Αφηρημένο

Η σύνθεση της ανθρώπινης εντερικής μικροχλωρίδας συνδέεται με την κατάσταση της υγείας. Ο στόχος ήταν να αναλυθεί η μικροχλωρίδα του κανονικού και του παχέος εντέρου ασθενών με σκοπό τη θέσπιση του καρκίνου που σχετίζονται με dysbiosis

Ασθενείς και Μέθοδοι

Σκαμνί βακτηριακό DNA εκχυλίζεται πριν από την κολονοσκόπηση από 179 ασθενείς:. 60 με καρκίνο του παχέος εντέρου, και 119 με φυσιολογική κολονοσκόπηση. Βακτηριακά γονίδια που λαμβάνονται από Pyrosequencing 12 δείγματα κοπράνων (6 Normal και 6 του Καρκίνου) υποβλήθηκαν σε δοκιμή επικυρωθεί Principal Component Analysis (PCA). Η κυρίαρχη και δευτερευούσης βακτηριακού πληθυσμού (

Γ. Leptum

,

Γ. Coccoides

,

Bacteroides /Prevotella

,

Lactobacillus /Leuconostoc /ομάδες Pediococcus

,

Bifidobacterium γένους

, και

Ε. coli,

και

Faecalibacterium prausnitzii

είδη) ποσοτικοποιούνται σε όλα τα άτομα που χρησιμοποιούν qPCR και ειδικά κύτταρα παραγωγού IL17 στον εντερικό βλεννογόνο χαρακτηρίστηκαν χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία.

Ευρήματα

Pyrosequencing (ελάχιστη ακολουθία 200 νουκλεοτιδίων έχουν διαβάσει) αποκάλυψε το 80% όλων των ακολουθιών θα μπορούσε να ανατεθεί σε ένα σύνολο 819 taxa με βάση την προεπιλογή των παραμέτρων του λογισμικού ταξινομητή. Η φυλογενετική πυρήνα στον Καρκίνο άτομα ήταν διαφορετική από ότι σε φυσιολογικά άτομα, σύμφωνα με την ανάλυση PCA, με τάσεις προς διαφορές στις κυρίαρχες και δευτερευούσης οικογένειες των βακτηρίων. Κατά συνέπεια, Όλα-βακτήρια [log

10 (βακτήρια /g κοπράνων)] σε κανονική, και Καρκίνος άτομα ήταν παρόμοιο [11,88 ± 0,35 και 11,80 ± 0,56, αντίστοιχα, (P = 0.16)], σύμφωνα με τις αξίες qPCR λαμβάνοντας υπόψη ότι μεταξύ όλων των κυρίαρχων και δευτερευούσης είδη μόνο εκείνοι των

Bacteroides /Prevotella

ήταν υψηλότερες (Όλα τα βακτήρια ειδικά βακτήριο? P = 0,009) στον Καρκίνο (-1,04 ± 0,55) σε σχέση με Normal (-1,40 ± 0,83) άτομα . IL17 ανοσοαντιδραστικά κύτταρα εκφράστηκαν σημαντικά περισσότερο στην κανονική βλεννογόνο των ασθενών με καρκίνο σε σχέση με εκείνους με φυσιολογική κολονοσκόπηση.

Συμπέρασμα

Αυτή είναι η πρώτη μεγάλη σειρά για να αποδείξει μια αλλαγή στη σύνθεση της μικροχλωρίδας του παχέος εντέρου ασθενείς με καρκίνο με πιθανές επιπτώσεις στην βλεννογονική ανοσοαπόκριση. Τα στοιχεία αυτά ανοίγουν νέες κατατεθεί για τις έρευνες μαζική διαλογή και την παθοφυσιολογία

Παράθεση:. Sobhani Ι, Πατήστε J, Roudot-Thoraval F, Roperch JP, Letulle S, Langella P, et al. (2011) Μικροβιακή Dysbiosis σε καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) ασθενείς. PLoS ONE 6 (1): e16393. doi: 10.1371 /journal.pone.0016393

Επιμέλεια: Sylviane Pied, Lille 2 Πανεπιστήμιο, Γαλλία

Ελήφθη: 12 Σεπτεμβρίου του 2010? Αποδεκτές: 14 του Δεκέμβρη 2010? Δημοσιεύθηκε: 27, Ιανουαρίου 2011

Copyright: © 2011 Sobhani et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Cancéropole Ιλ de France, CoMiCa 2007-2010 του έργου, (Charles Debray ένωση-ACD)? LNCC (γαλλικό Εθνικό Λιγκ κατά του Καρκίνου), CCR INSERM Προώθηση (2004-2006). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Το ανθρώπινο παχύ έντερο περιέχει έως και 10

14 βακτήρια [1]. Παίζουν σημαντικό ρόλο στη ζύμωση του υπολειμματικού τροφίμων, τη διαμόρφωση του εντέρου λειτουργίας του ανοσοποιητικού, και η προστασία έναντι των παθογόνων και των ασθενειών [2] – [5]. Παρά το γεγονός ότι η εντερική μικροχλωρίδα είναι πολύ θετική, αλλαγές σε βακτηριακά πληθυσμούς ή στα προϊόντα του βακτηριακού μεταβολισμού μπορεί να συμβάλει στην ασθένεια.

Το 1971, μια μελέτη που προορίζεται να εντοπίσει συσχετίσεις μεταξύ σύνθεση ανθρώπινη μικροχλωρίδα του παχέος εντέρου και την καρκινογένεση, αλλά είχε να εγκαταλειφθεί λόγω των τεχνικών δυσκολιών. Αργότερα, Moore και συν-εργαζομένων ανέφεραν ότι 13 είδη βακτηρίων ήταν σημαντικά σχετίζεται με υψηλό κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του παχέος εντέρου και του δυτικού τύπου διατροφή [1]. Ωστόσο, τα αποτελέσματά τους ήταν κάπως πειστική, επειδή διερευνηθεί ένα μικρό αριθμό υποκειμένων και δεν εντερική έρευνα δηλαδή ακτινολογία ή κολονοσκόπηση εκτελέστηκε. Παρ ‘όλα αυτά, δεδομένου ότι αυτή η μελέτη διεξήχθη, το ανθρώπινο κολονικό μικροχλωρίδα έχει αναδειχθεί ως ένα σημαντικό περιβαλλοντικό παράγοντα που φαίνεται να ρυθμίζουν τον κίνδυνο του καρκίνου του κόλου, και dysbiosis στη μικροχλωρίδα του εντέρου πιστεύεται τώρα ότι είναι ένας παράγοντας που καθορίζουν την ανάπτυξη της νόσου σε γενετικά -predisposed άτομα. Ωστόσο, δεν υπάρχει καμία ένδειξη αν dysbiosis συμβεί πράγματι σε καρκίνο του παχέος εντέρου.

Μόνο ένα περιορισμένο σύνολο βακτηριακών πληθυσμών στη φύση έχουν εντοπιστεί στο ανθρώπινο σώμα και περίπου 80% των ανθρώπινων βακτηρίων που προσδιορίζονται από μοριακά εργαλεία δηλαδή μεταγονιδιωματική αλληλούχιση, θεωρούνται uncultivable [6]. Αν και μερικοί διαδεδομένη βακτηριακά είδη σε φυσιολογικά άτομα είναι τώρα επισημανθεί με τη χρήση ολόκληρο το γονιδίωμα αλληλούχιση [7], περισσότερο από το 60% των ειδών παραμένει άγνωστη και δεν υπάρχουν δεδομένα σχετικά με το πώς, εάν υπάρχει, μπορεί να συμβεί dysbiosis σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου. Έτσι, ο προσδιορισμός αλληλουχίας του DNA που στοχεύει υπερμεταβλητές περιοχές εντός των μικρών RNA γονίδια ριβοσωματικού-υπομονάδα, ειδικά γονίδια 16S rRNA κατέστησε δυνατό να χαρακτηριστεί η βιοποικιλότητα της μικροχλωρίδας, η οποία θα μπορούσε να οδηγήσει σε ασθένειες (για μια επισκόπηση, βλέπε ref [8]). Το γονίδιο 16S rRNA είναι ένα ριβοσωμικό στοιχείο που διατηρείται σε όλα τα βακτήρια, και περιέχει μεταβλητές αλληλουχίες που εκχωρούν εξειδίκευση ειδών. Σύμφωνα με αυτή την τεχνική κυρίαρχη taxa στην ανθρώπινη εντερική μικροχλωρίδα αναφέρεται ότι είναι

Clostridium leptum,

C

coccoides lostridium,

τις

Bacteroides /Prevotella

ομάδες και το

Bifidobacterium

γένους [9]. Η προσέγγιση πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR (qPCR) έχει προσαρμοστεί στην αξιολόγηση αυτών των βακτηριακών πληθυσμών σε μεγάλους αριθμούς δειγμάτων [10] – [11], και οι αλλαγές στα συστατικά μικροχλωρίδα μπορεί τώρα να μελετηθούν σε σχέση με την κατάσταση της υγείας /ασθένειας. Είδη που συμμετέχουν θα επηρεάσει πειραματικές και μεταβολικές μελέτες με νέες προσεγγίσεις παθοφυσιολογία. Για παράδειγμα,

Bacteroides

πληθυσμούς και ειδικότερα εκείνες από

Bacteroides fragilis

, έχουν πρόσφατα δειχθεί να παράγει μια μεταλλοπρωτεάση σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου, αλλά όχι στους μάρτυρες [12]. Αυτή είδη βακτηρίων έχει δειχθεί ότι επάγει βλεννογόνου ρυθμιστικές αποκρίσεις Τ-κυττάρων στο έντερο που περιλαμβάνει πρόσληψη Th17 κυττάρων σε ζώα [13] – [14], υποδηλώνοντας έντονα ότι μπορεί να μεταβάλλει την ομοιόσταση των πληθυσμών Τ-κυττάρων τελεστή βοηθού στο έντερο [14] – [15].

με τη χρήση της τεχνικής Pyrosequencing, αναφέρουμε ενδείξεις ότι η νόσος του καρκίνου του παχέος εντέρου συνδέεται με dysbiosis, κυρίως λόγω της αλλαγής στο κυρίαρχο και δευτερευούσης ειδών. Με τη χρήση qPCR, συγκρίναμε την εντερική βακτηριακή κοινότητες σε φυσιολογικά άτομα και σε άτομα με καρκίνο του παχέος εντέρου στη μεγαλύτερη σειρά μέχρι στιγμής αναφερθεί και το επίπεδο εμφάνισης των dysbiosis σε κυρίαρχο είδος μικροχλωρίδας. Βάζουμε τα αποτελέσματα αυτά σε μια προοπτική με βλεννογόνου ανοσολογική ομοιόσταση και δείκτη σκαμνί για τη μαζική διαλογή

Αποτελέσματα

Χαρακτηριστικά των ατόμων

Αυτά ταξινομούνται ως εξής:. Κανονική (n = 119 ), ο οποίος είχε κανονική κολονοσκόπηση? εκείνοι με άνω και κάτω τελεία (n = 44) ή πρωκτική (n = 16) του καρκίνου (συνολικά n = 60). Ασθενείς με καρκίνο ήταν φύλο συμφωνημένα (προφανώς δύο κανονικά για ένα καρκίνο), αλλά ήταν 10 χρόνια μεγαλύτερος από εκείνους με φυσιολογική κολονοσκόπηση (Πίνακας 1), όπως στην ομάδα μας (Πίνακας S1 σε Συμπληρωματικό S1 File) σε διαδοχικές επειδή τα άτομα συμπεριλήφθηκαν. Φυσιολογικά άτομα λιγότερο συχνά αναφερθεί ένα προηγούμενο ατομικό ιστορικό πολυπόδων ή ιστορικό καρκίνου του παχέος εντέρου στην οικογένειά τους και δεν εμφανίζουν διαφορά σχετικά με το ΔΜΣ. Έτσι, εκτός από αυτή τη θέση και την ηλικία, ήταν συμφωνημένα για την κύρια άλλα χαρακτηριστικά, συμπεριλαμβανομένων ΔΜΣ και η πρόσληψη τροφής ή φαρμάκου με την ομάδα ασθενών του καρκίνου (Πίνακας 1, Πίνακας S1 και το σχήμα S1 στο Συμπληρωματικό S1 αρχείου).

Η

θέμα Phylogeny βάση για την πώληση της διανομής της ταξινομικής ομάδας

από όλα τα σετ δεδομένων, ελήφθησαν 1.210.781 στολισμένα ακολουθίες και 978.710 από αυτά θα μπορούσε να ανατεθεί σε ένα σύνολο 819 taxa (Πίνακας S2 στο Συμπληρωματικό S1 αρχείου). Μια αραίωση των δεδομένων έγινε και έδωσε επαρκή εκπροσώπηση της πολυμορφίας του εντέρου μικροβιακής κοινότητας (Πίνακες S1, S2 πίνακα και το σχήμα S3 στο Συμπληρωματικό S1 αρχείου). Ταυτοποιήσαμε 18 βακτηριακά γένη με αφθονία πάνω από 1%, και αυτά τα γένη συμπεριλαμβάνεται το 75% των αλληλουχιών. Δεκατρία από τα 18 γένη (

Alistipes, Collinsella, Bacteroides, Lachnospira, Prevotella, Subdoligranulum, Dorea, Faecalibacterium, Roseburia, Coprococcus, Streptococcus, Bifidobacterium

και

Ruminococcus)

αντιστοιχεί στην ανθρώπινη εντερική μικροχλωρίδας φυλογενετική πυρήνα [16]. ανάλυση PCAIV έδειξε επίσης ότι περίπου το 5% της μεταβλητότητας θα μπορούσε να αποδοθεί στην κατάσταση της ασθένειας του κάθε δείγματος (Normal έναντι Cancer? ρ

Bacteroides

) από τα επτά είδη που διερευνήθηκαν εδώ βρέθηκε να είναι υψηλότερη σε άτομα της ομάδας του καρκίνου. Όλες αυτές οι μέθοδοι έχουν επικυρωθεί και χρησιμοποιούνται συνήθως [6]. Παρά το γεγονός ότι Pyrosequencing τεχνική, η οποία θα πρέπει να θεωρείται ως ένα ημι ποσοτική εργαλείο αναφέρεται πολλές άλλες αλλαγή βακτηριακών ειδών, μόνο κύριο κυρίαρχο και δευτερευούσης είδη ποσοτικά στην παρούσα μελέτη με qPCR. Επιπλέον, μοριακές αναλύσεις περιλαμβάνουν είδη που σχετίζονται με τις διαφορές στη διαπερατότητα καθετήρα, και τις ιδιότητες ενίσχυσης, και λόγω του σχετικά μικρού αριθμού των ανιχνευτών που διατίθενται για την ανάλυση των πολλών μη χαρακτηρισμένα είδη εντέρου [19], δεν μπορούμε να αποκλείσουμε την πιθανότητα ότι μπορεί να έχουμε χάσει και άλλα σημαντικά διαφορές στη μικροβιακή πυκνότητα. Έτσι, αυτό δεν θα πρέπει να αποκλείει τη δυνατότητα των διαφορών μεταξύ των ομάδων ασθενών σε σχέση με taxa ή ειδών βακτηρίων που καλούν τώρα για περαιτέρω έρευνα, βάσει των αποτελεσμάτων αλληλούχισης υψηλής απόδοσης για καρκινικά και τον έλεγχο μικροχλωρίδας. Το γονίδιο που βασίζεται αλληλουχίας rRNA μπορεί να ανιχνεύσει τα κυρίαρχα μέλη της κοινότητας, αλλά αυτές οι προσεγγίσεις δεν μπορεί να ανιχνεύσει τις σπάνιες μέλη μιας κοινότητας με αποκλίνουσες αλληλουχίες στόχους. Για να ξεπεραστούν οι περιορισμοί του μοναδικού γονιδίου που βασίζεται σε ανάλυση αλληλουχίας αμπλικονίου από Pyrosequencing, ολόκληρο το γονιδίωμα-αλληλούχιση κυνηγετικό όπλο έχει αναδειχθεί ως μια ελκυστική στρατηγική για την αξιολόγηση συγκρότημα μικροβιακή ποικιλότητα σε μικτούς πληθυσμούς [7]. Παρ ‘όλα αυτά, αυτή είναι η μεγαλύτερη μικροβιολογική έρευνα για να έχουν αναφερθεί μέχρι στιγμής, και ο μεγάλος αριθμός των ατόμων που εγγράφονται με γνωστές κολονοσκόπηση και ιστοπαθολογία χαρακτηριστικά το καθιστούν πολύ ισχυρή και θα μπορούσε να ανοίξει το δρόμο για νέες παθοφυσιολογικές πεδία και νέων δεικτών ελέγχου.

Ο λόγος για μια συσχέτιση μεταξύ του

Bacteroides /Prevotella

ομάδα ανύψωση πυκνότητα, όπως εκτιμάται από qPCR και κακοήθεις όγκους του παχέος εντέρου δεν είναι σαφής. Όλες οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για qPCR σε αυτή τη μελέτη σχεδιάστηκαν για την ποσοτικοποίηση κυρίαρχο και υπο κυρίαρχα είδη, όπως προτείνεται από Pyrosequencing προσέγγιση. Αν οι μικροβιολογικές διαφορές που διαπιστώθηκαν στην παρούσα μελέτη είναι αιτία ή συνέπεια της διαπιστώσεως του όγκου σε κολονοσκόπηση ανησυχίες μηχανιστική προσέγγιση, η οποία δεν είχε σχεδιαστεί για να αναλυθεί εδώ και απαιτεί προοπτικές μελέτες. Ωστόσο, θα μπορούσαμε να υποθέσουμε ότι

Bacteroides /Prevotella

πυκνότητα ομάδα δεν είναι πιθανώς η συνέπεια της εμφάνισης όγκων, επειδή τα επίπεδά τους δεν συσχετίζεται με το μέγεθος του όγκου ή σταδιοποίηση της νόσου και

Bacteroides

είδη του γένους θα μπορούσε να ανιχνευθεί από πλυμένες βλεννογόνου που υποδηλώνει ότι ανήκει σε βλεννώδεις προσκολλημένη ομάδες βακτηρίων. Αστάρια σχεδιάσαμε στοχευμένες

Bacteroides

και

Prevotella

πληθυσμούς του γένους. Αλλαγές στο

Prevotella

έχουν αναφερθεί μόνο στις προφορικές και γαστρική κοιλότητα [20], χωρίς καμία σχέση με την ανάπτυξη του όγκου. Σε αντίθεση,

Bacteroides

πληθυσμούς γένος και ειδικότερα εκείνες από

Bacteroides fragilis

, έχουν πρόσφατα δειχθεί να παράγει μια μεταλλοπρωτεάση σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου, αλλά όχι στους μάρτυρες [12] υποδηλώνοντας το είδος αυτό υπο του πληθυσμού θα μπορούσε να ευνοήσει την καρκινογένεση. Είναι αξιοσημείωτο ότι μεταξύ των πολλών μηχανισμών που μπορεί να μεσολαβήσει συσχετίσεις μεταξύ μικροχλωρίδα και της ανθρώπινης υγείας [21] – [22], προ-φλεγμονώδη και άνοσο ενεργοποίηση κυττάρου σε βλεννογόνο του παχέος εντέρου έχουν μεγάλη σημασία σε σχέση με την κακοήθεια. Ορισμένα μέλη της μικροχλωρίδας του εντέρου μπορεί να κατευθύνουν αποκρίσεις Τ-κυττάρων ξενιστή [13], [15] άλλοι μπορεί διατήρηση της ομοιόστασης των πληθυσμών Τ-κυττάρων τελεστή βοηθού στο έντερο [14].

Β. fragilis

έχει δειχθεί ότι επάγει βλεννογόνου ρυθμιστικές αποκρίσεις Τ-κυττάρων στο έντερο που περιλαμβάνει πρόσληψη κύτταρο Th17 σε πειραματικά μοντέλα [13] – [14]. Ενδιαφέροντος προσκολλάται εις τον βλεννογόνο

Bacteroides

είδη στη μελέτη μας εμφανίζεται υψηλότερη σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου σε σχέση με την κανονική κολονοσκόπηση άτομα σε αναλογία που συνδέονται με βλεννογόνου IL17 πυκνότητα ανοσοαντιδραστικών κυττάρων. Αυτό είναι σύμφωνο με προηγούμενη μελέτη μας σε ανθρώπινα κύτταρα που αναφέρθηκαν Th17 υπερέκφραση σε περισσότερο από το 80% των σποραδικών καρκίνου του παχέος εντέρου μικρο-περιβάλλον [23]. IL17 ανοσοδραστικά κύτταρα διεισδύουν περισσότερο ο ομόλογος φυσιολογικού βλεννογόνου του παχέος εντέρου των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου από φυσιολογικούς ιστούς σε φυσιολογικά άτομα κολονοσκόπηση όπως αξιολογείται με ανοσοϊστοχημεία ή mRNA qPCR ποσοτικοποίηση από το βλεννογόνο (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά θα μπορούσε να υποδηλώνει την ενεργοποίηση των Τ-κυττάρων μπορεί να συνδέονται με την αλλαγή του βλεννογόνου IL17 λόγω

Bacteroides

όπως αναφέρεται σε ζωικά μοντέλα [13] – [14], [21] – [22]. Εν συντομία, αυτά τα δεδομένα υποστήριξαν μια διαταραγμένη ανοσολογική απόκριση σε ιστούς καρκίνου του κόλου με IL-17 υπερπαραγωγή επιδεινώνοντας [24] – [25], η νόσος πιθανόν να οφείλεται σε

Bacteroides

Η

Πρόσθετες ενδιαφέρουσες. πτυχή της μικροχλωρίδας είναι πιθανή αξία της ως δείκτης καρκίνου του παχέος εντέρου αφού πλειονότητα των ασθενών θα μπορούσαν να ταυτοποιηθούν από μια ανύψωση του

Bacteroides /Prevotella

πληθυσμός με δυνατότητα μιας ποσοτικής δοκιμασίας μια cut-off βασίζεται σε μια ειδικότητα τιμή. Σε σύγκριση με την κολονοσκόπηση μέχρι τώρα τις αυξήσεις των

Bacteroides

στα κόπρανα ή /και IL17 ανοσοδραστικών κυττάρων στις κανονικές βλεννογόνο φαίνεται να υπόσχεται ευαίσθητη δείκτες.

Μέθοδοι

από Σεπτέμβρης 2004 – Σεπτέμβρης 2006, 648 άτομα με μέση ή υψηλότερο του μέσου όρου κίνδυνο CRC (π.χ. με την ιστορία του καρκίνου σε συγγενείς ή ατομικό ιστορικό παρελθόν της πολυπόδων, ή κοιλιακό ή συμπτώματα που σχετίζονται με την εντερική ή αναιμία που απαιτούνται κολονοσκόπηση), ήταν που περιλαμβάνονται σε μελέτη συλλογής τράπεζα δείγματος. Για να είναι επιλέξιμες για ένταξη, οι ασθενείς έπρεπε να έχουν κανένα προηγούμενο ιστορικό του παχέος εντέρου ή του ορθού χειρουργική επέμβαση, από ασθένειες όπως ο καρκίνος, ή των φλεγμονωδών ή μολυσματικών τραυματισμοί του εντέρου, και να μην χρειάζεται μια κολονοσκόπηση έκτακτης ανάγκης. Δύο εβδομάδες πριν από την κολονοσκόπηση, οι ασθενείς εντάχθηκαν μετά τον εν επιγνώσει συναίνεση και κλήθηκαν να δώσουν ένα φρέσκο ​​δείγμα κοπράνων μέσα σε 2 εβδομάδες έως τρεις ημέρες πριν από την κολονοσκόπηση. Η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας της περιοχής Val de Marne Paris-EST που εξουσιοδότησε την εγγραφή τους ασθενείς σε όλες τις συναφείς κέντρα. Όλοι οι ασθενείς έλαβαν πληροφορίες σχετικά με τη μελέτη, τους στόχους της, και τα δείγματα θα πρέπει να δώσει. Όλες οι πληροφορίες που δόθηκαν από δακτυλογραφημένη επιστολή που γράφτηκε στα Γαλλικά και την επίσημη συγκατάθεση έχει ληφθεί σε ένα τριπλό έντυπο αντίγραφο? Ένα από αυτά ήταν συντηρημένα από τον ασθενή, κρατάμε ένα αντίγραφο στο τμήμα της κλινικής έρευνας (CIC) και το τελευταίο αντίγραφο διατηρείται από τον υποκινητή (Εθνικό Ινστιτούτο επιστημονικής έρευνας στον τομέα της ιατρικής-INSERM). Έτσι, μια επίσημη συγκατάθεση είναι διαθέσιμα για κάθε ασθενή. Σε όλες τις περιπτώσεις τα δείγματα κοπράνων συλλέχθηκαν πριν εντέρου καθαρισμού για κολονοσκόπηση. Τυχόν ιδιαίτερη δίαιτες (διαβητικοί, χορτοφάγοι) και τα φάρμακα (αντιδιαβητικά φάρμακα, hypocholesterolemics, και καθαρτικά) κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου καταγράφηκαν. Ένας αναισθησιολόγος επισκέφθηκε τους συμμετέχοντες τουλάχιστον τρεις ημέρες πριν από την προγραμματισμένη κολονοσκόπηση. Η διάρκεια της μελέτης συνεχίζεται μέχρις ότου ελεγχθεί η κολονοσκόπηση και την παθολογία των δεδομένων, καθώς και το τελικό καθεστώς θα μπορούσε να αποδοθεί ως «κανονική κολονοσκόπηση», «όγκου σε κολονοσκόπηση» ή «άλλες ανωμαλίες σε κολονοσκόπηση». Κρατήθηκαν σε μια συλλογή βιο-τράπεζα για παθοφυσιολογία ή Screening Test μελέτες, μεταξύ των οποίων αυτή που αναφέρεται εδώ. Μετά την αντιστοίχιση των δύο φύλων μεταξύ των ατόμων με όγκων και φυσιολογικό κολονοσκοπήσεις, δείγματα από 180 ασθενείς (ένας ασθενής με καρκίνο για 2 άτομο με κανονική κολονοσκόπηση) που ελέγχθηκαν δεν λαμβάνουν αντιβιοτικά είτε με «κανονική» ή πορίσματα «καρκίνος» υποβλήθηκαν σε βακτήρια ανάλυση του DNA στο τρέχουσα σειρά.

δείγματα κοπράνων και βακτηριακό DNA

εκχύλιση

Ολόκληρα νωπά κόπρανα συλλέχθηκαν σε αποστειρωμένα κουτιά, και μέσα σε 4 ώρες και 10 gr καταψύχθηκαν στους -20 ° C για ανάλυση. Το βακτηριακό DNA εκχυλίστηκε από κλάσματα των κοπράνων, και μετά από την τελική καθίζηση, το DNA επαναιωρήθηκε σε 150 μΐ ΤΕ ρυθμιστικού και αποθηκεύθηκε στους -20 ° C για περαιτέρω ανάλυση, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26].

Pyrosequencing ανάλυση από κόπρανα

δείγματα βακτηριακό DNA από 6 άτομα (3 άνδρες και 3 γυναίκες που επιλέγονται τυχαία) με μια κανονική κολονοσκόπηση, και 6 ηλικία και το φύλο-συμφωνημένα ασθενείς με διηθητικό CCR του σταδίου Ι ή ΙΙ της κατάταξης ΤΝΜ , χρησιμοποιήθηκαν για να κατασκευαστεί 12 βιβλιοθηκών DNA. Οι παρακάτω γενικών εκκινητών 16SrRNA χρησιμοποιήθηκαν για την αντίδραση PCR: V3F (TACGGRAGGCAGCAG) [27] και V4R (GGACTACCAGGGTATCTAAT) [28] για τη στόχευση της περιοχής V3-V4, το οποίο δίνει τα χαμηλότερα ποσοστά σφάλματος [29]

ακολουθίες Barcode (πλήκτρο GsFLX) TCAG και MIDGsFLX (12 νουκλεοτίδια) συνδέθηκαν μεταξύ του 454 ακολουθία adaptator GsFLX και προς τα εμπρός V3F αστάρι. Το κλειδί GsFLX και το 454 GsFLX adaptator συνδέθηκαν με εκκινητή. Η συγκέντρωση και η ποιότητα των προϊόντων PCR αξιολογήθηκαν με PicoGreen προκειμένου να λάβει ίσες ποσότητες του καθενός από τα δείγματα (10

8 μόρια /μl), και στη συνέχεια αμπλικόνια γονίδιο 16S rRNA αλληλουχήθηκαν επί Roche GS FLX 454 sequencer ( Genoscreen, Λιλ, Γαλλία) και επεξεργασία με το πρότυπο πρωτόκολλο από τον κατασκευαστή (https://genoscreen.fr/). Για την επικύρωση της παρουσίας συγκεκριμένων βακτηριακών taxa στις 2 ομάδες των ασθενών παρά τη μεταβλητότητα οφείλεται στην τεχνική μέθοδο, κάθε δείγμα DNA αλληλουχήθηκε εις διπλούν. Έτσι 12 σκαμνί εκχυλίσματα βακτηριακό DNA υποβλήθηκαν Pyrosequencing ανάλυση, με δύο επαναλήψεις του καθενός. Αυτά τα 24 σύνολα ακολουθιών υποβλήθηκαν σε ενδο ατομική και αναλύσεων μεταξύ ατομικών και κλασική δείκτες ποικιλότητας υπολογίστηκαν. Κοινές ακολουθίες σε δύο αντίγραφα εξετάστηκαν για κάθε άτομο? Στη συνέχεια, μεταξύ ατομικών και μεταξύ της ομάδας αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με το «Normal» σε σχέση με την κατάσταση «Καρκίνος».

Ποσοτική PCR ανάλυση

Χρησιμοποιήσαμε ένα πραγματικό χρόνο τεχνική qPCR να διερευνήσει τη διαφορά σε βακτηριακά πυκνότητες εντός της μικροχλωρίδας μεταξύ των κοπράνων κανονικής και του καρκίνου των ασθενών (Ν = 179) και του βλεννογόνου του DNA (Ν = 44). Οι εκκινητές και ανιχνευτές που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη έχουν περιγραφεί αλλού [26], και παρουσιάζονται στον Πίνακα S1 S1 συμπληρωματική αρχείου. Σε πραγματικό χρόνο qPCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας ΑΒΙ 7000 Sequence Detection System με λογισμικό έκδοσης 1.2.3 (Applied Biosystems-, Foster City, CA, USA), και το συνολικό αριθμό των βακτηρίων συναχθεί από κατά μέσο όρο πρότυπες καμπύλες και εκφράζεται ως log10 αξία, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Οι τιμές των qPCR ελήφθησαν ανά ασθενή και για κάθε συστατικό του εντέρου μικροχλωρίδας (σύνολο n = 180 ασθενείς, 60 με καρκίνο και 119 με την κανονική κολονοσκόπηση, ένα λείπει δείγμα). Για να ξεπεραστεί το γεγονός ότι τα δείγματα κοπράνων μπορεί να περιέχει περισσότερο ή λιγότερο νερό, τα δεδομένα για κάθε δείγμα κοπράνων ομαλοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Το επίπεδο βρέθηκαν για κάθε συγκεκριμένο κυρίαρχο και υπο-κυρίαρχο πληθυσμό βακτηρίων αφαιρέθηκε από τις all-βακτήρια περιεχόμενο, και τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ο λογάριθμος του αριθμού των βακτηρίων ανά γραμμάριο κοπράνων. Αυτές οι δοκιμασίες χρησιμοποιήθηκαν για να συγκρίνουν τη σύνθεση της εντερικής μικροχλωρίδας των 179 ατόμων και τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσοι όροι ± SD στην κανονική, και ο καρκίνος ομάδες ασθενών. Επιπλέον, ο εκπρόσωπος του παχέος εντέρου (Ν = 32) ή πρωκτική (Ν = 12) δείγματα φυσιολογικού ιστού από 22 άτομα με φυσιολογικό κόλον και 22 ασθενείς με άνω και κάτω τελεία (Ν = 16) ή πρωκτική (Ν = 6) καρκίνο υποβλήθηκαν σε εκχύλιση του DNA και qPCR ποσοτικοποίηση σύμφωνα με την ίδια διαδικασία για την ανάλυση του βλεννογόνου προσκολλημένη συστατικό βακτήρια. Παχέος ή πρωκτική ιστοί ελήφθησαν μετά από χειρουργική επέμβαση? κομμάτια πλύθηκαν και αντιπροσωπευτικά δείγματα συντηρούνται είτε σε φορμόλη για ιστοχημεία ή κατεψυγμένα μέχρι την εκχύλιση του DNA για την ανθρώπινη λευκωματίνη και

Bacteroides

διαδικασία PCR

Ανοσοϊστοχημεία

επιλέχθηκαν για.

δείγματα ιστών κάθε περίπτωση (φυσιολογικών και καρκινικών άτομα), και τα τμήματα 4-μm εμπεδωθεί με παραφίνη χρησιμοποιήθηκαν και ανοσοκηλίδωση διεξήχθη σύμφωνα με τις μεθόδους που περιγράφονται αλλού [23], [30]. Εν συντομία, η κατσίκα αντι-ανθρώπινο IL-17 αντίσωμα (αραιωμένη σε 1:40) προστέθηκε για 2 ώρες, και στη συνέχεια χρώση πραγματοποιείται με τη χρήση (κιτ Vectastain ΑΡ από τη Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), και αποκαλύπτεται από ναφθόλη /Fast Red (Sigma-Aldrich). Για την ποσοτικοποίηση των ανοσοχρωματισμένες κύτταρα, πέντε και προσανατολισμένη δείγματα slide /άτομο από φυσιολογικούς ιστούς είτε σε ασθενείς της ομάδας ελέγχου ή καρκίνο του παχέος εντέρου εξετάσθηκαν σε μεγέθυνση 400 × (για ένα 3-mm μήκους δείγμα επιθηλίου σε κάθε περίπτωση). Επισημασμένα κύτταρα ανά χιλιοστό προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα οφθαλμικό πλέγμα. Ανοσοχρωματίστηκε κύτταρα μετρήθηκαν σε 10 διαδοχικά πεδία και ημι-ποσοτικά δέχεται (όπως +/-, +, ++ ή +++) και ταξινομούνται. Για IL17 /CD3 διπλή χρώση, η κατσίκα αντι-ανθρώπινο IL-17 αντίσωμα (αραιωμένη σε 1:40) προστέθηκε για 2 ώρες, και στη συνέχεια χρώση πραγματοποιείται με τη χρήση του κιτ Vectastain ΑΡ από Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA), και αποκάλυψε με ναφθόλη /Fast Red (Sigma-Aldrich).