Αφηρημένο

Ιστορικό

Ακτινοθεραπεία είναι μία από τις σημαντικότερες θεραπευτικές στρατηγικές στη θεραπεία του καρκίνου. Η τελομερών πρωτεΐνη δεσμεύσεως TPP1 είναι ένα σημαντικό συστατικό του συμπλόκου shelterin σε τελομερή θηλαστικών. προηγούμενες εκθέσεις μας έδειξαν ότι η έκφραση TPP1 ανυψώθηκε σε ακτινοανθεκτικά κύτταρα, αλλά οι ακριβείς επιπτώσεις και τους μηχανισμούς της TPP1 για ακτινοευαισθησία είναι ασαφής.

Κύρια Ευρήματα

Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι η αυξημένη έκφραση TPP1 συσχετίστηκε σημαντικά με ραδιοαντοχή και μεγαλύτερο μήκος των τελομερών σε ανθρώπινο ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές. Επιπλέον, TPP1 υπερέκφραση έδειξε επιμηκυνθεί το μήκος των τελομερών και σημαντική μείωση των ακτινοευαισθησία με ακτίνες Χ. TPP1 μεσολάβηση ραδιοαντοχή συσχετίστηκε με μειωμένο ρυθμό απόπτωσης μετά από έκθεση IR. Επιπλέον, TPP1 υπερέκφραση έδειξαν παρατεταμένη G2 /M σύλληψης διαμεσολαβείται από σηματοδοτικό μονοπάτι ATM /ATR-Chk1 μετά από έκθεση IR. Επιπλέον, TPP1 υπερέκφραση επιτάχυνε την κινητική αποκατάσταση του συνόλου των βλαβών στο DNA και δυσλειτουργία των τελομερών που προκαλείται από ιονίζουσα ακτινοβολία.

Συμπεράσματα

Έχουμε αποδείξει ότι αυξημένη έκφραση των TPP1 σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα θα μπορούσε να προστατεύσει τελομερών από το DNA βλάψει, και να αναθέσει ραδιοαντοχή. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι TPP1 μπορεί να είναι ένας πιθανός στόχος στην ακτινοθεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Yang L, Wang W, Hu L, Yang X, Zhong J, Li Ζ, et al. (2013) τελομερή Binding Protein TPP1 διαμορφώνει τελομερούς Ομοιόσταση και αναθέτει ραδιοαντοχή σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 8 (11): e81034. doi: 10.1371 /journal.pone.0081034

Συντάκτης: Stephanie Filleur, Texas Tech University Κέντρο Επιστημών Υγείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2 Ιούλ 2013? Αποδεκτές: 8 Οκτώβρη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 19, Νοεμβρίου, 2013

Copyright: © 2013 Yang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (No.81071825), το Ταμείο Διδακτορική του Υπουργείου Παιδείας της Κίνας (No.20120141130010) και των Θεμελιωδών Κονδυλίων Έρευνας για τις Κεντρικές πανεπιστήμια. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC), με πάνω από 1,2 εκατομμύρια νέα κρούσματα και 608.700 θανάτους το 2008, είναι μια σημαντική αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται σε πολλές χώρες [1]. Ακτινοθεραπεία είναι μία από τις σημαντικότερες θεραπευτικές στρατηγικές σε ορθοκολικό θεραπεία του καρκίνου με αποτελεσματικό τοπικό έλεγχο, την προστασία των φυσιολογικών ιστών και λιγότερο συστημικές επιδράσεις [2,3]. Ωστόσο, πολλοί ασθενείς εξακολουθούν να αντιμετωπίζουν υποτροπή ή μετάσταση μετά την αγωγή ακτινοβολίας. Η κύρια αιτία της ακτινοθεραπείας αποτυχίας είναι η κυτταρική ραδιοαντοχή. Έτσι αναγνώριση νέων παραγόντων που προβλέπουν ραδιοαντοχή είναι μια περιοχή έντονης έρευνας και θα μπορούσε να έχει μεγάλη αξία στη θεραπεία των καρκίνων.

Τα τελομερή είναι εξειδικευμένες σύμπλοκα DNA-πρωτεϊνης στα άκρα των ευκαρυωτικών χρωμοσωμάτων που αποτελείται από ένα μεταβλητό αριθμό εν σειρά επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες TTAGGG και σχετιζόμενες πρωτεΐνες [4]. Τα τελομερή παίζουν σημαντικό ρόλο στη διασφάλιση της γονιδιωματικής σταθερότητας και ακεραιότητας [5-8]. Επιπλέον, μελέτες έχουν αποσαφηνίσει ότι ομοιόσταση των τελομερών χρησιμεύει ως πιθανός στόχος στη θεραπεία του καρκίνου, ειδικά σε ακτινοθεραπεία [9-12]. Προηγούμενη έρευνα μας έδειξε επίσης ότι υπήρχε μια σημαντική αρνητική συσχέτιση του μήκους του τελομερούς και ραδιοευαισθησία και το μήκος των τελομερών μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως μια πολλά υποσχόμενη εργαλείο για την πρόβλεψη της ραδιοευαισθησία των ανθρώπινων καρκινωμάτων [13].

ομοιόσταση τελομερούς επηρεάζεται από πολλαπλά στοιχεία, και ένας από τους σημαντικότερους ρυθμιστές είναι shelterin. Το συγκρότημα shelterin αποτελείται από έξι τελομερών που σχετίζονται πρωτεΐνες: TRF1, trf2, RAP1, TIN2, TPP1 και ΡΟΤ1 [8]. Διαταραχή στην shelterin θα οδηγήσει σε δυσλειτουργία των τελομερών και, ενδεχομένως, χρωμοσωμική αστάθεια [14]. TPP1 (επίσης γνωστή ως TINT1 /PTOP /PIP1) είναι ένα κρίσιμο μέλος shelterin και συγγενείς με άλλες πρωτεΐνες των τελομερών δέσμευσης για το σχηματισμό του πυρήνα shelterin [8]. TPP1 ετεροδιμερίζεται με POT1 και αυξάνει τη συγγένεια του με τελομερών ssDNA [15,16]. Το συγκρότημα POT1-TPP1 είναι ικανή για την πρόσληψη και την τόνωση της δραστηριότητας της τελομεράσης, ρυθμίζοντας έτσι το μήκος των τελομερών μέσω TPP1-τελομεράση αλληλεπίδραση [17-19]. Προηγούμενες έρευνες έδειξαν ότι TPP1 νοκ ντάουν ενεργοποιεί ένα ΑΤΜ-εξαρτώμενη απόκριση βλάβης του DNA που χαρακτηρίζεται από το σχηματισμό των τελομερών δυσλειτουργίας που προκαλείται από εστίες (TIFs) στα τελομερή [20]. Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι η έκφραση TPP1 ανυψώθηκε σε ραδιοανθεκτικά κύτταρα και μπορεί να περιλαμβάνει TPP1 σε ραδιοαντοχή καρκίνο [21]. Ωστόσο, οι ακριβείς επιπτώσεις και το μηχανισμό της TPP1 για ακτινοευαισθησία είναι ασαφής.

Για να διευκρινίσει περαιτέρω τις λειτουργίες του TPP1, μελετήσαμε το ρόλο της TPP1 υπερέκφραση σε ραδιοευαισθησία και ομοιόσταση των τελομερών σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα σε αυτή τη μελέτη.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture και θεραπεία

Ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές (HCT116, SW480, LoVo, ΗΤ29 και DLD-1) αγοράστηκαν από την Τράπεζα Κυττάρων του η κινεζική Ακαδημία Επιστημών, Σαγκάη της Κίνας. Όλα τα κύτταρα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη καλλιεργήθηκαν το 1640 μέσο συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου. κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν με pcDNA6-flag-hTPP1 (ένα είδος δώρο από τον Dr Joachim Lingner) [19] ή pcDNA6 κενό φορέα (Invitrogen) χρησιμοποιώντας λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen). TPP1 κύτταρα που υπερεκφράζουν επιλέχθηκαν με 5 μg /ml βλαστισιδίνη (Sigma) για 4 εβδομάδες. Οι σταθερές κυτταρικές σειρές επιμόλυνση ονομάστηκαν ως HCT116-TPP1 και HCT116-Mock, αντίστοιχα.

ακτίνες Χ ακτινοβολία διεξήχθη με μια γεννήτρια ακτίνων Χ (Primus Υψηλής Ενέργειας Siemens), εκπέμπει σε ένα σταθερό ρυθμό δόσης 2 Gy /min, η ενέργεια των ακτίνων Χ που χρησιμοποιείται για την ακτινοβόληση των κυττάρων είναι 0 -10 Gy.

κλωνογονική δοκιμασία

Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε φιάλες καλλιέργειας 6 φρεατίων. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα ακτινοβολήθηκαν με κλιμακούμενες δόσεις (0, 2, 4, 6, 8, 10 Gy) χρησιμοποιώντας γεννήτρια ακτίνων-Χ (Primus Υψηλής Ενέργειας Siemens) με ρυθμό δόσης 2 Gy /min. Τα κύτταρα στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν σε επωαστή που περιέχει 5% CO2 στους 37 ° C για 14 ημέρες. Τα επόμενα βήματα και υπολογισμός του κλάσματος επιβίωσης διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13] .All πειράματα έγιναν τουλάχιστον τρεις φορές.

Ανάλυση Κυτταρομετρίας Ροής του κυτταρικού κύκλου

Εν συντομία, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 6 Gy IR και στη συνέχεια επωάζονται για τους υποδεικνυόμενους χρόνους (0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, και 42 ώρες), τότε κυτταρικού κύκλου αναλύσεις διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]. ιστογράμματα DNA αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Modifit. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της Απόπτωσης

δοκιμασίας

Η απόπτωση εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ ανίχνευσης απόπτωσης AnnexinV-FITC (Beyotime, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ο φθορισμός μετρήθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρόμετρο ροής (Beckman Coulter, Brea, CA) και τα δεδομένα αναλύθηκαν με λογισμικό ΟβΙΙ Quest. Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν εις τριπλούν.

Αντισώματα και ανάλυση Western Blot

κηλίδος Western έγινε όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [21]. Τα ακόλουθα αντισώματα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη: TPP1 (Abcam), ATR, φωσφο-Ser345-Chk1 /Chk1 και ΑΤΜ (Cell Signaling Technology). Ένα β-ακτίνης αντίσωμα (Santa Cruz) χρησιμοποιήθηκε για να ομαλοποιήσει τις διαφορές φόρτωσης μεταξύ των δειγμάτων.

Η τελομεράση Δραστηριότητα Δοκιμασία

Η μέτρηση της δράσης της τελομεράσης εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ PCR TRAP ELISA (Roche) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η λεπτομερής μέθοδος διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22] .Sample απορρόφηση μετρήθηκε με μια συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας (Bio-Rad) στο μήκος κύματος των 450/690 nm.

Μέτρηση της τελομερούς Μήκος με κηλίδωση Southern

προσδιορισμός κομμάτι περιορισμού Terminal εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας Μήκος TeloTAGGG τελομερούς (Roche) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μέσο μήκος των τελομερών (μέση περιορισμός τερματικών θραυσμάτων μήκους, TRF) προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό ανάλυσης εικόνας (Bio-Rad).

ανοσοφθορισμού

Μετά την ενδεικνυόμενη θεραπεία, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% φορμαλδεΰδη για 15 λεπτά και κατέστησαν διαπερατά με 0,2% Triton Χ-100 σε PBS για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά δεσμεύτηκαν με διάλυμα αποκλεισμού, τα κύτταρα επωάστηκαν με το πρωτογενές αντίσωμα όλη τη νύκτα στους 4 ° C, στη συνέχεια πλένονται και επωάζονται με το δευτερεύον αντίσωμα. Οι πυρήνες βάφτηκαν με ϋΑΡΙ (Sigma) για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. σήματα φθορισμού λήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο (Carl Zeiss LSM710).

τελομερούς Δοκιμασία chip και Dot Blot ανάλυση

τελομερούς Δοκιμασία chip και Dot Blot ανάλυση πραγματοποιήθηκαν όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [19]. Μετά την καταβύθιση με το αντίσωμα trf2, DNA καθαρίστηκε από ανοσοκαταβυθίστηκε χρωματίνη και στυπώθηκαν σε μεμβράνη Hybond-N (Amersham), και οι αλληλουχίες τελομερούς επανάληψης ανιχνεύθηκαν με ένα κιτ δοκιμασίας μήκος των τελομερών TeloTAGGG (Roche Diagnostics). Ένα μη ειδικό καθετήρα (Alu) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Τα σήματα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ανάλυσης εικόνας (Bio-Rad).

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM. t-test του Student χρησιμοποιήθηκε για να ελεγχθεί η στατιστική σημαντικότητα. P & lt? 0.05 θεωρήθηκε ως σημαντική. GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Καλιφόρνια), το λογισμικό χρησιμοποιήθηκε ως εργαλείο στατιστικής ανάλυσης.

Αποτελέσματα

Συσχετισμός Μεταξύ TPP1 Protein Expression, το μήκος των τελομερών και ενδογενής ακτινοευαισθησία

Αρχικά εξετάστηκε η έκφραση της πρωτεΐνης και των τελομερών μήκη TPP1 σε πέντε ορθοκολικό καρκίνο κύτταρα (Σχήμα 1Α και Β). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1ϋ, η έκφραση της πρωτεΐνης TPP1 συσχετίστηκε σημαντικά με το μήκος των τελομερών (R = 0,9783, Ρ & lt? 0,05). Στη συνέχεια, η επιβίωση των κυττάρων μετρήθηκε με μία κλωνογονική δοκιμασία και SF2 χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης της εγγενούς ραδιοευαισθησία (Σχήμα 1 C). έκφραση TPP1 σχετίστηκε αρνητικά με εγγενή ακτινοευαισθησία (R = 0.9792, Ρ & lt? 0.05, Σχήμα 1Ε). Εν περιλήψει, ραδιοανθεκτικά κύτταρα έχουν πλέον τελομερή και υψηλότερη παραγωγή του TPP1 από εκείνο στο ακτινοευαίσθητα κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι υπήρχε σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης TPP1, το μήκος των τελομερών και κυττάρων εγγενή ακτινοευαισθησία.

(Α) η παραγωγή TPP1 ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western ..

Μήκος (Β) τελομερούς εξετάστηκε με ανάλυση κηλίδος Southern.

(C) η παραγωγή Σχετική TPP1, ακτινοευαισθησία (SF2) και το μήκος των τελομερών (TRF) σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές.

(D) Συσχέτιση μεταξύ της παραγωγής TPP1 και ακτινοευαισθησία (SF2) σε ορθοκολικό καρκινικά κύτταρα εξετάστηκε.

(Ε) Συσχέτιση μεταξύ της παραγωγής TPP1 και το μήκος TRF σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα εξετάστηκε.

η

TPP1 υπερέκφραση Μειώσεις Ευαισθησία των HCT116 κυττάρων στην ακτινοβολία

για να εξεταστεί η επίδραση της υπερέκφρασης TPP1 στην κυτταρική ραδιοευαισθησία, HCT116-TPP1 και HCT116-Mock κύτταρα καθοριστεί (Σχήμα 2Α) και η επιβίωση των κυττάρων μετρήθηκε με κλωνογόνο προσδιορισμό. κύτταρα HCT116-TPP1 έδειξαν σημαντικά ραδιοαντοχή σύγκριση με HCT116-Mock κύτταρα μετά από έκθεση IR (Σχήμα 2Β).

(Α) Έλεγχος της TPP1 υπερέκφραση από κηλίδωση western.

(Β) HCT116-Mock και-TPP1 κύτταρα ακτινοβολούνται με ακτίνες Χ και στη συνέχεια κυτταρική επιβίωση προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας κλωνογονική δοκιμασία.

(C) HCT116-Mock και-TPP1 κύτταρα ακτινοβολούνται με 6 Gy Χ-ray και ανακτώνται για υποδεικνύεται φορές. του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με FACS.

(Δ) Ο πληθυσμός των κυττάρων σε G2 /M φάσεις πάροδο του χρόνου σε HCT116- Mock και -TPP1 κύτταρα.

Η

TPP1 υπερέκφραση στον Καρκίνο HCT116 κύτταρα Προκαλεί παρατεταμένη G2 /M σύλληψης μετά από έκθεση IR

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2C, TPP1 υπερέκφραση δεν είχε σημαντική επίδραση στις κατανομές κυτταρικού κύκλου με την απουσία της βλάβης του DNA. Μετά την έκθεση σε ακτινοβολία, παρατηρήσαμε ότι η G2 /M σύλληψη έφθασε σε μια αιχμή σε 18 ώρες μετά την έκθεση IR τόσο HCT116-Mock και -TPP1 κύτταρα. Το πιο σημαντικό, η κινητική της απόκρισης των κυτταρικών γραμμών ήταν διαφορετική. Σε HCT116-Mock κύτταρα, η G2 /M κορυφή μειώθηκε σταδιακά από 18 ώρες μετά την ιονίζουσα ακτινοβολία και επέστρεψαν στα φυσιολογικά επίπεδα σε περίπου 42 ώρες. Ωστόσο, η G2 /M κορυφή στα κύτταρα HCT116-TPP1 δεν μειώθηκε, αλλά εξακολουθεί να διατηρείται σε υψηλό επίπεδο μέχρι 30-36 ώρες μετά IR. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι TPP1 υπερέκφραση σε κύτταρα HCT116 παρατεταμένη G2 /M σύλληψη μετά από έκθεση IR.

TPP1 που προκαλείται G2 /M σύλληψης Παράταση αυτή διαμεσολαβείται από ATM /ATR-Chk1 Διαδρομή

Για να προσδιορίσει το μοριακών μηχανισμών της παρατεταμένης G2 /M σύλληψη μετά από έκθεση IR σε TPP1-κύτταρα που υπερεκφράζουν, μετρήθηκε η παραγωγή των ΑΤΜ, ATR και Chk1. Βρήκαμε ότι οι εκφράσεις του ΑΤΜ και ATR και οι δύο αυξημένα σε κύτταρα HCT116-TPP1 (Σχήμα 3Α). Στη συνέχεια, μελετήσαμε τις ενεργοποιήσεις των Chk1, ένα σημαντικό υπόστρωμα της ATR και ΑΤΜ. Βρήκαμε ότι τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της Chk1 στο Ser345 ήταν υψηλότερες μέχρι 36 ώρες μετά την έκθεση IR σε κύτταρα HCT116-TPP1. Σε αντίθεση, τα επίπεδα σε HCT116-Mock κύτταρα επανήλθαν στα κανονικά επίπεδα σε περίπου 30h μετά την έκθεση IR (Σχήμα 3Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η παρατεταμένη G2 /M σύλληψης από TPP1 υπερέκφραση είναι πιθανό να οφείλεται σε ATM /ATR-Chk1 μονοπατιού σηματοδότησης.

(Α) ανάλυση Western blot αποκάλυψε ότι TPP1 υπερέκφραση αύξησε την έκφραση των ΑΤΜ και ATR.

(Β) HCT116-Mock και-TPP1 κύτταρα ακτινοβολούνται με 6 Gy Χ-ray και επωάζονται για ενδεδειγμένους χρόνους. Western κηλίδες πραγματοποιείται για να ανιχνεύσει την έκφραση του Chk1 και π-Ser

345-Chk1.

Η

TPP1 υπερέκφραση Αναστέλλει απόπτωση που προκαλείται από Ιονίζουσες Ακτινοβολίες

Αξιολογήσαμε τα αποτελέσματα της TPP1 για προκαλούμενη από ακτινοβολία απόπτωση χρησιμοποιώντας ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, διαπιστώσαμε ότι δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ HCT116-Mock και τα κύτταρα HCT116-TPP1 (5,72 ± 0,15% έως 5,55 ± 0,12%, ρ & gt? 0,05), αλλά TPP1 υπερέκφραση θα μπορούσε να εξασθενήσει την ακτινοβολία (5Gy) που προκαλείται επίπεδα απόπτωσης, από 26,89% ± 0,75 στα κύτταρα ελέγχου να 17,47 ± 0,45% στα κύτταρα HCT116-TPP1 (ρ & lt? 0,05). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι η αυξημένη ραδιοαντοχή από TPP1 υπερέκφραση μπορεί να οφείλεται σε μία μείωση της επαγόμενης από ακτινοβολία απόπτωση.

κύτταρα HCT116-Mock και-TPP1 ακτινοβολήθηκαν με 5 Gy ακτινών Χ και επωάστηκαν για 24 ώρες. Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής.

(Α) Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα diffrerent ομάδων δείχνεται.

(Β) Τα δεδομένα που παρατίθενται είναι μέσες ± SEM από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

*, P & lt? 0.05.

Η

TPP1 υπερέκφραση Αυξάνει τελομερούς Μήκος σε HCT116 κύτταρα

Για να διερευνήσουν περαιτέρω το ρόλο της TPP1 στον έλεγχο του μήκους των τελομερών, HCT116-TPP1 και -Mock κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 20 PD και το μήκος των τελομερών μετρήθηκε με κηλίδωση Southern. Εμείς εμφανίζεται ότι το μέσο μήκος των τελομερών των κυττάρων HCT116-TPP1 σταδιακά επιμηκύνθηκε από ότι στα κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 5Α). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι TPP1 υπερέκφραση θα μπορούσε να αυξήσει το μήκος των τελομερών στα κύτταρα HCT116.

(A) Μέση TRF μήκη σε διαφορετικές πιθανότητες αθέτησης ανιχνεύθηκαν από τη νότια κηλίδα. PD, ο πληθυσμός διπλασιασμό. Η θέση του MWs (kb) υποδεικνύεται στα αριστερά.

(Β) TRAP ποσοτικού προσδιορισμού PCR ELISA χρησιμοποιήθηκε στην ανάλυση της δράσης της τελομεράσης σε διαφορετικές PD.

ανάλυση (C) κηλίδα Western αποκάλυψε ότι η υπερέκφραση TPP1 δεν είχε σημαντική επίδραση στην έκφραση των hTERT.

(D) δοκιμασίες τελομερούς-chip πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα trf2 να εξετάσει το DNA τελομερούς συνδεδεμένο με από trf2. Εισόδου, υπερκείμενο πριν από ανοσοκατακρήμνιση? ppt, σύμπλεγμα ανοσοΐζημα πρωτεΐνη-DNA. Ειδικά (τελομερές) και μη ειδικά (Alu) ανιχνευτές χρησιμοποιήθηκαν.

τελομερικού DNA τσιπ (%) = τελομερικού DNA σήματα των σημάτων ppt /τελομερικού DNA της εισόδου * 100%.

Η

TPP1 υπερέκφραση δεν επιπτώσεων τελομεράση δραστηριότητα

Για να διερευνηθεί κατά πόσο οι επιμήκεις τελομερή στα κύτταρα HCT116-TPP1 ήταν αποτέλεσμα της αυξημένης δραστηριότητας της τελομεράσης, τα επίπεδα δραστηριότητας της τελομεράσης και της πρωτεΐνης hTERT στα κύτταρα HCT116-TPP1 συγκρίθηκαν με HCT116-Mock κύτταρα. Δεν υπήρξε καμία ανιχνεύσιμη αύξηση στα επίπεδα της πρωτεΐνης hTERT ή στη δράση της τελομεράσης στα κύτταρα HCT116-TPP1 σύγκριση με mock κύτταρα ή γονικών κυττάρων (Σχήμα 5Β και C). Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι η επιμήκυνση των τελομερών από TPP1 δεν οφείλεται σε μια γενική αύξηση στη δράση της τελομεράσης.

TPP1 υπερέκφραση επιτάχυνε την Κινητική επισκευής του DNA βλάβη που προκαλείται από IR

Εμείς που χρησιμοποιούνται δοκιμασία ΔΕΘ για να διαπιστωθεί κατά πόσον η κινητική TPP1 υπερέκφραση επισκευή των επιπτώσεων της βλάβης του DNA σε τελομερή. προσδιορισμός των τελομερών-chip αποκάλυψε ότι TPP1 υπερέκφραση δεν είχε καμία επίπτωση, για τη σύνδεση μεταξύ trf2 και τελομερή (Σχήμα 5D), έτσι TIFs παρακολουθούνταν από την συν-εντοπισμό των trf2 και γ-H2AX σε αυτή τη μελέτη (Σχήμα 6Α). Παρατηρήσαμε σημαντικά χαμηλότερες συχνότητες της αυθόρμητης TIFs στα κύτταρα HCT116-TPP1 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (ρ & lt? 0,05) (Σχήμα 6Β) .Στη συνέχεια HCT116-TPP1 και -Mock κύτταρα εκτέθηκαν σε 1 Gy IR και χρωματίστηκαν για την αναγνώριση του TIF εστίες σε 0.5, 6 και 12 ώρες μετά την έκθεση IR. Η έρευνά μας άφησε να εννοηθεί ότι τα κύτταρα υπερέκφραση TPP1 ήταν σε θέση να επισκευάσει TIFs πιο αποτελεσματικά από τα κύτταρα ελέγχου. Για παράδειγμα, οι συχνότητες του IR επάγεται TIFs ήταν παρόμοιες σε HCT116-TPP1 και HCT116-Mock κύτταρα 0.5 ώρες μετά IR, υποδεικνύοντας ότι TPP1 δεν μείωσε τον αριθμό των TIFs που προκαλείται από IR. Στη συνέχεια τα κύτταρα TPP1 υπερέκφραση είχε περίπου 0,53 TIFs /κύτταρο 12 ώρες μετά την IR, ενώ τα mock κύτταρα είχαν 1,04 TIFs /κύτταρο 12 ώρες μετά IR (Σχήμα 6C). Έτσι, τα κύτταρα HCT116-TPP1 έδειξε αυξημένη ικανότητα για την αποκατάσταση ζημιών σε τελομερή. Η δοκιμασία TIF προσδιορίζονται γ-H2AX εστίες σε τελομερή, καθώς και της συνολικής εστίες γ-Η2ΑΧ στον πυρήνα. Τότε θα ποσοτικοποιηθεί ο σχηματισμός του συνόλου των εστιών γ-H2AX, ένα δείκτη για ϋδΒδ, να διερευνήσει περαιτέρω το υποκείμενο μηχανισμό για ραδιοαντοχή. Παρόμοια με τα αποτελέσματα της ανάλυσης TIFs, το ποσοστό των συνολικών επιδιόρθωσης του DNA διπλό σκέλος διάλειμμα επιταχύνθηκε από TPP1 υπερέκφραση. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η υπερέκφραση TPP1 θα μπορούσε να επιταχύνει το ρυθμό της επιδιόρθωσης του DNA μετά από έκθεση σε ακτινοβολία.

HCT116-Mock και -TPP1 εκτέθηκαν σε 1 Gy IR και επωάστηκαν σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία .. Τα αποτελέσματα βασίζονται σε τρία ανεξάρτητα πειράματα με κατά μέσο όρο 100 πυρήνες των κυττάρων που αναλύθηκαν ανά πείραμα ανά σημείο. Ράβδοι αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM από 3 ανεξάρτητα πειράματα.

(Α) Αντιπροσωπευτικές εικόνες για TIFs δείξει.

(Β) Συχνότητες αυθόρμητης γ-H2AX θετικές εστίες και TIFs σε HCT116-Mock και -TPP1 κύτταρα.

(C) κινητική Επισκευή IR που προκαλείται ΔΕΘ σε HCT116-Mock και -TPP1 παχέος κύτταρα. Μέσος όρος TIFs ανά κύτταρο σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά την έκθεση IR προσδιορίστηκαν ποσοτικά.

(D) κινητική Επισκευή IR που προκαλείται από βλάβη στο DNA HCT116-Mock και -TPP1 παχέος κύτταρα. Averageγ-H2AX θετικές εστίες ανά κύτταρο σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά την έκθεση IR προσδιορίστηκαν ποσοτικά.

Η

Συζήτηση

Έχουμε αποδείξει για πρώτη φορά, εξ όσων γνωρίζουμε, ότι TPP1 υπερέκφραση συνδέεται με ραδιοαντοχή σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα σε αυτό το έργο.

TPP1 διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση του μήκους των τελομερών και την αντιμετώπιση βλαβών του DNA. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι η έκφραση TPP1 ήταν συσχετίζεται στενά με το μήκος των τελομερών και ραδιοευαισθησία σε ορθοκολικό καρκίνο κύτταρα. Επιπλέον, βρήκαμε ότι η έκτοπη υπερέκφραση της TPP1 οδήγησε σε ραδιοαντοχή και τελομερών επιμήκυνση σε κύτταρα HCT116. Προηγούμενες έρευνες επαλήθευσε ότι υπήρχε σημαντική αρνητική συσχέτιση μεταξύ του μήκους των τελομερών και ακτινοευαισθησία [10,11,13]. Η μελέτη μας έδειξε ότι TPP1 εμπλέκονται στην ραδιοαντοχή μέσω της ρύθμισης του μήκους των τελομερών. Τα τελομερή διαδραματίζουν βασικό ρόλο στη διατήρηση της ακεραιότητας των χρωμοσωμάτων και σταθερότητα, και συντομεύεται το μήκος των τελομερών σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο καρκίνου [23]. Τα επίπεδα της πρωτεΐνης POT1 που σχετίζονται με το μήκος των τελομερών σε καρκίνο του στομάχου [24,25]. TPP1 ετεροδιμερίζεται με POT1 αλλά δεν υπάρχουν αποτελέσματα για την συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων TPP1 και το μήκος των τελομερών σε δείγματα καρκίνου. Πιστεύουμε ότι η συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων TPP1 και το μήκος των τελομερών σε παχέος δείγματα καρκίνου έχει μεγάλη σημασία. Στην πραγματικότητα, στη μελέτη μας, προσπαθήσαμε να κάνουμε αυτό το έργο χρησιμοποιώντας δείγματα παραφίνης αλλά διαπίστωσε ότι τα φρέσκα καρκινικούς ιστούς είναι πιο κατάλληλο για την κηλίδωση Southern πείραμα. Στην παρακάτω μελέτη μας, θα συλλέξουμε περισσότερα δείγματα φρέσκου καρκίνο του ιστού και την επαλήθευση της σχέσης μεταξύ TPP1 και το μήκος των τελομερών σε καρκίνο του παχέος εντέρου με φρέσκα καρκινικούς ιστούς.

Βρήκαμε ότι TPP1 υπερέκφραση παρατεταμένη ακτινοβολία που προκαλείται από G2 /M σύλληψη μετά IR έκθεσης. Κύτταρα συνελήφθη στη φάση G2 /M δοθεί περισσότερος χρόνος για την αποκατάσταση των ζημιών, επομένως προσδίδουν ραδιοαντοχή. Η ενεργοποίηση των σημείων ελέγχου ρυθμίζει τη σύλληψη του κυτταρικού κύκλου σε απόκριση σε βλάβη του DNA. Αταξία τηλαγγειεκτασία (AT) μεταλλαγμένα (ATM) και ΑΤΜ και rad3 που σχετίζονται με (ATR) πρωτεϊνικών κινασών είναι σημαντικές ανάντη σημείο ελέγχου κινασών για την αντιμετώπιση βλάβης του DNA [26]. Εμείς αποκάλυψε ότι TPP1 υπερέκφραση αυξημένα τις εκφράσεις των δύο ΑΤΜ και πρωτεΐνη ATR. Προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι τα αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης ΑΤΜ συσχετίζεται με εγγενή ραδιοαντοχή σε όγκους GBM [27]. Kim και οι συνεργάτες του διαπίστωσαν ότι ATR υπερέκφραση οδήγησε σε παρατεταμένη G2 /M σύλληψη και ραδιοαντοχή στα κύτταρα HCT116 [28]. Πολλές μελέτες έδειξαν επίσης ότι η αναστολή της δραστηριότητας των ΑΤΜ ή ATR θα μπορούσε να οδηγήσει σε αύξηση ακτινοευαισθησία [29,30]. Chk1 είναι ένα σημαντικό υπόστρωμα της ΑΤΜ και ATR. Επιπλέον, Chk1 είναι ένας αποτελεσματικός στόχος για ραδιοευαισθητοποίηση σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα [31,32]. Η φωσφορυλίωση των Chk1 επί S345 θεωρείται ως ένας δείκτης της ενεργοποίησης Chk1. Στο έγγραφο αυτό, βρήκαμε ότι η φωσφορυλίωση Chk1 ανυψώθηκε και υπέστη αργότερα χρονικά σημεία μετά από έκθεση IR σε TPP1-κύτταρα που υπερεκφράζουν σε σύγκριση με τα mock κύτταρα. Η μελέτη μας μπορεί να υποδεικνύουν ότι η παρατεταμένη G2 σύλληψης από TPP1 είναι πιθανόν να οφείλεται σε υψηλότερα επίπεδα ATM /ATR-Chk1 οδό σήματος.

Πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι η ομοιόσταση των τελομερών χρησιμεύει ως πιθανός στόχος στη θεραπεία του καρκίνου, ειδικά στην ακτινοθεραπεία . ομοιόσταση των τελομερών μπορεί να διατηρηθεί με την τελομεράση, καθώς και των συναφών πρωτεϊνών τους (όπως ονομάζεται shelterin). το μήκος των τελομερών, η δραστηριότητα της τελομεράσης και η δυσλειτουργία των τελομερών είναι οι κύριοι δείκτες της ομοιόστασης των τελομερών. Πρώτον, η ανάλυση μήκος των τελομερών έδειξαν σημαντική επιμήκυνση των τελομερών σε κύτταρα HCT116-TPP1 σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου, υποδεικνύοντας ότι TPP1 μπορεί να δράσει ως θετικός ρυθμιστής του μήκους των τελομερών. Ωστόσο, παρατηρήθηκε ότι η έκφραση της TPP1 δεν είχε επίδραση επί το μήκος των τελομερών σε ανθρώπινα κύτταρα ινοσαρκώματος HTC75 [16]. Η διαφορά μεταξύ αυτών των αποτελεσμάτων μπορεί να οφείλεται στην ξεχωριστή επιλέγεται σε κυτταρικές σειρές. Είναι ενδιαφέρον, δεν υπήρχε ανιχνεύσιμη αύξηση στη δράση της τελομεράσης ή επίπεδα πρωτεΐνης hTERT σε κύτταρα HCT116-TPP1 σύγκριση με κύτταρα ελέγχου. Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι η επιμήκυνση των τελομερών από TPP1 δεν οφείλεται σε μια γενική αλλαγή στη δράση της τελομεράσης, αλλά μπορεί να οφείλεται στην πυρηνική μετατόπιση hTERT ή εντοπισμένη ενεργοποίηση της τελομεράσης στο τελομερών.

συν-εντοπισμό των τελομερών και ενεργοποιημένου σημειωτές DDR (όπως 53BP1 andγ-Η2ΑΧ), που ονομάζεται έτσι τελομερούς δυσλειτουργία που προκαλείται από εστίες (TIF), είναι ένα τυπικό σημάδι δυσλειτουργίας των τελομερών. TIFs συνεπάγεται DDR των μη προσαρμοσμένων τελομερών [33] .Recent μελέτες έδειξαν ότι TPP1 εμπλέκει σε απάντηση βλάβες στο DNA και την καταστολή της έκφρασης TPP1 σε ινοβλάστες εμβρύου ποντικού (ΠΜΑ) ή ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα θα μπορούσε να κινήσει τη δυσλειτουργία των τελομερών [19,20]. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι TPP1 υπερέκφραση ανέστειλε τις αυθόρμητες TIFs στα κύτταρα HCT116 παχέος. Έτσι TPP1 μπορεί να προστατεύσει τη δομή των τελομερών και να διατηρήσει τη φυσιολογική λειτουργία των τελομερών.

Βρήκαμε ότι TPP1 υπερέκφραση επιτάχυνε την κινητική αποκατάσταση του συνόλου διάλειμμα DNA διπλό σκέλος που προκαλείται από την έκθεση IR. Το πιο σημαντικό, δοκιμασία ΔΕΘ αποκάλυψε ότι το ποσοστό επιδιόρθωσης της βλάβης του DNA σε τελομερή μετά από ακτινοβολία επίσης επιταχύνθηκε από TPP1 υπερέκφραση. Τελομερούς ομοιόσταση είχε εντοπιστεί για να χρησιμεύσει ως ένας πιθανός στόχος στην ακτινοθεραπεία. Μελέτες είχαν αποκαλύψει ότι η αναστολή της τελομεράσης μπορεί να οδηγήσει σε δυσλειτουργία των τελομερών και έτσι αυξάνεται ακτινοευαισθησία [22,34]. Επιβεβαιώθηκε επίσης ότι η διακοπή της shelterin θα μπορούσε να οδηγήσει σε δυσλειτουργία των τελομερών [14,20]. David Soler και οι συνεργάτες του έδειξαν ότι η δυσλειτουργική τελομερή στα επιθηλιακά κύτταρα του ανθρώπου ήταν πιθανό να επηρεάσει την αποτελεσματική επισκευή της ακτινοβολίας που προκαλείται DSBs και στη συνέχεια οδήγησε σε αύξηση ραδιοευαισθησία [35]. Η μελέτη μας έδειξε ότι TPP1 μπορούν να συμμετέχουν στην ομοιόσταση των τελομερών και θα μπορούσε να προστατεύσει τελομερών από την ακτινοβολία στο ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα.

Εν κατακλείδι, η μελέτη αποκαλύπτει ότι τα αυξημένα επίπεδα TPP1 προστασία των τελομερών από βλάβες του DNA και προσδίδουν ραδιοαντοχή στον ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. Επιπλέον, παρέχουμε αποδεικτικά στοιχεία για την συσχέτιση μεταξύ TPP1expression, το μήκος των τελομερών και εγγενή ακτινοευαισθησία. Επιπλέον, αυτή η μελέτη έχει προχωρήσει την κατανόηση της σχέσης μεταξύ ομοιόστασης τελομερών και ραδιοευαισθητοποίηση. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι τα επίπεδα TPP1 μπορεί να είναι ένας χρήσιμος δείκτης της απόκρισης σε θεραπεία με ακτινοβολία. Συνοπτικά, η μελέτη μας για πρώτη φορά δείχνει ότι TPP1 μπορεί να είναι ένας πιθανός στόχος στην ακτινοθεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου. Επιπλέον, TPP1 αναστολή TPP1 αναστολή μπορεί να παρέχει μια λειτουργική επικουρική θεραπεία με ακτινοβολία, μια δυνατότητα που διερευνά επί του παρόντος.

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Δρ Joachim Lingner ((ISREC, Epalinges, Ελβετία)) για την ευγενική δωρεά του πλασμιδίου pcDNA6-σημαία-hTPP1.