Αφηρημένο

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι μία από τις συχνότερες μορφές καρκίνου και δεν υπάρχει απαίτηση για την αναγνώριση των προγνωστικών βιοδεικτών. Σε αυτή την πρωτεΐνη μελέτης προφίλ έκφρασης καθιερωθεί για τον ορθοκολικό καρκίνο και φυσιολογικό βλεννογόνο του κόλου με πρωτεομική με χρήση ενός συνδυασμού δύο διαστάσεων ηλεκτροφόρηση πηκτής με φρέσκο ​​κατεψυγμένες τομές ζεύγη Dukes Β ορθοκολικό καρκίνο και φυσιολογικό ορθοκολικό βλεννογόνο (n = 28), ανάλυση εικόνας γέλη και υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης-διαδοχική φασματομετρία μάζας. Ιεραρχική ανάλυση συστάδων και ανάλυση σε κύριες συνιστώσες έδειξαν ότι τα προφίλ πρωτεϊνικής έκφρασης του καρκίνου του παχέος εντέρου και φυσιολογικό βλεννογόνο του κόλου συγκεντρωμένα σε ξεχωριστές μορφές έκφρασης της πρωτεΐνης. Σαράντα-πέντε πρωτεΐνες που εμφάνισαν τουλάχιστον 1,5 φορές αυξημένη έκφραση σε καρκίνο του παχέος εντέρου και την ταυτότητα αυτών των πρωτεϊνών επιβεβαιώθηκε με φασματομετρία μάζας χρωματογραφία-διαδοχική υγρό. Δεκαπέντε πρωτεΐνες που έδειξαν αυξημένη έκφραση επικυρώθηκαν με ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας ένα καλώς χαρακτηρισμένο ορθοκολικό καρκίνο μικροσυστοιχία ιστού που περιέχει 515 πρωτογενή ορθοκολικό καρκίνο, 224 λέμφου μετάσταση στους λεμφαδένες και 50 κανονικής κολονικής βλεννογόνου δείγματα. Οι πρωτεΐνες που έδειξαν το μεγαλύτερο βαθμό υπερέκφρασης στην πρωτογενή ορθοκολικό καρκίνο συγκριτικά με φυσιολογικό βλεννογόνο του κόλου ήταν πρωτεΐνη θερμικού σοκ 60 (ρ & lt? 0.001), S100A9 (ρ & lt? 0.001) και μεταφραστικά ελεγχόμενης πρωτεΐνης όγκων (ρ & lt? 0.001). Ανάλυση των πρωτεϊνών προσδιορίζονται μεμονωμένα 14-3-3β ως προγνωστικό βιοδείκτη (χ

2 = 6,218, p = 0,013, HR = 0,639, 95% CI 0,448 έως 0,913). Ιεραρχική ανάλυση συστάδων εντοπίζονται διακριτές φαινοτύπους που σχετίζονται με την επιβίωση και την υπογραφή δύο πρωτεϊνών που αποτελείται από 14-3-3β και αφυδρογονάση αλδεΰδη 1 ταυτοποιήθηκε ως δείχνοντας προγνωστική σημασία (χ

2 = 7.306, p = 0,007, HR = 0,504, 95 % CI 0,303 έως 0,838) και ότι παρέμεινε ανεξάρτητο προγνωστικό (p = 0.01, HR = 0,416, 95% CI 0,208 έως 0,829) σε ένα πολυπαραγοντικό μοντέλο

Παράθεση:. O’Dwyer D, Ralton LD, O ‘ Shea Α, Murray GI (2011) Οι Πρωτεομική του καρκίνου του παχέος εντέρου: Αναγνώριση ενός Υπογραφή πρωτεΐνης που σχετίζεται με την πρόγνωση. PLoS ONE 6 (11): e27718. doi: 10.1371 /journal.pone.0027718

Επιμέλεια: Χριστίνα Lynn Addison, Οτάβα Νοσοκομείο Ίδρυμα Ερευνών, Καναδάς

Ελήφθη: 8 Σεπ, 2011? Αποδεκτές: 23 Οκτ 2011? Δημοσιεύθηκε: 18 Νοεμβρίου 2011

Copyright: © 2011 O’Dwyer et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από τη χρηματοδότηση από την Ένωση Διεθνών Ερευνών Καρκίνου (www.aicr.org.uk), NHS Grampian και το Πανεπιστήμιο του Aberdeen Ανάπτυξης Εμπιστοσύνη (www.abdn.ac.uk/giving). Η ανάπτυξη του ορθοκολικού καρκίνου μικροσυστοιχιών ιστού υποστηρίχθηκε από τη συνεργασία της Σκωτίας Ακαδημαϊκό Επιστημών Υγείας χρηματοδοτείται από επιστημονικού διευθυντή γραφείου της κυβέρνησης της Σκωτίας (www.cso.scot.nhs.uk/SuppScience/SAHSC.11.html). DO’D ελάμβανε ένα προπτυχιακό ερευνητική υποτροφία από την παθολογική Society (www.pathsoc.org) να προβεί σε παρένθετα πτυχίο Med Sci. Η διευκόλυνση Αμπερντίν Proteome (www.abdn.ac.uk/ims/proteomics/) χρηματοδοτείται από κοινού από Βιοτεχνολογίας και Βιολογικών Επιστημών Συμβούλιο Έρευνας, Χρηματοδότηση Συμβούλιο της Σκωτίας και το Πανεπιστήμιο του Aberdeen. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

στο δυτικό κόσμο καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC) είναι το τρίτο πιο κοινό είδος καρκίνου και η δεύτερη συνηθέστερη αιτία θανάτου από καρκίνο [1]. Σε όλο τον κόσμο από ένα εκατομμύριο άνθρωποι κάθε χρόνο θα αναπτύξουν CRC και η συχνότητα εμφάνισης αυτού του όγκου αυξάνεται [1]. Οι περισσότερες περιπτώσεις είναι σποραδικές CRC που προκύπτουν από τη συσσώρευση των σωματικών γενετικών ανωμαλιών και συνδέονται με μία ποικιλία περιβαλλοντικών παραγόντων κινδύνου [1], [2]. Το υπόλοιπο ποσοστό των περιπτώσεων αφορά μια οικογενειακή γενετική συνιστώσα. Πολυάριθμες γενετικών ανωμαλιών συσσωρεύονται συμπεριλαμβανομένου την αδρανοποίηση της αδενωματώδη πολυποδίαση coli ογκοκατασταλτικό γονίδιο και ενεργοποίηση των ογκογονιδίων όπως Κ-ras, διαγραφή του χρωμοσώματος 18q και ενίσχυση 20q [1], [3]. Σωρευτικά αυτές οι γενετικές αλλαγές παρέχουν τα καρκινικά αντι-αποπτωτικά, προ-αγγειογενετική και πολλαπλασιαστικές ιδιότητες. Πρόσφατα έχει γίνει δεκτό ότι CRC είναι γενετικά ετερογενής νόσος και έχουν δύο διακριτά μονοπάτια της καρκινογένεσης έχει εντοπιστεί. Σποραδικών CRC, το 85% τα αποτελέσματα από χρωμοσωμική αστάθεια και το υπόλοιπο 15% από αστάθεια μικροδορυφόρου [3]. Αντί συμβαίνουν ως μια γραμμική διαδικασία πολλών σταδίων, του παχέος καρκινογένεση είναι πιο πιθανό να είναι το αποτέλεσμα της πολύπλοκης αλληλεπίδρασης μεταξύ πολλαπλών μεταλλάξεων οδούς. Αυτό μπορεί να εξηγήσει εν μέρει την κλινική ετερογένεια αυτής της ασθένειας και τη μεγάλη διαφορά που παρατηρείται στην έκβαση μεταξύ των ασθενών [2]. Αυτό τονίζει η σαφής απαίτηση να έχουν τελειοποιηθεί μεθόδους ταξινόμησης και κατηγοριοποίησης ορθοκολικού καρκίνου με τον προσδιορισμό και την επικύρωση των κατάλληλων βιοδεικτών.

Μοριακοί βιοδείκτες μπορεί να χαρακτηριστεί από την ικανότητά τους να βοηθήσουν την πρόληψη, την προώθηση της έγκαιρης ανίχνευσης, καθορίζει την πρόγνωση και την πρόβλεψη ανταπόκριση της ασθενή σε ειδικές θεραπείες [4], [5]. Η ανακάλυψη βιοδεικτών θα βοηθήσει επίσης στην κατανόηση των βιολογικών μηχανισμών που υπόκεινται στην ανάπτυξη και εξέλιξη της νόσου. Ενώ γονιδιωματική συμπεριλαμβανομένων epigenomics και transcriptomics έχουν επιρροή στην ανακάλυψη βιοδεικτών, μελετώντας τα γονίδια και την έκφραση του γονιδίου δεν αντικατοπτρίζει με ακρίβεια την ποσότητα της πρωτεΐνης που εκφράζεται στο κύτταρο. Επιπλέον πρωτεΐνες υποβάλλονται σε πολλές μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις οι οποίες μπορούν να επηρεάσουν την ενεργοποίηση, οι αλληλεπιδράσεις τους και λειτουργούν εντός ενός κυττάρου. Πρωτεομική η οποία είναι η παγκόσμια μελέτη των πρωτεϊνών έχει έναν βασικό ρόλο στην πιθανή ταυτοποίηση βιοδεικτών που σχετίζονται με όγκους [6], [7]. Η σχέση μεταξύ των επιμέρους βιοσημειωτές όγκου και καρκίνο του παχέος εντέρου έχει ερευνηθεί εκτενώς και μελέτες έχουν συμπεριλάβει βιοδείκτες που αντιπροσωπεύουν γονίδια και πρωτεΐνες που εμπλέκονται σε πολλές πτυχές της ανάπτυξης και εξέλιξης του όγκου συμπεριλαμβανομένης της εισβολής του όγκου και της μετάστασης, ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, παράγοντες ανάπτυξης και συναφείς απόπτωση πρωτεΐνες [5] [8], – [26].

σε αυτή τη μελέτη έχουμε χρησιμοποιήσει συγκριτική πρωτεομική ανάλυση (δύο διαστάσεων ηλεκτροφόρηση πηκτής, ανάλυση εικόνας των πηκτωμάτων και φασματομετρία μάζας) για την ταυτοποίηση πρωτεϊνών οι οποίες υπερ-εκφράζεται σε καρκίνο του παχέος εντέρου, σε σύγκριση με το φυσιολογικό ορθοκολικό μορφολογικά βλεννογόνου. έχουν υπερεκφράζεται πρωτεΐνες έχουν επικυρωθεί με ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας ένα μεγάλο καλά χαρακτηρισμένη σύνολο του παχέος εντέρου και μια πρωτεΐνη υπογραφή που σχετίζεται με την πρόγνωση εντοπιστεί.

Μέθοδοι

Δύο διαστάσεων (2D) ηλεκτροφόρησης γέλης

ηλεκτροφόρηση 2D πήγματος πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ζεύγη φρέσκου κατεψυγμένου καρκίνου του Β κόλον Dukes ‘και μορφολογικά φυσιολογικό βλεννογόνο του κόλου (τυφλό και το ανιόν κόλον, n = 15 και σιγμοειδές κόλον n = 13) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20] – [22], [ ,,,0],27]. Όλες οι περιπτώσεις που επιλέγεται από την ορθοκολικό τράπεζα όγκων Aberdeen και οι κλινικοπαθολογικών λεπτομέρειες των δειγμάτων που χρησιμοποιούνται για πρωτεομική σημειώνεται στον Πίνακα 1. Καμία από ασθενείς είχαν λάβει χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία πριν από την επέμβαση. Κατά τη συλλογή, τόσο όγκου και φυσιολογικών ορθοκολικού βλεννογόνου αποκόπηκαν από ορθοκολικό καρκίνο δείγματα εκτομής εντός 30 λεπτών από χειρουργική αφαίρεση, και αμέσως καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C πριν από την ανάλυση.

Η

Κατεψυγμένα τμήματα (20 πάχος μικρά, n = 30) κάθε δείγματος κόπηκαν και διαλυτοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης [27]. Ένα τμήμα (πάχος 10 μικρά) από κάθε δείγμα κηλιδώθηκε με αιματοξυλίνη και ηωσίνη και τη μορφολογική διάγνωση επιβεβαιώνεται με μικροσκοπική εξέταση φωτός. Μετά solubulisation, τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν για να απομακρυνθούν τα αδιάλυτα κυτταρικά υπολείμματα και υφίσταται κατεργασία με DNase. ηλεκτροφόρηση πηκτής 2D διεξήχθη εις διπλούν για κάθε δείγμα χρησιμοποιώντας 13 cm pI3-10 μη γραμμικές λωρίδες Immobilon (GE Health Care, Little Chalfont, UK) με πρωτεΐνες διαχωρίζονται σύμφωνα με το φορτίο (300 V, 6 λεπτά, 3500 V, 90 λεπτά , 3500 V, 300 λεπτά), και στη συνέχεια το μοριακό βάρος (100 V, 25 mA ανά γέλη για 60 λεπτά). Μετά την ολοκλήρωση της ηλεκτροφόρησης, τα πηκτώματα χρωματίστηκαν με coomassie blue για να απεικονίσει πρωτεΐνες κηλίδες.

απεικόνισης Gel και ανάλυση

Οι πηκτές στη συνέχεια σαρώνονται για την παραγωγή 256 της κλίμακας του γκρι 24 bit εικόνες που σώθηκαν ως TIFF αρχεία. Οι απεικονίζεται πηκτές αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Progenesis SameSpots (μη γραμμικής δυναμικής, Newcastle-upon-Tyne, Ηνωμένο Βασίλειο). Όλες οι εικόνες τζελ εισήχθησαν Progenesis SameSpots για ανάλυση. αξιολόγηση της ποιότητας της εικόνας έγινε επίσης με τη χρήση του λογισμικού SameSpots να εξασφαλιστεί όλες οι εικόνες ήταν στη σωστή μορφή για την ανάλυση και δεν είχε άλλα προβλήματα που θα μπορούσαν να επηρεάσουν με επακόλουθη ανάλυση εικόνας. Όλες οι πηκτές αρχικά ευθυγραμμίζονται αυτόματα επάνω σε ένα πήκτωμα αναφοράς χρησιμοποιώντας το λογισμικό ανάλυσης, τότε ευθυγραμμίζονται με το χέρι για να εξασφαλιστεί σωστή ευθυγράμμιση όλων των γελών, επιτρέποντας σε όλα τα σημεία που πρέπει να ανιχνευθεί, ομαλοποιημένη και συμφωνημένα σε όλες τις γέλες. Αντικείμενα (π.χ., σωματίδια σκόνης ή ραβδώσεις ανιχνεύεται ως πρωτεΐνη σημεία) απομακρύνθηκαν με χειροκίνητη επεξεργασία. τζελ εικόνα αναφοράς δημιουργήθηκαν μετά από ευθυγράμμιση τζελ χρησιμοποιώντας το λογισμικό ανάλυσης. Μόλις ευθυγραμμίζονται, γέλες αυτόματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Progenesis SameSpots. Τα πήγματα διαχωρίστηκαν σε 2 ομάδες, είτε όγκου ή κανονικός γέλες. Η στατιστική ανάλυση των επιπέδων έκφρασης πρωτεΐνης στην συνέχεια προσδιορίζεται για κάθε κηλίδα με βάση μέσου όγκου τόπου, και οι διαφορές στην έκφραση πρωτεΐνης μεταξύ όγκου και φυσιολογικών πηκτώματα αξιολογήθηκαν με ANOVA. επιλέχθηκαν σημεία με p ≤ 0,05 για συμπερίληψη στα αποτελέσματα. Πολυπαραγοντική ανάλυση έγινε επίσης χρησιμοποιώντας Progenesis SameSpots και τόσο ανάλυση συσχέτισης και ανάλυση κύριων συστατικών έγινε στις απεικονίζεται τζελ. ανάλυση συσχέτισης πραγματοποιήθηκε σε επίπεδα έκφρασης κανονικοποιούνται σημείο καταγραφής στην ομάδα είδε την κίνηση του κοινού σύμφωνα με τις ομοιότητες στα προφίλ τους έκφραση. Κύρια ανάλυση συστατικών που χρησιμοποιούνται επίπεδα έκφρασης σημείο σε όλες τις γέλες να διαχωριστούν τα πηκτώματα σύμφωνα με την παραλλαγή της έκφρασης, επιτρέποντας μια γραφική αναπαράσταση των πολυδιάστατων δεδομένων, συγκεντρωμένα σε δύο ομάδες? όγκου και φυσιολογικών. Η τελική έκθεση που δείχνει όλα αναλύονται κηλίδες στο gel μαζί με τιμές ANOVA, τάξεις και τα προφίλ έκφρασης για κάθε σημείο με βάση το μέσο κανονικό όγκο για τα τότε παράγεται ομάδες.

υγρή χρωματογραφία-διαδοχική φασματομετρία μάζας

Μετά την ηλεκτροφόρηση γέλης και 2D ανάλυση εικόνας των πηκτωμάτων τα πρωτεϊνικά σημεία ενδιαφέροντος (εκείνα τα σημεία τα οποία ήταν σημαντικά αυξημένα στα δείγματα όγκου) αποκόπηκαν από τις πηκτές και πρωτεΐνες που ταυτοποιούνται με φασματομετρία μάζας υγρής χρωματογραφίας-tandem.

Πρωτεΐνες στα κομμάτια γέλη υποβλήθηκαν σε πέψη με θρυψίνη (βαθμός αλληλουχίας, τροποποιημένο? Promega UK, Southampton, UK) χρησιμοποιώντας ένα ερευνητή PROGEST ρομποτικό σταθμό εργασίας (Genomic Solutions Ltd., Huntingdon, UK). Εν συντομία, οι πρωτεΐνες μειώθηκαν με DTT (60 ° C, 20 min), S-αλκυλιωμένη με ιωδοακεταμίδιο (25 ° C, 10 λεπτά) και στη συνέχεια υποβάλλεται σε πέψη με θρυψίνη (37 ° C, 8 ώρες). Το προκύπτον εκχύλισμα τρυπτικό πεπτίδιο ξηράνθηκε με περιστροφική εξάτμιση (SC110 Speedvac? Savant Instruments, Holbrook, ΝΥ, USA) και διαλύθηκε σε 0.1% μυρμηκικό οξύ για ανάλυση LC-MS /MS

διαλύματα πεπτιδίου αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα. HCTultra PTM Σύστημα Discovery (Bruker Daltonics Ltd, Coventry, UK) σε συνδυασμό με ένα Ultimate 3000 Σύστημα LC (Dionex (UK) Ltd., Camberley, Surrey, UK). Τα πεπτίδια διαχωρίστηκαν σε ένα μονολιθικό τριχοειδή στήλη (200 μm εσωτερική διάμετρο χ 5 cm σε μήκος? Dionex). Έκλουσμα Α ήταν 3% ακετονιτρίλιο σε νερό που περιέχει 0.05% μυρμηκικό οξύ, μέσο έκλουσης Β -80% ακετονιτρίλιο σε νερό που περιέχει 0.04% μυρμηκικό οξύ με μια βαθμίδα 3% -45% Β σε 12 λεπτά με ρυθμό ροής 2,5 μL /λεπτό. Φάσματα μάζας θραύσμα πεπτιδίου αποκτήθηκαν στα δεδομένα που εξαρτώνται από AutoMS (2) Λειτουργία με μια σειρά σάρωσης των 300-1500 m /z, 3 μέσους όρους, και έως 3 πρόδρομος ιόντα επιλέγονται από την MS σάρωση 100 έως 2200 m /z). Πρόδρομες ουσίες αποκλείστηκαν ενεργά μέσα σε ένα παράθυρο 1,0 λεπτών, και αποκλείστηκαν όλες οι μόνες φορτισμένα ιόντα.

Το πεπτίδιο κορυφές ανιχνεύτηκαν και αποσυσπειρωμένο αυτόματα χρησιμοποιώντας το λογισμικό ανάλυσης δεδομένων (Bruker). Μάζα λίστες με τη μορφή της μασκότ αρχεία γενόσημων δημιουργήθηκαν αυτόματα και χρησιμοποιείται ως είσοδος για μασκότ MS /MS Ίωνες αναζητήσεις της βάσης δεδομένων NCBInr με τη χρήση του web server Matrix Science (www.matrixscience.com). Οι παράμετροι προεπιλεγμένη μηχανή αναζήτησης που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: ένζυμο = θρυψίνη, κατ ‘ανώτατο όριο αποτυχίας αποκοπής = 1? σταθερό τροποποιήσεις = carbamidomethyl (C)? μεταβλητή τροποποιήσεις = οξείδωση (Μ)? πεπτίδιο ανοχή ± 1,5 Da? MS /MS ανοχή ± 0,5 Da? πεπτίδιο χρέωση = 2+ και 3+ και μέσο = ESI-TRAP.

Και τα δύο ηλεκτροφόρηση διαστάσεων τζελ και φασματομετρία μάζας πραγματοποιήθηκαν από το Πανεπιστήμιο του Aberdeen Proteome εγκατάσταση (www.abdn.ac.uk/ims/πρωτεομική /).

Ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου ιστού μικροσυστοιχιών

Μια παχέος μικροσυστοιχιών καρκινικού ιστού κατασκευάστηκε περιέχει φυσιολογικό βλεννογόνο του παχέος εντέρου (n = 50), πρωτοβάθμιας (n = 515) και μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου ( n = 224), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28], [29].

Όλες οι περιπτώσεις επιλέχθηκαν από την τράπεζα του παχέος όγκου Αμπερντίν. Συνολικά, τα δείγματα όγκων από 515 ασθενείς συμμετείχαν σε αυτή τη μελέτη, σε κάθε περίπτωση, η διάγνωση του πρωτοπαθούς καρκίνου του παχέος εντέρου είχαν γίνει, και οι ασθενείς είχαν υποβληθεί σε εκλεκτική χειρουργική επέμβαση για την πρωτογενή καρκίνο του παχέος εντέρου, στο Aberdeen, μεταξύ 1994 και 2007. 99 όγκους ήταν από την περίοδο 1994-1998, 199 όγκοι ήταν 1.999 έως 2.003 και 217 όγκοι ήταν από την περίοδο 2004-2007. Κανένας από τους ασθενείς είχαν λάβει καμία προεγχειρητική χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία. Τα δεδομένα για τους ασθενείς και οι όγκοι τους περιλαμβάνονται στην παρούσα μελέτη περιγράφεται λεπτομερώς στην υποστήριξη πληροφορίες Πίνακα S1. Η μέση απόδοση λεμφαδένας για όλους τους όγκους σε αυτή τη μελέτη ήταν 13,4 λεμφαδένες ανά όγκο και για τον κόμβο αρνητικούς όγκους η μέση απόδοση λεμφαδένα ήταν 14,4 (απόδοση λεμφαδένας αναφέρεται στο συνολικό αριθμό των λεμφαδένων που ανακτώνται από κάθε παχέος δείγμα καρκίνο εκτομή). πληροφορίες επιβίωση ήταν διαθέσιμες για όλους τους ασθενείς και κατά το χρόνο της να λογοκρίνει τα δεδομένα έκβαση των ασθενών είχαν υπάρξει 237 (46%) των θανάτων (θνησιμότητα από όλα τα αίτια). Η μέση επιβίωση των ασθενών ήταν 114 μήνες (95% CI 105-122 μήνες). Οι ορθοκολικό καρκίνο δείγματα εκτομή ελήφθησαν φρέσκα, άνοιξε πάνω και όταν ενδείκνυται κάτω του όγκου, πλένεται με κρύο νερό και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν σε 10% ουδέτερη ρυθμισμένη φορμαλίνη για τουλάχιστον 48 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου και αντιπροσωπευτικές μπλοκ ενσωματωμένων σε κερί. Οι τομές χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη για ιστοπαθολογική διάγνωση και οι όγκοι έχουν αναφερθεί σύμφωνα με το Royal College of κατευθυντήριων γραμμών Παθολόγοι τα οποία ενσωματώνουν καθοδήγηση από TNM5 του συστήματος σταδιοποίησης TNM.

Μια παχέος μικροσυστοιχιών καρκινικού ιστού κατασκευάστηκε περιέχει φυσιολογικό κόλον βλεννογόνου (n = 50), πρωτοβάθμιας (n = 515) και μεταστατικό ορθοκολικό καρκίνο (n = 224). Οι μεταστάσεις ήταν όλοι από όγκο που εμπλέκονται λεμφαδένες από τις περιπτώσεις Dukes C. Κάθε δείγμα φυσιολογικού βλεννογόνου αποκτήθηκε από τουλάχιστον 10 cm μακριά από τον όγκο, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28], [29]. Όλες οι περιπτώσεις εξετάστηκαν και οι περιοχές του ιστού πρέπει να ληφθούν δείγματα εντοπίστηκαν για πρώτη φορά και σηματοδότησε την κατάλληλη αιματοξυλίνη και ηωσίνη χρωματισμένο διαφανειών ειδικός σύμβουλος του γαστρεντερικού παθολόγο (GIM). Δύο 1 πυρήνες mm λήφθηκαν από αυτές τις περιοχές του αντίστοιχου κερί ενσωματωμένο μπλοκ χρησιμοποιώντας ένα microarrayer ιστού Beecher Instruments (Sun Prairie, WI, USA) και τοποθετήθηκαν σε ένα μπλοκ δέκτη παραφίνη. Μετά τη μεταφορά, το μπλοκ συστοιχία αποδέκτη θερμάνθηκε στους 37 ° C, και ένα γυάλινο πλακίδιο χρησιμοποιήθηκε για να πιέσετε προσεκτικά τους πυρήνες για να διασφαλιστεί ότι ήταν όλοι στο ίδιο επίπεδο εντός του μπλοκ παραλήπτη κερί.

Ανοσοϊστοχημεία

Ανοσοϊστοχημεία για κάθε αντίσωμα (Πίνακας 2) πραγματοποιήθηκε με τη βιοτίνη δωρεάν σύστημα Dako Envision ™ (Dako, Ely, Ηνωμένο Βασίλειο) χρησιμοποιώντας ένα Autostainer Dako (Dako) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28], [30], [31] . Τμήματα της μικροσυστοιχίας ιστού αποκηρώθηκαν σε ξυλόλιο, επανυδατώθηκαν σε αλκοόλη και ένα βήμα ανάκτησης αντιγόνου εκτελείται. Αυτό το βήμα συνίστατο σε φούρνο μικροκυμάτων τα τμήματα πλήρως βυθισμένα σε 10 mM κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα σε ρΗ 6,0 για 20 λεπτά σε ένα φούρνο μικροκυμάτων των 800 W φούρνος λειτουργεί σε πλήρη ισχύ. Οι τομές στη συνέχεια αφέθηκε να ψυχθεί σε θερμοκρασία δωματίου. Το πρωτογενές αντίσωμα αραιωμένο κατάλληλα (Πίνακας 2) εντός αραιωτικού αντισώματος (Dako) εφαρμόστηκε για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, πλύθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα (Dako) με επακόλουθη υπεροξειδάση αποκλεισμού για 5 λεπτά (Dako). Αυτό ακολουθήθηκε από μία μόνο πλύση ρυθμιστικού 2 λεπτό μετά την οποία προ-αραιωμένου με υπεροξειδάση πολυμερές επισημασμένο κατσίκα αντι-ποντικού /κουνελιού δευτερογενές αντίσωμα (Envision ™, Dako) εφαρμόστηκε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, που ακολουθείται από περαιτέρω πλύση με ρυθμιστικό διάλυμα για την απομάκρυνση μη δεσμευμένο αντίσωμα. Τοποθεσίες της δραστηριότητας υπεροξειδάσης στη συνέχεια αποδεικνύεται με διαμινοβενζιδίνη ως το χρωμογόνο εφαρμόζεται για τρεις διαδοχικές περιόδους πέντε λεπτά. Τέλος τομές πλύθηκαν σε νερό, ελαφρά με αιματοξυλίνη, αφυδατώνονται και τοποθετημένα. Η παράλειψη του πρωτογενούς αντισώματος από την ανοσοϊστοχημική διαδικασία και αντικαθιστώντας το με είτε αραιωτικό αντισώματος ή μη-άνοσο ορό κουνελιού κατά περίπτωση ενήργησε ως αρνητικοί μάρτυρες. Οι θετικοί μάρτυρες ήταν ιστοί που είναι γνωστό ότι εκφράζουν την πρωτεΐνη άτομο.

Η

Οι τομές αξιολογήθηκαν με φως μικροσκοπική εξέταση και η ένταση της ανοσοχρώσης σε κάθε πυρήνα αξιολογείται ανεξάρτητα από δύο ερευνητές (DO’D και GIM) χρησιμοποιώντας ένα σύστημα βαθμολόγησης που περιγράφηκε προηγουμένως για την αξιολόγηση της έκφρασης πρωτεΐνης σε μικροσυστοιχίες όγκου [28] – [31]. Η ένταση της ανοσοχρώσης σε κάθε πυρήνα βαθμολογήθηκε ως αρνητική, αδύναμη, μέτρια ή ισχυρή. Η υποκυτταρική εντόπιση (είτε πυρηνική ή κυτταροπλασματική) της ανοσοχρώση επίσης εκτιμήθηκε. Διακύμανση ανοσοχρώση μεταξύ πυρήνες κάθε περίπτωση δεν είχε εντοπιστεί. Τυχόν διαφορές στην αξιολόγηση των τεμαχίων των ιστών μεταξύ των δύο παρατηρητές επιλύθηκαν με ταυτόχρονη μικροσκοπική επαναξιολόγηση.

Αξιολόγηση των μικροδορυφόρων αστάθειας κατάστασης

μικροδορυφορικού κατάσταση αστάθεια (MSI) εκτιμήθηκε με ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας αντισώματα για να MLH1 και MSH2 (Πίνακας 2), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30].

Στατιστικά

η στατιστική ανάλυση των ανοσοϊστοχημική δεδομένων, συμπεριλαμβανομένου του Mann-Whitney U, Wilcoxon signed rank test, chi- τετράγωνο τεστ, ιεραρχική ανάλυση συστάδων, ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier, δοκιμασία log-rank και Cox ανάλυση πολλαπλών περιγραφικές (μεταβλητές εισαχθεί ως κατηγορικές μεταβλητές) συμπεριλαμβανομένου του υπολογισμού των δεικτών κινδύνου και 95% ΠΙ πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση PASW v18.0.2 για τα Windows XP ™ (SPSS UK, Ltd, Woking, Ηνωμένο Βασίλειο). Η δοκιμή log rank χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των διαφορών επιβίωση μεταξύ των επιμέρους ομάδων. Μια τιμή πιθανότητας p ≤ 0,05 θεωρήθηκε ως σημαντική. Να διερευνήσει την επίδραση των διαφορετικών σημείων αποκοπής σε σχέση με την επιβίωση διαχωρίστηκαν μεταξύ τους οι ανοσοϊστοχημικές βαθμολογίες για κάθε δείκτη. Οι ομάδες που αναλύθηκαν ήταν αρνητικοί έναντι οποιασδήποτε θετικής χρώσης, τα αρνητικά και τα ασθενή χρώση σε σχέση με μέτρια και ισχυρή χρώση και αρνητικό, ασθενές και μέτρια χρώση έναντι ισχυρή χρώση. Ιεραρχική ανάλυση διασποράς διεξήχθη με τη χρήση της πλέον μέθοδο γείτονα με το τετράγωνο Ευκλείδεια απόσταση ως την ανάλυση μέτρο διασποράς και διασποράς έγινε χωρίς καμία μετατροπή των δεδομένων ή τον καταλογισμό των ελλιπών τιμών [18], [19].

Ηθική

το έργο είχε την έγκριση της The North of Scotland Επιτροπής Ερευνητικής Δεοντολογίας (σχετ. αρ. 08 /S0801 /81). Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από τους συμμετέχοντες που παρέχονται φρέσκα δείγματα ιστού για την πρωτεομική συνιστώσα της μελέτης. Η επιτροπή δεοντολογίας στην έρευνα παραιτηθεί από την απαίτηση για γραπτή συγκατάθεση για την αναδρομική ιστού δειγμάτων που περιλαμβάνονται στον ορθοκολικό καρκίνο μικροσυστοιχιών ιστού.

Αποτελέσματα

Πρωτεομική

Συνολικά πάνω από 1200 ατομικές πρωτεΐνη κηλίδες αναλύθηκαν μετά από διαχωρισμό με ηλεκτροφόρηση γέλης 2D και ανάλυσης εικόνας στην κανονική βλεννογόνο του κόλου και του παχέος εντέρου όγκοι (Σχήμα 1). Ιεραρχική ανάλυση συστάδων και αρχή ανάλυση συστατικών έδειξε τον διαχωρισμό των πρωτεϊνών σε δύο διακριτές ομάδες- κανονικό και όγκου (Σχήμα 2). Η μελέτη περιελάμβανε τόσο εγγύς και άπω όγκους του παχέος εντέρου και ούτε σύμπλεγμα ούτε αρχή συστατικών ανάλυση έδειξε ότι δεν υπήρχε καμία διαφορά στα προφίλ έκφρασης πρωτεΐνης μεταξύ όγκου και φυσιολογικού βλεννογόνου σε αυτές τις ανατομικές θέσεις. Οι πρωτεΐνες που δείχνει μεγαλύτερη από ό, τι και ίσο με 1,5 φορές αυξημένη έκφραση σε δείγματα όγκων συνοψίζονται στην υποστήριξη των πληροφοριών Πίνακα S2. Η ταυτότητα αυτών των πρωτεϊνών επιβεβαιώθηκε ως επί το πλείστον με φασματομετρία μάζας χρωματογραφία-διαδοχική υγρό. Για κάθε πρωτεΐνη πολλαπλά πεπτίδια με υψηλή στατιστική πιθανότητα (p & lt? 0,05) των αγώνων με τη σχετική πρωτεΐνης αναλύθηκαν για την επιβεβαίωση της ταυτότητας. Οι λεπτομέρειες της μάζας ταυτοποίηση με φασματομετρία πρωτεϊνών φαίνεται στην υποστήριξη των πληροφοριών Πίνακα S3.

Εκπρόσωπος τζελ 2D αναφοράς του φυσιολογικού παχέος εντέρου (Α) και του όγκου του παχέος εντέρου (C). Αυτά είναι τα σχολιασμένη τζελ αναφοράς που δημιουργούνται από την ίδια νούμερα λογισμικό ανάλυσης εικόνας τζελ Progenesis για την ανάλυση των επιμέρους τζελ. Ο αριθμός του κάθε τόπου έχει εκχωρηθεί από το λογισμικό ανάλυσης εικόνας. Για ευκολότερη απεικόνιση των μεμονωμένων κηλίδων Τα αντιπροσωπευτικά μη σχολιασμένη γελών 2D του φυσιολογικού κόλου και όγκων του παχέος εντέρου φαίνεται στο πάνελ Β και D αντίστοιχα. Οι πρωτεΐνες οι οποίες επικυρώθηκαν με ανοσοϊστοχημεία έχουν εντοπιστεί στο Δ

Η

Εκπρόσωπος ιεραρχική ανάλυση συστάδων (Α) και ανάλυση σε κύριες συνιστώσες (Β) των φυσιολογικών και καρκινικών τζελ. Αμφότερες οι στατιστικές μεθόδους δείχνουν ότι τα προφίλ έκφρασης πρωτεΐνης προσδιορίζεται με ηλεκτροφόρηση πηκτής 2D και ανάλυση εικόνας γέλη είναι διακριτές σε δείγματα όγκων συγκριτικά με φυσιολογικά δείγματα. Το κατώτερο πάνελ σε κάθε σχήμα παρουσιάζει τα προτυποποιημένα προφίλ έκφρασης. Τα στοιχεία που παρουσιάζονται στο σχήμα 2 είναι «οθόνη συλλαμβάνει» της εξόδου της ανάλυσης από το λογισμικό Progenesis SameSpots. Τόσο το σχήμα 2Α και σχήμα 2Β αντιπροσωπεύει τα αποτελέσματα του ίδιου πειράματος του μία περίπτωση (δηλαδή ένα ζεύγος κανονικής γελών Ν1 και Ν2 και ένα ζεύγος γελών όγκου Τ1 και Τ2). Το κατώτερο πάνελ σε κάθε μέρος του σχήματος δείχνει την τυποποιημένη προφίλ έκφρασης και αντιπροσωπεύει πρωτεΐνες διακριτών έκφρασης χαράσσονται κάθετα με τις γραμμές «που συνδέουν» τις αντίστοιχες πρωτεΐνες σε κάθε γέλη. Οι χρωματιστές κηλίδες αντιπροσωπεύουν διαδραστικά σημεία τοποθετούνται από το λογισμικό για το χρήστη να έχει πρόσβαση που το καθένα δεδομένων και τοποθετούνται αυθαίρετα από το λογισμικό στην οθόνη.

Η

Η ανοσοϊστοχημεία

επιλέχθηκαν Δεκαπέντε πρωτεϊνών για ανοσοϊστοχημική επικύρωση. Τα κριτήρια για την επιλογή των πρωτεϊνών που περιλαμβάνονται τον βαθμό υπερέκφρασης σε καρκίνο του παχέος εντέρου, ο αποκλεισμός των γνωστών διαρθρωτικών π.χ. ακτίνης και πρωτεϊνών ορού e.g.haemoglobin και η διαθεσιμότητα κατάλληλων επικυρωμένων αντισωμάτων τα οποία ήταν αποτελεσματικά επί σταθεροποιημένων με φορμαλίνη κερί παραφίνη ιστό.

Όλες οι πρωτεΐνες παρουσίασαν χρώση των καρκινικών κυττάρων και εκτός nucleophosmin (NPM1) έδειξε κυτταροπλασματική χρώση (Σχήμα 3). NPM1 έδειξε αποκλειστικά πυρηνική χρώση, ενώ αφυδρογονάση 3 φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH) έδειξε τόσο πυρηνική και κυτταροπλασματική χρώση και έχουν αυτά τα δύο υπο-κυτταρική εντοπιότητας αξιολογήθηκαν ξεχωριστά για αυτή την πρωτεΐνη. S100A9 έδειξε τόσο χρώση μεταβλητό όγκο κυττάρου (S100A9t) και μεταβλητή χρώση στρωματικών κυττάρων (S100A9s) και αυτά τα δύο κυτταρικά εντοπιότητας της πρωτεΐνης αυτής έχουν αξιολογηθεί ξεχωριστά. Οι πρωτεΐνες που συχνότερα έδειξαν ισχυρή ανοσολογική αντίδραση των κυττάρων του όγκου στην πρωτογενή ορθοκολικό καρκίνο ήταν NPM1 (99,6%), μείζων πρωτεΐνη θόλο (MVP, 81,1%) και prohibitin (ΡΗΒ, 75.6%), ενώ σε μετάσταση λεμφαδένα αυτές τις πρωτεΐνες που έδειξαν την πιο συχνή ισχυρή ανοσοαντιδραστικότητα των καρκινικών κυττάρων ήταν NPM1 (95,8%), MVP (74,5%) και πρωτεΐνη θερμικού σοκ 60 (HSP60, 63,9%) (Σχήμα 4). Σε φυσιολογικό κόλον οι πρωτεΐνες που έδειξαν την υψηλότερη συχνότητα της ισχυρής κυτταρικής ανοσοαντιδραστικότητας επιθηλιακών ήταν NPM1 (99,6%), ισοκιτρική αφυδρογονάση 1 (IDH1, 93%) και γαλακτικής αφυδρογονάσης Β (LDHB, 82,1%) (Σχήμα 4).

μικροφωτογραφίες του ανοσοϊστοχημική εντόπιση των επιμέρους πρωτεϊνών σε φυσιολογικό κόλον, πρωτογενή καρκίνο του παχέος εντέρου και μετάσταση λεμφαδένα.

η

η συχνότητα της έκφρασης όπως αξιολογείται ανοσοϊστοχημικώς των επιμέρους πρωτεϊνών σε Α φυσιολογικό κόλον, Β, πρωτογενή ορθοκολικό καρκίνο και C. μετάσταση λεμφαδένα

η

Οι πρωτεΐνες που έδειξαν το μεγαλύτερο βαθμό υπερέκφρασης στην πρωτογενή ορθοκολικό καρκίνο συγκριτικά με φυσιολογικό βλεννογόνο του κόλου ήταν HSP60 (ρ & lt? 0.001)., S100A9 (ρ & lt? 0.001) και translatinally ελεγχόμενη πρωτεΐνη όγκου (TCTP, ρ & lt? 0.001, Πίνακας 3), ενώ για τους καρκίνους Dukes C Δεν πρωτεΐνες έδειξαν αυξημένη ανοσοαντιδραστικότητα στην μετάσταση λεμφαδένα σε σύγκριση με τις αντίστοιχες πρωτοταγείς παχέος εντέρου και των πρωτεϊνών που έδειξε τη μεγαλύτερη μείωση στην έκφραση σε λεμφαδένα μετάσταση ήταν PHB (p = 0,002), peroxiredoxin (PRDX1, p = 0,003) και HSP60 (p = 0,005, Πίνακας 3). Η σχέση της πρωτεϊνικής έκφρασης με τα επιμέρους στάδια Dukes παρουσιάζεται στον Πίνακα 4 και Σχήμα 5.

Συχνότητα της έκφρασης των μεμονωμένων πρωτεϊνών όπως αξιολογείται ανοσοϊστοχημικώς σε A. DUKES Μια ορθοκολικό καρκίνο, Β Dukes Β καρκίνο του παχέος εντέρου και C. Dukes C καρκίνο του παχέος εντέρου.

η

η

οι συγκρίσεις της έκφρασης των επιμέρους πρωτεϊνών και κλινικο-παθολογικών παραμέτρων που περιγράφονται στον πίνακα 5. Αρκετές από τις πρωτεΐνες έδειξε μια πολύ σημαντική συνεργασία με αστάθεια μικροδορυφόρου καθεστώτος συμπεριλαμβανομένων 14-3-3β (χ

2 = 22.441, p & lt? 0.001), HSP60 (χ

2 = 27.663, p & lt? 0.001) και IDH1 (χ

2 = 47.733, p & lt? 0.001) .

Η

Η ανάλυση επιβίωσης

ανάλυση των επιμέρους δεικτών.

Η σχέση της έκφρασης των επιμέρους πρωτεϊνών και η επιβίωση διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας διαφορετικά σημεία αποκοπής (αρνητικά κατά θετικές, αρνητικές /θετικές αδύναμο ν μέτρια /strong και αρνητικά /αδύναμα /μέτρια ν ισχυρή) και συνοψίζεται στον πίνακα 6 και Σχήμα 6. 14-3-3β αναγνωρίστηκε ως δείχνοντας προγνωστική σημασία (χ

2 = 6.218, p = 0,013, αναλογία κινδύνου (HR) = 0,639, 95% διάστημα εμπιστοσύνης (CI) 0,448 – 0,913), αν οι αρνητικές όγκους σε σύγκριση με τους όγκους που δείχνουν οποιοδήποτε βαθμό 14-3-3β ανοσολογική αντίδραση (Σχήμα 6Α). Οι όγκοι που δείχνει την απουσία 14-3-3β ανοσοδραστικότητας συσχετίστηκε με καλύτερη πρόγνωση. Για τους ασθενείς με 14-3-3β αρνητικούς όγκους (n = 104, αριθμός των θανάτων = 36) η μέση επιβίωση ήταν 129 μήνες (95% CI 113 – 145 μήνες) και για ασθενείς με θετικούς όγκους (n = 398? Αριθμός των θανάτων = 194), η μέση επιβίωση ήταν 107 μήνες (95% CI 98-117 μήνες). Αυτό ήταν προγνωστικά σημαντική (p = 0,03, HR = 0,588, 95% CI 0,361 έως 0,958) σε ένα πολυπαραγοντικό μοντέλο που περιέχει όλες τις μεταβλητές (στάδιο Dukes, EMVI, η περιοχή του όγκου, την ηλικία του ασθενούς, το φύλο του ασθενούς, την έκφραση των επιμέρους πρωτεϊνών). Οι άλλες σημαντικές μεταβλητές ήταν το στάδιο Dukes (p & lt? 0.001, HR = 0,491, 95% CI 0,357 έως 0,714), την ηλικία (p & lt? 0.001, HR = 0,470, 95% CI 0,343 έως 0,645) και εκτός των τειχών της αγγειακής εισβολής (EMVI, σ & lt? 0.001, HR = 0,467, 95% CI 0,338 έως 0,644). Αν και η έκφραση PHB (θετικά κατά αρνητικές ΡΗΒ ανοσολογική) σημειώθηκε επίσης να έχει μια πολύ σημαντική συσχέτιση με την επιβίωση (χ

2 = 7.883, p = 0.005, HR = 3,311, 95% CI 1,359 έως 8,064) μόνο 6 ασθενείς ήταν σε η αρνητική ομάδα ΡΗΒ (Σχήμα 6Β). Άλλη πρωτεΐνη η οποία έδειξε μια σημαντική σχέση με την επιβίωση, χρησιμοποιώντας διαφορετικά σημεία αποκοπής ήταν IDH1, LDHB, ΤΟΤΡ και MVP (Πίνακας 6 και Σχήμα 6C-6G).

Η σχέση των επιμέρους πρωτεϊνών αξιολογείται με ανοσοϊστοχημεία με την επιβίωση με διαφορετικές cut-off σημεία. Α 14-3-3β (θετικά κατά αρνητική ανοσολογική αντίδραση), Β PHB (θετικά κατά αρνητική ανοσολογική αντίδραση), Γ IDH1 (αρνητικό /αδύναμη ανοσολογική αντίδραση κατά μέτρια /strong ανοσολογική αντίδραση), Δ LDHB (αρνητικό /αδύναμη ανοσολογική αντίδραση κατά μέτρια /ισχυρή ανοσολογική αντίδραση), Ε ΤΟΤΡ (αρνητικό /αδύναμη ανοσολογική αντίδραση κατά μέτρια /strong ανοσολογική αντίδραση), ΣΤ IDH1 (αρνητικό /αδύναμα /μέτρια ανοσολογική αντίδραση ν ισχυρή ανοσολογική αντίδραση), Γ MVP (αρνητικό /αδύναμα /μέτρια ανοσολογική αντίδραση ν ισχυρή ανοσολογική αντίδραση), Η . επιβίωσης σε κάθε μία από 10 ομάδες, που αναγνωρίζονται από την ιεραρχική ανάλυση συστάδων (κάθε συστάδα είναι αριθμητικά εντοπίζονται και αντιστοιχεί στις συστάδες που εντοπίζονται στον πίνακα ανάλυσης διασποράς του σχήματος 7), Ι επιβίωση σε 2 clusters- cluster 1 και συστάδες 2-10 σε συνδυασμό και J. δύο πρωτεϊνών υπογραφή 14-3-3β και ΑΙ_ϋΗ1 δείχνει ότι η διπλή αρνητική όγκοι έχουν ένα σημαντικά καλύτερο αποτέλεσμα.

η

Ιεραρχική ανάλυση συστάδων και την αναγνώριση των προγνωστικών πρωτεΐνης υπογραφής.

Ιεραρχική ανάλυση διασποράς χρησιμοποιήθηκε επίσης ως μια διερευνητική στατιστικό εργαλείο για να εξετάσει τη συνολική σχέση της έκφρασης δείκτη με αποτέλεσμα και με βάση αυτό το εντοπίσει μια πρωτεΐνη υπογραφή που σχετίζεται με την πρόγνωση. Μια σειρά από λύσεις συμπλέγματος (αριθμός των clusters) διερευνήθηκε για να προσδιοριστεί ο βέλτιστος αριθμός των συστάδων που παράγονται ομάδες με διαφορετικά αποτελέσματα. Ομαδοποίηση των δεδομένων σε δέκα συμπλέγματα ταυτοποιήθηκε ως ο βέλτιστος αριθμός των clusters για ανάλυση σε σχέση με τις πιο προγνωστικά σημαντικές ομάδες (υποστηρίζοντας πληροφορίες Πίνακας S4, Σχήμα 6Η και Σχήμα 7). Αυτές οι 10 συστάδες στη συνέχεια συνδυάστηκαν σε δύο ομάδες προγνωστική? μια καλή ομάδα πρόγνωση (cluster 1) και μια φτωχή ομάδα πρόγνωση (ομάδες σύμπλεγμα 2-10) (Σχήμα 6Η). Η καλή ομάδα πρόγνωση (μέση επιβίωση = 157 μήνες 95% CI 135-177 μήνες, n = 39, ο αριθμός των θανάτων = 8) είχαν σημαντικά καλύτερη επιβίωση (χ

2 = 8,144, p = 0,004, HR = 0,373, 95% CI 0,179 έως 0,757) από την κακή ομάδα πρόγνωση (μέση επιβίωση = 106 μήνες, 95% CI 1-2-119 μήνες, n = 392, αριθμός των θανάτων = 183).

γραφική αναπαράσταση του δεδομένα δείκτη ανοσοϊστοχημείας παρουσιάζεται στο μεσαίο πλαίσιο. Ο δεξιός πίνακας δείχνει τα αποτελέσματα της ανάλυσης ιεραρχικής σύμπλεγμα παρουσιάζονται ως ένα δενδρόγραμμα με 10 μεμονωμένες συστάδες προσδιορίζονται. Το αριστερό πλαίσιο δείχνει μια διευρυμένη τμήμα της γραφικής αναπαράστασης.