Αφηρημένο

Η απορρύθμιση του αυξητικού παράγοντα μεταμόρφωσης-β (TGFβ) μονοπατιού στο επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών σηματοδότησης έχει αναφερθεί, αλλά ο ακριβής μηχανισμός υποκείμενο διαταράσσεται TGFβ σηματοδότησης στην ασθένεια παραμένει ασαφής. Πραγματοποιήσαμε ανοσοκαθίζηση χρωματίνης που ακολουθείται από αλληλούχηση (τσιπ seq) για τη διερεύνηση του γονιδιώματος σε επίπεδο διαλογή δέσμευσης ΤΟΡβ-επαγόμενη Smad4 σε επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών. Μετά ΤΟΡβ διέγερση του Α2780 επιθηλιακού καρκίνου κυτταρική γραμμή ωοθηκών, εντοπίσαμε 2362 γενετικούς τόπους δέσμευσης Smad4 και 318 διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων στόχων Smad4. Ολοκληρωμένη εξέταση της Smad4-δεσμεύεται τόπους, αποκάλυψε τέσσερις διαφορετικές δεσμευτικά πρότυπα: 1) Βασική? 2) Shift? 3) διεγείρονται μόνο? 4) Μη διεγερμένα μόνο. ΤΟΡβ διεγερμένα Smad4 δεσμευμένα τόποι ήταν πρωτίστως ταξινομούνται είτε ως μόνο Προτρεπόμενης (74%) ή Shift (25%), υποδεικνύοντας ότι ΤΟΡβ-διέγερση μεταβάλλει μοτίβα πρόσδεσης Smad4 σε επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Επιπλέον, με βάση γονίδιο ανάλυση ρυθμιστικού δικτύου, διαπιστώσαμε ότι το ΤΟΡβ-επαγόμενη, Smad4 εξαρτώμενη ρυθμιστικών δίκτυο ήταν εντυπωσιακά διαφορετική στον καρκίνο των ωοθηκών σε σχέση με τα φυσιολογικά κύτταρα. Σημαντικά, τα γονίδια στόχου TGFβ /Smad4 προσδιορίζονται στο Α2780 επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών κυτταρική γραμμή ήταν προγνωστικά της επιβίωσης των ασθενών, με βάση στην εξόρυξη silico του δημοσίως διαθέσιμες βάσεις δεδομένων ασθενούς. Συμπερασματικά, τα δεδομένα μας αναδεικνύουν τη χρησιμότητα της τεχνολογίας αλληλουχίας επόμενης γενιάς για τον εντοπισμό του γονιδιώματος σε επίπεδο γονιδίων στόχων Smad4 στον επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών και συνδέουν παρεκκλίνουσα TGFβ /SMAD σηματοδότησης των ωοθηκών καρκινογένεση. Επιπλέον, η εντοπίστηκαν θέσεις δέσμευσης Smad4, σε συνδυασμό με το προφίλ της γονιδιακής έκφρασης και in silico εξόρυξη δεδομένων των ομάδων ασθενών, μπορεί να παρέχει μια ισχυρή προσέγγιση για τον προσδιορισμό των πιθανών υπογραφές γονίδιο με τη βιολογική και τη μελλοντική μεταφραστικής έρευνας σε καρκίνους των ωοθηκών και άλλων.

Παράθεση: Kennedy BA, Deatherage DE, Gu F, Tang Β, Chan MWY, Nephew KP, et al. (2011) τσιπ επόμενα καθορισμένων Genome-Wide Χάρτης του TGFβ /Smad4 Στόχοι: Επιπτώσεις με την κλινική έκβαση του καρκίνου των ωοθηκών. PLoS ONE 6 (7): e22606. doi: 10.1371 /journal.pone.0022606

Επιμέλεια: Patrick Tan, Duke-Εθνικό Πανεπιστήμιο της Σιγκαπούρης Πτυχιούχος Ιατρικής Σχολής, Σιγκαπούρη

Ελήφθη: 22 Φεβ 2011? Αποδεκτές: 26 Ιουνίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 25 Ιούλη 2011

Copyright: © 2011 Kennedy et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας U54CA113001, R01CA069065 και του National Cancer Institute CA85289 και με κονδύλια από το Πολιτειακό Πανεπιστήμιο του Οχάιο Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου και το Ohio State University Βιοϊατρικής Πληροφορικής. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο αυξητικός παράγοντας μεταμόρφωσης-β (ΤΟΡβ) μονοπατιού σηματοδότησης παίζει σημαντικό ρόλο στον έλεγχο του πολλαπλασιασμού, της διαφοροποίησης, και άλλες κυτταρικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της αύξησης της επιφάνειας των επιθηλιακών κυττάρων των ωοθηκών (ΟΣΕ) [1], [2]. Δυσλειτουργία του ΤΟΡβ σηματοδότηση συχνά παρατηρείται σε επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών (EOC) και μπορεί να είναι ζωτικής σημασίας για την ανάπτυξη EOC [3], [4]. Οι επιδράσεις του ΤΟΡβ που προκαλούνται από τρία προσδέματα ΤΟΡβ – TGFβ1, TGFβ2 και ΤΟΡβ3, ενεργώντας μέσω ΤΟΡβ τύπου 1 και τύπου 2 υποδοχείς [5] – [7]. TGFBR2 είναι το ειδικό υποδοχέα για συνδέτες ΤΟΡβ. Η λειτουργική σύμπλοκο υποδοχέα ρυθμίζει την ενεργοποίηση των κατάντη Smad και μη Smad οδών [8]. Οι φωσφορυλιωμένη προσλήψεις υποδοχέα τύπου 1 και φωσφορυλιώνει τον υποδοχέα-ρυθμίζεται Smads R-Smads). Από τα πέντε R-Smads στα θηλαστικά, η TGFBR2-ALK5 συγκρότημα ενεργοποιεί SMAD2 και Smad3, ενώ η TGFBR2-ALK1 συγκρότημα ενεργοποιεί SMAD1, SMAD5 και SMAD8 [9]. Ενεργοποιημένος R-Smads σχηματίζουν ετερομερικά σύμπλοκα με την κοινή εταίρο Smad (συν-Smad? Smad4 σε θηλαστικά) και μετατοπίζονται στον πυρήνα [6]. Καθώς η συγγένεια του ενεργοποιημένου συμπλόκου Smad για το στοιχείο Smad-σύνδεσης είναι ανεπαρκής για να υποστηρίξει σύνδεση με ενδογενή υποκινητές των γονιδίων στόχων, Smad σύμπλοκα πρέπει συνδέουν με άλλους μεταγραφικούς παράγοντες που δεσμεύονται με DNA για τη ρύθμιση της έκφρασης [7]. Πολυάριθμες μελέτες έχουν δείξει ότι διάφορες οικογένειες μεταγραφικών παραγόντων, όπως η forkhead, ομοιοακολουθίας, δακτύλου ψευδαργύρου, LEF1, Ets, και βασικά έλικας-θηλιάς-έλικας (bHLH) οικογένειες, μπορούν να χρησιμεύσουν ως πρωτεΐνες εταίρος Smad4 να επιτευχθεί υψηλή συγγένεια και εκλεκτικότητα για υποκινητές στόχος με τα κατάλληλα συνδετικά στοιχεία [10] – [14].

Το Α2780 ανθρώπινο επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών κυτταρική γραμμή είναι ευαίσθητη σε cis-διαμινοδιχλωρολευκόχρυσος (II) (σισπλατίνη), ένας από τους παράγοντες πλατίνας-τύπου ( carbolatin ή σισπλατίνη) χρησιμοποιείται στη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών. Εκτός από το ότι εξυπηρετεί ως ένα χρήσιμο μοντέλο για τη μελέτη φάρμακο ευαίσθητη ασθένεια, Α2780 κύτταρα εμφανίζουν μερική δυσρύθμιση ΤΟΡβ, που υποδεικνύεται από μόνο μια μέτρια αύξηση στην έκφραση Smad4 και μεταγωγή των υφιστάμενων Smad4 από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα εξής ΤΟΡβ διέγερση [15]. Έτσι, αυτή η κυτταρική σειρά είναι επίσης ένα κατάλληλο πρότυπο σύστημα για τη διεξαγωγή χαρτογράφηση του γονιδιώματος σε επίπεδο γονιδίων στόχων Smad4 και τον εντοπισμό των απελευθερωθεί γονιδίων στόχων του TGFβ /Smad4 και μονοπάτια που εμπλέκονται σε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών.

Οι πρόσφατες συγκρίσεις των ChIP- seq (χρωματίνη ανοσοκαταβύθιση-αλληλούχιση) για να προσεγγίσεις συστοιχία που βασίζονται αποδεικνύεται σαφώς ότι τσιπ seq τεχνολογία απέδωσε υψηλότερη ανάλυση, μεγαλύτερο βάθος και βελτιωμένη ακρίβεια χαρτογράφησης του δέσμευσης παράγοντα μεταγραφής και τροποποιήσεις των ιστονών σε κλίμακα γονιδιώματος σε επίπεδο [16] – [18]. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε τσιπ επόμενα τεχνολογίας για τη μελέτη ρύθμιση TGFβ /Smad4 στην πλατίνα ευαίσθητη Α2780 κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών. Εμείς προφίλ τόπους παρακάτω με TGFβ διέγερση δεσμευτική Smad4. Χρησιμοποιώντας υπολογιστικές προσεγγίσεις, ερευνήσαμε το μοτίβο πρόσδεσης Smad4 και συγκρίνεται με το μοτίβο πρόσδεσης Smad4 τόσο ενός epitheilial κύτταρο κανονική αθανατοποιημένα επιφάνεια των ωοθηκών (IOSE) από προηγούμενη μελέτη μας [12] και ανθρώπινα κερατινοκύτταρα (HaCaT) από Koinuma et al [11 ]. Περαιτέρω, δημιουργήσαμε TGFβ /Smad4 ρυθμιζόμενων υπογραφές γονιδίου και να χρησιμοποιηθεί ένα

in silico

προσέγγιση εξόρυξης να συσχετιστούν των εντοπισμένων υπογραφές με τα δεδομένα της κλινικής έκβασης από δύο δημόσια διαθέσιμες ομάδες ασθενή με καρκίνο των ωοθηκών. ολοκληρωμένη προσέγγιση μας αποκάλυψε σημαντικές ενώσεις των ρυθμιστικών δικτύων TGFβ /Smad4 τόσο με την ελεύθερη εξέλιξης και τη συνολική επιβίωση σε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών. Με τον εντοπισμό χιλιάδες θέσεις δέσμευσης Smad4 καθώς ρυθμίζονται τα γονίδια, τα δεδομένα μας παρέχει τόσο μια νέα πηγή για τη μελέτη του μηχανισμού υποκείμενων απορρύθμισης του TGFβ σηματοδότηση σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, καθώς και το δυναμικό προγνωστικούς βιοδείκτες για μελλοντική έρευνα του καρκίνου των ωοθηκών μεταφραστικής.

Αποτελέσματα

Genome-Wide Smad4 κατάληψης ορίζεται από τσιπ επόμενα τεχνολογία

προηγούμενες μελέτες μας [12], [15], [19], [20] και άλλοι [2], [ ,,,0],4], [21] – [23] έχουν προσπαθήσει να καθιερώσει και να χαρακτηριστούν οι μοριακοί μηχανισμοί απορυθμισμένης σηματοδότησης ΤΟΡβ μεσολάβηση σε ωοθηκών καρκινικά κύτταρα και απέκτησε σισπλατίνη ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Προκειμένου να μελετήσουμε περαιτέρω τις λεπτομέρειες των υποκείμενων μηχανισμών, χρησιμοποιήσαμε τσιπ επόμενα τεχνολογία για τον εντοπισμό των γονιδιωματικής θέσεις δεσμεύονται από Smad4 στα κύτταρα Α2780 πριν και μετά την TGFβ διέγερση.

Χρησιμοποιώντας τσιπ επόμενα, όλα τα δείγματα ήταν αρχικά ακολουθία για να δημιουργήσει ένα σύνολο πρώτων διαβάζει (κάθε ανάγνωσης έχει μήκος 36 bp) από το σύστημα Illumina /Solexa GAII (Πίνακας S1) που κυμαίνονται από ~43 εκατομμύρια σε ~51 εκατομμύρια διαβάζει ανά δείγμα. Μετά τη χαρτογράφηση του συνέρχεσθαι UCSC Ανθρωπίνων HG18, μια σειρά από -26 εκατομμύρια ευρώ και ~32 εκατομμύρια χαρτογραφηθεί διαβάζει με ελήφθησαν μοναδική γενωμική θέσεις για μη ενισχυμένα Α2780 και TGFβ-διεγείρονται Α2780 αντίστοιχα. Στη συνέχεια εφαρμόζεται το πρόγραμμά μας αιχμής καλώντας την ανίχνευση, ζώνη, [24], [25] (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι) για τον προσδιορισμό της δέσμευσης τόπους της Smad4 σε αυτές τις δύο προϋποθέσεις. Εν συντομία, το πρόγραμμα BELT μας χρησιμοποιεί μια μέθοδο εκατοστημόριο βαθμολόγησης για τον προσδιορισμό της τιμής κατωφλίου εμπλουτισμού για κάθε ένα από τα κορυφαία εκατοστημόρια από όλες τις περιοχές δέσμευσης, ακολουθούμενο από τον προσδιορισμό του αριθμού των δεσμευτικών loci σε κάθε εκατοστημόριο επίπεδο. Προκειμένου να προσδιοριστεί η σημασία της κάθε εκατοστημόριο, ένα σύνολο τυχαία προσομοιώνεται διαβάζει χρησιμοποιείται ως φόντο για την εκτίμηση της ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη (FDR). Τσιπ επόμενα δεδομένα μας επιβεβαιώθηκε πολλαπλές θέσεις που είχαν διαπιστωθεί σε διάφορους ιστούς και τύπους κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων Gadd45A, CTGF, JAG1, LEMD3 [14], MYC [26], EDN1, RYBP, DST και BCAT1 [11] δεσμευτική Smad4.

βασική χωρητικότητα.

Εντοπίσαμε 2009 Smad4 τόπους δεσμευτικός ως προς τη βασική (μη διεγερμένη) κατάσταση στην Α2780 κυτταρική γραμμή (Πίνακας S1). Βρήκαμε ότι 1.499 (74,6%) loci βρίσκονταν εντός +/- 100 kb ενός γνωστού γονιδίου REFSEQ [27]. Παραδόξως, μόνο μικρό τμήμα (267 του 1499, 13,3%) ήταν εντός της περιοχής του υποκινητή (+/- 8 kb), ενός γονιδίου, ενώ η πλειοψηφία των δεσμευτικών loci ήταν είτε 10 kb ανοδικά του 5’TSS ή 10 kb κατάντη 3 «TSS (Εικόνα 1Α – κόκκινη γραμμή). Αυτή η αμερόληπτη ολόκληρο τον ανάλυσης θέση του γονιδιώματος πρότεινε ότι πολλές άλλες προηγούμενες μελέτες γονιδιώματος σε επίπεδο βασίζεται στην τεχνολογία υποστηρικτής τσιπ chip [11], [12], [28] μπορεί να εντοπίσει μόνο υποσύνολα των γονιδίων στόχων Smad4.

) Η κατανομή της θέσης των τόπων δεσμευτική Smad4 σε οικόπεδο ιστόγραμμα με βάση τους σε σχέση με ένα πιο κοντινό γνωστό RefGene 5’TSS. Β) Κατάταξη των τόπων δεσμευτική Smad4 σε τέσσερα μοτίβα δέσμευσης. Διεγείρονται τόποι Μόνο δέσμευσης είναι εκείνοι των οποίων συνδέονται RefGene έχει δεσμευτικό τόπους μόνο στην εξαναγκασμένη σετ, το ίδιο και για Μη διεγερμένα μόνο. τόποι δεσμευτική Shift έχει δεσμευτικό τόπους που εμφανίζονται στο ίδιο γονίδιο και στις δύο συνθήκες και είναι μεγαλύτερη από 1.000 nt χώρια. Basal δεσμευτικές θέσεις εμφανίζονται στο ίδιο γονίδιο και στις δύο συνθήκες, αλλά είναι μικρότερη από 1000 nt χώρια. Γ) Ένα στιγμιότυπο δείχνει μοτίβο δέσμευσης LRRC17, όπου Smad4 συνδέεται με 5’TSS της LRRC17 μετά TGFβ διέγερση, κατηγοριοποιείται σε διεγείρονται μόνο Δεσμευτική. Δ) Αφθονία του DNA μετά από Smad4 ChIP τραβήξτε προς τα κάτω σε σύγκριση με το DNA που υπάρχει παρακάτω τραβήξτε προς τα κάτω με μη ειδικό αντίσωμα IgG όπως καθορίζεται από ποσοτική Syber πράσινο PCR. U και S χρησιμοποιούνται για να αντιπροσωπεύουν τις μη διεγερθέντα και διεγείρονται περιοχές πρόσδεσης του SLC40A1 αντίστοιχα. * Αντιπροσωπεύει μια τιμή ρ t-test μικρότερη από 0,05 και υποδηλώνει σημαντικό εμπλουτισμό σε σχέση με τον έλεγχο IgG.

Η

ΤΟΕβ-διεγερμένα δέσμευσης.

Κατά την διέγερση με ΤΟΡβ, δεσμευτική 2362 Smad4 loci ταυτοποιήθηκαν (Πίνακας S1). Συνολικά, η κατανομή της θέσης των τόπων πρόσδεσης Smad4 μετά TGFβ διέγερση είναι πολύ παρόμοια με εκείνη πριν από τη διέγερση (Σχήμα 1Α – μαύρη γραμμή για εξαναγκασμένη και κόκκινη γραμμή για μη διεγερμένα). Ωστόσο, οι δεσμευτικές μοτίβα μεταξύ δύο συνθήκες (πριν και μετά τη διέγερση ΤΟΡβ) είναι δραματικά διαφορετική (Σχήμα 1Β). Έχουμε απομακρυνθεί πρώτα αυτές τις δεσμευτικές θέσεις βρίσκονται μακριά από οποιαδήποτε γνωστά γονίδια REFSEQ (+/- 100 kb) και, στη συνέχεια, κατατάσσονται αυτά (1.723 θέσεις για διεγείρονται και 1.499 θέσεις για μη διεγερμένο) σε τέσσερις διαφορετικές δεσμευτικά πρότυπα: 1) Βασική Βιβλιοδεσία – δύο θέσεις πρόσδεσης συνδέονται με το ίδιο γονίδιο και εντός 1 kb απόσταση μεταξύ τους (δηλαδή αμετάβλητο δέσμευσης)? 2) Shift Δέσμευση – δύο τόποι πρόσδεσης που σχετίζεται με το ίδιο γονίδιο και στις δύο συνθήκες, αλλά είναι περισσότερο από 1 kb πέρα ​​από ένα άλλο? 3) διεγείρονται μόνο Binding – ένα δεσμευτικό τόπους που συνδέονται με ένα γονίδιο μόνο στην τονωθεί κατάσταση? 4) Μη διεγερμένα μόνη δεσμευτική – μια δεσμευτική loci σχετίζεται με ένα γονίδιο μόνο σε μη διεγερμένη κατάσταση. Με βάση την παραπάνω ταξινόμηση, διαπιστώσαμε ότι 74,2% (1.279 από 1.723) και 73,5% (1.102 από 1.499) των δεσμευτικών θέσεις ήταν στο διεγείρονται μόνο βιβλιοδεσίας και μη ενισχυμένα κατηγορίες μόνη δεσμευτική αντίστοιχα. Ενώ το 24,8% (429 από 1.723) και 25,5 (382 από 1.499) δεσμευτικές θέσεις ταξινομήθηκαν στην κατηγορία Δεσμευτική το Shift, για το τονωθεί και η μη διεγερμένα κατάσταση, αντίστοιχα, μόνο 15 θέσεις πρόσδεσης για κάθε κατάσταση (0,9% και 1,0% αντίστοιχα) έπεσε σε η κατηγορία Δεσμευτική Basal. γονιδιωματική αποτελέσματα χαρτογράφησης μας έδειξαν ότι TGFβ διέγερση των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών μπορεί να αλλάξει το τοπίο των προτύπων δεσμευτική Smad4. Ένας πλήρης κατάλογος των κατατάσσονται μοτίβα πρόσδεσης φαίνεται στον Πίνακα S2.

Επιπλέον, προκειμένου να επαληθεύσει ότι TGFβ διέγερση είχε ως αποτέλεσμα οι δεσμευτικές αλλαγές που παρατηρούνται στα δεδομένα τσιπ επόμενα, επιλέξαμε τυχαία ένα σύνολο 22 στόχους που προσδιορίζονται από την ανάλυση μας και εκτελείται τσιπ qPCR χρησιμοποιώντας DNA απομονωμένο από ένα ανοσοκατακρήμνιση που ήταν διαφορετικό από το DNA που χρησιμοποιήθηκε για τσιπ seq. Τσιπ qPCR μας επικυρώσεις όχι μόνο επιβεβαίωσαν οι στόχοι που προσδιορίζονται στα δεδομένα τσιπ seq αλλά επίσης κατέδειξαν περαιτέρω ότι η εξωγενώς ενεργοποιημένη σηματοδότηση ΤΟΡβ είναι ικανό να παράγει δραστικές αλλαγές στις Smad4 δεσμευτικός μοτίβα (Σχήματα 1C, 1D και Σχήματα S1A, Β).

κανονισμός του TGFβ-διεγείρεται έκφραση του γονιδίου-στόχου Smad4 σε Α2780

στη συνέχεια, θα πραγματοποιηθεί μικροσυστοιχίες γονιδιακής έκφρασης για τον καθορισμό του καθεστώτος έκφρασης γονιδίων-στόχων Smad4 μετά TGFβ διέγερση. Α2780 mRNA από τρεις ανεξάρτητες βιολογικές επαναλήψεων τόσο πριν όσο και μετά από 3 ώρες από ΤΟΡβ διέγερση παρασκευάστηκε και αναλύθηκε για Affymetrix U133 Plus 2 Platform. Συνολικά, 3.191 γονίδια ταυτοποιήθηκαν ως σημαντικά πάνω ή κάτω-ρύθμιση μετά ΤΟΡβ διέγερση με τουλάχιστον 0,5 Log2 φορές μεταβολή στην έκφραση και ρ τιμή μικρότερη από 0,1 (Σχήμα 2Α). Μετά την εξέταση της συσχέτισης με 1.443 TGFβ-διεγείρονται γονιδίων στόχων Smad4 (που αντιστοιχούν σε 1,723 Smad4 δεσμευτικές θέσεις στην διεγείρονται κατάσταση), η πλειοψηφία (2.873 από 3.191) των γονιδίων με διαφορική έκφραση στο Α2780 εκπληκτικά έλειπε Smad4 τόποι δέσμευσης, όπου 318 γονίδια είχαν τουλάχιστον τόποι που δεσμεύουν ένα Smad4 και έδειξε τουλάχιστον μία αλλαγή έκφραση 0.5 Log2 φορές μετά από 3 ώρες από ΤΟΡβ διέγερση (Σχήμα 2Β). Λεπτομέρειες του 3191 σημαντικά διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων είναι διαθέσιμα σε πίνακες S4 και 318 γονίδια στον Πίνακα S5.

Α) heatmap της έκφρασης φορές οι αλλαγές για τα γονίδια μεταξύ του μη διεγερμένα και του TGFβ διεγείρονται κατάσταση, δείχνοντας τρεις ομάδα των γονιδίων , up-ρύθμιση, καμία αλλαγή, και κάτω-ρυθμίζονται. Τα Πάνω και κάτω ρυθμιζόμενα γονίδια ορίζεται ως έχον μια αλλαγή Log2 φορές μεγαλύτερο από 0,5 ή μικρότερη από -0,5 αντίστοιχα. Β) Η σύγκριση μεταξύ των γονιδίων με θέσεις δέσμευσης Smad4 (1443) του TGFβ διεγείρονται κατάσταση με όλα τα γονίδια που δείχνουν διαφορική έκφραση (3193), που δείχνει τρεις διαφορετικές ομάδες, άτομα με διαφορική έκφραση και δεν τόπους δεσμευτική Smad4, εκείνους που δεν έχουν διαφορικής έκφρασης και ένα τόποι πρόσδεσης Smad4 και εκείνων με τους δύο. Γ) GO σχολιασμούς για τα τρία διαφορετικά γονίδια ομάδα που δείχνει στο διάγραμμα Venn (Β). Δ) επίπεδο έκφρασης RNA όπως προσδιορίζεται με qRT-PCR σε σχέση με τα επίπεδα έκφρασης GAPDH. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε βιολογικά τριπλούν. * Αντιπροσωπεύει μια τιμή ρ t-test μικρότερη από 0,05 και υποδηλώνει σημαντική διαφορά στην έκφραση μεταξύ μη διεγερμένα και διεγερμένα συνθήκες.

Η ανάλυση

Gene οντολογία έδειξε ότι τα διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων με θέσεις πρόσδεσης Smad4 ήταν σημαντικά εμπλουτισμένη για τα γονίδια που εμπλέκονται με το μέρος των κυττάρων μορφογένεση και αναπτυξιακή πρωτεΐνες (Σχήμα 2C-Gene & amp? Loci), σύμφωνα με τις προηγούμενες μελέτες σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων [12], [36]. Βρήκαμε επίσης ότι Smad4 δεσμευτική συνδεδεμένων γονιδίων λείπει διαφορική έκφραση εμπλουτίστηκαν για τα γονίδια με EGF τομέα και πολυμορφισμός που υποδηλώνει ότι διαφορετικά μονοπάτια σηματοδότησης μπορεί να μεσολαβήσει Smad4 και λειτουργίες άλλες από TGFβ σηματοδότησης (μόνο σχήμα 2C-Loci), ενώ το μεγάλο σύνολο των διαφορικά εκφρασμένων γονίδια που στερούνται δεσμευτική Smad4 τόποι συμμετείχαν σε λειτουργίες του ανοσοποιητικού και πρωτεϊνούχα εξωκυττάρια μήτρα. Μετά την εξέταση μιας πιο ρ-τιμή περιορισμό των 0,05 και διπλώστε την αλλαγή των 0,5 για TGFβ διεγερμένη διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων, λάβαμε μια σειρά από 1763 γονίδια. Από αυτά τα γονίδια, βρήκαμε 184 γονίδια (10,4%) για να έχουν τουλάχιστον ένα ΤΟΡβ διεγείρονται θέση πρόσδεσης Smad4 (Πίνακας S6). Το ποσοστό αυτό είναι πολύ παρόμοιο με το σύνολο δεδομένων της οποίας 318 (10%) του 3191 έχουν διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων τουλάχιστον ένα ΤΟΡβ διεγείρονται θέση πρόσδεσης Smad4 (Πίνακας S5). Η ανάλυση της λειτουργίας GO ήταν επίσης πολύ παρόμοια σε πάνω κατηγορίες (Εικόνα S2). Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω απόκλιση εκφράζεται Smad4 στοχευμένες γονίδια που προκύπτουν από TGFβ διέγερση, επιλέξαμε τυχαία ένα σύνολο από 18 στόχους που προσδιορίζονται από την ανάλυση μας και πραγματοποίησε RT-qPCR. Περισσότερο από το 70% (13 από 18) γονιδίων επικυρώθηκαν με RT-qPCR όπως φαίνεται στο Σχήμα 2D και Σχήμα S3. Μια λίστα σχεδιασμένους εκκινητές παρουσιάζεται στον Πίνακα S7.

Smad4 γονιδίου που εξαρτάται από ρυθμιστικά δίκτυα σε ΤΟΡβ-επαγόμενη ωοθηκών καρκινικά κύτταρα

προηγούμενη μελέτη μας [12] και μια μελέτη από Koinuma et al [ ,,,0],11] έχουν εντοπίσει μια σειρά από 150 TGFβ διεγείρονται γονίδια στόχους Smad4 σε IOSE (ένα απαθανάτισε επιφάνεια επιθηλιακά κυτταρική γραμμή ωοθηκών) και ένα σύνολο 92 TGFβ διεγείρονται γονίδια στόχους Smad4 σε HaCaT (μια κυτταρική γενιά κερατινοκυττάρων). Δεν ήταν έκπληξη να βρούμε περιορισμένη επικάλυψη μόνο 6 από 150 σε IOSE, 6 από 92 σε HaCaT, και 1 για όλες τις τρεις μελέτες από κοινού με τα 318 Smad4 γονίδια στόχους σε αυτή τη μελέτη (Σχήμα 3Α), καθώς μόνο το ένα, Α2780, είναι μια καρκινική κυτταρική σειρά και τα άλλα δύο είναι φυσιολογικές κυτταρικές σειρές. Μια άλλη δυνατότητα για τέτοια χαμηλά ποσοστά σώρευση είναι ότι μπορεί να είναι λόγω των περιορισμένων στόχων πιστοποιούνται χρησιμοποιώντας συστοιχία προαγωγό (τσιπ προαγωγός-chip). GO ανάλυση [29] έδειξε επίσης γονιδίων στόχων σε HaCaT και IOSE συμμετείχαν κυρίως στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού (ή αντι-απόπτωση) και την αναπτυξιακή διαδικασία (μυϊκή ανάπτυξη), οι οποίες ήταν διαφορετικές από γονίδια στόχους σε Α2780 (Εικόνα 3Β).

Α) Ένα διάγραμμα Venn δείχνει τη σύγκριση των γονιδίων στόχων TGFβ /Smad4 σε τρεις διαφορετικούς τύπους κυττάρων. Β) GO σχολιασμούς για τα μοναδικά γονίδια για κάθε τύπο κυττάρου.

Η

Για να συγκρίνετε περαιτέρω τη διαφορά του TGFβ-διεγείρεται Smad4 γονιδίου που εξαρτάται από ρυθμιστικές πληροφορίες μεταξύ αυτών των τριών τύπων κυττάρων, εφαρμόσαμε μια υπολογιστική αναλυτική προσέγγιση εμείς προηγουμένως αναπτυχθεί [30] για την κατασκευή των Smad4 εξαρτώμενη ρυθμίζονται δίκτυα σε HaCaT, IOSE, και Α2780, αντίστοιχα (Σχήμα 4). Εν συντομία, υπολογιστική αναλυτική προσέγγιση μας ξεκίνησε με ChIP σύνολα δεδομένων με βάση και τα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης. Κάθε Smad4 δεσμευτικός wa loci ταιριάζει με γνωστό ένα αναγνωριστικό γονίδιο REFSEQ οι οποίες στη συνέχεια να εξετάζονται για διαφορική γονιδιακή έκφραση. Ένα σύνολο των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων στόχων Smad4 μετά ΤΟΡβ διέγερση χρησιμοποιήθηκαν περαιτέρω για την εύρεση του πλέον σημαντικό παράγοντα μεταγραφής (TF) εταίρων δέσμευσης με ChIPMotifs [31] ή ChIPModudles [32], τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ως Hub TFs. Η σύνδεση TF-γονίδιο Hub προσδιορίστηκε με σάρωση PWMs του Hub TFs »σε όλες τις θέσεις δέσμευσης και μια δοκιμασία μετάθεσης χρησιμοποιήθηκε για να ελεγχθεί η αξιοπιστία της κάθε σύνδεση του δικτύου. Ο προέκυψε κανονιστικού δικτύου οπτικοποιήθηκε από Cytoscape [33].

Η

Έχουμε εντοπίσει έξι Hub TFs, Gfi1, NR3C1, SOX17, Stat4, ZNF354C και TCF8 από 318 Smad4-εξαρτώμενη γονιδίων στόχων σε κύτταρα Α2780, ενώ τέσσερα Hub TFs, Ι.ΕΡ1 (TCF), ELK1, COUPTF (NR2F5), και E2F, εντοπίστηκαν σε κύτταρα IOSE από προηγούμενη μελέτη μας, χρησιμοποιώντας μια παρόμοια προσέγγιση (μοντέλο CART) [12]. υπολογιστική αναλυτική προσέγγιση μας εντόπισε επίσης τρία Hub TFs, E2F1, SP1, και USF, για 92 Smad4 εξαρτώμενη γονιδίων στόχων σε κύτταρα HaCaT, η οποία ήταν πολύ παρόμοια με τα μοτίβα TF που προσδιορίζονται από την Koinuma et al. μελέτη [11]. Η κορυφή μοτίβο που αναφέρθηκαν στη μελέτη τους, ΑΡ1, χάθηκε στα αποτελέσματά μας λόγω χρησιμοποιώντας ένα προηγμένο αλγόριθμο ταξινόμησης σε ChIPModules μας [32] και να είναι σε θέση να εξαλείψει αυτά τα μοτίβα TF τα οποία είναι επίσης εμπλουτισμένα με τυχαία σύνολα. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε επίσης ένας Hub TF E2F (E2F1) ήταν κοινή μεταξύ των δύο φυσιολογικά κύτταρα, αλλά όχι από κοινού με κύτταρα Α2780. Μαζί με την ανάλυση της λειτουργίας GO, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η E2F μπορεί να δράσει ως ένα σημαντικό Smad4 συν-παράγοντα μεταγραφής εταίρος στη μεσολάβηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε φυσιολογικά κύτταρα αλλά έχασε σε κύτταρα καρκινώματος. Τα ρυθμιστικά δίκτυα προκύπτον γονίδιο (GRN) και για τα τρία κύτταρα φαίνεται στο Σχήμα 4. Γενικά, η γονιδιακή ρυθμιστική ανάλυση του δικτύου μας υποδεικνύει έντονα ότι ΤΟΡβ διεγείρει ένα διαφορετικό Smad4 εξαρτώμενη ρυθμιστικό μηχανισμό σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών σε σχέση με τα φυσιολογικά κύτταρα, δηλαδή, την Smad4 ρύθμιση του δικτύου έχει γίνει «rewired» στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

Gene υπογραφές της επιλογής και της κλινικής έκβασης

Ένα από τα πολλά υποσχόμενες δυνατότητες εφαρμογών των «μελετών omics γονιδίωμα-ευρεία χρήση των συστημάτων κυτταρική γραμμή είναι η αναγνώριση του γονιδίου υπογραφές που μπορούν να παρέχουν καλύτερα προγνωστικές πληροφορίες σε σχέση με τις καθιερωμένες κλινικές και παθολογικές παράμετροι [34], [35]. Για να αντιμετωπιστεί η σχέση του ΤΟΡβ διεγείρεται γονιδίων στόχων Smad4-εξαρτώμενη και την κλινική έκβαση των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών, εξετάσαμε τα 307 γονίδια στόχους που προσδιορίζονται στην Α2780 κύτταρα σε αυτή τη μελέτη, η οποία δεν προσδιορίστηκαν σε προηγούμενες μελέτες των φυσιολογικών κυττάρων, σε δύο διαφορετικές κλινικές ωοθηκών μελέτες για τον καρκίνο ομάδα που είχε αναφερθεί δεδομένα επιβίωσης [36], [37]. Εμείς που ταξινομούνται για πρώτη φορά τις ασθενείς σε διαφορετικές υπο-ομάδες, με βάση το γονίδιο υπογραφές τους, και στη συνέχεια συσχετίζονται τα δεδομένα με τα στοιχεία επιβίωσης του ασθενούς. Στην εξόρυξη του ομάδα 153 ασθενών από Bild et al [36], ήμασταν σε θέση να χρησιμοποιήσουν τα 187 307 γονίδια που εντοπίστηκαν στο σύνολο δεδομένων γονιδιακής έκφρασης για να εφαρμόσει τη μέθοδο ιεραρχικής ομαδοποίησης με τα μέτρα με βάση την απόσταση από την άποψη της δοκιμής και λάθους και ταξινομούν τα γονίδια σε τέσσερις ομάδες γονιδίων (Σχήμα 5Α). Για κάθε μία από τις τέσσερις ομάδες γονιδίων, έχουμε συγκεντρωμένα περαιτέρω τα 153 δείγματα σε τέσσερις ομάδες ασθενών (PGs, Σχήμα 5Β), και συσχετίζεται τις PGs με πληροφορίες επιβίωσή τους. 153 ασθενείς, μόνο 124 έχουν πλήρη πληροφόρηση επιβίωση, έτσι χρησιμοποιήθηκαν περαιτέρω για οικόπεδα καμπύλη επιβίωσης. Βρήκαμε ότι μια υπογραφή ενός υποσυνόλου 49 γονιδίων (ομάδα γονίδιο G2) που ήταν σε θέση να προβλέψει μια σημαντική συσχέτιση επιβίωση για 62 από τους ασθενείς με μία τιμή ρ 0,0471 (Σχήμα 5C, D). Συγκεκριμένα PG: 4 (25 ασθενείς) εμφανίζεται κακή διάμεση επιβίωση των 31 μηνών σε σύγκριση με PG: 3 (37 ασθενείς), με μέση επιβίωση 63 μηνών. Ένα οικόπεδο καμπύλη επιβίωσης για δύο ομάδες ασθενών, PG: 3 και PG: 4 χρησιμοποιώντας ένα τυχαία επιλεγμένο 49 γονίδια (όταν δεν είναι μέσα σε 49 γονίδια G2) έδειξε μια τιμή p δοκιμασία log-rank του 0,1558 (Σχήμα 5Ε). Λόγω των περιορισμένων παθολογικές πληροφορίες που είναι διαθέσιμες για αυτήν την ομάδα ασθενών, δεν ήμασταν σε θέση να συσχετίσει σημαντικά υπογραφές γονιδίων μας με άλλες κλινικές εκβάσεις. Ωστόσο, ένα ιδιαίτερα υψηλό ποσοστό του σταδίου IV ασθενείς ομαδοποιήθηκαν σε PG3 ενώ όλες στάδιο IC και δύο ασθενείς σταδίου IIC συγκεντρωμένοι σε PG4, παρά ένα παρόμοιο αριθμό ασθενών στάδιο IIIC σε κάθε (Πίνακας S8), ίσως δείχνει ότι TGFβ /Smad4 ρυθμίζονται τα γονίδια θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν δυνητικά για την ταξινόμηση ενός υποτύπου των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών.

Α) Η ιεραρχική συσταδοποίηση αποτέλεσμα των 187 γονιδίων σε τέσσερις ομάδες γονιδίων, δηλαδή G1, G2, G3 και G4. Ο κάθετος άξονας αντιπροσωπεύει τις συστάδες γονιδίων (187 γονίδια) και ο οριζόντιος άξονας αντιπροσωπεύει διαφορετικές δείγματα (153 ασθενείς). Β) Η ιεραρχική αποτέλεσμα ομαδοποίησης των 153 ασθενών σε τέσσερις ομάδες ασθενών, δηλαδή PG: 1, PG: 2, PG: 3 και PG: 4, χρησιμοποιώντας την ομάδα G2 των 49 γονιδίων. Γ) Επιβίωση καμπύλη οικόπεδο για την ομάδα του γονιδίου G2. Ο οριζόντιος άξονας αντιπροσωπεύει τις μηνών επιβίωση και την κάθετη προς το εκατοστιαίο ποσοστό επιβίωσης (%) κατά την αντίστοιχη ομάδα των ασθενών. Εντελώς τέσσερις ομάδες ασθενών, δηλ PG: 1, PG: 2, PG: 3 και PG: Τα 4 αναλύθηκαν για την ομάδα γονίδιο G2. Δ) Μια λεπτομερής οικόπεδο καμπύλη επιβίωσης για δύο ομάδες ασθενών, PG: 3 και PG: 4, παρουσιάζοντας σημαντική τιμή p δοκιμασία log-rank του 0.0471.E) Ένα οικόπεδο καμπύλη επιβίωσης για δύο ομάδες ασθενών, PG: 3 και PG: 4 χρησιμοποιώντας ένα τυχαία επιλεγμένο 49 γονίδια (όταν δεν είναι μέσα σε 49 γονίδια G2) δείχνει p-value δοκιμασία log-rank είναι 0,1558.

η

Όταν εφαρμόζεται το ίδιο

in silico

προσέγγιση εξόρυξης στη δεύτερη ομάδα ασθενών από Lu et al [37], (που αποτελείται από 42 ασθενείς και 5 κανονικοί άνθρωποι), τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ένα γονίδιο υπογραφή 19 των 307 γονιδίων προβλέψει καλύτερα ποσοστά επιβίωσης για PG4 και Normals ό, τι άλλες PGs με p-τιμή 0.0078 (Σχήμα S4).

Συζήτηση

Έχουμε για πρώτη φορά εφαρμόζεται τσιπ επόμενα τεχνολογία για ολόκληρο το γονιδίωμα-ευρεία χαρτογράφηση του TGFβ-διεγείρονται, SMAD4- εξαρτώμενη ρυθμιζόμενα γονίδια σε μια καρκινική κυτταρική σειρά ωοθηκών (Α2780). Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι σε σύγκριση με την βασική κατάσταση (χωρίς διέγερση ΤΟΡβ), η πλειοψηφία των Smad4 loci πρόσδεσης είτε πρόσφατα δεσμεύονται να χρωματίνη (74,2%) ή μετατοπίζεται δεσμευμένου (24,8%) κατά ΤΟΡβ διέγερση, υποδεικνύοντας ΤΟΡβ διεγερμένα κύτταρα καρκίνου μπορεί να τροποποιήσει το τοπίο μοτίβα δέσμευσης Smad4. Περαιτέρω, η ανάλυση GO μας αποκάλυψε εντυπωσιακές ομοιότητες μεταξύ των κορυφαίων 10 κατηγορίες GO για 1.443 και 1.316 Smad4 γονιδίων στόχων σε διεγερμένα και μη ενισχυμένα συνθήκες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, 318 διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια, που περιέχει τουλάχιστον ένα διεγείρονται Smad4 τόποι πρόσδεσης, ήταν σημαντικά εμπλουτισμένη για πιο συγκεκριμένους όρους GO, όπως μέρος των κυττάρων μορφογένεση και αναπτυξιακές πρωτεΐνες. Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι Smad4 μπορεί να ρυθμίζει ένα πολύ συγκεκριμένο σύνολο γονιδίων-στόχων σε απόκριση σε TGFβ σηματοδότηση, προκειμένου να διευκολυνθεί η ειδικές λειτουργίες σε αυτόν τον τύπο κυττάρου μέσω αυτού του ειδικού μονοπατιού σηματοδότησης. Πράγματι, GO ανάλυση για τα γονίδια-στόχους Smad4 χωρίς αλλαγές σε επίπεδο γονιδιακής έκφρασης μετά TGFβ διέγερση βρέθηκε μία από τις εμπλουτισμένες κατηγορίες γονιδίων είναι «το ΕΤΠ, όπως σηματοδότησης, παρέχοντας περαιτέρω ενδείξεις ότι άλλα μονοπάτια σηματοδότησης μπορεί να διαμορφώνει Smad4-εξαρτώμενη ρύθμιση γονιδίων στον καρκίνο των ωοθηκών. Ένα τέτοιο παράδειγμα μπορεί να είναι οι μορφογενετικές πρωτεΐνες οστών (ΒΜΡ), οι οποίες είναι επίσης ανοδικά Smad4 και έτσι μπορεί να είναι σε θέση να ρυθμίζουν ορισμένες από αυτές τις Smad4 γονιδίων στόχων. ΒΜΡ έχουν δειχθεί ότι είναι κύριοι ρυθμιστές της ωοθηκικής φυσιολογίας και που εμπλέκονται στην ανάπτυξη του καρκίνου των ωοθηκών και άλλους καρκίνους [38] – [40]. Σε μελλοντικές μελέτες η συμβολή του παρόντος κανονισμού, κάθε σηματοδότηση μονοπατιών »των ταυτοποιημένων γονιδίων-στόχων Smad4 θα προσπαθήσει να αποκρυστάλλωσε

Παρόμοια με άλλα ευρήματα για μεταγραφικούς παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων των άλφα υποδοχέων οιστρογόνων (ΕΡα) [41] -. [43 ], υποδοχέα ανδρογόνου (AR) [44], και του υποδοχέα ενεργοποιείται από πολλαπλασιαστή περοξυσώματος (PPAR) [45], παρατηρήσαμε ότι η πλειοψηφία (& gt? 70%) της loci δέσμευσης Smad4 βρίσκεται πάνω από 8 kb μακριά από 5’TSS του ένα γνωστό γονίδιο REFSEQ. Αυτό θα μπορούσε να υποδηλώνει την τόποι δεσμευτική TGFβ έρχονται σε άμεση γειτνίαση με τον υποκινητή μέσω χρωμοσώματος looping κατά TGFβ διέγερση. Είναι ενδιαφέρον, μας

de novo

μοτίβο ανάλυση εντόπισε επίσης SMAD-σαν μοτίβο σε ένα σύνολο 5-άπω loci δεσμευτικές αλλά όχι σε ένα σύνολο loci 5′-προαγωγό (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). γονιδίωμα-ευρεία ανάλυση θέση μας επισημαίνει επίσης τη σημασία των τεχνολογιών ολόκληρου του γονιδιώματος σε επίπεδο αλληλουχίας, όπως μας έδειξε πολλά δεσμευτικές θέσεις βρίσκονται πολύ μακριά από την 5’TSS ενός γνωστού γονιδίου και συνεπώς μια τεχνολογία υποκινητή-array μπορεί να χάσει πολλές θέσεις δεσμευτικός στόχος ενός παράγοντα μεταγραφής. μελλοντικές μελέτες μας θα επικεντρωθεί στην διεξαγωγή ChIP-3C-qPCR να επιβεβαιώσει κατά πόσον αυτές οι απομεμακρυσμένες θέσεις πρόσδεσης πράγματι σχετίζονται με αυτά τα συγκεκριμένα γονίδια, πιθανώς αποκαλύπτοντας το υποκείμενο μηχανισμό ρύθμισης με τη μεσολάβηση του γονιδίου TGFβ /Smad4.

Μια σημαντική πτυχή της η μελέτη αυτή είναι η χρήση του

in silico

εξόρυξη των διαθέσιμων στο κοινό δεδομένων κοόρτη ασθενών να προσδιορίσει ένα υποσύνολο των γονιδίων στόχων του TGFβ /Smad4 ως ένα γονίδιο υπογραφή για την πρόβλεψη της κλινικής (επιβίωση) αποτελέσματα. Όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη μελέτη για να προσπαθήσει να χρησιμοποιήσει TGFβ σηματοδότησης ανταποκρίνεται Smad4 ρυθμιζόμενων γονιδίων για την ταξινόμηση των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών σε διαφορετικές υπο-είδη των ομάδων ασθενών, καθώς και την πρόβλεψη κακή επιβίωση από την καλή πληθυσμούς επιβίωσης με στατιστική σημαντικότητα (Σχήμα 5). Έτσι, συνδυάζοντας τσιπ επόμενα εντοπίστηκαν δεσμευτική τόπους, προφίλ γονιδιακής έκφρασης, και ένα

in silico

εξόρυξη των ομάδων ασθενών μπορεί να παρέχει μια ισχυρή προσέγγιση για τον εντοπισμό πιθανών υπογραφών γονιδίων με βιολογική και κλινική σημασία.

Συμπερασματικά, η μελέτη μας παρέχει την πρώτη ολοκληρωμένη γονιδίωμα-ευρεία χάρτη χιλιάδες στόχων TGFβ /Smad4 σε μια ωοθηκική κυτταρική σειρά καρκίνου, τα οποία θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν περαιτέρω για τη μελέτη των λειτουργιών Smad4 στην ογκογένεση. Για τις γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη μελέτη που συνδέει TGFβ /Smad4 γονιδίων που ρυθμίζονται με τις κλινικές πληροφορίες σχετικά με τον καρκίνο των ωοθηκών επιβίωση των ασθενών και τον εντοπισμό δυνητικών υπογραφές γονίδιο για την πρόγνωση του καρκίνου των ωοθηκών. Σε μελλοντικές μελέτες μας, θα διεξάγει τσιπ επόμενα ανάλυση των θέσεων πρόσδεσης TGFβ /Smad4 χρησιμοποιώντας ένα πάνελ των κυτταρικών σειρών καρκίνου των ωοθηκών αντιπροσωπεύουν διαφορετικές ιστολογικές υποτύπους των ωοθηκών έναρξη κύτταρα.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια και ΤΟΡβ διέγερση

Α2780 κύτταρα [15] καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου σε 37 ° 5% CO

2 θερμοκοιτίδα. Πριν από ΤΟΡβ διέγερση, τα κύτταρα χωρίστηκαν σε ~ 70% συρροή και επιθεωρούνται καθημερινά. Για ChIP, 80% συρρέοντα κύτταρα βέλτιστα διεγείρονται με 10 ng /ml ανασυνδυασμένης TGFβ1 (Sigma, St. Louis, ΜΟ) επί 1 ώρα πριν από την φορμαλδεΰδη σταυροειδών δεσμών ενώ ανάλυση έκφρασης εκτελέστηκε μετά από 3 ώρες από τη διέγερση με 10 ng /ml TGFβ1.

χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση και μαζική παράλληλη αλληλουχίας

χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση (μάρκας) έγινε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [46], [47] με κάποιες αξίζει να προσέξετε τις αλλαγές. Εν συντομία, τα κύτταρα ξεπλύθηκαν με PBS σε θερμοκρασία δωματίου πριν από τη διασυνδεδεμένη σε ένα διάλυμα φορμαλδεΰδης 1%. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν και ομογενοποιήθηκαν σε παρουσία αναστολέων πρωτεάσης πριν υποβλήθηκε σε υπερήχους DNA. Μαγνητικά Dynal σφαιρίδια (Invitrogen) σε συνδυασμό με ένα μίγμα αντισωμάτων (20% Smad4 # 9515 (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ) και 80% Smad4 DCS-46 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) χρησιμοποιήθηκαν για να τραβήξει προς τα κάτω Smad4 όλη τη νύκτα. Το καθαρισμένο DNA χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει τον εμπλουτισμό φορές με Syber Πράσινο qRT-PCR βλέπε πίνακα S3 για μια λίστα των εκκινητών.

βιβλιοθήκες Sequencing παρήχθησαν για μαζική παράλληλη ανάλυση αλληλουχίας χρησιμοποιώντας πρότυπες μεθόδους. Εν συντομία, 500 ng DNA αναπτυσσόμενο υποβλήθηκε σε τερματισμό επισκευής, τερματικό αδενυλίωσης, και σύνδεση προσαρμογέα πριν θραύσματα που κυμαίνονται από ~175-250 απομονώθηκαν από 2% Ε-gel (Invitrogen). Μετά την τυποποιημένη 12 κύκλο PCR, ποιότητα του DNA αξιολογήθηκε πάνω σε ένα DNA 1.000 Bioanalyzer . chip (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) πριν υποβληθούν για αλληλούχιση σε Illumina GAII Όλα τσιπ επόμενα δεδομένα έχει κατατεθεί στο Gene Expression Omnibus (GEO) βάση δεδομένων στο National Center for Biotechnology Information (http: //www.ncbi .nlm.nih.gov /GEO) και τον αριθμό πρόσβασης GSE27526.

η γονιδιακή έκφραση προφίλ

Το συνολικό RNA εξήχθη από κύτταρα χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (Invitrogen) για την ανάλυση microrarray σε Affymetrix HGU133 Plus 2