikant Anant, Πανεπιστήμιο του Κάνσας Ιατρική Σχολή, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 18η Οκτωβρίου, 2013? Αποδεκτές: 22 Νοεμβρίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 20 Ιανουαρίου 2014

Copyright: © 2014 Nangia-Makker et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το NIH (AG014343) και το Τμήμα Υποθέσεων Βετεράνων (I101BX001927). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Πρόσφατα κατανόηση της ετερογενούς μακιγιάζ των καρκινικών κυττάρων σε έναν όγκο έχει αποκαλύψει την παρουσία του ΚΕΠ /CSLCs [1], [2], τα οποία εμφανίζουν αυτο-ανανέωση χαρακτηριστικά, την ικανότητα να κινήσει όγκου από ένα μικρό αριθμό των κυττάρων που είναι ιδιαίτερα ανθεκτικά χημειο-[3] – [7]. Καρκίνωμα υποτροπή οφείλεται εν μέρει στο γεγονός ότι η συμβατική χημειοθεραπεία στοχεύει μόνο τα ταχέως διαιρούμενα κύτταρα που σχηματίζουν μεγαλύτερο μέρος του όγκου, αλλά απαλλάσσει τα ΚΕΠ /CSLCs [8]. Το ποσοστό των ΚΕΠ έχει αναφερθεί ότι αυξάνει μετά από συμβατική χημειοθεραπεία [9]. Έτσι, η παρουσία των ανθεκτικών χημειοθεραπεία ΚΕΠ /CSLCs στον πρωτογενή όγκο μπορεί εν μέρει να είναι υπεύθυνη για την αποτυχία της πλήρους εξάλειψης των όγκων οδηγεί σε επανεμφάνιση της στην πρωτοβάθμια και δευτεροβάθμια sites. Ανάπτυξη νέων θεραπευτικών στρατηγικών, που στοχεύουν ειδικά ΚΕΠ /CSLCs είναι, ως εκ τούτου, δικαιολογείται.

Η μετφορμίνη, (υδροχλωρική 1,1-dimethylbiguanide) ένα FDA ενέκρινε διγουανίδιο αντι-διαβητικό φάρμακο, προέρχεται από τη γαλλική λιλά (

Galega officinalis

), ένα φυτό που χρησιμοποιείται στη λαϊκή ιατρική για αρκετούς αιώνες. Εκτός από τη λειτουργία της ως καταστολέας γλυκονεογένεση, η μετφορμίνη έχει πρόσφατα δειχθεί ότι έχει ισχυρές αντικαρκινικές ιδιότητες. Σε διαβητικούς ασθενείς τύπου 2 μετφορμίνη έχει δειχθεί ότι καταστέλλουν την καρκινογένεση στο μαστό, πάγκρεας και τον πνεύμονα, και να μειώνει τη θνησιμότητα που συνδέεται με καρκίνο (που επισκοπείται στο [10], [11]. Σε έναν αριθμό προκλινικές μελέτες, μετφορμίνη μείωσε τον πολλαπλασιασμό, απόπτωση, προκάλεσε αναστολή του κυτταρικού κύκλου, και μειωμένη συχνότητα εμφάνισης και την ανάπτυξη πειραματικών όγκων

in vivo

[12] – [18] Μερικές εκθέσεις δείχνουν επίσης ότι η μετφορμίνη βελτίωσε την απόκριση των ανθρώπινων καρκινικών ξενομοσχευμάτων μαστού στην συμβατική χημειοθεραπεία με την εξάλειψη ΚΕΠ σε. ο όγκος [19], [20].

Πολλοί ερευνητές έχουν αναφέρει τον κεντρικό ρόλο του /β-κατενίνης σηματοδοτικό μονοπάτι Wnt στη ρύθμιση των επιθηλιακών βλαστικών κυττάρων αυτο-ανανέωση [21], [22], και απορύθμιση του έχει εμπλακεί σε πολλές κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος (CRC) [23], [24]. στην CRC, ως αποτέλεσμα της απενεργοποίησης του γονιδίου APC, η συντονισμένη φωσφορυλίωση και την καταστροφή των β-κατενίνης διαταράσσεται. ως αποτέλεσμα, β-κατενίνης συσσωρεύεται στο κυτταρόπλασμα, σύμπλοκα με πρωτεΐνες δέσμευσης DNA της οικογένειας TCF /LEF και μετατοπίζεται στον πυρήνα [25], [26]. Αφού εκεί, ενεργοποιεί τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων της, όπως κυκλίνη D1, c-myc, ΜΜΡ-7, ΜΤ1-ΜΜΡ, axin1 κλπ [27]. Πολλά από αυτά τα γονίδια στόχους εμπλέκονται στην εντερική πολλαπλασιασμού αρχέγονων κυττάρων και την καρκινογένεση [28]. Πρόσφατα δείξαμε ότι μονοπάτι Wnt /β-κατενίνης διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη και τη συντήρηση των colonospheres, τα οποία είναι ιδιαίτερα εμπλουτισμένα σε κύτταρα /CSL CSC [29]. Αυξημένα επίπεδα β-κατενίνης σε colonospheres συνδέθηκαν με επαγωγή μεταγραφική ενεργοποίηση του TCF /LEF, η οποία μειώθηκε όταν β-κατενίνης σίγησε χρησιμοποιώντας siRNA [29].

μία νέα κατηγορία μικρού μη-κωδικοποίησης RNAs , που ονομάζεται έτσι miRNAs έχει αναδειχθεί ως ρυθμιστής της μετάφρασης του mRNA. Ένα miRNA μπορεί να δράσει ως καταστολέας όγκου ή ενός ογκογονιδίου, ανάλογα με τους στόχους της σε διάφορους ιστούς και τύπους κυττάρων [30]. Περιεκτική αναλύσεις των προτύπων miRNA-έκφρασης σε ανθρώπινους καρκίνους έχουν δείξει ότι διάφοροι τύποι καρκίνου του έχουν διακριτά πρότυπα έκφρασης miRNA [31] Εμείς έχουν αναφέρει ότι miR21, η οποία έχει αποδειχθεί ότι είναι προς τα πάνω ρυθμισμένα σε CRC [32], διεγείρει βλαστική ικανότητα σε χημειο ανθεκτικών (CR) καρκινικά κύτταρα κόλου [33]. miR21 έχει αποδειχθεί ότι ρυθμίζει την ανάπτυξη, τη μετανάστευση, εισβολή και την απόπτωση σχετικές ιδιότητες των καρκινικών κυττάρων [34]. Κάτω ρύθμιση των miR21 από CDF, ένα ανάλογο της κουρκουμίνης [35], είχε ως αποτέλεσμα την εξομάλυνση των άξονα PTEN /Akt στο CR HCT-116 και CR ΗΤ-29 κύτταρα και μειωμένη ανάπτυξη [36]. Υπερ-έκφραση του miR21in HCT-116 κύτταρα είχε ως αποτέλεσμα αυξημένη δραστικότητα β-κατενίνης [33].

Η παρούσα έρευνα πραγματοποιήθηκε να εξετάσει εάν η μετφορμίνη μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με τη συμβατική χημειοθεραπεία για να αναστέλλουν την ανάπτυξη των χημειο ανθεκτικών κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου και η ρύθμιση αυτής της διαδικασίας. Στο παρόν, έχουμε αποδείξει ότι η μετφορμίνη δρα συνεργικά με FuOx, έναν συνδυασμό 5-FU και οξαλιπλατίνη, το στήριγμα στη χημειοθεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου να αναστέλλουν την ανάπτυξη των κυττάρων του παχέος εντέρου CR

in vitro

και

in vivo

καθώς και η μετανάστευση τους μέσω ρύθμισης προς τα κάτω miR21and αναστέλλοντας την /β-κατενίνης μονοπάτι σηματοδότησης Wnt.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και αντιδραστήρια

καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου του Ανθρώπου ΗΤ-29 και HCT-116 λήφθηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (4,5 g /I D-γλυκόζη) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Invitrogen, Grand Island, ΝΥ) και 1% αντιβιοτικό /αντιμυκητιασικό σε υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C σε μία ατμόσφαιρα 95% αέρα και 5% diaoxide άνθρακα. Η 5-φθοροουρακίλη + Η οξαλιπλατίνη (FuOx) ανθεκτικών κυττάρων (κύτταρα CR) δημιουργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [37] – [39] στο εργαστήριο μας. Τα κύτταρα CR διατηρήθηκαν σε κανονικό μέσο καλλιέργειας που περιείχε 2 χ FuOx (50 μΜ 5 FU + 1,25 μΜ Οχ). Τα ενδοθηλιακά κύτταρα ήταν ένα δώρο από τον Dr Dipak Banerjee, University of Puerto Rico και διατηρήθηκαν σε ελάχιστο βασικό μέσο Earle συμπληρωμένου με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Hyclone) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [40]. Το μέσο αλλάχθηκε δύο φορές την εβδομάδα, και τα κύτταρα ανακαλλιεργήθηκαν χρησιμοποιώντας 0,05% θρυψίνη /ΕϋΤΑ (Invitrogen). Η χρήση των κυτταρικών σειρών εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ανθρωπίνων Έρευνας, Πολιτειακό Πανεπιστήμιο Wayne, Detroit, MI. Η υδροχλωρική μετφορμίνη αγοράστηκε από την Sigma Chemical Co. Ένα 2 Μ διάλυμα παρασκευάστηκε σε αποστειρωμένο απεσταγμένο νερό και αποθηκεύτηκε στους -20 ° C. FU και Οχ ελήφθησαν από την Sigma Chemical Co.

Προσδιορισμός της κυτταρικής ανάπτυξης

Η ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου εκτιμήθηκε με μιτοχονδριακή εξαρτώμενη μείωση του 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ ) -2, βρωμιούχο 5-διφαινυλτετραζόλιο (ΜΤΤ) (Sigma) προς φορμαζάνη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [41]. Εν συντομία, τα κύτταρα (5 × 10

3) σπάρθηκαν σε τετραπλούν σε 24 δίσκους καλλιέργειας καλά. Μετά από 24 ώρες, φρέσκο ​​μέσο που περιέχει διάφορες συγκεντρώσεις της μετφορμίνης και /ή FuOx προστέθηκε. Μετά από 72 ώρες, ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Εν συντομία, το μέσο απομακρύνθηκε και τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C με ΜΤΤ (0,5 mg /mL) για 4 ώρες. Το μέσο αναρροφήθηκε και τα κύτταρα διαλυτοποιήθηκαν σε 0,04 Ν HCl σε ισοπροπανόλη. Η οπτική πυκνότητα (OD) μετρήθηκε στα 570 και 630 nm.

Ανάλυση της αλληλεπίδρασης μεταξύ μετφορμίνης και FuOx

Συνδυασμός δεικτών (CI) μέθοδος προσαρμοστεί για

in vitro

ναρκωτικών δοκιμή χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η φύση της αλληλεπίδρασης μεταξύ μετφορμίνης και FuOx. Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιεί εξίσωση πολλαπλής δράσης του φαρμάκου αρχικά που προέρχονται από τη μέθοδο κινητική του ενζύμου, όπου η έξοδος αναπαρίσταται ως CI ή /και ανάλυση ισοβολογράμματος analysis.CI διεξήχθη με τη χρήση λογισμικού CalcuSyn (Biosoft, Ferguson, ΜΟ). Με βάση τις τιμές CI, έκταση συνέργεια /anatogonism προσδιορίζεται. Σε γενικές γραμμές, οι τιμές CI κάτω από 1 δείχνουν συνέργεια, ενώ CI τιμές πάνω από 1 δείχνουν ανταγωνισμό μεταξύ των φαρμάκων. τιμές CI της τάξης του 0,9 έως 1,10 θα υποδείκνυε κυρίως αθροιστικά αποτελέσματα: αυτές μεταξύ 0,9 – 0,85 υποδηλώνουν ελαφρά συνέργεια, και τις αξίες της τάξεως των 0,7 έως 0,3 είναι ενδεικτικά της μέτριας συνέργεια. Οποιεσδήποτε τιμές μικρότερες από 0,3 θα πρότεινα ισχυρή συνεργιστικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των φαρμάκων.

Σχηματισμός και τη διαφοροποίηση των colonospheres

Η ικανότητα των κυττάρων να σχηματίσουν σφαίρες σε εναιώρημα αξιολογήθηκε όπως περιγράφεται από τους Liu et al [42 ] με ελαφρές τροποποιήσεις [29], [43]. Εν συντομία, colonospheres δημιουργήθηκαν με επώαση ενός περιορισμένου αριθμού γονικών και CR HCT-116 και ΗΤ-29 κύτταρα σε μια συγκέντρωση 100 κύτταρα ανά 200 μL σε ορό μέσο κυτταρικής -Δωρεάν βλαστικών (SCM) που περιέχει DMEM /F12 (1:01) συμπληρωμένο με Β27 (τεχνολογίες Life, Gaithersberg, MD) παράγοντα 20 ng /mL επιδερμικού αυξητικού (Sigma, St. Louis, ΜΟ), 10 ng /mL αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών (Sigma) και αντιβιοτικό /αντιμυκητιασικό σε πλάκες 24 φρεατίων σε παρουσία μετφορμίνη μόνο ή σε συνδυασμό με FuOx. Οι colonospheres σχηματίζονται μετά από 8 ημέρες αξιολογήθηκαν για το μέγεθος και τον αριθμό τους με οπτικό μικροσκόπιο. Σε μια σειρά πειραμάτων, οι colonospheres διαμορφώνεται σε κανονικό μέσο υποβλήθηκαν σε θεραπεία με μετφορμίνη ή /και FuOx να αναλύσει τις επιπτώσεις τους στη διαφοροποίηση σφαίρα και προσκόλληση.

Extreme περιορισμό της αραίωσης ανάλυση

Extreme ανάλυση περιοριστικής αραίωσης (ΕΛΔΑ) πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται από τον Hu και Smyth [44]. Εν συντομία, σε ένα εναιώρημα κυττάρων που λαμβάνονται από προσκολλημένα κύτταρα προκατεργάστηκαν με μετφορμίνη και /ή FuOx για 72 ώρες απλώθηκαν σε μία συγκέντρωση των 100, 10 και 1 κύτταρο ανά 100 μLSCM (24 καλά για κάθε αραίωση) σε πλάκες 96 φρεατίων και επωάστηκαν για 8 ημέρες . Στο τέλος του 8 ημέρες, μετρήθηκε ο αριθμός των πηγαδιών δείχνει σχηματισμό colonospheres. Η συχνότητα των κυττάρων που σχηματίζουν σφαίρα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ΕΛΔΑ WebTool στο https://bioinf.wehi.edu.au/software/elda.

Η μετανάστευση των κυττάρων δοκιμασία

Αυτή η δοκιμασία διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα Boyden θάλαμο (Neuroprobe Inc., Cabin John, MD) όπως περιγράφεται παραπάνω [41], [45]. Στο κάτω θάλαμο 100 μg /mL Matrigel (BD Biosciences, Bedford, ΜΑ) μόνο ή αναμεμιγμένο με μετφορμίνη ή /και προσετέθη FUOX. ΗΤ-29 ή CR ΗΤ-29 κύτταρα (5 × 10

4) κύτταρα φορτώθηκαν στον άνω θάλαμο. Οι δύο θάλαμοι χωρίζονται από ένα φίλτρο πολυανθρακικού 8 μ μέγεθος πόρων και επωάζονται σε επωαστήρα ιστοκαλλιέργειας 37 ° C για 16 ώρες, μετά από το οποίο αφαιρέθηκε το φίλτρο, τα κύτταρα στην κορυφή του φίλτρου σκουπίζεται και μετανάστευσαν κύτταρα ήταν σταθερό, χρωματίζονται χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο Χέμα 3 σετ λεκέ (Fisher Scientific Company, Pittsburgh, PA). Τα κύτταρα τα οποία μετανάστευσαν φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας Ολύμπου 45 μικροσκόπιο υποστήριξη μιας Spot κάμερα Ιδέα και τα μεταναστεύσει κύτταρα ανά πεδίο μετρήθηκαν. Κάθε δοκιμασία διεξήχθη τρεις φορές και 6 φρεάτια χρησιμοποιήθηκαν για κάθε θεραπεία.

Στην επόμενη σειρά πειραμάτων, η μετανάστευση του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων προς ενδοθηλιακά κύτταρα μετρήθηκε. Σε αυτή την έρευνα, enodothelial κύτταρα ή ΗΤ-29 /CR κύτταρα ΗΤ-29 (2,4 χ 10

4) προ-σημασμένο με βιώσιμο λεκέ D; ή με Dil αντίστοιχα (Invitrogen), πλύθηκαν δύο φορές με πλήρες μέσο και σπάρθηκαν σε κάθε θάλαμο του ενθέτου κυτταρικής καλλιέργειας (ibidi GmbH). Μετά από 24 ώρες, το ένθετο κυτταροκαλλιέργειας απομακρύνθηκε και παρατηρήθηκε η μετανάστευση των συν-καλλιέργειες προς το άλλο για την επούλωση τραυμάτων. Σε μερικούς πολιτισμούς, μετφορμίνη και /ή FuOx προστέθηκε κατά τη στιγμή της αφαίρεσης του ενθέτου. Τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν σε 0, 24 και 48 ώρες μετά την απομάκρυνση του ενθέτου.

Western ανάλυση κηλίδος

ανάλυση στυπώματος Western έγινε σύμφωνα με το πρότυπο πρωτόκολλο [46]. Εν συντομία, τα κύτταρα διαλυτοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM Tris HCI, ρΗ 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton Χ100, 0,5% ΝΡ40, 25 μg /mL κάθε απροτινίνης, λευπεπτίνη και πεπστατίνη, 1 × φωσφατάση κοκτέιλ αναστολέα (Sigma). Μετά τη διαύγαση στα 10.000 g για 30 λεπτά, το υπερκείμενο χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση των πρωτεϊνών. η συγκέντρωση της πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με το κιτ προσδιορισμού πρωτεΐνης Bio-Rad ((Bio-Rad, Hercules, CA) και κλάσματα που περιέχουν 25 μg πρωτείνης διαχωρίστηκαν με SDS-πολυακρυλαμιδίου ηλεκτροφόρηση πηκτής. Μετά την ηλεκτροφόρηση, οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Millipore) με ηλεκτροκηλίδωση και υποβλήθηκε σε ανάλυση στυπώματος Western με τη συνιστώμενη αραίωση του πρωτογενούς αντισώματος. Μετά από πλύσεις οι κηλίδες αντέδρασαν με δευτερογενές μείγμα αντισώματος που περιέχει 1:2500 αραιώσεις του κατάλληλου δευτερεύοντος αντισώματος συζευγμένου με υπεροξειδάση αρμορακίας (Amersham Biosciences). οι ζώνες πρωτεΐνης έγιναν ορατές χρησιμοποιώντας ένα εμπορικά διαθέσιμο κιτ ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (Amersham Biosciences). Τα στυπώματα επίσης ανοσο-αντιδρά με μια αραίωση 1:5000 αντι-ακτίνης μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) για την εξομάλυνση για μεταβολή στην πρωτεϊνική φόρτωση.

Απομόνωση RNA και Ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ανάλυση

Ολικό RNA εξήχθη από τη γονική και CR κύτταρα κατεργασμένα με μετφορμίνη ή /και FuOx για 48 ώρες χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο TRIZOL (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ολικό RNA υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DNase1 για την απομάκρυνση μολυσματικών γενωμικού DNA, στη συνέχεια καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας miRNAeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). Η συγκέντρωση του RNA μετρήθηκε σε οπτική πυκνότητα 260 nm.

Για να ποσοτικοποιηθεί miR-21 και miR-145, πρώτα η σύνθεση του cDNA διεξήχθη χρησιμοποιώντας Taqman microRNA κιτ αντίστροφη μεταγραφή (Applied Biosystems, Foster City, CA) . Τα miRNA RT-PCR εκκινητές για miR21, miR145 και ενδογενείς τον έλεγχο RNU6B αγοράστηκαν από την Applied Biosystems. Σε πραγματικό χρόνο ανάλυση qRT-PCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας Applied Biosystems 7500 PCR πραγματικού χρόνου του συστήματος. Το μίγμα PCR περιείχε Taqman 2 × καθολική PCR Master Mix υποβλήθηκαν σε επεξεργασία ως ακολούθως: 95 ° C για 10 λεπτά που ακολουθείται από 40 κύκλους των 95 ° C για 15 sec και 60 ° C για 60 sec. Σήμα που συλλέγονται στο ακραίο σημείο του κάθε κύκλου. Η έκφραση του γονιδίου ΔΟ

τιμές Τ για κάθε δείγμα υπολογίζεται από την κανονικοποίηση με RNU6B εσωτερικού ελέγχου, και των σχετικών τιμών ποσοτικοποίηση χαράχθηκαν.

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

αναστολές Ενιαία κελί της μετφορμίνης και /ή FuOx επεξεργασμένο ή κύτταρα CR ΗΤ-29 υποβλήθηκαν σε άμεση χρώση ανοσοφθορισμού που ακολουθείται από ανάλυση κυτταρομετρίας ροής σύμφωνα με πρότυπο πρωτόκολλο [38]. Εν συντομία, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν με PBS. μισό εκατομμύριο κύτταρα αιωρήθηκαν σε 90 μΐ PBS που περιέχει 0.5% BSA. Μετά από 10 λεπτά επώασης σε θερμοκρασία δωματίου, 10 μl φθοροφόρο (PE-Cy7 ή PerCP-Cy5) συζευγμένο μυρμήγκι-ανθρώπινο CD44 ή CD166 αντίσωμα προστέθηκε και επωάστηκε για 30 λεπτά στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου. Τα δείγματα στη συνέχεια πλύθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μια ντίβα FACS (BD, San Jose, CA). Τα κύτταρα βάφονται με IgG2b (ισοτύπου αρνητικού ελέγχου) υπηρέτησε ως gating ελέγχου. Το ποσοστό των CD44

+ /CD166

+ /χαμηλή κυττάρων προσδιορίστηκε με βάση την ένταση φθορισμού-φάσματα.

Η ανάπτυξη των όγκων σε ποντίκια SCID

Για να προσδιορίσετε αν ο συνδυασμός μετφορμίνης και FuOx θα ήταν ένα αποτελεσματικό θεραπευτική στρατηγική για τους όγκους του παχέος εντέρου, SCID μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντίκια του όγκου του παχέος εντέρου χρησιμοποιήθηκε. Για τη δημιουργία όγκων του παχέος εντέρου, τέσσερις εβδομάδες θηλυκά ποντίκια SCID, αγοράστηκαν από την Taconic Laboratory, ενέθηκαν s.c. είτε με 1 × 10

6 CR HCT-116 ή CR ΗΤ-29 κύτταρα αιωρούνται σε 100 μΙ Matrigel. Στη συνέχεια χωρίζονται σε 2 υποομάδες των 4 ποντικών και αγωγή με μετφορμίνη ξεκίνησε 7 ημέρες μετά τον εμβολιασμό των κυττάρων σε μία υποομάδα. Μετφορμίνη (RIOMET 500 mg /5 ml? Ranbaxy Laboratories, Princeton, NJ) διαλύθηκε σε 100 ml πόσιμου νερού για την επίτευξη του δοσολογία των 200 mg /kg σωματικού βάρους. Το νερό αλλάχθηκε καθημερινά και μετρήθηκαν για την πρόσληψη νερού. θεραπεία μετφορμίνη συνεχίστηκε για 5 εβδομάδες έως ότου θυσιάστηκαν τα ποντίκια. ομάδα μετφορμίνη εγχύθηκε επίσης ΙΡ με ένα μίγμα 25 mg /kg 5-φθοριοουρακίλη και 2 mg /kg οξαλιπλατίνης μια φορά την εβδομάδα για 3 εβδομάδες. Οι όγκοι μετρήθηκαν μία φορά την εβδομάδα και οι όγκοι των όγκων υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τον τύπο: Όγκος όγκου = μήκος Χ πλάτος Χ πλάτος /2. Τα ποντίκια παρακολουθούνται τακτικά για τυχόν σημάδια της ταλαιπωρίας. Όλα τα πειράματα σε ζώα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με Θεσμικών φροντίδας του κράτους Πανεπιστημίου Wayne των ζώων και την Επιτροπή Χρήση (IACUC) εγκεκριμένο πρωτόκολλο # A02-02-13. Πρόνοιας Διασφάλισης ζώο # A3310-01.

απομόνωση απλού κυττάρου από το ξενομόσχευμα

Μικρά τμήματα (5-10 mg) του όγκου, που παράγεται σε SCID ποντίκια με CR HCT-116 και CR ΗΤ -29 κυττάρων, όπως περιγράφεται παρακάτω πλύθηκαν εκτεταμένα σε 1 × PBS που περιέχει 10% αντιβιοτικό /αντιμυκητιασικό (ΑΒ /AM) και στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύκτα σε ελάχιστα βασικά μέσα Dulbecco (DMEM /F12) που περιέχει 5% αντιβιοτικό /αντιμυκητιασικό στους 4 ° C. Ο ιστός κόβεται σε λεπτά κομμάτια χρησιμοποιώντας αποστειρωμένο νυστέρι και μετά υποβλήθηκε σε πέψη με 1.5 mg /ml κολλαγενάση Ι (Sigma-Aldrich) και 20 μg /ml υαλουρονιδάση Ι (Sigma Aldrich) υπό ήπια ανάδευση για 2-3 ώρες στους 37 ° C. Η πέψη ιστός διηθείται μέσω 40 μ φίλτρου και φυγοκεντρήθηκε στις 1200 rpm για 5 λεπτά. Το υπερκείμενο (που περιέχει νεκρά κύτταρα καθώς και τα κύτταρα του λίπους) απορρίφθηκε και τα κύτταρα (pellet) πλύθηκαν τρεις φορές με DMEM media /F12 που περιείχε 5% ΑΒ /AM. Τα κύτταρα αιωρήθηκαν σε ορίστηκε προηγουμένως βλαστοκυττάρων μέσα ενημέρωσης.

Στατιστική ανάλυση

Όλα

in vitro

πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές εις τριπλούν. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Microsoft Excel. Οι τιμές ρ υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας 2 δείγμα t-test, υποθέτοντας άνισες διακυμάνσεις. Αξίες & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

Η μετφορμίνη και η συνδυασμένη θεραπεία FuOx αναστέλλει την ανάπτυξη των χημειο-ανθεκτικά ΗΤ-29 και HCT-116 κυττάρων σε συνέργεια

Για να εξεταστεί. εάν η μετφορμίνη δρα συνεργιστικά με FuOx να αναστέλλουν την ανάπτυξη των χημειο-ανθεκτικών κυττάρων, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες δόσεις μετφορμίνης και FuOx, κάθε μόνα τους ή σε συνδυασμό. Μετά από 72 ώρες, η κυτταρική ανάπτυξη προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Οι καμπύλες απόκρισης δόσης Εικ 1Α & amp? Β δείχνουν ότι ενώ 10 mM μετφορμίνη ή 8 × (200 μΜ FU και 5 μΜ οξαλιπλατίνη) FuOx μόνη προκάλεσε -40 και 60% αναστολή, μαζί προκάλεσε μία αναστολή ~ 70% και 80% σε CR ΗΤ-29 και CR HCT- 116 κύτταρα, αντιστοίχως. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ο συνδυασμός μετφορμίνης και FuOx δρα συνεργικά για να αναστείλουν την ανάπτυξη τόσο της CR HCT-116 και CR ΗΤ-29 κύτταρα. Όλα τα επακόλουθα πειράματα πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας έναν από τους χημειο-ανθεκτικού καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές γραμμές.

(Α) και CR κύτταρα ΗΤ-29 (Β) που παράγεται με τη μέθοδο σταθερής αναλογίας. Κλάσμα των κυττάρων που επηρεάζονται από συνδυασμό των δύο φαρμάκων (σταθερή αναλογία) ήταν υψηλότερο από οποιονδήποτε παράγοντα μεμονωμένα. Φα αντιπροσωπεύει το κλάσμα των κυττάρων που επηρεάζονται σε απόκριση στη θεραπεία. τιμές Fa χρησιμοποιήθηκαν για τη διεξαγωγή ανάλυσης συνέργεια με λογισμικό CalcuSyn όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. C. Σχετική επιβίωση των κυττάρων ΗΤ-29 CR παρουσία αυξανόμενων δόσεων της μετφορμίνης με και χωρίς 2 χ FuOx. Η συνδυασμένη θεραπεία είναι πιο αποτελεσματική σε όλα τα συγκεντρώσεις. VEH: μόνο όχημα. Κάθε αγωγή διεξήχθη εις τετραπλούν, ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± τυπική απόκλιση. * Τιμή p & lt?. 0.05

Η

Τα κλάσματα των κυττάρων επηρεάζεται σε απόκριση σε κάθε θεραπεία, χρησιμοποιήθηκε για να εκτελέσει την ανάλυση συνέργεια με το λογισμικό CalcuSyn. Η CI όπως διατυπώθηκε από το λογισμικό, αποκάλυψε τιμές υποδεικνύοντας μέτρια συνεργιστική αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο παραγόντων στο CR HCT-116 κυττάρων σε δόσεις μετφορμίνης 5 mm και άνω και μια ισχυρή συνέργεια σε 10 και 20 mM μετφορμίνη στα κύτταρα CR ΗΤ-29 (Πίνακας 1). Δεν συνέργεια παρατηρήθηκε στα γονικά κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Δεδομένου ότι οι χημειο-ανθεκτικά κύτταρα διατηρήθηκαν σε 2 × FuOx (50 μΜ FU, 1,25 μΜ οξαλιπλατίνη), την επόμενη μελετήθηκε η επίδραση των δόσεων της μετφορμίνης που κυμαίνονται από 0,6 στα 20 mM σε συνδυασμό με 2 × FuOx στην ανάπτυξη των CR HT- 29 κύτταρα. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι σε όλα τα χρησιμοποιούμενες συγκεντρώσεις, η θεραπεία συνδυασμού ήταν περισσότερο αποτελεσματική στην αναστολή ανάπτυξης κυττάρου από ότι μετφορμίνη μόνο (Σχ. 1 C). Οι χημειο-ανθεκτικά κύτταρα ήταν περισσότερο ανθεκτικά στην FuOx και πιο ευαίσθητα σε θεραπεία συνδυασμού σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η

μετφορμίνη και θεραπεία συνδυασμού FuOx αναστέλλει τον σχηματισμό colonosphere (αριθμός βλαστοκυττάρων /βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν)

έχει αναφερθεί ότι οι FuOx επιζώντα κύτταρα εμπλουτισμένα σε ΚΕΠ /CSLCs που αναπτύσσονται ως μεγάλα, στρογγυλά ασύνδετος κυμαινόμενο αποικίες σφαιροειδές (colonospheres), όταν καλλιεργούνται σε μέσο ελεύθερο βλαστοκυττάρων ορού σε σχετικά χαμηλή πυκνότητα [38] [29]. Σχ. 2Α και Β (αριστερό πάνελ) δείχνουν ότι με την παρουσία 2 × FuOx, αυξανόμενες συγκεντρώσεις της μετφορμίνης μειώθηκε ο αριθμός και το μέγεθος των colonospheres. Η μετφορμίνη προκάλεσε επίσης προσκόλληση και αποσυντεθεί τα colonospheres (Σχ. 2Α και Β (δεξιός πίνακας)) Όταν τρυψινοποιήθηκαν και σπάρθηκαν με την παρουσία της μετφορμίνης + FuOx οι colonospheres, αύξηση του αριθμού των σφαιρών χάνονται stem-σαν τους ιδιότητες, όπως αυτοί φαίνονται να αποδίδουν στον πυθμένα του πιάτου

Α & amp? Β:. Σχηματισμός πρωτογενούς colonospheres παρουσία μετφορμίνης και FuOx (αριστερό πάνελ). Διέγερση διαφοροποίησης και την προσάρτηση του colonospheres παρουσία μετφορμίνης /FuOx (δεξί πάνελ). Α: γραφική αναπαράσταση των αριθμών Β: μικροφωτογραφίες αντιπροσωπευτικών σφαίρες. C:. Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των CD44 και CD166 θετικών κυττάρων μετά από θεραπεία με μετφορμίνη /FuOx

Η

Αξιολογήσαμε επίσης τις ιδιότητες του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων των κατεργασμένων κυττάρων πραγματοποιώντας ένα ακραίο περιορισμό δοκιμασία αραίωσης (ΕΛΔΑ). CR ΗΤ-29 κύτταρα κατεργάστηκαν με μετφορμίνη + FuOx επί 72 ώρες και σπάρθηκαν σε κανονικό μέσο βλαστοκυττάρων. Ενώ η μετφορμίνη μείωσε μόνη της συχνότητας να σχηματίσουν colonospheres από 1,5-2 πτυχώσεις, η θεραπεία συνδυασμού μείωσε κατά 7-8 διπλώνει ότι το μη επεξεργασμένο μάρτυρα (Πίνακας 2).

Η

Για να καθοριστεί εάν και σε ποιο βαθμό τα τρέχουσες στρατηγικές θεραπείας θα μπορούσε να επηρεάσει την αναλογία των ΚΕΠ /CSLCs, ροής κυτομετρική ανάλυση εκτελέσθηκε ακολουθώντας τη μετφορμίνη ή /και θεραπεία FuOx του CR ΗΤ-29 κύτταρα. Τα αποτελέσματα έδειξαν μια μείωση (-65%) σε CD44

υψηλή /CD166

χαμηλό πληθυσμό κυττάρων φαινότυπο, σε σύγκριση με FuOx αντιμετωπίζονται ελέγχους. Αντίθετα, το ποσοστό των CD44

υψηλή /CD166

χαμηλή κυττάρων αυξήθηκε 5,12 έως 7,34% με την παρουσία FuOx, η οποία θα μπορούσε, εν μέρει, να οφείλεται σε θάνατο των ευαίσθητων κυττάρων FuOx. θεραπεία συνδυασμού μείωσε το ποσοστό των CD44

υψηλή /CD166

χαμηλή κύτταρα στο 2,8% (Σχήμα 2C). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι ο συνδυασμός μετφορμίνης και FuOx μειώνει όχι μόνο CR κόλον CSC /CSLC πληθυσμού, αλλά επίσης μειώνει βλαστικών κυττάρων τους ιδιότητες.

μετφορμίνη και FuOx συνδυαστική θεραπεία αναστέλλει την κυτταρική μετανάστευση

η κυτταρική μετανάστευση προσδιορίστηκε με Boyden θάλαμο (σχήμα 3Α) και την επούλωση των πληγών (Σχήμα 3Β) δοκιμασίες. δοκιμασία Boyden θάλαμο δείχνει ότι ενώ τα γονικά κύτταρα ΗΤ-29 δείχνουν περιορισμένη μετανάστευση, CR ΗΤ-29 κύτταρα εμφανίζουν έντονη μετανάστευση προς Matrigel. Ωστόσο, η μετφορμίνη βρέθηκε να αναστέλλει τη μετανάστευση σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο, και η θεραπεία συνδυασμού προκάλεσε περαιτέρω μείωση: στα 10 mM μετφορμίνη + FuOx, ~ 6 φορές αναστολή της μετανάστευσης παρατηρήθηκε σε CR ΗΤ-29 κύτταρα (σχήμα 3Α)

η μετφορμίνη θεραπεία /FuOx μείωσε τη μετανάστευση των CR ΗΤ-29 κύτταρα. Κάθε σημείο αντιπροσωπεύει μέσο όρο 6 αναγνώσεις. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (Α). Πληγή δοκιμασία επούλωσης χρησιμοποιώντας ενδοθηλιακών (επάνω /κόκκινο) και CRC (κάτω /πράσινο). Επάνω αριστερά πάνελ: πληγή σε 0 ώρα? κάτω αριστερό πλαίσιο: πλήρης επούλωση του τραύματος σε 48 ώρες στο CR ΗΤ-29 κύτταρα? Επάνω δεξιά πίνακας: μερική επούλωση τραύματος σε ΗΤ-29 κυττάρων μετά από 48 ώρες? κάτω δεξιά πάνελ: ατελής επούλωση τραύματος σε CR ΗΤ-29 κυττάρων παρουσία 5 mM μετφορμίνης /FuOx στις 48 ώρες (Β). Η ανάλυση στυπώματος Western της μετφορμίνης /FuOx επεξεργασμένα κύτταρα CR Η29 υποδεικνύοντας μειωμένη pAkt επίπεδα (C)? σχετικές μεταβολές στην φωσφο-Akt (pAkt) υπολογίστηκαν ως αναλογία pAkt /Akt μετά από κανονικοποίηση σε β-ακτίνη, η οποία χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. * P & lt?. 0.05

Η

Οι επουλωτικές των πληγών δοκιμασία πραγματοποιήθηκε για τη μελέτη της μετανάστευσης των γονικών και CR ΗΤ-29 κυττάρων προς ενδοθηλιακά κύτταρα. Σύκο. 3Β έδειξε CR ΗΤ-29 και ενδοθηλιακά κύτταρα μεταναστεύουν προς την άλλη. Με 48 ώρες, το τραύμα ήταν εντελώς θεραπευτεί από κύτταρα κόλου CR, ενώ γονικών κυττάρων έδειξαν μόνο ~46 κλείσιμο% τραύματος (Σχήμα 3Β). Η θεραπεία με μετφορμίνη + FuOx επιβράδυνε τη διαδικασία επούλωσης του τραύματος. Ενώ παρατηρήθηκε 54% και το πλήρες κλείσιμο της πληγής σε μη επεξεργασμένα CR κύτταρα ΗΤ-29 σε 24 και 48 ώρες αντίστοιχα, μετφορμίνη + θεραπεία FuOx οδήγησε σε κλείσιμο του τραύματος 46 και 77% στις 24 και 48 ώρες αντίστοιχα. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν περαιτέρω ότι η μετφορμίνη + FuOx συνδυασμός είναι αποτελεσματικός στη συγκράτηση των ογκογόνο /μεταναστευτικών /επεμβατική ιδιότητες χημειο-ανθεκτικά κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου.

Έχει αναφερθεί ότι Akt είναι ένα ουσιαστικό κατάντη στόχος της PI3K για η αναδιαμόρφωση των νημάτων ακτίνης για την αύξηση της κυτταρικής μετανάστευσης [47]. Αυτό μας ώθησε να αναλύσουμε την έκφραση /pAkt Akt στην μετφορμίνη και FuOx επεξεργασμένα κύτταρα. Η ανάλυση στυπώματος Western απεκάλυψε μειωμένα επίπεδα pAkt σε κατεργασμένα κύτταρα, σε σύγκριση με τους ελέγχους (Σχ. 3). Προτείνουμε PI3K /Akt μονοπατιού σηματοδότησης μπορεί να παίζει ρόλο στη ρύθμιση της μετφορμίνης /FuOx που προκαλείται από την αναστολή της κυτταρικής μετανάστευσης.

Η μετφορμίνη και η συνδυασμένη θεραπεία FuOx μειώνει miRNA21 και αυξάνει την έκφραση miR145

Κατά την άποψη από την ιδέα ότι το miR-21 είναι ογκογόνο, ενώ miR-145 είναι κατασταλτικό όγκου, έχουμε αναλύσει τα επίπεδά τους στην χημειο-ανθεκτικά κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου. Βρήκαμε τα επίπεδα miR21 να είναι υψηλότερη σε CR καρκινικά κύτταρα κόλου [33] και miR145 να είναι χαμηλότερο, σε σύγκριση με τις αντίστοιχες γονικού ελέγχου (μη δημοσιευμένα δεδομένα). Αποτελέσματα της ποσοτικής σε πραγματικό χρόνο PCR ανάλυση έδειξε, ενώ μετφορμίνης είτε μόνη της είτε μαζί με FuOx προκάλεσε σημαντική μείωση του miR-21expression, αυτό που επάγεται miR-145, όταν συγκρίνεται με τις αντίστοιχες τους ελέγχους τους (Εικ. 4). Αρκεί να αναφέρουμε ότι οι τιμές qRT-PCR για miR-21 και miR-145 ομαλοποιήθηκαν στα επίπεδα του RNU6B

C:. Μετφορμίνης /θεραπεία FuOx του CR HCT-116 κύτταρα αναστέλλει μεταγραφική δραστηριότητα του TCF /LEF. D: ανάλυση στυπώματος Western δείχνει μία μειωμένη έκφραση β-κατενίνης και c-myc σε μετφορμίνης /FuOx αγωγή CR HCT-116 κύτταρα. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. * Ρ & lt?. 0.05

Η

Καθώς η σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των καρκινικών βλαστικών κυττάρων του παχέος εντέρου, μελετήσαμε την επόμενη την επίδραση της θεραπείας μετφορμίνης για δραστικότητα β-κατενίνης, έκφρασή του και τα επίπεδα της πρωτεΐνης-στόχου c-myc του. Η θεραπεία συνδυασμού μετφορμίνης και FuOX προκάλεσε -50% μείωση στην μεταγραφική δραστικότητα του TCF /LEF σε CR HCT-116 κύτταρα, σε σύγκριση με τους χωρίς θεραπεία ελέγχους (Σχ 4C). ανάλυση κηλίδας Western έδειξε αξιοσημείωτη μείωση στα επίπεδα της ολικής β-κατενίνης, καθώς και c-myc έκφραση σε CR HCT-116 κύτταρα. Λαμβανόμενα μαζί, τα αποτελέσματα υποδηλώνουν μια αναστολή της σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης σε χημειο-ανθεκτικά κύτταρα καρκίνου κόλου σε απάντηση στην θεραπεία συνδυασμού μετφορμίνης και FuOx.

μετφορμίνη και FuOx συνδυαστική θεραπεία επιβραδύνει την ανάπτυξη του όγκου σε ποντικούς SCID

Για να εξεταστεί η θεραπευτική αποτελεσματικότητα του συνδυασμού του metform και FuOx, ο SCID μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντίκια του όγκου του παχέος εντέρου χρησιμοποιήθηκε. CR HCT-116 ή CR ΗΤ-29 κύτταρα εγχύθηκαν υποδορίως στην περιοχή του πλευρού ποντικών SCID. Μετά σχηματίστηκαν ψηλαφητών όγκων, μία ομάδα τροφοδοτήθηκε μετφορμίνης στο πόσιμο νερό και εγχύθηκε επίσης (ί.ρ) με FuOx, μία φορά την εβδομάδα για 3 εβδομάδες. Η ανάπτυξη του όγκου μετράται με τον υπολογισμό του όγκου του όγκου για 34 ημέρες. Ξενομοσχεύματα που σχηματίζεται από CR HCT-116 κύτταρα έδειξαν μία γραμμική αύξηση μέχρι 27 ημέρες, μετά την οποία η ανάπτυξη του όγκου επιβραδύνθηκε. Ένα παρόμοιο πρότυπο αύξησης παρατηρήθηκε σε μετφορμίνης /FuOx ποντίκια με αγωγή, αν και η αύξηση ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε σύγκριση με τους ελέγχους. Μέχρι την ημέρα 34 μετά την έγχυση, υπήρξε μια στατιστικά σημαντική (σχεδόν 50%) μείωση του μεγέθους του όγκου σε μετφορμίνης /FuOx αγωγή ποντίκια (Σχήμα 5Α αριστερό πάνελ). CR ΗΤ-29 κύτταρα εγχύθηκαν ποντικοί εμφάνισαν βραδύ ρυθμό ανάπτυξης του όγκου αρχικά. Ωστόσο, μια έκρηξη ανάπτυξης παρατηρήθηκε σε ζώα ελέγχου μετά από 27 ημέρες. Από την άλλη πλευρά, η μετφορμίνη /FuOx αγωγή ποντίκια έδειξαν ταχεία μείωση στον όγκο του όγκου μετά από 27 ημέρες.

Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα. * P & gt? 0,05. Πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR σε RNA που εκχυλίζεται από κύτταρα που απομονώνονται από το CR ΗΤ-29 όγκου (Β). επίπεδα CD44 μειώθηκαν και τα επίπεδα ΟΚ20 αυξήθηκε σε μετφορμίνης /ξενομοσχεύματα FuOx θεραπεία. σχηματισμός Colonosphere στα κύτταρα που απομονώθηκαν από CR-ΗΤ-29 ξενομοσχεύματα (C).

Η

Οι όγκοι συλλέχθηκαν, και εναιωρήματα μονών κυττάρων καλλιεργήθηκαν σε μέσο βλαστοκυττάρων. Σε πραγματικό χρόνο ανάλυση qPCR διεξήχθη, η οποία έδειξε μία σημαντική μείωση σε CD44 και αύξηση των επιπέδων mRNA ΟΚ20 σε κύτταρα όγκου σχηματίζουν /FuOx-ποντίκια με αγωγή με μετφορμίνη (σχήμα 5Β).