Αφηρημένο

Ιστορικό

ιό των ανθρώπινων θηλωμάτων (HPV) που συνδέονται Κεφαλής και Καρκίνοι Λαιμός (HNCs) έχουν προκαλέσει σημαντική ποσότητα ερευνητικό ενδιαφέρον τα τελευταία χρόνια. Λόγω της υψηλής συχνότητας των HNCs και η έλλειψη επαρκών στοιχείων σχετικά με HPV υψηλού κινδύνου (HR-HPV) από τη Βόρεια -Ανατολική περιοχή της Ινδίας, αυτή η μελέτη σχεδιάστηκε για να διερευνήσει τη μόλυνση hr-HPV, τους τύπους και τη σύνδεσή του με τις συνήθειες του τρόπου ζωής όπως ο καπνός, η κατανάλωση αλκοόλ κλπ

Μέθοδοι

Ένα σύνολο των εκατόν έξι δείγματα βιοψίας πρωτοπαθούς όγκου ΕΘΕΓ συλλέχθηκαν. Αυτά τα δείγματα αναλύθηκαν για hr-HPV DNA (13 τύπους HPV) με τη χρήση υβριδικών σύλληψη 2 (HC2) δοκιμασίας και γονοτυπική έγινε από Ε6 ένθετα πολλαπλή PCR (NMPCR).

Αποτελέσματα

Η παρουσία hR-HPV επιβεβαιώθηκε σε 31,13% (n = 33) και 24,52% (n = 26) των ασθενών που HNC με ένθετες πολλαπλή PCR (NMPCR) και δοκιμασία HC2 αντίστοιχα. Μεταξύ hr-HPV θετικές περιπτώσεις, εκτός από δεκατρείς HR-HPV τύπους που αναλύθηκαν, μόνο δύο διαδεδομένη γονότυπους, HPV-16 (81,81%), ακολουθούμενη από HPV-18 (18,18%) βρέθηκαν. Σημαντική συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ της λοίμωξης HR-HPV με την κατανάλωση αλκοόλ (p & lt? 0.001) και το μάσημα του καπνού (p = 0.02) σε περιπτώσεις ΕΘΕΓ. Σε σύγκριση με HPV-18 μόλυνση του HPV-16 βρέθηκε να σχετίζεται σημαντικά με το μάσημα καπνού (p = 0.02) συνήθεια.

Συμπεράσματα

Η μελέτη μας έδειξε ότι το μάσημα του καπνού και την κατανάλωση αλκοόλ μπορεί να ενεργεί ως παράγοντες κινδύνου για λοίμωξη hR-HPV σε HNCs από την περιοχή βορειοανατολικά της Ινδίας. Αυτή ήταν η πρώτη μελέτη από τη Βόρεια-ανατολική Ινδία, η οποία αξιολόγησε επίσης την κλινική εφαρμογή της δοκιμασίας ΚΘ2 σε δείγματα ασθενών ΕΘΕΓ. Προτείνουμε ότι το αλκοόλ, τον καπνό και HR-πράξη HPV λοίμωξη συνεργικά ή συμπληρώνουν ο ένας τον άλλο κατά τη διαδικασία της ανάπτυξης και της προόδου ΕΘΕΓ στην παρούσα μελέτη πληθυσμού

Παράθεση:. Kumar R, Rai AK, Das D, Das R , Kumar RS, Sarma A, et al. (2015) Το αλκοόλ και καπνού αυξάνει τον κίνδυνο HPV υψηλού κινδύνου μόλυνσης στον Καρκίνο Κεφαλής και Τραχήλου Ασθενείς: Μελέτη από το North East-Περιφέρεια της Ινδίας. PLoS ONE 10 (10): e0140700. doi: 10.1371 /journal.pone.0140700

Επιμέλεια: Jeffrey S. Chang, Εθνική Έρευνα Υγείας Ινστιτούτα, την Ταϊβάν

Ελήφθη: May 24, 2015? Αποδεκτές: 28 του Σεπτέμβρη 2015? Δημοσιεύθηκε: 16 Οκτωβρίου, 2015

Copyright: © 2015 Kumar et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. Υποστήριξη δόθηκε από το Τμήμα Βιοτεχνολογίας, Υπουργείο Επιστημών και Τεχνολογίας, η Ινδία (Grant Νο BT /04 /NE /TBP /2010 και Grant Νο BT /Med /NE-SFC /2009) έλαβε από AR και AKR, αντίστοιχα [https://www.dbtindia.nic.in/]

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν αντικρουόμενα συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος κεφαλής και τραχήλου (ΕΘΕΓ) λογαριασμοί συχνότητα περίπου 25-30% όλων των περιπτώσεων καρκίνου στην Ινδία [1]. ΕΘΕΓ είναι μια πολυπαραγοντική και πολυφασικό ασθένεια που επηρεάζει ανατομικές περιοχές όπως τα χείλη, τη στοματική κοιλότητα, τη μύτη και παραρρινίων κόλπων, του ρινοφάρυγγα, του στοματοφάρυγγα, στοματικής κοιλότητας, του υποφάρυγγα, λάρυγγα κλπ [2]. Οι κρίσιμοι παράγοντες κινδύνου είναι καπνός, η κατανάλωση αλκοόλ, betel καρύδι μάσημα, την αλλαγή της σεξουαλικής συμπεριφοράς κ.λπ., τα οποία είναι υπεύθυνα για την πλειοψηφία των ΕΘΕΓ επιβάρυνση. Σε ασθενείς ΕΘΕΓ των 50 ετών και άνω της ηλικίας, των ενώσεων με τους παραπάνω βασικούς παράγοντες κινδύνου είναι πιο κυρίαρχη. Το κάπνισμα και καρκινογόνες ουσίες που σχετίζονται με το αλκοόλ παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του ΕΘΕΓ πιθανώς μέσω ανοσοκαταστολή [3-6]. Στον εξωκυττάριο και ενδοκυττάριο διαμέρισμα, ο καπνός του τσιγάρου παράγει τα αιωρούμενα σωματίδια, αέρια εκχυλίσματα και διαλυμένων ουσιών νερού. Σημαντικές ταξινομηθεί μεταλλαξιογόνο και καρκινογόνο συστατικά του τσιγάρου είναι η νικοτίνη, η πίσσα, αμμωνία, μονοξείδιο του άνθρακα, διοξείδιο του άνθρακα, φορμαλδεΰδη, ακρολεϊνη, ακετόνη, βενζοπυρένια, υδροξυκινόνη, οξείδια του αζώτου και το κάδμιο. Πίσσα και νικοτίνη του καπνού των τσιγάρων επηρεάζουν την έμφυτη ανοσολογική απάντηση και να αυξήσει την ευαισθησία σε λοιμώξεις [7, 8]. Η κατανάλωση αλκοόλ θεωρείται επίσης ως ένας από τους παράγοντες κινδύνου που μπορεί να συμβάλλει στην καρκινογένεση. Ο Διεθνής Οργανισμός Έρευνας για τον Καρκίνο του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας έχει χαρακτηριστεί το αλκοόλ ως καρκινογόνο Ομάδας 1 [9]. Ιού των Ανθρώπινων Θηλωμάτων (HPV) υποστηρίχθηκε για πρώτη φορά από τους Syrjanen et al (1983) ως παράγοντας κινδύνου ειδικά για στοματοφαρυγγική και τον καρκίνο του στόματος [10]. Σε υποσύνολο των περιπτώσεων ΕΘΕΓ, HPV ένωση έχουν αναγνωριστεί σε νεότερη ηλικιακή ομάδα (& lt? 50 ετών) ασθενείς χωρίς συνήθεια του καπνού και της κατανάλωσης αλκοόλ [11, 12]. Το HPV γονιδιωματικού ϋΝΑ ως επί το πλείστον ανιχνεύθηκαν με PCR μεθόδου που βασίζεται και μελέτες έχουν δείξει ότι μέχρι 60% των περιπτώσεων μπορεί να είναι HNC HPV θετικά [13, 14]. Η αιτιολογική συσχέτιση μεταξύ του HPV και του καρκίνου κεφαλής και τραχήλου παραμένει αντιφατική λόγω αντικρουόμενων αποδεικτικών στοιχείων [15, 16]. HPV συνεργασία με ΕΘΕΓ έχει αναλάβει σημασία λόγω των ευρημάτων ότι ο HPV θετικές περιπτώσεις ΕΘΕΓ έχουν καλή πρόγνωση σε σύγκριση με τις αρνητικές περιπτώσεις HPV [17-21]. Οι πιθανοί τρόποι μετάδοσης του ιού HPV σε ΕΘΕΓ μπορεί να είναι προφορική σεξουαλική συμπεριφορά σε ενήλικες και περιγεννητικής μετάδοσης των νεογνών παιδιά. Ειδικότερα, της στοματικής κοιλότητας, του φάρυγγα και του λάρυγγα, τα επιθηλιακά κύτταρα είναι πιο ευαίσθητα σε μόλυνση HPV [2, 22-26]. HPV τύπους ταξινομούνται ως υψηλού κινδύνου (HPV-16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 και 82) και χαμηλού κινδύνου (HPV-26, 30, 34, 53, 66, 67, 69, 70, 73, 82, 85) με βάση την καρκινογόνο δυναμικό τους. HPV-16 και HPV-18 τύπου υψηλού κινδύνου έχουν θεωρηθεί ως σημαντική ανταποδοτικού γονότυπους στην ΕΘΕΓ [27, 28].

Οι ρυθμιστές πλοίαρχος του κυτταρικού κύκλου, p53, pRB και p16 είναι σημαντικό ογκοκατασταλτικά γονίδια που έχουν σημαντική ρόλο στον κυτταρικό κύκλο ρυθμιστικής οδού και του καρκίνου [29]. Αυτά τα γονίδια παίζουν σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της ακεραιότητας γονιδιωματική και του κυτταρικού κύκλου, και τον έλεγχο της απόπτωσης [30, 31]. Το HPV υψηλού κινδύνου (HR-HPV) 16 και 18 ασκούν κυρίως καρκινογόνο δυναμικό τους μέσω της έκφρασης του Ε6 και Ε7 ογκοπρωτείνης. Το ογκογονίδιο ενεργοποίηση Ε6 οδηγεί σε αποικοδόμηση της ρ53 μέσω της αλληλεπίδρασής της με την Ε3 ουβικιτίνης λιγάση E6AP [31, 32]. Η δραστική Ε7 υποβαθμίζει την ρετινοβλαστώματος καταστολέα όγκου πρωτεΐνη (pRb) που οφείλεται στην οποία E2F παράγοντα μεταγραφής διεγείρεται και τα αποτελέσματα σε υπερέκφραση του ρ16 ΙΝΚ4 &, έναν αναστολέα της εξαρτώμενης από κυκλίνη κινάσης [31, 32]. Με σκοπό την καταστρατήγηση των παραπάνω πλοίαρχος φύλακες του κυτταρικού κύκλου, HPV γονίδια αναλάβει τον έλεγχο του κυτταρικού πολλαπλασιασμού που οδηγεί σε ανεξέλεγκτη κυτταρική διαίρεση.

Η Βόρεια Ανατολική (ΝΕ) την περιοχή της Ινδίας έχει ρυθμιστεί μεγάλη ηλικία συχνότητα εμφάνισης (AAR) ανά 1, 00.000 άτομα για HNCs στην Ινδία [33]. Μεταξύ όλων των μητρώων του καρκίνου με βάση τον πληθυσμό (PBCR), η συνοικία Kamrup Urban (KUD) της ΒΑ περιοχή της Ινδίας κατέλαβε την δεύτερη θέση (AAR-156,3) στις γυναίκες και η τέταρτη (AAR-185.2) στους άνδρες για όλους τους χώρους του καρκίνου συχνότητα. Το ΕΣΕ για κορυφαίους χώρους ΕΘΕΓ στο KUD PBCR έχει ως εξής: Γλώσσα 9.4 (αρσενικό), 3.2 (θηλυκό)? στόμα 7,7 (αρσενικό), 7.6 (γυναίκες)? υπογλυκαιμία φάρυγγα 7,7 (αρσενικό) και 7.6 (γυναίκες)? λάρυγγα 8.2 (αρσενικό). που σχετίζονται με τον καπνό καρκίνων (TRC) αντιπροσώπευαν & gt? 40%, αλλά & lt? 50% στους άνδρες, ενώ στις γυναίκες ήταν & gt? 30%, αλλά & lt? 40% όλων των περιπτώσεων ΕΘΕΓ στο KUD PBCR [33]. Ο πληθυσμός της περιοχής ΒΑ αντιπροσωπεύει μοναδική εθνότητα, ξεχωριστό στυλ ζωής και διατροφικές συνήθειες που μπορούν να διαδραματίσουν σημαντικό ρόλο στην πολύπλοκη αλληλεπίδραση των περιβαλλοντικών και γενετικών παραγόντων που μπορεί να συνδέονται με την υψηλή συχνότητα εμφάνισης της ΕΘΕΓ σε αυτή την περιοχή. Υπάρχει έλλειψη επαρκών στοιχείων σχετικά με την κατάσταση HR-HPV σε περιπτώσεις ΕΘΕΓ της ΒΑ Ινδία. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση του επιπολασμού της λοίμωξης hr-HPV και την ένωσή τους με betal λίρες το μάσημα, το κάπνισμα, καπνός, η κατανάλωση αλκοόλ και κλινικο-παθολογικών χαρακτηριστικών των ασθενών. Στην παρούσα μελέτη, Ε6 ένθετα multiplex PCR μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για την ευαίσθητη και ειδικού τύπου ανίχνευση των λοιμώξεων από HPV βασίζονται στην ενίσχυση του ιικού ογκογονιδίου Ε6 /Ε7 όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28, 34]. Το Hybrid Capture 2 (HC2) δοκιμή, η οποία είναι FDA-ΗΠΑ ενέκρινε και την ΠΟΥ συνιστάται για την ανίχνευση του ιού HPV σε κλινικά δείγματα της τραχηλικής ενδοεπιθηλιακής βλάβες (CINS) έχουν εφαρμοστεί για πρώτη φορά για την ανίχνευση HR-HPV σε ΕΘΕΓ δείγματα της ΒΑ Ινδία .

Υλικά και Μέθοδοι

ασθενείς Χαρακτηριστικά

Ένα σύνολο 106 ασθενών ΕΘΕΓ εντάχθηκαν σε αυτή τη μελέτη (αρσενικό 73? θηλυκό 33). δείγματα καρκινικού ιστού ελήφθησαν από το Χειρουργικής Κεφαλής και Τραχήλου ογκολογία μονάδα Δρ Bhubaneswar Borooah Cancer Institute (BBCi), Περιφερειακό Κέντρο Καρκίνου, Γκαουχάτι, Ινδία. Τα ιστοπαθολογικά επιβεβαιωμένα κρούσματα ΕΘΕΓ εγγράφηκαν κατά τη διάρκεια της περιόδου Οκτωβρίου 2011 έως τον Σεπτέμβριο του 2013. Η δημογραφική και τον τρόπο ζωής πληροφορίες συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας ένα προ-σχεδιασμένο ερωτηματολόγιο μέσω της προσωπικής συνέντευξης. Οι πληροφορίες που συλλέγονται για τις δημογραφικές μεταβλητές περιλάμβαναν την ηλικία, το φύλο, την εθνικότητα, την εκπαίδευση, την κοινωνικο-οικονομική κατάσταση, παράγοντες του τρόπου ζωής του αλκοόλ, το κάπνισμα, betel καρύδι μάσημα και άλλες διατροφικές συνήθειες. Η αμερικανική μεικτής επιτροπής για ΤΝΜ σταδιοποίηση του καρκίνου χρησιμοποιήθηκε για σταδιοποίηση και τη διάγνωση. Οι ασθενείς είχαν ενημερωθεί σχετικά με τη μελέτη και την γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε πριν από τη συλλογή των δειγμάτων. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας θεσμικό του Δρ Bhubaneswar Borooah Cancer Institute (BBCi), Γκαουχάτι, Assam (Ινδία).

Γονιδιωματική απομόνωση DNA από καρκινικό ιστό

δείγματα βιοψίας ιστού συλλέχθηκαν σε όγκο 1 mL αλατόνερου ρυθμισμένου με φωσφορικό (PBS) και το γονιδιωματικό DNA εκχυλίστηκε από το ομογενοποιημένο ιστό χρησιμοποιώντας QIAamp DNA μίνι κιτ (Qiagen, Germany) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ποσότητα και η ποιότητα του απομονωμένου γενωμικού DNA επιβεβαιώθηκε με Nano-φασματοφωτόμετρο (Bio-φωτόμετρο, Eppendorf, Γερμανία) και ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης αντίστοιχα.

Υψηλή -Κίνδυνος HPV DNA ανίχνευση με Hybrid Capture 2 (HC2) Δοκιμασία

το γονιδιακό DNA που απομονώθηκε από δείγματα βιοψίας από τους ασθενείς είχαν ανασταλεί στο μέσο μεταφοράς δείγματος (ΕΕΜ) (Qiagen, Γερμανία) και η παρουσία του HPV ανιχνεύθηκε από HC2 υψηλού κινδύνου HPV DNA τεστ

™ κιτ (Qiagen, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Στα δείγματα ασθενών STM, χημειοφωταυγή ανίχνευση των 13 πιο κοινούς τύπους hr-HPV (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, και 68) πραγματοποιήθηκε με τη χρήση αυτοματοποιημένων DML 2000 σύστημα φωτόμετρο (Digene, USA). Φως σήματα μετρήθηκαν ως σχετικές μονάδες φωτός (RLUs) με ένταση φωτός υποδεικνύει την παρουσία ή την απουσία του DNA στόχου σε το δοκιμαζόμενο δείγμα. Η μέση τιμή RLU για υψηλού κινδύνου HPV βαθμονομητή των θετικών δειγμάτων ελέγχου θεωρήθηκε ως τιμή θετικής αποκοπής (CO). Οι ασθενείς του δείγματος με RLU /CO αναλογία τιμής ≥ 1 με HPV ανιχνευτή υψηλού κινδύνου θεωρήθηκαν «θετικά» για οποιονδήποτε από τους τύπους hr-HPV (16,18,31,33,35,39,45,51,52,56, 58,59 και 68). Η απουσία hr-HPV DNA κάτω από το όριο ανίχνευσης υποδηλώνεται σε δείγμα με RLU /CO & lt? 1. Όταν RLU = CO προσδίδει παρουσία περίπου 5000 αντίγραφα του ιού στο δείγμα. Δύο επιβεβαιωμένες περιπτώσεις καρκίνου του τραχήλου με hr-HPV θετικότητας χρησιμοποιήθηκαν επίσης σε κάθε δοκιμαστική λειτουργία και φορέα DNA ως αρνητικός έλεγχος [35, 36]. Οι εκθέσεις δοκιμών παρήχθησαν σύμφωνα με τη μορφή του Hybrid Capture

λογισμικού TM ver. 2.0. Όλα τα δείγματα εξετάστηκαν δύο φορές και τα δείγματα με HR-HPV θετικό αποτέλεσμα και στις δύο δοκιμαστική λειτουργία ήταν μόνο σκόραρε ως HR-HPV θετικά.

Ε6 ένθετα multiplex PCR (NMPCR) για HPV γονοτυπική

Η δείγματα βρέθηκαν θετικά για hr-HPV DNA στην δοκιμασία HC2 αναλύθηκαν περαιτέρω για τον HPV γονότυπου. Το ένθετο αντίδραση Ε6 PCR 1

st γύρος έγινε σε όγκο 20 μΐ χρησιμοποιώντας 25-100 ng γενωμικού DNA, ρυθμιστικό 1Χ Maxima Hot Start PCR, 1.5-2.0 mM MgCl

2 (Thermo Scientific, USA), 250 ηΜ κάθε εκκινητές (Metabion, Γερμανία), 250 μΜ εκάστου dNTPs και 0.5 U Maxima Hot Start Taq DNA πολυμεράσης (Thermo Scientific, USA). Η κατάσταση θερμικών κύκλων για 1

ου γύρου των Ε6 PCR ήταν: Denaturation- 95 ° C- 5 λεπτά, 38 κύκλους ενίσχυσης με Denaturation- 95 ° C- 30 sec, Annealing- 55 ° C- 45 sec, ‘επέκταση 72 ° C- 90 sec, και η τελική ‘επέκταση 72 ° C για 7 λεπτά. Το 1

st γύρο προϊόν Ε6 PCR (630 bp) χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα (1 μL) για 2

ος γύρος φωλιασμένη αντίδραση για τον HPV γονοτυποποίηση χρησιμοποιώντας πολυπλεξίας σύνολο ειδικών ΗΡν τύπου εκκινητές. Ο όγκος της αντίδρασης και τα συστατικά ήταν παρόμοια όπως αναφέρθηκε ανωτέρω. Η 2

ου γύρου ένθετα κατάσταση PCR για τον HPV γονοτυπική ήταν παρόμοιο με 1

ου γύρο με αλλαγές μόνο σε Annealing- 55 ° C- 40 sec και επέκταση-72 ° C- 45 δευτερόλεπτα [34]. Όλα τα προϊόντα PCR κατέστησαν ορατά σε γέλη αγαρόζης 2% (Amresco, USA) χρωματίστηκαν με βρωμιούχο αιθίδιο (Amresco, USA) σε Gel Doc XR

™ σύστημα (Bio-Rad, USA). Τα δείγματα hr-HPV θετικά τραχηλικού πλακώδους καρκινώματος DNA χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος σε κάθε εκτέλεση PCR. Οι αλληλουχίες εκκινητών που περιγράφονται στον Πίνακα 1.

Η

Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD ή σε συχνότητες (%). Η δοκιμή χ² και ακριβής δοκιμασία Fisher χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιορίσουν τη σχέση μεταξύ κλινικο-παθολογικών χαρακτηριστικά και την κατάσταση hr-HPV. Μονοπαραγοντική ανάλυση έγινε με υπολογισμό των λόγων πιθανοτήτων (OR), μαζί με 95% διαστήματα εμπιστοσύνης (ΠΙ) και P ≤0.05 θεωρήθηκε ότι είναι το επίπεδο σημαντικότητας. Epi-info Version 6 λογισμικό που χρησιμοποιείται για τη στατιστική ανάλυση

Αποτελέσματα

Χαρακτηριστικά της

Ασθενών

Στον πληθυσμό της μελέτης (n = 106), 68,86% των ασθενών ( n = 73) ήταν άνδρες και το 31,13% ήταν (n = 33) τα θηλυκά. την ηλικία των ασθενών κυμαινόταν 25-80 ετών (μέσος όρος = 53,41 χρόνια). Περισσότερα από τα τρία τέταρτα (80.18%) των ασθενών ήταν από τις αγροτικές περιοχές, το υπόλοιπο (19,56%) προέρχονταν από περιαστικές και αστικές περιοχές. Μη χορτοφάγους διατροφική συνήθεια αναφέρθηκε από & gt? 92% των ασθενών (Πίνακας 2). Ο πληθυσμός της μελέτης ήταν ομαδοποιούνται σε είτε της «hr-HPV θετικά» (n = 33) ή «HPV αρνητικό» (n = 73) με βάση την παρουσία των hr-HPV DNA. Τα δημογραφικά χαρακτηριστικά των ασθενών και των διατροφικών συνηθειών τους που αναφέρονται στον Πίνακα 2. Οι δημογραφικοί παράγοντες δεν σχετίστηκαν σημαντικά με τη μόλυνση HR-HPV (p & gt? 0,05). Από τις 106 περιπτώσεις, οι ανατομικές θέσεις μεταξύ κλινικο-παθολογική χαρακτηριστικά των ασθενών ήταν της στοματικής κοιλότητας 81,13% (n = 86), στοματοφάρυγγα 4,71% (n = 5), υποφάρυγγα 2,83% (n = 3), του λάρυγγα 8,49% ( n = 9) σε (Πίνακας 3). Ποσοστά των ασθενών που διαγιγνώσκονται με προχωρημένο στάδιο HNCs ήταν σταδίου III 24,52% (n = 26), IVA- 55,66% (n = 59) και IVB 5,66% (n = 6). Πλακώδες καρκίνωμα ήταν κυρίαρχη 85,85% (n = 91) ιστολογικό τύπο στην παρούσα μελέτη πληθυσμό.

Η

ανίχνευσης HR-HPV και η σύνδεσή της με τη δημογραφική και Κλινικο-Παθολογική χαρακτηριστικά

Το HPV DNA υψηλού κινδύνου ανιχνεύθηκε με ένθετες πολλαπλή PCR (NMPCR) σε 31,13% (n = 33) και υβριδικούς σύλληψης σε 24,52% (n = 26) των ασθενών HNC. Η ευαισθησία και η αρνητική θετική προβλεπτικά βρέθηκε να είναι 100% κάθε? η εξειδίκευση και η θετική προγνωστική αξία (PPV) παρατηρήθηκε ως 91,19% και 78,78% αντίστοιχα. Η δοκιμή αυτή ταξινομείται 93,29% των περιπτώσεων σωστά και η περιοχή κάτω από την καμπύλη βρέθηκε ως 89.50% (ρ & lt? 0.001) με 95% CI (81,30% – 97,80%). Για την επιβεβαίωση των βιολογικώς δραστικών HPVs, έκφραση ρ16 αναλύθηκε σε δύο HPV θετικών και αρνητικών HPV περιπτώσεις, και πάνω από την έκφραση του ρ16 βρέθηκε σε HPV θετικών περιπτώσεων η οποία είναι ένας έμμεσος δείκτης για την παρουσία HPV (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε HC2 των δειγμάτων που ελέγχθηκαν, η μέση τιμή RLU ήταν της τάξεως των 99 έως 3466, και η μέση θετική τιμή αποκοπής (CO) για hr-HPV ήταν 347 (Qiagen, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες. Τα Υψηλά HPV κινδύνου θετικές περιπτώσεις ήταν ο γονότυπος για τον HPV υποτύπους χρησιμοποιώντας Ε6 ένθετα πολλαπλή PCR. Οι λεπτομέρειες αστάρι που χρησιμοποιούνται για την Ε6 ένθετα multiplex PCR [29] αναφέρονται στον Πίνακα 1. Το HR-HPV θετικών κρουσμάτων περαιτέρω univariant αναλύθηκαν για τις συνήθειες του τρόπου ζωής και σημαντική συσχέτιση βρέθηκε μεταξύ του HR-HPV θετικότητα και η κατανάλωση αλκοόλ (OR = 7,56? 95% CI 2,64 έως 22,19, p & lt?. 0.001) όπως υποδεικνύεται στον πίνακα 2. Τα δείγματα πότης αλκοόλ έχουν δείξει να φέρει λοίμωξη hr-HPV σε σύγκριση με τους μη πότες. Να κοιτάξει έξω για τη συνεργιστική ή συμπληρωματική δράση μεταξύ του καπνού και του αλκοόλ συνήθειες, παρατηρήσαμε σημαντική συσχέτιση με το HR-HPV θετικότητας (OR = 3,09?. 95% CI 1,00 – 9,65, p = 0,02), αλλά όταν τις περιπτώσεις των καπνιστών και των συνηθειών αλκοόλ ήταν μαζί αναλύεται και υπολογίζεται διαπιστώσαμε ότι δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση με hr-HPV θετικότητας. Οι chewers betel καρύδι, επίσης, είχε δείξει περισσότερη ώρα-HPV λοίμωξη. Μεταξύ hr-HPV θετικές περιπτώσεις (n = 33), 39.40% (n = 13) ασθενείς ήταν καπνός μη chewers και 60,60% (n = 20) ήταν chewers καπνού. Μη ομάδα καπνιστές 69,69% (n = 23) έχουν περισσότερα πιθανότητα μόλυνσης hr-HPV σε σύγκριση με τους καπνιστές 30,31% (10). Οι ασθενείς που διαμένουν σε αγροτικές περιοχές έχουν περισσότερη ώρα-HPV θετικότητας 87,88% (n = 29) σε σύγκριση με ημι αστικές 9,09% των κατοίκων (n = 3) και των αστικών 3,03% (1%) περιοχή. Δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση βρέθηκε μεταξύ του HR-HPV λοίμωξης και των δύο φύλων, betel λίρες, chewers καπνού, η συνήθεια του καπνίσματος, διατροφική συνήθεια, την ηλικία και τον τόπο κατοικίας (Πίνακας 2).

Μεταξύ HR-HPV θετικές περιπτώσεις (n = 33), της στοματικής κοιλότητας 72,72% (n = 24), του λάρυγγα 6,06% (n = 2), υποφάρυγγα 6,06% (n = 2) και του στοματοφάρυγγα 15,15% (n = 5) είχαν hr-HPV DNA (Πίνακας 3). Υπήρξε σημαντική συσχέτιση μεταξύ hr-HPV μόλυνσης και στοματοφαρυγγική θέση του όγκου (ρ = 0,01). Πλειοψηφία των HR-HPV θετικές περιπτώσεις 90.90% (30 από 33) παρουσιάστηκαν με προχωρημένο στάδιο ΙΙΙ, IVA ή ασθένεια IVB. Ιστολογικά, 90.90% HR-HPV θετικές περιπτώσεις ήταν πλακώδες καρκίνωμα, 6,06% ήταν μυρμηκιώ καρκίνωμα και 3,03% ήταν άλλα καρκινώματα (αδενοκυστικό καρκίνωμα, άτρακτο κυττάρων κακοήθη) (Πίνακας 3). Δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση του σταδίου του όγκου ΤΝΜ, βαθμός ιστολογίας και μορφολογίας με το HR-HPV θετικότητας (p & gt? 0,05). Όταν περιπτώσεις HNC αναλύθηκαν με παράγοντες του τρόπου ζωής, η κατανάλωση αλκοόλ βρέθηκε να σχετίζεται σημαντικά με λοίμωξη hr-HPV (ρ & lt? 0.001) (Πίνακας 2). Στη συνέχεια ανέλυσε την κατάσταση HR-HPV σε μορφές καρκίνου του στόματος κοιλότητα μόνη της (Πίνακας 4) και σε σχέση με το κάπνισμα, τον καπνό, το αλκοόλ, η χρήση betel καρύδι και διαπίστωσε ότι υπήρχε σημαντική συσχέτιση HR-HPV κατανάλωση θετικότητα και το αλκοόλ (OR = 2,98? 95% CI. 0,95 – 9,43, p = 0,03). Για να βρείτε τη συνεργιστική ή συμπληρωματικές επίδραση του καπνού και του αλκοόλ συνήθειες, από την μονοπαραγοντική ανάλυση διαπιστώθηκε ότι υπάρχει σημαντική συσχέτιση HR-HPV θετικότητας με τον καπνό και το αλκοόλ συνήθειες (OR = 2,94?. 95% CI 0,95 – 8,88, p = 0,05 ) (Πίνακας 4). Αλλά όταν ανέλυσε την περίπτωση των καπνιστών και τις συνήθειες αλκοόλ, δεν υπάρχει σημαντική συσχέτιση βρέθηκε με hr-HPV θετικότητας.

Η

Σύλλογος HPV τύπους 16 και 18 με τη δημογραφική και Κλινικο-παθολογικά χαρακτηριστικά

Μεταξύ HR-HPV θετικές περιπτώσεις, HPV-16 ήταν παρόν σε 81,81% (n = 27) και HPV-18 σε 18,18% (n = 6) των περιπτώσεων. Οι chewers καπνού είχαν σημαντικά αυξημένο κίνδυνο HPV-16 μόλυνση (ρ = 0,02), αλλά όχι του HPV-18. Ο κίνδυνος της HPV-16 που είναι θετικό είναι 11,88 φορές περισσότερο σε chewers σε σύγκριση με μη-chewers με 95% CI (1,01 έως 317,2). Ωστόσο, η συνήθεια του καπνίσματος δεν δείχνουν καμία σημασία σε σύγκριση με τους μη καπνιστές (OR- 0,14) με 95% CI (0,01 – 1,28). Η HPV-18 θετικότητα βρέθηκε σε 5 περιπτώσεις (83,33%) των μη-chewers σύγκριση με chewers. μόλυνση HPV-16 σε καπνιστές βρέθηκε να είναι υψηλότερη (ρ = 0.05) σε σύγκριση με HPV-18 (Πίνακας 5), αν και HR-HPV DNA βρέθηκε να σχετίζεται σημαντικά με την κατανάλωση αλκοόλ (Πίνακας 2), αλλά με αναφορά σε HPV – 16 μόνο του ή, ΗΡν τύπου 18 και μόνο, δεν υπήρχε καμία τέτοια συσχέτιση βρέθηκε με αυτό. Η στοματική κοιλότητα 70,37% (n = 19), του λάρυγγα 7,41% (n = 2), υποφάρυγγα 7,41% (n = 2) και του στοματοφάρυγγα 14,82% (n = 4) ασθενείς με καρκίνο έχουν HPV-16, όπως οι περισσότεροι κυρίαρχος τύπος hr-HPV ενώ HPV -18 βρέθηκε μόνο σε στοματική κοιλότητα 83,33% (n = 5) και του στοματοφάρυγγα 16,66% (n = 1). Στο καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων ιστολογική υπότυπο, ο HPV-16 βρέθηκε σε 25 περιπτώσεις (92,59%) και HPV-18 σε 5 περιπτώσεις (83,34%) ανιχνεύθηκε. HPV-16 ήταν κυρίαρχη στους άνδρες 66,66% (n = 18), καθώς και αναλογικά υψηλή σε θηλυκά 33,44% (n = 9), ενώ HPV-18 ήταν περισσότερο στους άνδρες 83,33% (n = 5) σε σύγκριση με τα θηλυκά 16,67% ( n = 1) περιπτώσεις. Betel λίρες μάσημα, η κατανάλωση αλκοόλ, η ηλικία, το φύλο δεν έδειξε καμία σημαντική συσχέτιση με την παρουσία του HPV-16, 18 είδη (p & gt? 0,05). (Πίνακας 5)

Η

Συζήτηση

Ο ιός των ανθρώπινων θηλωμάτων (HPV) έχει ταυτοποιηθεί ως αιτιολογικός παράγοντας σε υποσύνολο του καρκίνου κεφαλής και τραχήλου ειδικά στοματοφαρυγγικού καρκίνου του [37]. Οι περισσότεροι από τους ασθενείς με καρκίνωμα θετικά σχετίζεται στοματοφαρυγγική HPV έχουν αναφερθεί να είναι νεότεροι σε ηλικία και κυρίως δεν είχαν ιστορικό του καπνού /αλκοόλης χρησιμοποιούν [38]. Κάποιες ερευνητικές ομάδες έχουν υποστηρίξει ότι ο HPV θετικές και HPV περιπτώσεις αρνητικών ΕΘΕΓ θα πρέπει να θεωρούνται ως δύο ξεχωριστές κλινικές, παθολογικές οντότητες και τα θεραπευτικά σχήματα πρέπει να επινοηθούν αναλόγως [37-39]. Το κλάσμα και ο πολλαπλασιασμός των ικανοτήτων υποξίας των όγκων ήταν σημαντικά μειωμένα σε θετικά καρκινικά κύτταρα HPV μετά την ακτινοβόληση σε σύγκριση με αρνητικά κύτταρα HPV [40]. Απεδείχθη ότι ο HPV θετικά τοπικά προχωρημένο ασθενείς HNC έδειξαν σημαντικά υψηλότερες παθολογική πλήρης απόκριση σε σύγκριση με HPV αρνητικών περιπτώσεων που υποβάλλονται σε αγωγή χημειοθεραπείας [41]. Πολυάριθμες μελέτες έχουν αναφέρει ανίχνευση HPV DNA σε HNSCC με διαφορετικά ποσοστά, οι τεχνικές ανίχνευσης που περιλαμβάνονται στην situ υβριδισμό και υβριδισμό Southern blot (κατώτερο μέθοδοι ευαισθησία) ή PCR (μέθοδοι υψηλή ευαισθησία) [42]. Επιπλέον, οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για τη δειγματοληψία και την αποθήκευση ποικίλλουν επίσης. Η έλλειψη διεθνώς αποδεκτών τυποποιημένων και κλινικά σχετική διαδικασία για την ανίχνευση του HPV έχει εγείρει ανησυχίες σχετικά με την εφαρμογή τους στην καθημερινή κλινική πράξη. Η μελέτη μας έχει, για πρώτη φορά αξιολόγηση της δυνατότητας εφαρμογής δοκιμασίας HC2 σε κλινικά δείγματα των περιπτώσεων HNC από ΒΑ Ινδία. Προτείνουμε ότι Hybrid Capture 2 (HC2) δοκιμασία, η οποία έχει εγκριθεί από την Υπηρεσία Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA, ΗΠΑ), για την ανίχνευση HR-HPV σε κλινικά δείγματα του τραχήλου της μήτρας, μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση HR-HPV σε δείγματα ΕΘΕΓ. Λόγω της ημι-ποσοτική φύση του ποσοτικού προσδιορισμού ΚΘ2 μπορεί να έχει εφαρμογή για την προγνωστική αξιολόγηση HR-HPV σε ασθενείς ΕΘΕΓ.

Χρησιμοποιήσαμε Ε6 ένθετα multiplex PCR (NMPCR) για HPV του γονότυπου, και βρήκε τον HPV-16 σε 81,81 % (n = 27) και HPV-18 στο 18,18% (n = 6) της hR-HPV θετικό (n = 33) περιπτώσεις, που είναι 31.13% των ασθενών ΕΘΕΓ (33/106). δεδομένα της μελέτης μας υποστηρίζεται από προηγούμενες μελέτες από την Ινδία, η οποία είχε βρεθεί HPV DNA στην περιοχή του 22% έως 73% σε προφορική περιπτώσεων καρκίνου [43-45]. Μεταξύ (n = 33) HR-HPV περιπτώσεις βρήκαμε (n = 27) HPV 16 στην οποία 70,37%, 14,82%, 7,41%, 7,41% και (n = 7) HPV-18 σε 83,33%, 16,66%, 0 %, και 0% του στοματική κοιλότητα, στοματοφαρυγγική, του λάρυγγα και ασθενείς με καρκίνο υποφάρυγγα αντίστοιχα. Η μελέτη μας δείχνει υψηλότερη HPV-16, 18 ποσοστό μόλυνσης σε σύγκριση με προηγούμενες μελέτες από την Ινδία [43-46]. Βρήκαμε ότι στοματοφαρυγγική ιστοσελίδα του καρκίνου σε σύγκριση με άλλες περιοχές του όγκου έχει δείξει σημαντικό κίνδυνο για λοίμωξη από HPV υψηλού κινδύνου. Τα δεδομένα μας υποστηρίζεται από προηγούμενη μελέτη, στην οποία βρέθηκε να έχει σύνδεση της στοματοφαρυγγικής καρκίνου με τη μόλυνση υψηλού κινδύνου HPV [47]. Επιδημιολογία των θετικών στοματοφαρυγγικής ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα του HPV (OPSCC) είναι διακριτές από αρνητικές HPV και χαρακτηρίζονται από μικρότερη ηλικία και έντονα σχετίζεται με τη σεξουαλική συμπεριφορά. συνδέονται HPV καρκίνο στοματοφαρυγγική (HPV-OPC) αυξάνεται σε συχνότητα και έχει ξεχωριστές κλινικές, παθολογικές, μοριακής και επιδημιολογικές χαρακτηριστικά [38]. Η διαφορά με τις παρατηρήσεις μας με άλλες μελέτες μπορεί να αποδοθεί σε διαφορετικές μεθοδολογίες, οι εθνοτικές διαφορές, θέσεις όγκου κλπ [48]. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι betel καρύδι μάσημα, το κάπνισμα δεν μπορεί να έχει σημαντική συσχέτιση με λοίμωξη hr-HPV. Το HR-HPV θετικότητα στις περιπτώσεις ΕΘΕΓ ήταν μικρή η οποία μπορεί να συγχύσει το ρόλο του betel καρύδι, το κάπνισμα ως παράγοντες κινδύνου για λοίμωξη από HPV. Απεδείχθη από Ang et al (2010) ότι ο HPV θετικά στοματοφαρυγγική εξέλιξης του καρκίνου δεν μπορεί να συνδέεται ισχυρά με καπνίσματος [47]. Αλλά άλλες μελέτες έχουν δείξει συσχέτιση του καπνού με λοίμωξη από HPV [49].

Παρατηρήσαμε στα δεδομένα μας ότι chewers καπνού έχουν σημαντικά υψηλότερη μόλυνση hr-HPV, θέτοντας μάσημα καπνού ως παράγοντας κινδύνου για HR-HPV λοίμωξη. Η συγκέντρωση της νικοτίνης και η διάρκεια της έκθεσης του στο κύτταρο μπορεί να μεταβάλλει τις μεσολάβηση αντιγόνου μονοπάτια σηματοδότησης [50]. Μεταβολή στην μεσολάβηση αντιγόνου γεγονότα σηματοδότησης στα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος μπορεί να είναι ο μηχανισμός με τον οποίο η νικοτίνη ή άλλα συστατικά του τσιγάρου αναστέλλουν την απόκριση του κυττάρου για /ιικής μόλυνσης βακτηριακών [50]. Προτείνουμε ότι σχετίζεται καπνού καρκινογόνες ουσίες ενδέχεται να επιφέρει μεταβολές στο γενετικό γεγονότα που μπορεί να οδηγήσει σε μοριακές αλλαγές, καθιστώντας το άτομο επιρρεπή σε hr-HPV λοίμωξης.

Στην παρούσα λοίμωξη μελέτη HR-HPV βρέθηκε να σχετίζεται σημαντικά με η κατανάλωση αλκοόλ σε περιπτώσεις ΕΘΕΓ. Oh et al (2014) πρόσφατα έδειξαν ότι hr-HPV φορτίου και η κατανάλωση αλκοόλ μπορεί να έχει συνεργιστική επίδραση στην hr-HPV λοίμωξης και η επιμονή του στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας [51]. Μια άλλη πρόσφατη μελέτη έχει δείξει ότι η πρόσληψη αλκοόλ συσχετίστηκε με σημαντικά αυξημένο κίνδυνο για λοίμωξη HPV σε άνδρες [52]. Αυτό υποστηρίζει την παρατήρηση μας ότι η πρόσληψη αλκοόλ, μπορεί να δράσει ως παράγοντας κινδύνου για την HPV λοίμωξη.

Η αιθανόλη, ένα σημαντικό συστατικό των αλκοολούχων ποτών, οξειδώνεται σε ακεταλδεΰδη από αφυδρογονάσες αλκοόλης (ADH). Η ακεταλδεΰδη μεταβολίζεται σε οξικό με αφυδρογονάσες αλδεΰδης (ALDH). Κακή στοματική υγιεινή και το κάπνισμα μπορεί να αλλάξει τις προφορικές βακτηριακή χλωρίδα η οποία μπορεί να οδηγήσει σε αύξηση της παραγωγής ακεταλδεΰδη [53]. Σε ζωικά μοντέλα, η ακεταλδεΰδη έχει αποδειχθεί ως καρκινογόνες και μεταλλαξιογόνες [54]. Γενετικοί παράγοντες, όπως ADH /ALDH2 πολυμορφισμός, η έλλειψη ALDH2 ή χαμηλά επίπεδα έκφρασης της ALDH2 και το αλκοόλ συνήθειες κατανάλωσης οινοπνεύματος έχουν αναφερθεί να σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο καρκίνου κεφαλής και τραχήλου [55, 56].

Το αλκοόλ μπορεί να επίσης να τροποποιήσουν έμφυτη ανοσοαπόκριση σε δοσοεξαρτώμενο τρόπο που μπορεί να οδηγήσει σε αλλοιωμένη φλεγμονώδη απόκριση στη λοίμωξη [57]. Από ανοσολογική απόκριση παίζει σημαντικό ρόλο στη μόλυνση από HPV, η κατανάλωση αλκοόλ μπορεί να βοηθήσει στην αποφυγή της ανοσολογικής απόκρισης για τη λοίμωξη HPV. Οι συστημικές συνιστώσες της ασυλίας, όπως το επίπεδο του ορού της κυτοκίνης βρέθηκε να αυξηθεί σε επίμονες περιπτώσεις λοίμωξης από HPV [58].

Η μελέτη μας παρέχει στοιχεία για αύξηση της ευπάθειας για τη μόλυνση HR-HPV σε chewers τον καπνό και το αλκοόλ πότες ως επί το πλείστον σε ασθενείς με καρκίνο του στόματος κοιλότητα. Η παρατήρησή μας είναι καλά υποστηρίζεται από προηγούμενες μελέτες ΕΘΕΓ από την Ινδία και σε όλο τον κόσμο [14]. Από το συνολικό αριθμό των περιπτώσεων, όταν το μάσημα του καπνού και το κάπνισμα συνήθειες αναλύθηκαν με HPV, οι ενώσεις δεν ήταν σημαντικές (Πίνακας 2), καθώς μεγάλο ποσοστό του πληθυσμού ήταν HPV αρνητικά και HPV θετικές περιπτώσεις ήταν λιγότερο. Αλλά όταν ελήφθησαν οι συνήθειες μάσημα μαζί HPV θετικές περιπτώσεις και μόνο, σημαντική συσχέτιση βρέθηκε (Πίνακας 4) αποδεικνύει ότι το μάσημα του καπνού και αλκοόλ πράξη κατανάλωση ως παράγοντες κινδύνου για λοίμωξη από HPV. Περισσότερο τον αριθμό των στοματοφαρυγγικής καρκίνων στη μελέτη μας, θα μπορούσε να φέρει μια καλύτερη αξιολόγηση του αλκοόλ και του καπνού συνεργασία με HR-HPV σε αυτούς τους καρκίνους. Έχουμε επικεντρωθεί κυρίως στην HR-ανίχνευση του DNA του HPV με τη χρησιμοποίηση νεότερες μεθοδολογία, όπως ανάλυση HC2 και Ε6-NMPCR που είναι λιγότερο χρησιμοποιούνται σε ΕΘΕΓ. Η κατανάλωση αλκοόλ και καπνού για μάσημα /κάπνισμα είναι ευρέως διαδεδομένες συνήθειες στην ινδική πληθυσμού North-East. Αισθανόμαστε ότι η μαζική ευαισθητοποίηση μέσω των προγραμμάτων ευαισθητοποίησης cum προσυμπτωματικού ελέγχου για παράγοντες κινδύνου ΕΘΕΓ μπορεί να βοηθήσει στη μείωση της εμφάνισης ΕΘΕΓ στον πληθυσμό ΒΑ στο μέλλον.

Συμπεραίνουμε από τα σημερινά δεδομένα της μελέτης μας ότι hr-HPV λοίμωξη μπορεί να είναι πιο διαδεδομένη σε chewers καπνού, πότες αλκοόλ και δρουν ως παράγοντες κινδύνου για λοίμωξη από HPV σε περιπτώσεις ΕΘΕΓ της βορειοανατολικής Ινδίας. Hybrid Capture 2 (HC2) δοκιμασία λόγω της υψηλής αρνητική προγνωστική αξία, η εξειδίκευση και η ευαισθησία της μπορεί να εφαρμοστεί για HR-ανίχνευση του HPV σε κλινικά δείγματα ΕΘΕΓ.

Ευχαριστίες

Σας ενημερώνουμε ότι η συνεργασία της κεφαλής και του τραχήλου ασθενείς που συμμετείχαν στη μελέτη. Μπορούμε επίσης να ευχαριστήσω Madhumita Dey και Anindita Dutta για τις πολύτιμες υποδείξεις και την επεξεργασία του χειρογράφου.