Αφηρημένο

θεραπεία απόσπασης ανδρογόνων είναι η κύρια θεραπεία για μεταστατικό καρκίνο του προστάτη. Ωστόσο, το 80-90% των ασθενών που λαμβάνουν θεραπεία αφαίρεσης ανδρογόνου τελικά αναπτύσσουν υποτροπιάζουσες όγκων σε 12-33 μήνες μετά τη θεραπεία με διάμεση συνολικό χρόνο επιβίωσης των 1-2 ετών μετά από υποτροπή. LNCaP είναι ένα συνήθως χρησιμοποιούμενο κυτταρική γραμμή εγκατεστημένος από ανθρώπινο λεμφαδένα μεταστατικής αλλοιώσεως προστατικού αδενοκαρκινώματος. Έχουμε προηγουμένως συσταθεί δύο υποτροπιάζουσα υποδοχέα ανδρογόνων (AR) πλούσια σε ανδρογόνα ανεξάρτητο LNCaP υποσειρές 104-R1 (ανδρογόνων απεμπλουτισμένου για 12 μήνες) και 104-R2 κύτταρα (ανδρογόνων απεμπλουτισμένου για 24 μήνες) από AR-θετικά εξαρτώμενων από ανδρογόνα LNCaP 104-S κύτταρα. LNCaP 104-R1 και 104-R2 μιμείται τις υποτροπή των όγκων AR-θετική ορμονοάντοχου σε ασθενείς που λαμβάνουν θεραπεία απόσπασης ανδρογόνων. θεραπεία ανδρογόνων διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων 104-S, αλλά προκαλεί αναστολή της αναπτύξεως και διακοπή κύκλου κυττάρου σε G1 104-R1 και τα κύτταρα 104-R2. Ερευνήσαμε την έκφραση διαφορά προφίλ πρωτεΐνης μεταξύ LNCaP 104-S vs. LNCaP 104-R1, 104-R2, PC-3, και DU-145 κύτταρα καθώς επίσης εξέτασε την ευαισθησία αυτών των κυττάρων καρκίνου του προστάτη σε διαφορετικά φάρμακα χημειοθεραπείας και μικρού μορίου αναστολέων. Σε σύγκριση με τα κύτταρα 104-S, 104-R1 και 104-R2 κύτταρα εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα πρωτεΐνης του AR, PSA, c-myc, Skp2, BCL-2, ρ53, ρ-MDM2 S166, Rb, και ρ-Rb S807 /811 . Το 104-R1 και 104-R2 κύτταρα εκφράζουν υψηλότερη αναλογία ρ-Ακί S473 /Akt, ρ-EGFR /EGFR, και ρ-Src /Src, αλλά χαμηλότερη αναλογία του ρ-ΕΚΚ /ERK από τα κύτταρα 104-S. PC-3 και DU-145 κύτταρα εκφράζουν υψηλότερα c-myc, Skp2, Akt, Akt1 και φωσφο-EGFR αλλά λιγότερο φωσφο-Akt και φωσφο-ΕΚΚ. Η υπερέκφραση του Skp2 αυξημένη αντίσταση των κυττάρων LNCaP σε φάρμακα χημειοθεραπείας. Η πακλιταξέλη, ανδρογόνων, και αναστολείς για PI3K /Akt, EGFR, Src, ή Bcl-2 φαίνεται να είναι εν δυνάμει επιλογές για τη θεραπεία του προχωρημένου καρκίνων του προστάτη. Η μελέτη μας παρέχει λογική για στόχευση Akt, EGFR, Src, Bcl-2, και Ar σηματοδότησης ως θεραπεία για AR-θετικών όγκων του προστάτη υποτροπιάσει μετά ορμονοθεραπεία.

Παράθεση: Lin Η-Ρ, Lin C-Y, Χσιάο Ρ-Η, Wang H-D, Sheng Jiang S, Hsu J-M, et al. (2013) Διαφορά Protein Expression Προφίλ και Ανταπόκρισης Χημειοθεραπεία ναρκωτικά σε διαφορετικά στάδια εξέλιξη των LNCaP sublines και άλλα κύτταρα του Ανθρώπου του καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 8 (12): e82625. doi: 10.1371 /journal.pone.0082625

Επιμέλεια: Antimo Migliaccio, ΙΙ Università di Napoli, Ιταλία

Ελήφθη: 16 του Ιουλίου του 2013? Αποδεκτές: 25η Οκτωβρίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 5 Δεκ, 2013

Copyright: © 2013 Lin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις CS-101-PP-14 και CS-102-PP-14 (Εθνικό Σύστημα Υγείας Ερευνητικά Ινστιτούτα), NSC 99-2320-Β-400-015-my3 και NSC 101-2325-B-400-014 ( εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο), και DOH101-TD-C-111-004 (Υπουργείο Υγείας) από την Ταϊβάν για CPC και DOH102-TD-Μ-111 – 102001 (Υπουργείο Υγείας, Ταϊβάν) για HJK. CYL υποστηρίζεται από DOH101-TD-C-111-004. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Η αντίστοιχη συγγραφέας Δρ Chih-Pin Chuu είναι μέλος συντακτικής επιτροπής PLoS ONE, ωστόσο, επιβεβαιώνουμε ότι αυτό δεν μεταβάλλει προσήλωση μας σε όλες τις πολιτικές PLoS ONE σχετικά με την κοινοχρησία δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Σύμφωνα με τα τελευταία στατιστικά στοιχεία το 2008 (βάση δεδομένων GLOBOCAN 2008, έκδοση 1.2 ), ο καρκίνος του προστάτη είναι η δεύτερη πιο συχνά διαγιγνώσκεται καρκίνος των ανδρών και η πέμπτη πιο κοινή μορφή καρκίνου συνολική στον κόσμο. Τα στατιστικά στοιχεία της Αμερικανικής Αντικαρκινικής Εταιρείας εκτιμάται ότι 238.590 νέες περιπτώσεις καρκίνου του προστάτη θα διαγνωστούν και περίπου 29.720 άνθρωποι θα πεθάνουν από καρκίνο του προστάτη-ειδική θανάτων στις Ηνωμένες Πολιτείες το 2013. Η συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου του προστάτη αυξάνεται σταθερά σε όλες σχεδόν τις χώρες [1]. Ο καρκίνος του προστάτη διαγιγνώσκεται σε πολύ λίγους ανθρώπους ηλικίας κάτω των 50 ετών. Περίπου το 85% των ασθενών που διαγιγνώσκονται είναι άνω των 65 ετών [1]. Η χειρουργική επέμβαση είναι συχνά επιτυχείς για όργανο-περιορισμένο καρκίνο του προστάτη. Θεραπεία απόσπασης ανδρογόνων, προτείνει ο Δρ Charles B. Huggins, είναι η κύρια θεραπεία για μεταστατικό καρκίνο του προστάτη. Ωστόσο, οι περισσότεροι ασθενείς με καρκίνο του προστάτη που λαμβάνουν τη θεραπεία ανδρογόνων θα αναπτύξει τελικά υποτροπιάζουν, ευνουχισμός ανθεκτικά όγκους εντός 1-3 ετών μετά τη θεραπεία με διάμεση συνολικό χρόνο επιβίωσης των 1-2 ετών μετά από υποτροπή [2,3]. Δεν υπάρχει αποτελεσματική καθιερωμένη θεραπεία για την υποτροπιάζουσα προχωρημένους καρκίνους του προστάτη. Η χημειοθεραπεία εφαρμόζεται συνήθως για τη θεραπεία του μεταστατικού ορμόνες ανθεκτικό καρκίνο προστάτη [4]. Συνήθως χρησιμοποιούνται χημειοθεραπευτικών φαρμάκων για καρκίνους του προστάτη περιλαμβάνουν ετοποσίδη, πακλιταξέλη, βινμπλαστίνη, και μιτοξαντρόνη. Η ετοποσίδη και η μιτοξαντρόνη είναι αναστολείς της τοποϊσομεράσης τύπου II [4,5]. Βινβλαστίνη δεσμεύει τουμπουλίνης και αναστέλλει τη συναρμολόγηση των μικροσωληναρίων [4]. Η πακλιταξέλη διαταράσσει μιτωτική συναρμολόγηση ατράκτου, χρωμόσωμα διαχωρισμό, και την κυτταρική διαίρεση. Η πακλιταξέλη σταθεροποιεί επίσης το πολυμερές μικροσωληνίσκων και το προστατεύει από την αποσυναρμολόγηση [4]. Χημειοθεραπεία φαρμακευτικές αγωγές οδηγήσει σε μείωση του PSA, ραδιογραφικών απόκριση, βελτίωση του πόνου, και τη βελτίωση της ουρολογικών συμπτωμάτων σε ένα υπο-ομάδα ασθενών [4]. Ωστόσο, αυτά τα φάρμακα εμφανίζουν μικρή επίδραση στην παράταση της επιβίωσης [4]. Ανεπιθύμητες παρενέργειες αυτών των χημειοθεραπευτικών παραγόντων περιλαμβάνουν τοξικές θανάτους, εγκεφαλικά επεισόδια, θρόμβωση, ουδετεροπενία, οίδημα, δύσπνοια, κακουχία, κόπωση και [4]. Εναλλακτικές θεραπείες έχουν ανάγκη.

LNCaP είναι ένας συχνά χρησιμοποιούμενος κυτταρική γραμμή εγκατεστημένος από ανθρώπινο λεμφαδένα μεταστατικής αλλοιώσεως προστατικού αδενοκαρκινώματος [6]. LNCaP κύτταρα εκφράζουν υποδοχέα ανδρογόνων (AR) και ειδικό αντιγόνο προστάτη (PSA). Προηγουμένως, καλλιεργήσαμε ανδρογόνου LNCaP ευαίσθητη 104-S κύτταρα σε συνθήκες ανδρογόνα εξαντλημένο

in vitro

να μιμηθούν τους ασθενείς που λαμβάνουν θεραπεία απόσπασης ανδρογόνων [7-9]. Τα περισσότερα κύτταρα 104-S πέθανε μετά από 3 μήνες. Ένας μικρός πληθυσμός των κυττάρων που ονομάζεται 104-R1 προέκυψε μετά από 10 μήνες. Αυτά τα κύτταρα πολλαπλασιάζονται τακτικά απουσία ανδρογόνων [7-9]. Δεκαοκτώ έως είκοσι μήνες μετά την εξάντληση των ανδρογόνων, τα κύτταρα 104-R1 οδήγησε σε ταχύτερα αναπτυσσόμενες πληθυσμός των κυττάρων που ονομάζονται 104-R2 κυττάρων [7-9]. Κατά τη μετάβαση των κυττάρων 104-S έως 104-R1 και 104-R2 κύτταρα, η έκφραση του mRNA, πρωτεΐνες αφθονία, και μεταγραφική δραστικότητα αύξησης AR αρκετές πτυχώσεις [7-14]. Πολλαπλασιασμό του 104-R1 και 104-R2 κύτταρα είναι ανεξάρτητος από ανδρογόνο, αλλά καταστέλλεται από φυσιολογικές συγκεντρώσεις των ανδρογόνων [7-9,11-14]. Ανδρογόνων θεραπεία καταστέλλει c-Myc και Skp2, ως εκ τούτου προκαλεί G1 διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε 104-R1 και κύτταρα 104-R2. LNCaP του προστάτη μας μοντέλο εξέλιξης του καρκίνου μιμείται τις κλινικές καταστάσεις στις οποίες AR-θετικούς όγκους του προστάτη επαναληφθεί εξής στέρηση ανδρογόνου [13,15,16]. PC-3 και DU-145 κύτταρα ανήκουν σε NCI60 και ήταν AR-αρνητικά καρκινικά κύτταρα του προστάτη που έχουν καταρτισθεί από ανθρώπινο προστατικό αδενοκαρκίνωμα μεταστατικό στα οστά [17] και του εγκεφάλου [18], αντίστοιχα. Χρησιμοποιήσαμε έτσι LNCaP μοντέλο εξέλιξης, PC-3, και DU-145 κύτταρα σε αυτή τη μελέτη για να χαρακτηριστεί η διαφορά του προφίλ έκφρασης πρωτεΐνης μεταξύ εξαρτώμενων από ανδρογόνα και μη εξαρτώμενου από ανδρογόνα καρκίνου του προστάτη κύτταρο. Εξετάσαμε το προφίλ 33 διαφορετικές πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, την κυτταρική επιβίωση, σηματοδότηση Akt, και ο υποδοχέας επιδερμικού παράγοντα ανάπτυξης (EGFR) σηματοδότησης σε 104-S, 104-R1, 104-R2, PC-3, και DU-145 κύτταρα. Συγκρίναμε επίσης την διαφορά στην ευαισθησία αυτών των κυττάρων καρκίνου του προστάτη σε θεραπεία με διάφορα φάρμακα χημειοθεραπείας και αναστολέων μικρών μορίων για να καθορίσει ποια φάρμακο ή αναστολέας είναι περισσότερο αποτελεσματική για την καταστολή του πολλαπλασιασμού του προχωρημένου καρκίνου του προστάτη κύτταρα. Οι παρατηρήσεις μας πρότεινε ότι Akt, EGFR, Src, Bcl-2, και AR μονοπάτια σηματοδότησης είναι δυνητικοί θεραπευτικοί στόχοι για AR-θετικών ευνουχισμός ανθεκτικά καρκίνοι του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

LNCaP κυττάρων καρκίνου του προστάτη sublines (104-S, 104-R1, και 104-R2 κύτταρα) και PC-3 ήταν δώρα από την Ο Δρ Shutsung Liao (Το Πανεπιστήμιο του Σικάγο, IL, USA). LNCaP 104-S, 104-R1, και 104-R2 κύτταρα δημιουργήθηκαν από LNCaP FGC κλώνο (ATCC CRL-1740). Αυτές οι sublines LNCaP και PC-3 κύτταρα έχουν περιγραφεί σε προηγούμενες δημοσιεύσεις [7-12,14,19-24]. DU-145 κύτταρα αγοράστηκαν από Bioresource Συλλογή και Ερευνητικό Κέντρο (πόλη Hsinchu, Ταϊβάν). Αυτές οι κυτταρικές σειρές ανακαλλιεργήθηκαν και διατηρήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [7-12,14,19-24]. R1881 (17β-υδροξυ-17α-μεθυλοιστρα-4,9,11-τριεν-3-όνη) αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich (Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA).

Χημικά

αναστολέας του EGFR Gefitinib (Iressa, ZD-1839) και Src αναστολέα Saracatinib (AZD0530) αγοράστηκαν από Selleckchem (Houston, TX, USA). αναστολέα της Bcl-2 ABT 737 (CAS 852808-04-9) αγοράστηκε από Santa Cruz (Santa Cruz, CA, USA). Άλλες ενώσεις αγοράστηκαν από τη Sigma.

Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού Προσδιορισμός

σχετικός αριθμός των κυττάρων αναλύθηκε με μέτρηση της περιεκτικότητας σε DNA των κυτταρολυμάτων με τη φθορίζουσα χρωστική Hoechst 33258 (Sigma) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10,14 , 19,20,22-25]. Η μέση και τυπική απόκλιση αντιπροσώπευε τον μέσο όρο του octuplicate (8 κοιλότητες) ενός αντιπροσωπευτικού πειράματος.

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 5 χ 10

5 κύτταρα σε τρυβλία 10 cm σε 10 ml μέσου επί 24 ώρες. Μετά από 96 ώρες καλλιέργειας στην παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων των ανδρογόνων, τα κύτταρα αφαιρέθηκαν με θρυψίνη και σταθεροποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη σε PBS όλη τη νύχτα στους -20 ° C. Σταθερή κύτταρα πλύθηκαν με PBS, κατεργάστηκαν με 0,1 mg /mL RNase Α σε PBS για 30 λεπτά, και στη συνέχεια εναιωρήθηκε σε 50 μg /mL ιωδιούχου προπιδίου σε PBS. προφίλ κυτταρικού κύκλου και οι κατανομές προσδιορίσθηκαν με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των κυττάρων χρησιμοποιώντας μια ροή BD FACScan κυτταρόμετρο (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). κατανομή του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό ModFit LT (Verity Software House, Topsham, ME, USA) όπως περιγράφεται [8,9,14,20,22,23,25].

πραγματικού χρόνου ποσοτική Polymerase Chain

αντίδρασης

RNA απομονώθηκε και ειδικά mRNA προσδιορίστηκαν ποσοτικά όπως περιγράφεται [10-12,19,21,26]. Οι αλληλουχίες των εκκινητών και ανιχνευτών για υποδοχέα ανδρογόνων (AR) και αφυδρογονάση γλυκεραλδεϋδης-3-φωσφορικής (GAPDH) έχουν περιγραφεί προηγουμένως [9,12,26]. αλληλουχίες εναρκτήρα και διερευνητή που χρησιμοποιούνται για την PSA ποσοτικοποίηση περιγράφηκαν από Gelmini κ.ά. [27]. Όλα τα επίπεδα μεταγραφής κανονικοποιήθηκαν σε επίπεδα GAPDH σε κάθε δείγμα.

Western Blotting Ανάλυση

Cells δείγματα λύθηκαν σε ρυθμιστικό SDS λύσης (240 mM τρις-οξικό, 1% SDS, 1% γλυκερίνη, 5 mM EDTA ρΗ 8.0, 0.1 mM διθειοθρεϊτόλη) που περιέχει αναστολέων της πρωτεάσης του 1 mM 4- (2-αμινοαιθυλο) βενζολοσουλφονυλο φθορίδιο (AEBSF), 0.8 μΜ απροτινίνη, 40 μMbestatin, 14 μΜ Ε-64, 20 μΜ λευπεπτίνη, 15 μΜ πεπστατίνη Α (Sigma -Aldrich, P8340) και οι αναστολείς της φωσφατάσης cantharidin, bromotetramisole και μικροκυστίνη LR (Sigma-Aldrich, P2850). Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα 8-12% SDS-PAGE και τα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών προσδιορίστηκαν με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα αντισώματα: Akt2, β-ακτίνη και GAPDH ήταν από Novus (Littleton, CO, USA). Σύνολο Akt, φωσφο-Ακί Ser473, φωσφο-Akt Thr308, phodpho-ρ42 /44 ΜΑΡΚ Thr202 /Tyr204, EGFR, ρ-MDM2, ρ53, Src, φωσφο-Src Tyr527, Rb, και ρ-Rb Ser807 /811 ήταν από τη Cell Σηματοδοσίας (Danvers, ΜΑ, USA). Λιπαρό οξύ συνθάσης (FAS), AR και c-Myc αντισώματα αγοράστηκαν από Epitomics (Burlingame, CA, USA). Skp2, ρ21 και ρ27 αντισώματα αγοράστηκαν από την Santa Cruz (Santa Cruz, CA, USA). PSA ήταν από ϋΑΚΟ (Elostrup, Δανία). Bcl-2 ήταν από BD (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Bad, MDM2, Akt1, ρ42 /44 ΜΑΡΚ, φωσφο-EGFR Tyr1173, φωσφο-EGFR Tyr1148, φωσφο-EGFR Tyr1086, φωσφο-EGFR Tyr1069, φωσφο-EGFR Tyr1045, και φωσφο-EGFR Tyr 845 ήταν από την Millipore (Billerica, ΜΑ, ΗΠΑ). α-τουμπουλίνης ήταν από τη Sigma. β-ακτίνη, α-τουμπουλίνης, και GAPDH χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος φόρτωσης. Υπεροξειδάση χράνου-συζευγμένο αντι-κουνελιού και αντι-ποντικού IgG δευτερογενή αντισώματα ήταν από την Santa Cruz. Το σήμα του ραφανιδική υπεροξειδάση δευτερογενή αντισώματα σημασμένα ανιχνεύθηκε με ενισχυμένη αντίδραση χημειοφωταύγεια (ECL κιτ ανίχνευσης Western Blotting) (PerkinElmer, Waltham, ΜΑ, USA). GAPDH, α-τουμπουλίνης, και β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι φόρτωσης. Ένταση των ζωνών για διαφορετικές πρωτεΐνες ήταν ποσοτικά με Epson Stylus TX130 χρησιμοποιώντας ΟΗΕ-SCAN-IT gel 6.1 του λογισμικού.

αλληλουχίας του συνδέτη AR δεσμευτική τομέα στο sublines LNCaP

Το συνολικό RNA απομονώθηκε με RNeasy Mini Kit (Qiagen, Venlo, Hilden, Γερμανία). cDNA συντέθηκε από ολικό RNA χρησιμοποιώντας RevertAid Η Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Waltham, Massachusetts, USA). Η κωδικοποιητική αλληλουχία για τον τομέα δέσμευσης συνδέτη του AR ενισχύθηκε με ΚΩΔ-plus κιτ (ΤΟΥΟΒΟ, Osaka, Japan), χρησιμοποιώντας το ζεύγος εκκινητών 5′-ctgaaactacaggaggaagg-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-tgcagaggagtagtgcagag-3’ (αντίστροφο) . Διεξήχθη ενίσχυση χρησιμοποιώντας ένα touch-κάτω θερμική πρωτόκολλο: 8 κύκλοι των 94 ° C για 15 s, 55 στους 47 ° C για 30 s (μειώθηκε η θερμοκρασία αναδιάταξης 1 ° C ανά κύκλο), 68 ° C για 1 λεπτό, που ακολουθείται από 35 κύκλοι των 94 ° C για 15s, 47 ° C για 30s, 68 ° C για 1 λεπτό, και ένα τελικό στάδιο επέκτασης στους 68 ° C για 3 λεπτά. Τα προϊόντα PCR καθαρίστηκαν με πηκτή (FAVORGEN, Ping-Tung, Ταϊβάν) και απευθείας προσδιορισμού σειράς επί ενός DNA Sequencer. Τα δεδομένα αλληλουχίας κατατέθηκε στο GenBank (ID υποβολή: 1.664.456? BankIt1664456 SEQ1 KF720403? BankIt1664456 Seq2 KF720404? BankIt1664456 Seq3 KF720405).

Ανάλυση Δεδομένων

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση τιμή +/- SD τουλάχιστον τριών πειραμάτων ή είναι αντιπροσωπευτικά πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές. t δοκιμή Student (two-tailed, unpaired) χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της στατιστικής σημασίας των αποτελεσμάτων από πειράματα δοκιμασίας πολλαπλασιασμού. Ένα πρόσθετο του Excel ED50V10 πρόγραμμα χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό μισή μέγιστη ανασταλτική συγκέντρωση (IC

50).

Αποτελέσματα

ανδρογονική απόκριση των LNCaP sublines

Η κύρια διαφορά μεταξύ LNCaP 104-R1 ή 104-R2 κυττάρων με μητρικά κύτταρα 104-S τους είναι η απάντησή τους στην ανδρογόνων θεραπεία. Θεραπεία LNCaP κύτταρα 104-S με φυσιολογική συγκέντρωση ανδρογόνου (0.1, 1, 10 ηΜ R1881) [28] διεγείρεται κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Ωστόσο, η θεραπεία ανδρογόνων κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό του 104-R1 και 104-R2 κύτταρα (Σχήμα 1Α). Εν απουσία ανδρογόνων, ο ρυθμός αύξησης των 104-R1 και 104-R2 κυττάρων ήταν 1.8 έως 2.3 διπλώνει υψηλότερη από εκείνη των 104-S κύτταρα (Σχήμα 1Α). θεραπεία ανδρογόνων (0,1, 10 ηΜ R1881) αύξησε τον πληθυσμό κυττάρων σε φάση S και μείωσε τον κυτταρικό πληθυσμό σε φάση G1 σε 104-S κύτταρα. Ωστόσο, ανδρογόνο μειώθηκε πληθυσμός κυττάρων σε φάση S και προκάλεσε G1 διακοπή του κυτταρικού κύκλου στις δύο 104-R1 και 104-R2 κύτταρα (Εικόνα 1Β). Το IC

50 του R1881 που υπολογίζεται για να καταστείλει 104-R1 και 104-R2 κυττάρων ήταν 14,9 και 13,2 ηΜ, αντιστοίχως. PC-3 και DU-145 κύτταρα δεν εκφράζουν AR και δεν ανταποκρίνονται στη θεραπεία των ανδρογόνων, εμείς έτσι δεν περιλαμβάνουν PC-3 και DU-145 κύτταρα σε αυτά τα πειράματα.

Ο πολλαπλασιασμός των LNCaP 104-S, 104-R1, και 104-R2 κύτταρα που αναπτύσσονται σε 10% CS-FBS DMEM συν 0, 0,1, 1, ή 10 ηΜ συνθετικά ανδρογόνα R1881 επί 96 ώρες προσδιορίστηκε με πολλαπλασιασμό 96-φρεατίων μέτρησης του συνολικού περιεχομένου DNA ανά φρεάτιο χρησιμοποιώντας Hoechst 33258 φθορισμού . Σχετική αριθμούς κυττάρων κανονικοποιήθηκαν με εκείνη των κυττάρων 104-S χωρίς θεραπεία R1881. Τριπλό αστερίσκοι (***) αντιπροσωπεύει τον αριθμό των κυττάρων είναι στατιστικά σημαντικά διαφορετική (Ρ & lt? 0.001) σε σύγκριση με τον ίδιο τύπο κυττάρων χωρίς αγωγή R1881. Στήλες αντιπροσωπεύουν σημαίνει για 24 επαναλήψεις? μπάρες αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση. (Β) Η κατανομή κυτταρικού κύκλου του LNCaP 104-S, 104-R1, και τα κύτταρα 104-R2 σε επεξεργασία με 0, 0,1, και 10 ηΜ R1881 επί 96 ώρες προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής. Αστερίσκο (*), διπλό αστερίσκους (**), και τρίκλινα αστερίσκοι (***) δείχνουν στατιστικά σημαντική διαφορά του

P

& lt? 0.05,

P

& lt? 0.01, και

P

& lt? 0.001, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τον ίδιο τύπο κυττάρων χωρίς αγωγή R1881.

Η

Έκφραση των AR και PSA mRNA σε sublines LNCaP

Παρόμοια με προηγούμενες παρατηρήσεις μας [7-9,14], 104-R1 και 104-R2 κύτταρα εκφράζουν υψηλότερα mRNA AR από 104-S κύτταρα όταν ανδρογόνο είναι απών (Εικόνα 2Α). Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι 0.1 ηΜ R1881 αυξημένη έκφραση του AR mRNA σε όλους τους 104-S, 104-R1, και 104-R2 κύτταρα, ενώ 10 ηΜ R1881 αυξήθηκε μόνο AR mRNA σε 104-S και 104-R1 κυττάρων (Σχήμα 2Α ). Η μεταγραφική δραστικότητα του AR σε 104-S, 104-R1, και τα κύτταρα 104-R2 συγκρίθηκε με την εξέταση της ανδρογονική επαγωγή της έκφρασης του mRNA του ειδικού αντιγόνου του προστάτη γονιδίου-στόχου AR (PSA). επίπεδα PSA mRNA αυξήθηκε με τη θεραπεία R1881 δοσοεξαρτώμενο αλλά ήταν πολύ υψηλότερες σε 104-R1 και 104-R2 κύτταρα από εκείνες στις 104-S κύτταρα (Σχήμα 2Β). Θεραπεία 104-S κυττάρων με 0,1 ηΜ R1881 προκάλεσε 2,3 φορές αύξηση του PSA mRNA. Ωστόσο, R1881 στα 0.1 ηΜ προκάλεσε περίπου 6,3 και 9,0 φορές αύξηση του PSA mRNA σε 104-R1 και τα κύτταρα 104-R2, αντίστοιχα. Η θεραπεία με 10 ηΜ R1881 προκάλεσε 6,8 φορές αύξηση του PSA mRNA σε κύτταρα 104-S, αλλά προκάλεσε μία περίπου 22,1 και 32,0 φορές αύξηση του PSA mRNA σε 104-R1 και 104-R2 κύτταρα, αντίστοιχα (Σχήμα 2Β). Όταν R1881 ήταν απούσα, το επίπεδο mRNA PSA ήταν υψηλότερη σε 104-R1 και 104-R2 κύτταρα από ότι σε κύτταρα 104-S. PC-3 και DU-145 κύτταρα δεν εκφράζουν AR και δεν ανταποκρίνονται στη θεραπεία ανδρογόνων, εμείς έτσι δεν περιλάμβαναν PC-3 και DU-145 κύτταρα σε αυτά τα πειράματα.

Η έκφραση του AR (Α) και PSA (Β) mRNA ανιχνεύθηκε με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR σε 104-S, 104-R1, και τα κύτταρα 104-R2 σε επεξεργασία με 0, 0,1, και 10 ηΜ R1881 για 96 ώρες. Αστερίσκο (*), διπλό αστερίσκους (**), και τρίκλινα αστερίσκοι (***) δείχνουν στατιστικά σημαντική διαφορά του

P

& lt? 0.05,

P

& lt? 0.01, και

P

& lt? 0.001, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τον ίδιο τύπο κυττάρων χωρίς αγωγή R1881. σύμβολο αριθμού (#) και (###) δείχνουν στατιστικά σημαντική διαφορά του

P

& lt? 0,05 και

P

& lt? 0,001, αντίστοιχα, για 104-R1 ή κύτταρα 104-R2 σε σύγκριση με κύτταρα 104-S με την απουσία του R1881.

Η

πεδίο σύνδεσης συνδετήρα AR σε LNCaP sublines

LNCaP κύτταρα εκφράζουν ένα μεταλλαγμένο AR (T877A) που εμφανίζει εξειδίκευση σύνδεσης χαλαρή συνδέτη [29,30]. Ως 104-R1 και 104-R2 κύτταρα έδειξαν μεγαλύτερη ανδρογόνο απόκριση (Σχήμα 2Β), προσδιορίσαμε αν υπάρχουν πρόσθετες μεταλλάξεις σε 104-R1 και 104-R2 κύτταρα διαφορετικά από T877A. Αλληλούχηση του cDNA από LNCaP 104-S, 104-R1, και 104-R2 κύτταρα (Σχήμα 3Α, 3Β) πρότεινε ότι οι τρεις υποσειρές LNCaP περιέχουν την T877A μετάλλαξη στο AR. Δεν υπήρχε πρόσθετη μετάλλαξη σε 104-R1 και τα κύτταρα 104-R2 σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα 104-S τους. Όσο μεγαλύτερη ανδρογόνο απόκριση μπορεί να οφείλεται σε υψηλότερο επίπεδο έκφρασης AR σε 104-R1 και 104-R2 κύτταρα (Σχήμα 2Β).

Ακολουθία του LBD του AR σε 104-S, 104-R1, και 104-R2 κύτταρα με βάση την προς τα εμπρός εκκινητή (Α) και αντίστροφο εκκινητή (Β) δείχθηκε. Κόκκινο βέλος δείχνει την T877A σημειακή μετάλλαξη στο LBD των AR σε κύτταρα LNCaP.

Η

Ο χαρακτηρισμός των πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου κανονισμού sublines LNCaP, PC-3, και DU-145 κύτταρα

Πρωτεΐνη επίπεδο έκφρασης του AR είναι υψηλότερη σε LNCaP 104-R1 και 104-R2 σε σύγκριση με κύτταρα LNCaP 104-S απουσία ανδρογόνων. Η θεραπεία με τα δύο 0,1 και 10 ηΜ συνθετικό ανδρογόνο R1881 ελαφρώς αυξημένη πρωτεΐνες AR σε όλες τις υποσειρές LNCaP (Σχήμα 4). DU-145 και τα κύτταρα PC-3 δεν εκφράζουν AR (Σχήμα 4). Και οι τρεις υποσειρές LNCaP αλλά όχι DU-145 και τα κύτταρα PC-3 εκφράζουν πρωτεΐνες PSA. θεραπεία ανδρογόνων επαγόμενη παραγωγή πρωτεΐνης PSA. πρωτεϊνικό επίπεδο PSA ήταν πολύ υψηλότερη σε 104-R1 και τα κύτταρα 104-R2 σε σύγκριση με 104-S κύτταρα κατά τη θεραπεία με 10 ηΜ R1881. Η θεραπεία με 0.1 ηΜ R1881 μόνο επαγόμενη έκφραση PSA σε 104-R1 και 104-R2 κύτταρα αλλά όχι τα κύτταρα 104-S. Η επαγωγή αναδίπλωσης της πρωτεΐνης PSA με ανδρογόνο θεραπεία ήταν παρόμοια με την επαγωγή αναδίπλωσης του PSA mRNA (Σχήμα 2Β, εικόνα 4).

Η έκφραση της πρωτεΐνης του AR, PSA, c-myc, Skp2, p21

Cip1, p27

Kip1, Bcl-2, Bad, p53, MDM2, φωσφο-MDM2 Ser166, Rb, φωσφο- Rb Ser807 /811, GAPDH, α-τουμπουλίνης, και β-ακτίνης σε LNCaP 104-S, 104-R1, και τα κύτταρα 104-R2 σε επεξεργασία με 0, 0,1, ή 10 ηΜ R1881 για 96 ώρες αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. GAPDH, α-τουμπουλίνης, και β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος φόρτωσης. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές. Αυτές οι πρωτεΐνες εξετάστηκαν επίσης σε PC-3 και DU-145 κύτταρα απουσία ανδρογόνου. Οι αριθμοί αντιπροσωπεύουν ποσοτικοποίηση των ζωνών των επιμέρους πρωτεΐνης ποσοτικοποιείται με ImageJ και UN-SCAN-IT gel 6.1 του λογισμικού.

Η

Όταν ανδρογόνων είναι απούσα, 104-R1 και 104-R2 κύτταρα εξέφραζαν υψηλότερα επίπεδα του c-myc , Skp2, BCL-2, Ρ53, φωσφο-MDM2 Ser166, Rb, και φωσφο-Rb Ser807 /811 αλλά λιγότερο ρ27

Kip πρωτεΐνες σε σύγκριση με 104-S κύτταρα. θεραπεία ανδρογόνων αυξημένη πρωτεΐνη έκφραση του Skp2, c-myc, Rb, και φωσφο-Rb Ser 807/811, και ρ53 σε 104-S κύτταρα, αλλά μείωσε την έκφραση αυτών των πρωτεϊνών σε 104-R1 και 104-R2 κύτταρα. Η έκφραση του Ρ27

Kip μειώθηκε κατά ανδρογόνων σε 104-S κύτταρα αλλά προκλήθηκε σε 104-R1 και τα κύτταρα 104-R2. θεραπείας ανδρογόνων μειώθηκε P21

Cip αφθονία σε όλες τις sublines LNCaP. BCL-2 έκφραση πρωτεΐνης σε 104-R1 και 104-R2 κυττάρων ήταν υψηλή, αλλά πρωτεΐνης BCL-2 ήταν μόλις ανιχνεύσιμη σε 104-S κύτταρα. θεραπεία ανδρογόνων μειώθηκε BCL-2 σε 104-R1 και 104-R2 κύτταρα. MDM2 σε 104-S κύτταρα αυξήθηκαν ελαφρά κατά των ανδρογόνων, αλλά δεν επηρεάστηκε από ανδρογόνο σε 104-R1 και τα κύτταρα 104-R2. έκφραση BAD πρωτεΐνη δεν επηρεάστηκε από τη θεραπεία ανδρογόνων σε 104-R1 και sublines 104-R2 LNCaP (Σχήμα 4). 0,1 nM R1881 μειώθηκε ελαφρά BAD πρωτεΐνη στα κύτταρα 104-S. DU-145 και PC-3 κύτταρα εξέφρασαν υψηλότερα c-Myc και Skp2 αλλά χαμηλότερη ρ27

Kip σε σύγκριση με 104-S κύτταρα όταν ανδρογόνων ήταν απούσα. Σε σύγκριση με 104-S κύτταρα, DU-145 κύτταρα εξέφρασαν υψηλότερα p53 και κάτω BAD πρωτεΐνη. PC-3 κύτταρα εξέφρασαν υψηλότερα Bcl-2, φωσφο-MDM2 S166, Rb, και φωσφο-Rb S807 /811 αλλά μικρότερη BAD, Ρ53, και MDM2 σε σύγκριση με κύτταρα 104-S.

προφίλ της Akt και πρωτεΐνες EGFR σηματοδότησης σε LNCaP υποσειρές, PC-3, και DU-145 κύτταρα

Akt και του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) σηματοδότησης παίζει σημαντικούς ρόλους που ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό και την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη. Σε σύγκριση με 104-S κύτταρα, 104-R1 και 104-R2 κύτταρα εξέφρασαν υψηλότερα επίπεδα πρωτεΐνης Akt2 και φωσφορυλίωση τυροσινών επί EGFR (Tyr 1173, Tyr 1148, Tyr 1069, Tyr 1045, και Tyr 845), αλλά εξέφρασαν χαμηλότερα επίπεδα πρωτεΐνης του Akt, Akt1, φωσφο-EGFR Tyr 1086, φωσφο-Ακί Thr308, φωσφο-ρ42 /44 ΜΑΡΚ Thr202 /Tyr 204, Src, φωσφο-Src Tyr527, και EGFR (Εικόνα 5). θεραπεία ανδρογόνων αυξημένη πρωτεΐνη έκφραση Akt2 στις τρεις υποσειρές καθώς και φωσφο-EGFR Tyr 1148, Tyr 1069, Tyr 1045, και Tyr 845 σε 104-S κύτταρα. Ανδρογόνα μειώθηκε φωσφο-Ακί Ser473, φωσφο-Akt Thr308, και φωσφο-ρ42 /44 ΜΑΡΚ Thr202 /Tyr 204 σε 104-S κύτταρα αλλά όχι σε 104-R1 και 104-R2 κύτταρα. Ανδρογόνων αυξήθηκε ελαφρώς φωσφορυλίωση της Akt (Thr308 και Ser473) σε 104-R1 και 104-R2 κύτταρα. Πρωτεΐνη έκφραση του συνολικού Akt, Akt1, ρ42 /44 ΜΑΡΚ και EGFR δεν επηρεάστηκε από ανδρογόνων θεραπεία. Σε σύγκριση με τα κύτταρα 104-S, DU-145 και PC-3 κύτταρα εξέφρασαν υψηλότερα Akt και Akt1 και παρόμοιο επίπεδο ρ42 /44 ΜΑΡΚ. Ωστόσο, το επίπεδο πρωτεΐνης φωσφο-Ακί T308 και S473, καθώς και φωσφο-ρ42 /44 ΜΑΡΚ ήταν πολύ χαμηλή σε DU-145 και PC-3 κύτταρα. Αν και PC-3 κύτταρα εξέφρασαν λιγότερη πρωτεΐνη Src, φωσφο-Src Tyr527 ήταν σχετικά υψηλή σε PC-3 κύτταρα σε σύγκριση με 104-S κύτταρα. επίπεδο πρωτεΐνης φωσφο-EGFR Tyr1045 και Tyr845 ήταν υψηλότερη σε DU-145 και PC-3 σε σύγκριση με κύτταρα 104-S.

Protein έκφραση του συνολικού Akt, Akt1, Akt2, φωσφο-Akt Ser473, φωσφο- Akt Thr308, ρ42 /44 ΜΑΡΚ, φωσφο-ρ42 /44 ΜΑΡΚ Thr202 /Tyr204, EGFR, και διαφορετική θέση φωσφορυλίωσης της τυροσίνης (Tyr1173, Tyr1148, Tyr1086, Tyr1069, Tyr1045, και Tyr845) σε LNCaP 104-S, 104-R1, και τα κύτταρα 104-R2 σε επεξεργασία με 0, 0,1, ή 10 ηΜ R1881 για 96 ώρες αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. Ίδια GAPDH, α-τουμπουλίνης, και β-ακτίνη, όπως φαίνεται στο Σχήμα 3 χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος φόρτωσης. Αυτές οι πρωτεΐνες εξετάστηκαν επίσης σε PC-3 και DU-145 κύτταρα απουσία ανδρογόνου. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές. Οι αριθμοί αντιπροσωπεύουν ποσοτικοποίηση των ζωνών των επιμέρους πρωτεΐνης ποσοτικοποιείται με ImageJ.

Η

Παρατηρήσαμε ένα ενδιαφέρον εύρημα όταν ομαλοποιηθεί η φωσφο-πρωτεΐνης Akt, EGFR, και Src από την συνολική πρωτεΐνη αφθονία τους. 104-R1 και 104-R2 κύτταρα εκφράζουν σχετικά υψηλή αναλογία της φωσφο-Ακί /Akt, φωσφο-Src /Src, φωσφο-ΕΟΡΚ /EGFR, αλλά χαμηλότερη αναλογία της φωσφο-ΕΚΚ /ΕΚΚ (Πίνακας 1). Σύμφωνα με αυξανόμενη κατάσταση (0,1 ηΜ R1881 για 104-S? 0 ηΜ R1881 για 104-R1 και τα κύτταρα 104-R2), η αναλογία της φωσφο-Ακί /Akt, φωσφο-Src /Src, και φωσφο-ΕΟΡΚ /EGFR σε 104-R1 και 104-R2 κύτταρα ήταν 1,6-2 φορές, 02.02 – 03.09, και 1,7 έως 10 φορές υψηλότερη. Η αναλογία του p-Akt /Ακί δεν επηρεάστηκε πολύ από ανδρογόνο και στις τρεις υποσειρές LNCaP. Ανδρογόνων μειωμένη αναλογία του π-Src /Src σε 104-R1 και 104-R2 κύτταρα αλλά όχι τα κύτταρα 104-S. Ανδρογόνων ελαφρώς αυξημένη αναλογία του ρ-EGFR /EGFR σε 104-S κύτταρα. Ανδρογόνων μειωμένη αναλογία p-EGFR /EGFR σε Tyr1148, Tyr1069, και Tyr 1045 σε 104-R1 και Tyr1069 και Tyr845 σε 104-R2 κύτταρα. Ανδρογόνων αύξησε την αναλογία της φωσφο-EGFR Tyr1173 /EGFR και φωσφο-EGFR Tyr1045 /EGFR σε κύτταρα 104-R2. Σε σύγκριση με 104-S, DU-145 και αναλογία PC-3 κύτταρα εξέφρασαν πολύ χαμηλά φωσφο-Ακί /Akt και φωσφο-ΕΚΚ αναλογία /ΕΚΚ αλλά υψηλότερη φωσφο-EGFR Tyr1045 /EGFR και φωσφο-EGFR Tyr845 /EGFR. PC-3 κύτταρα εξέφρασαν επίσης σχετικά χαμηλή αναλογία της φωσφο-EGFR /EGFR του Tyr1173, Tyr1148, Tyr1086, Tyr 1069 αλλά πολύ υψηλή αναλογία της φωσφο-Src /Src σε σύγκριση με κύτταρα 104-S.

Η LNCaP 104-S

LNCaP 104-R1

LNCaP104-R2

DU-145

PC-3

Η R1881 (nM)

0

0.1

10

0

0.1

10

0

0.1

10

0

0

AktS47310.70.71.41.51.21.11.21.30.00.1T30810.80.70.91.10.90.60.71.00.00.0SrcY52710.91.13.52.32.32.02.01.31.05.0EGFRY117311.41.92.72.53.014.025.025.01.30.6Y114811.71.96.04.04.516.016.014.01.10.5Y108611.01.01.01.01.03.03.02.00.90.5Y106911.41.38.35.05.019.014.010.00.70.5Y104513.52.99.79.07.326.030.033.04.62.0Y84511.51.44.74.04.517.013.09.02.31.8ERK1/2T202/Y20410.70.50.50.50.60.30.10.10.40.0Table 1. αναλογία της φωσφο-Ακί /Akt, φωσφο-Src /Src, φωσφο-ΕΟΡΚ /EGFR, και φωσφο-ΕΚΚ /ΕΚΚ για LNCaP 104-S, 104-R1, 104-R2, PC-3, και DU-145 κυττάρων.

Ποσοτικοποίηση πρωτεΐνης από το Σχήμα 4 και Σχήμα 5 χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό της αναλογίας. Οι τιμές στον Πίνακα 2 δείχνουν την αναλογία της φωσφο-πρωτεΐνης πάνω συνολικής πρωτεΐνης αφθονία. CSV Λήψη CSV

Μοτίβο του προφίλ πρωτεΐνης έκφρασης σε τρεις υποσειρές LNCaP, DU-145 και PC-3

Προφίλ αλλαγές πρωτεΐνης υπό θεραπεία 0, 0,1, και 10 nM R1881 στο 104-S, 104-R1, και 104-R2 κυττάρων συνοψίζεται στον χάρτη θερμότητας στο Σχήμα 6. είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι η μορφή της πρωτεΐνης έκφρασης του 104-S κύτταρα σε επεξεργασία με 10 ηΜ R1881 ήταν περισσότερο παρόμοια με 104-R1 και 104-R2 κύτταρα κατεργασμένα με ανδρογόνων (0,1 και 10 ηΜ R1881). Το μοτίβο της πρωτεΐνης έκφρασης του 104-S κύτταρα χωρίς θεραπεία ανδρογόνων ήταν πολύ διαφορετικό από όλα τα άλλα δείγματα που δοκιμάζονται (Σχήμα 6).

Protein προφίλ έκφρασης του LNCaP 104-S, 104-R1, και 104-R2 κύτταρα κατεργασμένα με 0, 0,1, ή 10 ηΜ R1881 για 96 ώρες, καθώς και σε DU-145 και PC-3 κύτταρα απουσία ανδρογόνου προσδιορίστηκε στο Σχήμα 3 και Σχήμα 4 συνδυάστηκε και δημιουργήθηκε σε διαγράμματα χάρτη δυο θερμότητας με χρήση συμπλέγματος 3.0 TreeView (https://genome-www.standford.edu). Κόκκινο και πράσινο χρώμα αντιπροσωπεύει την αύξηση και μείωση της πρωτεΐνης αφθονία, αντίστοιχα. Φωτεινότερο χρώμα δείχνει μεγαλύτερη αλλαγή της πρωτεΐνης αφθονία.

Η

Ευαισθησία των LNCaP sublines, DU-145, και τα κύτταρα σε φάρμακα χημειοθεραπείας

Είμαστε δίπλα προσδιοριστεί η απόκριση ανάπτυξης των LNCaP 104-S, 104-R1 3 PC-, 104- R2, DU-145, και PC-3 κύτταρα σε τέσσερις χρησιμοποιούνται συνήθως χημειοθεραπεία φάρμακα καρκίνοι του προστάτη. Το IC

50 πακλιταξέλης και για τις τρεις υποσειρές LNCaP ήταν παρόμοια (Σχήμα 7 και Σχήμα 8). Η ευαισθησία του 104-R1 και 104-R2 κυττάρων σε ετοποσίδη, μιτοξαντρόνη, και βινμπλαστίνη, ήταν παρόμοια. 104-R1 και 104-R2 κύτταρα ήταν περισσότερο ανθεκτικά σε θεραπεία ετοποσίδης, μιτοξαντρόνη, και βινβλαστίνη σε σύγκριση με 104-S κύτταρα (Πίνακας 2). DU-145 και PC-3 κύτταρα ήταν περισσότερο ανθεκτικά σε όλα τα τέσσερα φάρμακα χημειοθεραπείας, σε σύγκριση με 104-S κύτταρα.

LNCaP 104-S, 104-R1, 104-R2, PC-3, και DU-145 κύτταρα κατεργάστηκαν με αυξανόμενες συγκεντρώσεις ετοποσίδης (Α) ή paclitaxel (Β) για 72 ώρες. Σχετικό αριθμό κυττάρων των κυττάρων LNCaP προσδιορίστηκε από την Hoechst δοκιμασία πολλαπλασιασμού των 96 φρεατίων βαφή 33258 που βασίζεται, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Οι αριθμοί των κυττάρων κανονικοποιήθηκαν για τον έλεγχο (διμεθυλοσουλφοξείδιο) του κάθε κυτταρική γραμμή. Τρίκλινο αστερίσκοι (***) αντιπροσωπεύουν στατιστικώς σημαντική διαφορά

σ

& lt?. 0.001 μεταξύ της ομάδας υπό θεραπεία και τον έλεγχο (χωρίς επεξεργασία) ομάδα

Η

LNCaP 104-S, 104- R1, 104-R2, PC-3, και DU-145 κύτταρα κατεργάστηκαν με αυξανόμενες συγκεντρώσεις μιτοξαντρόνη (Α) ή βινμπλαστίνης (Β) για 72 ώρες. Σχετικό αριθμό κυττάρων των κυττάρων LNCaP προσδιορίστηκε από την Hoechst δοκιμασία πολλαπλασιασμού των 96 φρεατίων βαφή 33258 που βασίζεται, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Οι αριθμοί των κυττάρων κανονικοποιήθηκαν για τον έλεγχο (διμεθυλοσουλφοξείδιο) του κάθε κυτταρική γραμμή. Τρίκλινο αστερίσκοι (***) αντιπροσωπεύουν στατιστικώς σημαντική διαφορά

σ

& lt?. 0.001 μεταξύ της ομάδας αγωγή και την ομάδα ελέγχου

Η LNCaP 104-S

LNCaP 104-R1

LNCaP 104-R2

PC-3

DU-145

etoposide12.352.002.492.76paclitaxel11.181.072.923.43mitoxantrone13.523.383.382.28vinblastine11.321.453.231.83AG147811.841.410.501.69Gefitinib11.090.991.791.32LY29400211.491.332.953.73Saracatinib11.110.901.870.77BCl-2 inhibitor11.151.030.571.12Table 2. Αναλογία του IC

50 για LNCaP 104-R1, 104-R2, PC-3, και DU-145 κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα 104-S

. IC

50 από Τα σχήματα 7-10 χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό της αναλογίας. IC

50 104-S κύτταρα για όλους τους διαφορετικούς αναστολείς ορίστηκε σε 1 για σύγκριση. CSV Λήψη CSV

Ευαισθησία των LNCaP sublines, DU-145 και PC-3 κύτταρα με αναστολείς κινάσης και Bcl-2 αναστολέας

Σε σύγκριση με κύτταρα LNCaP 104-S, 104-R1 και 104-R2 κύτταρα ήταν πιο ανθεκτικά στην θεραπεία του αναστολέα ΡΙ3Κ LY294002 και αναστολέα EGFR AG1478 (Σχήμα 9, Σχήμα 10, Πίνακας 2). Ευαισθησία του 104-R1 και τα κύτταρα 104-R2 προς αναστολέα EGFR Gefitinib και Bcl-2 αναστολέα ΑΒΤ 737 ήταν παρόμοιο με εκείνο του 104-S κύτταρα. 104-R2 κύτταρα ήταν ελαφρώς πιο ευαίσθητα στην θεραπεία του αναστολέα Src Saracatinib. Σε σύγκριση με τα κύτταρα 104-S, PC-3 και DU-145 κύτταρα ήταν περισσότερο ανθεκτικά σε περισσότερα φάρμακα που δοκιμάζεται. Ωστόσο, PC-3 κύτταρα ήταν περισσότερο ευαίσθητα στη θεραπεία του AG1478 ή ΑΒΤ 737 ενώ DU-145 κύτταρα ήταν περισσότερο ευαίσθητα σε Saracatinib.

LNCaP 104-S, 104-R1, 104-R2, PC-3, και DU-145 κύτταρα κατεργάστηκαν με αυξανόμενες συγκεντρώσεις AG1478 (Α) ή Gefitinib (Β) για 72 ώρες. Σχετικό αριθμό κυττάρων των κυττάρων LNCaP προσδιορίστηκε από την Hoechst δοκιμασία πολλαπλασιασμού των 96 φρεατίων βαφή 33258 που βασίζεται, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Οι αριθμοί των κυττάρων κανονικοποιήθηκαν για τον έλεγχο (διμεθυλοσουλφοξείδιο) του κάθε κυτταρική γραμμή. Τριπλό αστερίσκοι (***) αντιπροσωπεύουν στατιστικώς σημαντική διαφορά

ρ

& lt? 0.001 μεταξύ της ομάδας υπό θεραπεία και της ομάδας ελέγχου.

Η

LNCaP 104-S, 104-R1, 104-R2, PC-3, και DU-145 κύτταρα κατεργάστηκαν με αυξανόμενες συγκεντρώσεις LY294002 (Α), Saracatinib (Β), ή ΑΒΤ 737 (C) για 72 ώρες. Σχετικό αριθμό κυττάρων των κυττάρων LNCaP προσδιορίστηκε από την Hoechst δοκιμασία πολλαπλασιασμού των 96 φρεατίων βαφή 33258 που βασίζεται, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Οι αριθμοί των κυττάρων κανονικοποιήθηκαν για τον έλεγχο (διμεθυλοσουλφοξείδιο) του κάθε κυτταρική γραμμή.