Αφηρημένο

Ιστορικό

γλοιοβλάστωμα είναι η πιο συχνή και πιο κακοήθης πρωτοπαθούς όγκου του εγκεφάλου με κακή πρόγνωση. Η μετάφραση των θεραπευτικών στρατηγικών για γλοιοβλαστώματος από την πειραματική φάση στην κλινική έχει περιοριστεί από την ανεπαρκή ζωικά μοντέλα, τα οποία στερούνται σημαντικά χαρακτηριστικά των ανθρώπινων όγκων. Λεντοϊού γονιδιακή θεραπεία είναι μια ελκυστική θεραπευτική επιλογή για την ανθρώπινη γλοιοβλάστωμα, η οποία θα επικυρωθεί σε ένα κλινικά σχετικό ζωικό μοντέλο.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Χρησιμοποιήσαμε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος τρωκτικών που ανακεφαλαιώνει την επεμβατική και αγγειογενετική χαρακτηριστικά του ανθρώπινου γλοιοβλαστώματος να αναλυθεί το σχέδιο μεταγωγής και η θεραπευτική αποτελεσματικότητα του βραδέος ιού ψευδοτυποποιημένοι φορέων. Και οι δύο, λεμφοκυτταρική γλυκοπρωτεΐνη του ιού χοριομηνιγγίτιδας (LCMV-GP) και τη φυσαλιδώδη γλυκοπρωτεΐνη του ιού στοματίτιδας (VSV-G) ψευδοτυποποιημένοι φορείς λεντοϊών πολύ αποτελεσματικά σε μεταγωγή ανθρώπινα κύτταρα γλοιοβλαστώματος

in vitro

και

in vivo

. Σε αντίθεση, ψευδότυποι gammaretroviral φορείς, παρόμοιες με εκείνες που αξιολογούνται για την κλινική θεραπεία του γλοιοβλαστώματος, έδειξε αναποτελεσματική μεταφορά γονιδίων

in vitro

και

in vivo

. Τόσο ψευδότυποι φορείς λεντοϊών μεταχθέντα καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν χαρακτηρίζεται από CD133-, nestin- και SOX2-έκφραση τους, την ικανότητα να σχηματίζουν σφαιροειδή στα νευρικά μέσο βλαστοκυττάρων και να εκφράζουν δείκτες αστροκυτταρικές και νευρωνική διαφοροποίηση υπό συνθήκες ορού. Σε μια θεραπευτική προσέγγιση με τη χρήση του έρπητα γονίδιο αυτοκτονίας κινάσης θυμιδίνης απλού έρπητα (HSV-1

-tk

) συγχωνευμένο με eGFP, οι δύο φορείς λεντοϊών μεσολάβηση πλήρη ύφεση των συμπαγών όγκων, όπως φαίνεται στην MRI με αποτέλεσμα μια πολύ σημαντική επιβίωσης όφελος (ρ & lt? 0.001) σε σύγκριση με ομάδες ελέγχου. Σε όλες τις επαναλαμβανόμενες όγκους, επιζών eGFP-θετικά καρκινικά κύτταρα βρέθηκαν, υποστηρίζοντας την εφαρμογή προφάρμακο για αρκετούς κύκλους, ακόμη και για να ενισχύσει και να παρατείνει το θεραπευτικό αποτέλεσμα.

Συμπεράσματα /Σημασία

Εν κατακλείδι, λεντοϊού ψευδοτυποποιημένοι διανύσματα είναι πολλά υποσχόμενοι υποψήφιοι για γονιδιακή θεραπεία του γλοιώματος σε ασθενείς. Η αναποτελεσματική παράδοσης γονιδίων από gammaretroviral φορείς είναι σύμφωνη με τα αποτελέσματα που προκύπτουν στην κλινική θεραπεία για την GBM και έτσι επιβεβαιώνει την υψηλή επαναληψιμότητα της επεμβατικής γλοιώματος ζωικό μοντέλο για τη μεταγραφική έρευνα

Παράθεση:. Huszthy PC, Giroglou Τ, Tsinkalovsky O, Euskirchen Ρ, Skaftnesmo KO, Bjerkvig R, et al. (2009) Διαγραφή Επεμβατική, Cancer Stem-Όπως Ξενομοσχεύματα Γλοιοβλαστώματος Χρησιμοποιώντας φορέα λεντοϊού που διαμεσολαβείται Αυτοκτονία Γονιδιακή θεραπεία. PLoS ONE 4 (7): e6314. doi: 10.1371 /journal.pone.0006314

Επιμέλεια: Chris Jones, Ινστιτούτο Έρευνας για τον Καρκίνο, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 9 Μαρτίου, 2009? Αποδεκτές: 23 Ιούν 2009? Δημοσιεύθηκε: 20 του Ιούλη, 2009

Copyright: © 2009 Huszthy et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Συμβούλιο Ερευνών της Νορβηγίας (χορήγηση 186.492 έως HM), η νορβηγική Αντικαρκινική Εταιρεία, Helse Vest, Haukeland Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο, το πρόγραμμα Μπέργκεν Translational Research, το 6ο πρόγραμμα πλαίσιο της Ευρωπαϊκής Επιτροπής (Συμβόλαιο 504.743) και από το πρόγραμμα Koeln Fortune σε το Πανεπιστήμιο της Κολωνίας (επιχορήγηση 28/2006 για την HM). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

γλοιοβλάστωμα είναι η πιο συχνή και πιο κακοήθης πρωτοπαθούς όγκου του εγκεφάλου. Παρά τις προόδους στη νευροχειρουργική, η ακτινοβολία και η χημειοθεραπεία, η πρόγνωση των ασθενών παραμένει φτωχή, με μέση επιβίωση 14 μηνών [1].

Ένα σημαντικό μειονέκτημα στη μεταφραστική έρευνα για τον καρκίνο του εγκεφάλου ήταν η έλλειψη κατάλληλων ζωικών μοντέλων. Syngeneic- ή ξενομοσχεύματος όγκους που βασίζεται σε κυτταρικές σειρές γλοιοβλαστώματος καλλιεργούνται ως μονοστοιβάδες αναπτυχθεί ως περιγεγραμμένη και άκρως αγγειογενετική βλάβες

in vivo

[2], χωρίς τα επεμβατική τα καρκινικά κύτταρα, τα οποία αντιπροσωπεύουν ένα σημαντικό χαρακτηριστικό της ανθρώπινης γλοιοβλαστώματος. Τα επεμβατική κύτταρα μεταναστεύουν μακριά από την αρχική μάζα του όγκου και μπορεί να προκαλέσει επαναλαμβανόμενες όγκους σε διαφορετικές περιοχές του εγκεφάλου. Έτσι, αυτά τα κύτταρα αντιπροσωπεύουν ένα σημαντικό θεραπευτικό στόχο.

Μία πρόσφατα καθιερωμένο μοντέλο στο οποίο γλοιοβλαστώματος σφαιροειδή βιοψία με βάση τα σειριακά στους εγκεφάλους γυμνών αρουραίων δείχνει πολύ επεμβατική και αγγειογόνων χαρακτηριστικά [3]. Ως εκ τούτου, το μοντέλο αυτό είναι κατάλληλο για τη μελέτη των νέων θεραπευτικών στρατηγικών. Παρόλα αυτά, οι εκθέσεις που χρησιμοποιούν αυτό ή άλλες κλινικά σημαντικές μοντέλα για την πειραματική θεραπεία είναι λιγοστές. Πρόσφατα, αναλύσαμε το θεραπευτικό δυναμικό του HSV-1 με βάση το φορέα G207 ογκολυτική έρπητα στο μοντέλο GBM βιοψία σφαιροειδή που βασίζεται. Ο όγκος του όγκου σε ζώα που υπέστησαν αγωγή ήταν μειωμένη σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου, αλλά δεν υπήρχε σημαντικό πλεονέκτημα επιβίωσης [4]. Σε αντίθεση, η ίδια θεραπεία ήταν πιο αποτελεσματική σε ένα κύτταρο line- βασίζεται ζωικό μοντέλο [5] και ως αποτέλεσμα σήμερα διερευνηθεί σε μια φάση Ι /ΙΙ κλινική μελέτη [6]. Στην παρούσα έρευνα χρησιμοποιήθηκε το μοντέλο ξενομοσχεύματος επεμβατικές για την αξιολόγηση της μεταγωγής και η θεραπευτική αποτελεσματικότητα του βραδέος ιού ψευδοτυποποιημένοι φορέων.

Gammaretroviral φορείς που προέρχονται από την ιού λευχαιμίας ποντικού Moloney (MMLV) ήταν οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενες ρετροϊών για γονιδιακή θεραπεία του όγκους του εγκεφάλου [7] – [10]. Ωστόσο, παρά τα ελπιδοφόρα αποτελέσματα σε ζωικά μοντέλα, οι κλινικές δοκιμές με χρήση ρετροϊικού φορέα υπερκείμενα ή ρετροϊικά συσκευαστικά κύτταρα έχουν αποτύχει [11] – [13]. Ένα σημαντικό μειονέκτημα των φορέων gammaretroviral είναι ο αποκλειστικός μεταγωγή διαιρετικών κυττάρων, δεδομένου ότι σε ανθρώπινα γλοιώματα, η πλειονότητα των καρκινικών κυττάρων δεν διαιρούνται σε ένα δεδομένο παράθυρο θεραπείας. Ως εκ τούτου, οι φορείς λεντοϊών με την ικανότητά τους να μεταδιεγείρει επίσης μη διαιρούμενα κύτταρα είναι ελκυστικοί υποψήφιοι για τη θεραπεία του καρκίνου του εγκεφάλου. Σε προηγούμενες μελέτες, έχουμε αναπτύξει gammaretroviral και φορείς λεντοϊού ψευδοτυποποιημένοι με τις γλυκοπρωτεΐνες (GP) του ιού της λεμφοκυτταρικής χοριομηνιγγίτιδας (LCMV) [14], [15]. Αυτοί οι φορείς έχουν ένα ευρύ φάσμα ξενιστών και μπορεί να συμπυκνωθεί με υπερφυγοκέντρηση για

in vivo

εφαρμογές. Επιπλέον, LCMV-GP δεν είναι κυτταροτοξική, και μπορεί να καθοριστεί σταθερών ανασυνδυασμένων κυτταρικών σειρών συσκευασίας [16], [17]. Πρόσφατα, δείξαμε ότι λεντοϊού ψευδότυπους LCMV-GP παρέχονται αποτελεσματικά διαγονιδίων αρουραίου κύτταρα γλοιώματος

in vivo

, ενώ οι νευρώνες κάτοικος δεν μετήχθησαν [18]. Επιπλέον, δείξαμε μία σημαντική θεραπευτική επίδραση του LCMV-GP ψευδότυποι φορείς λεντοϊών στο μοντέλο γλοιώματος 9L αρουραίου κυτταρική σειρά που βασίζεται χρησιμοποιώντας το γονίδιο αυτοκτονίας HSV-1-

tk

. VSV-G βραδέος ψευδότυπους έδειξε επίσης μια σημαντική αποτελεσματικότητα, παρόμοια με εκείνη του ψευδότυπους LCMV, η οποία διαμεσολαβείται κυρίως από ένα φαινόμενο γειτνιάσεως των μετατραπέντων φυσιολογικών κυττάρων του εγκεφάλου [19].

Στην παρουσιαζόμενη εργασία, δείξαμε ότι οι δύο , VSV-G και φακοϊούς ψευδοτυποποιημένου LCMV-GP αποτελεσματικά σε μεταγωγή ανθρώπινα κύτταρα γλοιώματος

in vitro

και

in vivo

, ενώ gammaretroviral μεταγωγή ήταν αναποτελεσματική. Η μεταφορά γονιδίων σε κύτταρα γλοιώματος ήταν αποτελεσματική για τους δύο λεντοϊού ψευδοτυποποιημένοι τύπους φορέα. Ωστόσο, ήταν πιο συγκεκριμένη χρήση φορέων ψευδοτυπωμένους LCMV-GP, όπως VSV-G ψευδότυπους μετάγονται επίσης τα κύτταρα του εγκεφάλου ξενιστή σε επεμβατικές περιοχές. Ανάλυση διαμολυσμένα καρκινικά κύτταρα αποκάλυψε ότι και οι δύο φορείς λεντοϊών στοχευμένη CD133-θετικά καθώς και CD133-αρνητικά καρκινικά κύτταρα. Επιπλέον, μεταγωγή κύτταρα γλοιοβλαστώματος εξέφρασε την βλαστικών κυττάρων δείκτες νεστίνη και SOX2. Είναι σημαντικό, όταν αξιολογούνται για θεραπευτική εφαρμογή χρησιμοποιώντας τον HSV-1-

tk

ως διαγονίδιο, και οι δύο φορείς λεντοϊών που προκαλείται πλήρης υποχώρηση του όγκου στην MRI, με αποτέλεσμα ένα πολύ σημαντικό όφελος επιβίωσης (ρ & lt? 0.001) σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου .

Υλικά και Μέθοδοι

ηθική Δήλωση

Η συλλογή των ανθρωπίνων βιοψίας ιστού εγκρίθηκε από την περιφερειακή επιτροπή δεοντολογίας. Ο χειρισμός των ζώων και τις χειρουργικές επεμβάσεις έγιναν σύμφωνα με το νορβηγικό νόμο των ζώων και την τοπική επιτροπή δεοντολογίας ενέκρινε το πρωτόκολλο.

Οι κυτταρικές σειρές

Η ανθρώπινη σειρά εμβρυϊκού νεφρού 293Τ (ATCC αριθμός CRL-11268) και η κυτταρική σειρά ΤΕ671 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) και διατηρήθηκαν σε τροποποιημένο Eagle Medium Dulbbeco (DMEM) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS) και 1% γλουταμίνη. Όλες οι κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν σε 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2.

καλλιέργειας ιστού

Tumor θραύσματα από ασθενείς πολύμορφο γλοιοβλάστωμα ελήφθησαν κατά τη διάρκεια της χειρουργικής επέμβασης. δείγματα ιστού ελήφθησαν από βιώσιμες περιοχές του όγκου που αντιστοιχεί σε περιοχές με ενίσχυση αντίθεσης σε προεγχειρητική μαγνητική τομογραφία-σαρώσεις. Τα δείγματα μεταφέρθηκαν σε δοκιμαστικούς σωλήνες που περιέχουν πλήρες μέσο ανάπτυξης, και σφαιροειδή παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Η ίδια μέθοδος εφαρμόστηκε για υλικό όγκου περάστηκαν σε γυμνά ποντίκια. Εν συντομία, δείγματα ιστού άλεσμα σε τεμάχια περίπου 0.5 mm και τοποθετήθηκαν σε 80 cm

2 φιάλες καλλιέργειας ιστού (Nunc, Roskilde, Denmark) βάσης επικαλυμμένα με 0.75% άγαρ (Difco, Detroit, ΜΙ). Τα σφαιροειδή διατηρήθηκαν σε ένα πρότυπο επωαστήρα καλλιέργειας ιστού με 5% CO

2 και 100% σχετική υγρασία στους 37 ° C. Το μέσο αλλάχθηκε μία φορά την εβδομάδα. επιλέχθηκαν σφαιροειδή με διάμετρο μεταξύ 400 και 600 μm για

in vitro

πειράματα και για ενδοεγκεφαλική εμφύτευση.

Ο διαχωρισμός των όγκων

Οι όγκοι διαχωρίστηκαν με τη χρήση νευρωνικών διαστάσεως Kit (Miltenyi , Bergisch Gladbach-, Germany) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή

ανάλυση κυτταρομετρίας ροής και διαλογή κυττάρων

τα κύτταρα αναλύθηκαν και ταξινομούνται σε έναν MoFlo ταξινομητή κυττάρων (Beckman Coulter, USA?. πρώην Cytomation, USA), εξοπλισμένο με μια συνεκτική Επιχείρηση λέιζερ 621 ιόντων αργού συντονισμένοι σε 488 nm (που χρησιμοποιείται σε 180 mW) και 635 nm Diode (25 mW). Δύο μg /ml ιωδιούχου προπιδίου – ΡΙ (Molecular Probes) προστέθηκαν στα δείγματα πριν ροή διαλογή για να διευκολύνει νεκρός διάκριση κυττάρων. Η GFP και PI ήταν ενθουσιασμένοι στα 488 nm και ο φθορισμός μετρήθηκε μέσω 530/40 BP και 613/20 BP οπτικά φίλτρα (όλα τα φίλτρα από Omega Optical, Brattleboro, VT, USA), αντίστοιχα. Διπλές διακρίθηκαν χρησιμοποιώντας ένα προς τα εμπρός σκέδαση φωτός (FSC) έναντι εύρους παλμού. FL3 κανάλι (σε ​​λογαριθμική λειτουργία) με FSC είχαν χρησιμοποιηθεί για την εμφάνιση και την πύλη έξω PI θετικά /νεκρά κύτταρα. FSC και πλευρική σκέδαση φωτός (SSC) σήματα ανιχνεύθηκαν και παρουσιάζεται σε γραμμική λειτουργία. GFP + κύτταρα καθορίζεται με SSC έναντι FL1 (σε λογαριθμική λειτουργία) τελεία οικόπεδο μετά τον αποκλεισμό των νεκρών κυττάρων και των υπολειμμάτων, όπως περιγράφεται παραπάνω.

Για την ανάλυση των κυττάρων έκφρασης CD133 βάφτηκαν με αλλοφυκοκυανίνη (APC) συζευγμένο μονοκλωνικό CD133 /1 (AC133) αντισώματα (Miltenyi, Bergisch Gladbach-, Γερμανία), σύμφωνα με τη γενική πρωτόκολλο του κατασκευαστή για χρώση ανοσοφθορισμού (για 10 λεπτά στο σκοτάδι στους 4 ° C). CD133-APC ήταν ενθουσιασμένος στα 635 nm, ο φθορισμός μετρήθηκε μέσω 670/30 BP οπτικό φίλτρο, και ζωντανό + κύτταρα CD133 ορίστηκαν για SSC έναντι FL6 (σε λογαριθμική λειτουργία) dot οικόπεδο. Μη χρώση κυτταρικό εναιώρημα χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος.

GFP + καρκινικά κύτταρα ταξινομήθηκαν σε «καθαρίσει 1» mode σε στρογγυλού πυθμένα σωλήνες Falcon πολυπροπυλενίου (Becton Dickinson Labware Ευρώπη, Γαλλία) που περιέχει μέσα καλλιέργειας, τα οποία τοποθετήθηκαν στον πάγο. Κλάσματα από μερικά δείγματα κατά το τέλος της διαλογής απομακρύνθηκαν και να αναλύονται για τον έλεγχο της καθαρότητας είδους που ήταν μεγαλύτερη από 98%.

πολιτισμού διαλεγμένων κυττάρων

ταξινόμηση κύτταρα είτε καλλιεργήθηκαν σε Neurobasal μέσο (Invitrogen, Carlsbad, CA) με συμπλήρωμα Β27 (20 μl /ml? Invitrogen), Glutamax (10 μl /ml? Invitrogen), αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών 2 (20 ng /ml? Peprotech, Rocky Hill, NJ), του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (20 ng ml? Peprotech) ή μεταφέρθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS) και 1% γλουταμίνη και αναπτύχθηκαν επί καλυπτρίδων σε πλάκες 24 φρεατίων

χρώση ανοσοφθορισμού των σφαιροειδών /προσκολλημένων κυττάρων

τα σφαιροειδή /προσκολλημένα κύτταρα χρωματίστηκαν με ανθρώπινο ειδικό ποντικού-αντι-νεστίνη αντισώματα (Millipore, Billerica, ΜΑ), αντισώματα κατσίκας αντι-SOX2 (R &? D), ποντικού-αντι-β-tubulinIII (Millipore ) αντισώματα και-GFAP ποντικού-αντι αντισώματα (Millipore). Πρωτογενή αντισώματα επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C. αντισώματα Alexa-Fluor647-κατσίκας-αντι-ποντικού und Alexa-Fluor647-γαϊδάρου αντι-κατσίκα (Dianova, Αμβούργο, Γερμανία) χρησιμοποιήθηκαν ως δεύτερα αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 ° C (για σφαιροειδή) ή για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου (για προσκολλημένα κύτταρα). Τα σφαιροειδή εξετάστηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Nikon, Tokyo, Japan) και προσκολλημένα κύτταρα αναλύθηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία laser σάρωσης (Zeiss, Jena, Germany).

λεντοϊών και ρετροϊικοί φορείς

Ο λεντοϊού πλασμιδικός φορέας pRRL.sinCMVeGFPpre δημοσιεύθηκε από Naldini et al. [21]. Η κατασκευή του φορέα λεντοϊού pRRL.sinCMV-ΤΚ /eGFPpre έχει περιγραφεί προηγουμένως. Ο ρετροϊικός φορέας pMP71-eGFP-pre έχει περιγραφεί προηγουμένως [22].

Παρασκευή βραδέος ιού και ρετροϊικών υπερκειμένων φορέα

Ο 293Τ κυτταρική γραμμή χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγή παροδική φορέα λεντοϊού. Ο φορέας λεντοϊού πλασμίδιο pRRL.sinCMV-ΤΚ /eGFPpre (5 μg) ή pRRL.sinCMVeGFPpre (5 μg), το πλασμίδιο έκφρασης gag-pol-REV HIV pCMV-dR8.91 (12,5 μg) [21] και 2 μα του φάκελος πλασμίδιο έκφρασης pHCMV-LCMV-GP [14] ή pCMV-G [23] συνδιαμολύνθηκαν σε κύτταρα 293Τ και συμπυκνώθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Για την παραγωγή ρετροϊικών φορέων, κύτταρα 293Τ επιμολύνθηκαν με 7.5 μα pMP71-eGFP-προ, 12,5 μg του pSV-Mo-MLVgagpol, και 2 μg του πλασμιδίου έκφρασης φακέλου pHCMV-LCMV-GP [14] ή pCMV-G [23]. Φορείς συλλέχθηκαν και συμπυκνώθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24].

Η τιτλοδότηση των υπερκειμένων ιικού φορέα

Vectors τιτλοδοτήθηκαν επί κυττάρων ΤΕ671 όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18].

Εμφύτευση σφαιροειδή γλοιοβλάστωμα

Ενδοκρανιακή εμφύτευση των σφαιριδίων γλοιοβλάστωμα έγινε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25].

Vector έγχυση

Τρεις εβδομάδες έως ένα μήνα μετά την εμφύτευση, τα ζώα αναισθητοποιούνται και προετοιμάζονται για ένεση φορέα. Το δέρμα τραβήχτηκε για να αποκαλύψει τη θέση του κρανιοτομή. 2 φορές 10 μί των αποθεμάτων φορέα παραδόθηκαν στο κέντρο των όγκων χρησιμοποιώντας μια γυάλινη σύριγγα (μοντέλο 701, Χάμιλτον, Bonaduz, Ελβετία) εξασφάλισε σε ένα μικροεπεξεργαστή ελεγχόμενη αντλία έγχυσης (UMP 2-1, World Precision Instruments, Aston, Stevenage , UK). Οι συντεταγμένες έγχυσης εκτιμήθηκαν μετά από ανάλυση εικόνων MRI για κάθε βλάβη. έγχυση Vector έγινε με συναγωγή ενισχυμένη παροχή κατά τη διάρκεια 25 λεπτών (200 nl /min για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 400 nl /min για 10 λεπτά, και τελικά 800 nl /min για 5 λεπτά). Μετά την έγχυση, η βελόνα αφέθηκε στη θέση του για 5 λεπτά για να αποφευχθεί διάνυσμα αναρροή. Η βελόνα αργά ανασυρθεί και οι δερματοπτυχών έκλεισαν με πολυαμίδιο χειρουργικό νήμα. Μετά την χειρουργική επέμβαση, οι αρουραίοι αφέθηκαν να ανανήψουν σε ένα σύστημα επώασης στους 35 ° C πριν από την επιστροφή τους στους κλωβούς.

Θεραπεία των γλοιωμάτων αρουραίου

Οι αρουραίοι που φέρουν ξενομοσχεύματα γλοιοβλαστώματος υποβλήθηκαν σε αγωγή με ημερήσιες ϊ.ρ. ενέσεις των 50 mg /kg ganciclovir (GCV, Roche, Βασιλεία, Ελβετία).

Ανάλυση των εγκεφάλων αρουραίων

Τα ζώα ευθανατώθηκαν και διαποτίστηκαν με στείρο αλατόνερο και στη συνέχεια με 4% παραφορμαλδεΰδη. Οι εγκέφαλοι απομακρύνθηκαν, αιωρήθηκε σε 30% σακχαρόζη για τρεις ημέρες, και στη συνέχεια καταψύχθηκαν σε ισοπεντάνιο ψύχεται με ξηρό πάγο. Στεφανιαίες τομές (12 μm) παρασκευάστηκαν σε κρυοστάτη. Για την ανάλυση ανοσοφθορισμού, οι τομές χρωματίστηκαν με ανθρώπινο-ειδικά αντι-νεστίνη αντισώματα (Millipore) για τη ανθρώπινα κύτταρα γλοιοβλαστώματος, αντι-NeuN ποντικού (Millipore) αντισωμάτων για νευρώνες, ειδικές ποντικού-αντι-νεστίνη αντισώματα αρουραίου (Millipore) για τη αστροκύτταρα και τα προγονικά κύτταρα. Πρωτογενή αντισώματα (αραίωση 1:200) επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Βιοτινυλιωμένο κατσίκα-αντι-ποντικού και αίγας-αντι-κουνελιού (Vector Laboratories, Burlinghame, CA) χρησιμοποιήθηκαν σαν δεύτερα αντισώματα (αραίωση 1:100) για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Οι τομές επωάστηκαν με εξτραβιδίνη-Cy3 (Sigma, St. Louis, ΜΟ) ως φθοριόχρωμα (αραίωση 1:200) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι τομές εξετάστηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Nikon) και αναλύθηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία σάρωσης με λέιζερ (Zeiss, Jena, Germany).

Για την ανάλυση της αποτελεσματικότητας μεταγωγής, συνεχόμενα τμήματα (κάθε 20.-30.) Σε όλη την όγκοι εξετάστηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Nikon) με ένα αυτοματοποιημένο στάδιο χρησιμοποιώντας μεγέθυνση 10x. Ο όγκος μεταγωγή υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό απεικόνισης της Nikon Lucia.

Ανοσοβαφή τομές παραφίνης

παραφίνη ενσωματωμένα τμήματα ιστού φορμόλη-σταθερή από τον εγκέφαλο του αρουραίου και του υλικού ασθενών που είχαν τοποθετηθεί στο μπάνιο ξυλόλιο για 2 × 3 λεπτά , απόλυτη αιθανόλη 2 × 3 λεπτά, 96% αιθανόλη 2 × 2 λεπτά και τελικά σε απεσταγμένο νερό για 30 δευτερόλεπτα για την αφαίρεση της παραφίνης και επανυδάτωση. Επιτόπου ανάκτηση πραγματοποιήθηκε με θέρμανση των τμημάτων στους 99 ° C για 20 λεπτά σε 10 mM κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα σε ρΗ 6.0. Οι τομές επωάστηκαν με ένα μονοκλωνικό ανθρώπινο-ειδικό αντι-νεστίνης αντίσωμα 1:200 σε TBS /1% BSA επί μία νύκτα στους 4 ° C. Ένα βιοτινυλιωμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού (Vector Laboratories) χρησιμοποιήθηκε ως δεύτερο αντίσωμα (αραίωση 1:100) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου ακολουθούμενη από ABC-συγκρότημα επώαση για 30 λεπτά. Τμήματα αναπτύχθηκαν με με 3’3-διαμινοβενζιδίνη (DAKO Cytomation), ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Μαγνητική τομογραφία

Χρησιμοποιώντας ένα Bruker Pharmascan 7 Tesla MR scanner (Bruker Biospin, Billerica, ΜΑ ), αξονική ΣΠΑΝΙΑ ακολουθίες Τ2 αποκτήθηκαν (επανάληψη του χρόνου, 4.200 ms? ηχώ του χρόνου, 36 ms? πάχος τομής, ενός χιλιοστού? οπτικό πεδίο, 3,2 εκατοστά? μεγέθους της μήτρας, 256 × 256? 20 φέτες). Κατά τη διάρκεια της σάρωσης, τα ζώα κρατήθηκαν υπό αναισθησία με 1.5% ισοφλουράνιο (Schering-Plough, Kenilworth, NJ) αναμειγνύεται με 50% αέρα και 50% Ο2.

Στατιστική ανάλυση

Η επιβίωση αναλύθηκε με μια δοκιμασία log-rank με βάση τη δοκιμή Kaplan-Meier με τη χρήση του λογισμικού SPSS. Οι διαφορές μεταξύ των ζευγών των ομάδων καθορίζεται από το Μαθητή

t-test

.

P

τιμές & lt? 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές

Αποτελέσματα

λεντοϊών ψευδοτυποποιημένοι φορείς αποτελεσματικά τη μεταγωγή σφαιροειδή γλοιοβλάστωμα

in vitro

Η

Ανθρώπινο γλοιοβλάστωμα. σφαιροειδή που προέρχονται είτε απευθείας από τον ασθενή (χαμηλή γενιάς) ή από την σειριακή

in vivo

περάσματα στους εγκεφάλους γυμνών αρουραίων (υψηλή γενιάς), μολύνθηκαν με λεντοϊού LCMV-GP (5 × 10

4 10 μΙ) ή VSV-G φορείς ψευδότυποι βραδέος ιού (και τα δύο 5 × 10

4 σωματίδια σε 10 μΐ) ή με ρετροϊικούς φορείς MLV-based ψευδοτυποποιημένο με LCMV-GP (1 × 10

5 σωματίδια σε 10 μΙ). Οι φορείς παρασκευάστηκαν με τον ίδιο τρόπο για

in vitro

και

in vivo

πειράματα (βλέπε υλικά και μέθοδοι). Και οι δύο φορείς λεντοϊών σε μεταγωγή σφαιροειδή ασθενούς και σφαιροειδή υψηλή παραγωγή πολύ αποτελεσματικά (Εικόνα 1). Σε αντίθεση, οι ρετροϊικοί φορείς μετάγονται μόνο μερικά μονά κύτταρα σε σφαιροειδή υψηλής γενιάς (Σχήμα 1) και απέτυχε να μετάγει σφαιροειδή ασθενή (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Εν κατακλείδι, οι δύο φορείς λεντοϊών είναι πολύ πιο αποτελεσματική στη μεταγωγή του ανθρώπου σφαιροειδή γλοιοβλάστωμα

in vitro

από φορείς ρετροϊών.

Ανθρώπινο σφαιροειδή γλοιοβλαστώματος που προέρχονται από βιοψία ασθενή ή μετά από σειριακό πέρασμα σε γυμνούς αρουραίους (υψηλής γενιάς) μολύνθηκαν με φορείς λεντοϊών ψευδοτυποποιημένοι με LCMV-GP (5 × 10

4) ή VSV-G (5 × 10

4) ή με φορείς ρετροϊών ψευδοτυποποιημένοι με LCMV-GP (1 × 10

5). Όλοι οι φορείς που εκφράζουν το γονίδιο δείκτη eGFP. Τα σφαιροειδή αναλύθηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία για έκφραση eGFP 7 ημέρες μετά τη μόλυνση. Εικόνες δείχνουν eGFP (πράσινο), αντίθεσης φάσης και μια επικάλυψη των δύο. Χαμηλή gen .: σφαιροειδή που προέρχονται απευθείας από υλικό του ασθενούς (χαμηλή γενιάς). Υψηλή gen .: σφαιροειδή προέρχεται από σειριακή

in vivo

διόδους στον εγκέφαλο του αρουραίου (υψηλή γενιάς). Αρχική μεγέθυνση 100 ×.

Η

φορείς λεντοϊών ψευδοτυποποιημένοι αποτελεσματικά και ειδικά τη μεταγωγή κυττάρων γλοιοβλαστώματος

in vivo

Η

Για να συγκριθεί η αποτελεσματικότητα μεταγωγής λεντοικής και gammaretroviral φορείς

in vivo

, χρησιμοποιήσαμε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος που αντανακλά τις αγγειογόνες και επεμβατικές χαρακτηριστικά του ανθρώπινου γλοιοβλαστώματος

in situ

. Το ξενομόσχευμα εκφράζει επίσης την νευρικών προγονικών νεστίνη δείκτη και στενά ανακεφαλαιώνει την ιστολογία του όγκου ασθενή (Σχήμα 2). Οι φορείς ενέθηκαν στο κέντρο του προοδευτικά αυξανόμενη βλαβών χρησιμοποιώντας ελέγχεται από μικροεπεξεργαστή στερεοτακτική έγχυση. Οι συντεταγμένες έγχυσης εκτιμήθηκαν μετά από ανάλυση εικόνων MRI για κάθε βλάβη. Ο όγκος της ένεσης που εφαρμόστηκε ήταν 2 × 10 μl και το διάνυσμα τίτλος 1 × 10

7 /ml για όλους τους φορείς. αποτελεσματικότητα μεταγωγής αξιολογήθηκε 7 ημέρες μετά την ένεση φορέα. Και οι δύο λεντοϊού ψευδότυποι φορείς έδειξε πολύ αποτελεσματική μεταγωγή των όγκων (Σχήμα 3Α, D). Όταν αναλύθηκαν σε μεγαλύτερη μεγέθυνση, τόσο LCMV-GP και VSV-G ψευδότυποι φορείς λεντοϊού έδειξαν αποτελεσματική παράδοση διαγονιδίου να καρκινικά κύτταρα νεστίνη-θετικά σε στερεά (Σχήμα 3Β, Ε) και επεμβατική περιοχές του όγκου (Σχήμα 3C, F). Σε αντίθεση, ο ρετροϊικός φορέας σε μεταγωγή μόνο μερικά διάσπαρτα κύτταρα όγκου κοντά στη θέση της ένεσης (Σχήμα 3 G, H). Για μια ποσοτική σύγκριση του αποτελεσματικότητα μεταγωγής μεταξύ των δύο λεντοϊκούς ψευδοτυποποιημένοι φορείς, οι περιοχές GFP-θετικά μετρήθηκαν σε ιστολογικές πλάκες (βλέπε υλικά και μέθοδοι). Ο συνολικός όγκος των μετατραπέντων ιστού όγκου ήταν 7,05 ± 3,51 mm

3 για LCMV-GP φορείς ψευδότυποι και 4,05 ± 2,04 mm

3 για VSV-G φορείς ψευδότυποι (Σχήμα 3θ). Αν και υπήρχε μια διαφορά στη μέση, δεν ήταν στατιστικά σημαντική (p = 0,269) εξαιτίας της υψηλής διαφορές (τυπικές αποκλίσεις)

τομές παραφίνης του όγκου του ασθενούς και τον όγκο ξενομοσχεύματος χρωματίστηκαν με Η &.? E (AD) ή ανοσοχρώση με αντι-νεστίνη αντισώματα ανθρώπου-ειδική (E, F). όγκου ασθενών (Α) και ξενομοσχεύματος όγκου (Β) δείχνουν αγγειογενετική χαρακτηριστικά του ανθρώπινου γλοιοβλαστώματος με palisading νέκρωση (βέλος) και αγγειακά πολλαπλασιάζονται (αιχμές βελών). Μεγαλύτερη μεγέθυνση του ασθενούς (C) και ξενομοσχεύματος όγκου (D) καταδεικνύουν παρόμοια μορφολογία των κυττάρων του όγκου με πολυμορφικές πυρήνες στην περιοχή του ενός νέκρωσης όγκου. Ασθενής (Ε) και ξενομοσχεύματος όγκου (F) δείχνουν ισχυρή έκφραση νεστίνη των καρκινικών κυττάρων. Ενιαία διείσδυση των καρκινικών κυττάρων στη λευκή ύλη παρατηρείται στον όγκο ξενομοσχεύματος (F). Η βιοψία ασθενής προήλθε μόνο από το στερεό πυρήνα του όγκου. Α, Β, Ε, F: Αρχική μεγέθυνση 100 ×. C, D: Αρχική μεγέθυνση 200 ×

Η

Ενδοκρανιακή γλοιώματα μολύνθηκαν με LCMV-GP ή VSV-G ψευδοτυποποιημένοι φορείς λεντοϊών ή με LCMV-GP ψευδοτυποποιημένοι φορείς ρετροϊών που εκφράζουν eGFP 3-4 εβδομάδες μετά την εμφύτευση σφαιροειδές. και αναλύθηκαν με φθορισμό (A, D, G) ή μικροσκοπία λέιζερ συνεστιακή σάρωσης (B, C, E, F, η) 7 ημέρες μετά τη μόλυνση. Οι ομοεστιακό εικόνες δείχνουν επικάλυψη της eGFP (πράσινο φθορισμό) και την ανθρώπινη-συγκεκριμένες νεστίνη (ερυθρός φθορισμός). Οι όγκοι αποτελεσματικά μεταγωγή από λεντοϊού LCMV-GP (A-C) και VSV-G ψευδότυποι φορείς (D-F), ενώ ρετροϊικοί φορείς μετάγονται μόνο λίγα διάσπαρτα καρκινικά κύτταρα (G, Η? Βέλη). Τα μετατραπέντα κύτταρα γλοιώματος εκφρασμένο ανθρώπινο ειδικό νεστίνη σε στερεά (Β, Ε, Η) και επεμβατική περιοχές όγκου (C, F? Βέλη). (Ι) αποτελεσματικότητα μεταγωγής των φορέων λεντοϊού συγκρίθηκε ποσοτικά με τη μέτρηση του όγκου της μεταγωγής σε ιστολογικές τομές χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού και λογισμικό απεικόνισης της Nikon. LCMV σε μεταγωγή όγκους (n = 3) έδειξε μεγαλύτερο όγκο μεταγωγή από VSV σε μεταγωγή όγκους (n = 3), ωστόσο, η διαφορά δεν ήταν στατιστικά σημαντική (p = 0,269). Α, D: Αρχική μεγέθυνση 40 ×. C, Ε, Ζ? Η: Αρχική μεγέθυνση 100 ×. D, F:. Αρχική μεγέθυνση 200 ×

Η

Για να αναλυθεί η ειδικότητα μεταγωγή, ιστολογικές τομές διηθητικού περιοχές του όγκου υπέστησαν χρώση για συγκεκριμένους δείκτες αρουραίου NeuN (για νευρώνες) και νεστίνη (για αστροκύτταρα και προγονικά κύτταρα). LCMV-GP ψευδοτυποποιημένοι φορείς λεντοϊών έχουν υποστεί μεταγωγή αποκλειστικά καρκινικά κύτταρα σε όλες τις επεμβατικές περιοχές (Σχήμα 4Α), ενώ τα φυσιολογικά κύτταρα του εγκεφάλου δεν υπέστησαν μεταγωγή (Σχήμα 4Β, C). Επίσης VSV-G φορείς ψευδότυποι έδειξε ειδική μεταγωγή των καρκινικών κυττάρων σε ορισμένους επεμβατική περιοχές (Εικόνα 4D, Ε), όμως, έχουν υποστεί μεταγωγή επίσης μερικά κύτταρα του εγκεφάλου ξενιστή σε άλλες θέσεις (Σχήμα 4G, Η).

Ενδοκρανιακά γλοιώματα μολύνθηκαν με LCMV-GP- ογ VSV-G-ψευδοτυποποιημένοι φορείς λεντοϊών που εκφράζουν eGFP 3-4 εβδομάδες μετά την εμφύτευση του όγκου και αναλύθηκαν συνεστιακή μικροσκοπία σάρωσης με λέιζερ 7 ημέρες μετά τη μόλυνση. Η μεταγωγή των επεκτατικών κυττάρων όγκου αναλύθηκε μετά από χρώση με αντισώματα ανθρώπινου νεστίνη-ειδικά. νευρώνες υποδοχής και αστροκύτταρα σημάνθηκαν χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι NeuN και GFAP. Διηθητική περιοχές έδειξε μόνο κύτταρο εισβολή από κύτταρα όγκου (Α-Γ, Ε, F) ή συσσώρευση υποεπενδυματικό κυττάρων όγκου (D, G, H). Οι φορείς LCMV ψευδοτυποποιημένου σε μεταγωγή ειδικά επεμβατικές κύτταρα γλοιώματος (A-C). VSV-G φορείς ψευδότυποι έδειξε ειδική μεταγωγή των καρκινικών κυττάρων σε ορισμένους τομείς επεμβατικές (D-F), αλλά επίσης και τη μεταγωγή του ενιαίου φυσιολογικών κυττάρων του εγκεφάλου σε άλλες (G, H? Βέλη). Τα μετατραπέντα φυσιολογικά κύτταρα του εγκεφάλου ως επί το πλείστον ανιχνεύθηκαν από μορφολογικές κριτήρια (περισσότερες διαδικασίες), όπως κηλίδωση (GFAP ή NeuN) δεν είναι πάντα συσχετίζονται με τα μεταγόμενα κύτταρα. Α, D: νηστίνη χρώση, μεγέθυνση 200 ×. Β, Ε, Ζ: χρώση GFAP, μεγέθυνση 200 ×. C, F, H:. Χρώσης NeuN, μεγέθυνση 200 ×

Η

λεντοϊών ψευδοτυποποιημένοι φορείς τη μεταγωγή του καρκίνου του στελέχους-όπως κύτταρα γλοιώματος

Για να αναλύσει τις δυνατότητες και των δύο φορείς λεντοϊών να μολύνει τον καρκίνο βλαστικά κύτταρα όμοια, μεταδιηγερμένα όγκοι ενζυματικώς διαχωρίστηκαν και η έκφραση CD133 μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Αμφότεροι οι φορείς μετάγονται CD133-θετικών και CD133-αρνητικά κύτταρα (Σχήμα 5Α). Αν και υπήρχαν ατομική υψηλή διαφορές στο κλάσμα του συνολικού CD133-θετικών καρκινικών κυττάρων στα διάφορα ξενομοσχεύματα, και οι δύο φορείς έδειξαν παρόμοια αποτελεσματικότητα στην μεταγωγή CD133-θετικών κυττάρων, η οποία ήταν ελαφρώς υψηλότερο από το συνολικό κλάσμα του CD133-θετικών κυττάρων (Πίνακας 1) .

Ενδοκρανιακή γλοιώματα μολύνθηκαν με LCMV-GP ή VSV-G φορείς ψευδοτυποποιημένοι λεντοϊού που εκφράζουν eGFP 3-4 εβδομάδες μετά την εμφύτευση του όγκου. Οι όγκοι αποκόπηκαν όταν μεγάλες βλάβες εμφανίστηκαν σε μαγνητική τομογραφία και τα ενζυμικά σε διάσταση. Η μεταγωγή του CD133 θετικών κυττάρων μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής. (Α) LCMV-GP και VSV-G φορείς ψευδοτυποποιημένοι τη μεταγωγή CD133 θετικά και αρνητικά καρκινικά κύτταρα. Το κλάσμα των μετατραπέντων κυττάρων (GFP-θετικά) είναι ελαφρώς υψηλότερο σε CD133 θετικά κύτταρα (δεξιά στήλη) σε σύγκριση με αρνητικά κύτταρα CD133 (μεσαία στήλη). GFP + κύτταρα ταξινομήθηκαν, καλλιεργήθηκαν παρουσία ή απουσία ορού και αναλύθηκαν με φθορισμό (Β-G) ή ομοεστιακή μικροσκοπία (H-O). LCMV-GP (Β) και VSV-G (Ε) σε μεταγωγή κύτταρα σχηματίζουν σφαιροειδή κατόπιν καλλιέργειας σε νευρικά βασικό μέσο χωρίς ορό συμπληρωμένου με EGF και bFGF. Μετάγονται σφαιροειδή εκφράζουν το νευρικό δείκτες βλαστοκυττάρων νεστίνη (C, F) και SOX2 (D, G). Τα μετατραπέντα κύτταρα καλλιεργούνται σε μέσο που περιέχει ορό εκφράζουν την σημειωτές βλαστοκυττάρων νεστίνη (Η, L) και SOX2 (Ι, Μ), αλλά επίσης και η διαφοροποίηση Σημάδια GFAP (J, Ν) και βήτα-tubulinIII (Κ, Ο). Οι εικόνες C, D, E, F, HO δείχνουν επικάλυψη του ιού-παραδοθεί διαγονιδίου (eGFP, πράσινο) και ανιχνεύεται αντιγόνο (Alexa-647, κόκκινο).

Η

Η GFP- θετικών κυττάρων από όγκους μεταγωγή με LCMV-GP ή VSV-G ψευδότυποι φορείς λεντοϊού ταξινομήθηκαν και καλλιεργήθηκαν σε νευρωνικά βασικό μέσο συμπληρωμένο με EGF και bFGF. Τα μετατραπέντα καρκινικά κύτταρα και από τις δύο φορείς ήταν σε θέση να σχηματίσει σφαιροειδή (σχήμα 5Β, E). Τα σφαιροειδή που εκφράζονται τους δείκτες αρχέγονων κυττάρων νεστίνη και SOX2 (Σχήμα 5C, D, F, G). Ταξινόμηση κύτταρα επίσης επιστρώθηκαν υπό συνθήκες ορού. Τα κύτταρα συνέχισαν να δείχνουν σημαντική έκφραση των δεικτών των βλαστικών κυττάρων νεστίνη και SOX2, αλλά επίσης και της δεικτών διαφοροποίησης GFAP και β-tubulinIII (Σχήμα 5Η-O).

λεντοϊών ψευδοτυποποιημένοι φορείς που εκφράζουν το γονίδιο αυτοκτονίας HSV-1 –

tk

μεσολαβούν ένα αποτελεσματικό θεραπευτικό αποτέλεσμα

in vivo

η

Για να αξιολογηθεί η θεραπευτική αποτελεσματικότητα τόσο της λεντοϊού pseudotyoped φορείς στην επεμβατική μοντέλο ξενομοσχεύματος, φορείς που εκφράζουν το γονίδιο αυτοκτονίας HSV1-

tk συγχωνευμένο με

eGFP εγχύθηκαν σε καθιερωμένους όγκους όταν είναι ορατός στην MRI χρησιμοποιώντας την ίδια μέθοδο όπως περιγράφηκε για το

in vivo μελέτη

τροπισμό. Τα ζώα υπέστησαν αγωγή ημερησίως με /kg ganciclovir 50 mg επί 30 ημέρες ξεκινώντας 7 ημέρες μετά την ένεση φορέα. Η ανάπτυξη του όγκου μετρήθηκε κάθε 7-14 ημέρες με MRI. Μετά από 4 εβδομάδες θεραπείας, 7 από 8 ζώα τόσο στην LCMV- και το VSV-ψευδότυπου αγωγή ομάδες είχαν πλήρη ύφεση στην MRI (Σχήμα 6). Ένα ζώο σε κάθε ομάδα είχε μια σταθερή νόσο μέχρι το τέλος της θεραπείας GC. Όλα τα ζώα στις ομάδες ελέγχου ανέπτυξαν μεγάλους όγκους κατά την διάρκεια της περιόδου θεραπείας των 30 ημερών (Σχήμα 6). Και οι δύο, LCMV- και VSV-ψευδότυπου ζώα που υπέστησαν αγωγή είχαν πολύ σημαντικό πλεονέκτημα επιβίωσης (ρ & lt? 0.001) σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου (Σχήμα 7Α). Δεν υπήρχε στατιστικά σημαντική διαφορά στην επιβίωση μεταξύ των δύο ομάδων θεραπείας.

Εκπρόσωπος τρισδιάστατη μαγνητική τομογραφία (Τ2 σπάνια). φορείς (Α, F, Κ, Ρ) λεντοϊών LCMV-GP με αγωγή ganciclovir. φορείς (Β, G, L, Q) λεντοϊών VSV-G με κατεργασία ganciclovir. φορείς (C, Η, Μ, R) λεντοϊών LCMV-GP χωρίς θεραπεία ganciclovir. φορείς (D, I, N, S) λεντοϊών VSV-G χωρίς θεραπεία ganciclovir. (Ε, J, O, Τ) θεραπεία ganciclovir μόνο. χρονικές στιγμές μετά την εμφύτευση του όγκου: (Α-Ε) 1 ημέρα πριν την ένεση φορέα. (F-J) 1. εβδομάδα θεραπείας ganciclovir. (Κ-Ο) 2. εβδομάδες θεραπείας ganciclovir. (PT) θεραπεία γκανσικλοβίρη 4. εβδομάδα.

Η

Ενδοκρανιακή γλοιώματα έλαβαν ένεση με LCMV-GP ή VSV-G φορείς ψευδοτυποποιημένοι λεντοϊού που εκφράζουν HSV-1

tk

συγχωνευμένο με eGFP 3 εβδομάδες μετά την εμφύτευση του όγκου. 7 ημέρες μετά τη μόλυνση φορέα, τα ζώα και στις δύο ομάδες έλαβαν και σε μία ομάδα ελέγχου υποβλήθηκαν σε αγωγή με γανκικλοβίρη επί 30 ημέρες. καμπύλη επιβίωσης (Α) Kaplan-Meier. Το όφελος επιβίωσης για τις δύο ομάδες θεραπείας σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου ήταν στατιστικά σημαντική (

P

& lt? 0.001? Δοκιμασία log-rank). Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην επιβίωση μεταξύ των δύο ομάδων θεραπείας. (Β-D) Αντιπροσωπευτικά MRI (Τ2 RARE) των επαναλαμβανόμενων όγκων στο LCMV- (B, C) και η ομάδα VSV-αγωγή (D, E). (Β) Τα χωροκατακτητικά ετερόπλευρο υποτροπή. (C) Επεμβατική τοπικές και ετερόπλευρο υποτροπή. (D) Περισσότερα περιγεγραμμένες τοπική υποτροπή. (Ε) Η μακροσκοπική εικόνα ενός εγκεφάλου αρουραίου με υποτροπή στην παρεγκεφαλίδα (κόκκινος κύκλος), υποβλήθηκε σε επεξεργασία με VSV-G φορείς ψευδοτυποποιημένοι και GC. (F-M) Τμήματα των επαναλαμβανόμενων όγκων βάφτηκαν με αντισώματα έναντι ανθρώπινου ειδικά νεστίνη και αναλύθηκαν με φθορισμό (F, J) ή ομοεστιακή μικροσκοπία (G-Ι, Κ-Μ).