Αφηρημένο

λογαριασμούς μετάσταση του καρκίνου για την πλειονότητα των θανάτων που σχετίζονται με τον καρκίνο λόγω της κακής απάντηση αντικαρκινικών θεραπειών. Μοριακή κατανόηση της ανθεκτικότητας στα φάρμακα μετάστασης που σχετίζονται παραμένει ασαφείς λόγω της σπανιότητας των διαθέσιμων ιστών όγκου. Απομόνωση των κυκλοφορούντων κυττάρων όγκου (ΚΜΑ) από το περιφερικό αίμα των ασθενών έχει αναδειχθεί ως ένα έγκυρο εναλλακτική πηγή ιστού όγκου που μπορεί να υποβληθεί σε μοριακό χαρακτηρισμό. Ωστόσο, τα ζητήματα με χαμηλή καθαρότητα και την ευαισθησία να παρεμποδίσει την έκδοση στην κλινική πρακτική. Εδώ αναφέρουμε μια νέα μέθοδο για να συλλάβει και μοριακά ΚΜΑ χαρακτηρίζουν απομονωθεί από ασθενείς με καρκίνο του προστάτη ευνουχισμού ανθεκτικά (CRPC) που λαμβάνουν χημειοθεραπεία ταξάνη. Έχουμε αναπτύξει μια μικρορευστομηχανική διάταξη γεωμετρικά ενισχυμένο διαφορικό ανοσοσύλληψης (GEDI) που συνδυάζει ένα αντι-ειδικό προστατικό αντιγόνο μεμβράνης (PSMA) αντίσωμα με ένα 3D γεωμετρία που συλλαμβάνει ΚΜΑ ενώ ελαχιστοποιεί μη ειδικές προσκόλληση λευκοκυττάρων. Καταμέτρηση GEDI-κατέλαβε ΚΜΑ (που ορίζεται ως άθικτα, πυρηνοποιημένα PSMA CD45-κυττάρων + /) αποκάλυψαν μια διάμεση των 54 κυττάρων ανά ml που προσδιορίζονται στο CRPC ασθενείς έναντι 3 σε υγιείς δότες. Απευθείας σύγκριση με το εμπορικά διαθέσιμο CellSearch® αποκάλυψε μια 2-400 φορές μεγαλύτερη ευαισθησία επιτυγχάνεται με τη συσκευή GEDI. Ομοεστιακό μικροσκόπιο της GEDI-κατέλαβε ΚΜΑ ασθενή που προέρχεται προσδιόρισε το TMPRSS2: πρωτεΐνη σύντηξης ERG, ενώ αλληλουχίας προσδιορίζονται συγκεκριμένες ανδρογόνων σημείο υποδοχέα μετάλλαξη (T868A) σε δείγματα αίματος εμπλουτίστηκε με μόνο 50 κύτταρα PC C4-2. On-chip θεραπεία της ΚΜΑ ασθενή που προέρχεται με docetaxel και paclitaxel επέτρεψε την παρακολούθηση της δέσμευσης του φαρμάκου-στόχου μέσω των μικροσωληνίσκων δεματοποίησης. ΚΜΑ απομονωθεί από CRPC ασθενείς docetaxel ανθεκτικά δεν εμφανίζει κανένα σημάδι της δραστικότητας του φαρμάκου. Οι μετρήσεις αυτές αποτελούν τις πρώτες λειτουργικές δοκιμασίες της δέσμευσης φαρμάκου-στόχου στο σαλόνι κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων και ως εκ τούτου έχουν τη δυνατότητα να ενεργοποιήσετε διαμήκη παρακολούθηση της ανταπόκρισης των στόχων και ενημερώνει σχετικά την ανάπτυξη νέων αντικαρκινικών παραγόντων

Παράθεση:. Kirby BJ, Jodari Μ, Loftus MS, Gakhar G, Pratt ΕΔ, Chanel-Vos C, et al. (2012) Functional Χαρακτηρισμός των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων με ένα καρκίνο του προστάτη-ειδικού Microfluidic συσκευής. PLoS ONE 7 (4): e35976. doi: 10.1371 /journal.pone.0035976

Επιμέλεια: Νατάσα Κυπριανού, Πανεπιστήμιο του Κεντάκι College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 20 του Δεκέμβρη του 2011? Αποδεκτές: 23 του Μαρτίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 27 Απριλίου 2012 |

Copyright: © 2012 Kirby et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από τις ΗΠΑ Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας (R01 CA137020-01 και U54 CA143876) (PG), το Ογκολογικό Κέντρο NIH Φυσικών Επιστημών στο Cornell (BK, PG DN), Νέα Υόρκη Γραφείο της Επιστήμης, Τεχνολογίας και Έρευνας ( BK), το Weill Cornell Κλινική και Μεταγραφική Science Center (DN, PG BK) ένα Βραβείο Δημιουργικότητας από το Ίδρυμα Καρκίνος του προστάτη (PG και DN) και υποστήριξη από το ουροποιητικό Ογκολογίας Ταμείου Έρευνας (DN). CCV είναι αποδέκτης μιας μεταδιδακτορικής έρευνας NRSA. ΕΚ και SS υποστηρίχθηκαν από το Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών Μεταπτυχιακή Έρευνα υποτροφίες. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. BK, PG, ST και DN αποκαλύπτουν εισόδημα συμβούλων από την Sanofi ΗΠΑ. Αυτό δεν αλλάζει την προσήλωσή μας σε όλες τις πολιτικές της PLoS One για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Η ανάπτυξη των μεταστάσεων σε ασθενείς με κακοήθειες συμπαγών όγκων πιστεύεται ότι προκύπτει από τα καρκινικά κύτταρα που εισέρχονται στην κυκλοφορικό σύστημα και μεταναστεύουν σε απομακρυσμένα όργανα, όπου εξαγγειώνονται και πολλαπλασιάζονται [1] – [3]. Παρά το γεγονός ότι κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων (ΚΜΑ) είναι σπάνιες-τόσο λίγα όπως ένα κύτταρο ανά 100 εκατομμύρια κύτταρα του αίματος [3], [4], μοριακές και λειτουργικές αναλύσεις της ΚΜΑ μπορεί να παρέχει μια καλύτερη κατανόηση της βιολογίας των μεταστάσεων του καρκίνου, να βοηθήσει στον εντοπισμό νέων θεραπευτικών στόχων, και θα επιτρέψει την κλινική συσχετίσεις για την παρακολούθηση ασθενών που υποβάλλονται σε θεραπεία [5]. Μια ποικιλία των τεχνολογιών έχει αναπτυχθεί για να βελτιωθεί η ανίχνευση και τη σύλληψη του ΚΜΑ από το περιφερικό αίμα. Αυτές περιλαμβάνουν φυγοκέντρηση βαθμίδωσης πυκνότητας, ανοσομαγνητικό διαχωρισμό σφαιριδίων χρησιμοποιώντας μονοκλωνικά αντισώματα που στοχεύουν επιθηλιακού κυττάρου-επιφανειακά αντιγόνα, διαλογή κυττάρων χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής, η διήθηση με βάση το διαχωρισμό μεγέθους [6] και microfluidic συσκευές. Παρά το γεγονός ότι έχουν εξελίξεις στη σύλληψη CTC έχουν γίνει, η χαμηλή συχνότητα των CTCs σε ασθενείς με καρκίνο, ετερογένεια τους, η έλλειψη οργάνων-συγκεκριμένες προσεγγίσεις σύλληψη, και η πλαστικότητα του πληθυσμού CTC έχει περιορίσει την ικανότητα να συλλάβει και να παρακολουθείτε όλες τις ΚΜΑ [2] , [6]. Επί του παρόντος, το μόριο επιθηλιακών κυττάρων πρόσφυσης (EpCAM), αντιπροσωπεύει το αντιγόνο επιλογής για την πλειονότητα των μικρορευστομηχανικών διατάξεων που έχουν αναπτυχθεί για να συλλάβει κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων [7] – [10].

Ωστόσο, συσσωρεύοντας αποδείξεις δείχνει ότι η έκφραση του EpCAM κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου και ιδίως κατά τη διάρκεια των επιθηλιακών-to-μεσεγχυματικά μετάβαση δεν έχει χαρακτηριστεί πλήρως, αυξάνοντας τις ανησυχίες για την οικουμενικότητα αυτού του αντιγόνου για συστήματα ανοσοσύλληψης [11], [12]. EpCAM έχει αναφερθεί ότι έχουν ογκογόνο δυναμικό [13] και συσχετίζονται με πολλαπλασιασμό σε κυτταρικές σειρές [14]? Ωστόσο, ρυθμίζεται προς τα κάτω κατά τη διάρκεια της ΕΜΤ [1], και έχουν δείκτες EMT έχει αποδειχθεί ότι είναι πιο σημαντικό από τα επιθηλιακά σημειωτές π.χ., κυτοκερατίνη στην πρόβλεψη της εξέλιξης του καρκίνου [15]. Έτσι, ενώ η EpCAM είναι σαφώς χρήσιμος για τον εντοπισμό των πληθυσμών CTC σε πολλούς καρκίνους, οι προκαταλήψεις που συνδέονται με τον εμπλουτισμό EpCAM είναι προς το παρόν άγνωστη.

Εκτός από τις αβεβαιότητες σχετικά με αντιγόνα επιφανείας, η ιδιαιτερότητα της ανοσοσύλληψης από το αίμα διαταράσσεται από οι μη ειδικές συγκολλητικές ιδιότητες των λευκοκυττάρων στις περισσότερες επιφάνειες αντίσωμα. Λόγω της παρουσίας πολλών λευκοκυττάρων στο αίμα σε ένα περίπου 10

4-10

5:01 αναλογία σε σχέση με την ΚΜΑ, ανοσοειδική επιφάνειες εμπλουτίσουν ΚΜΑ, αλλά δεν μπορεί να τους απομονώσει από μολυσματικές λευκοκύτταρα εντελώς. Προσδιορισμός ΚΜΑ απαιτεί επιπλέον βήματα και συχνά συνεπάγεται χρώση με ϋΑΡΙ να διασφαλίσει την παρουσία ενός ακέραιου πυρήνα και ανοσοχρώση για τον προσδιορισμό της παρουσίας επιθηλιακών δεικτών (δηλαδή, κυτοκερατίνη) και η έλλειψη του λευκοκυττάρων CD45 δείκτη. Όπως ανοσοχρώση εντόπισε μια οικογένεια κριτηρίων που συσχετίζονται αριθμό CTC με την πρόγνωση των ασθενών [16], αλλά απαιτεί στερέωση και χρώση είναι κεντρικής σημασίας για την αναγνώριση CTC, όπως και στο σύστημα εμπορικών CellSearch® [17], [18]. Αν και απαρίθμηση των CTCs από ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο του προστάτη που υποβάλλονται σε χημειοθεραπεία με τη χρήση του εμπορικά διαθέσιμο σύστημα σύλληψης CTC από CellSearch® απέδειξε χρησιμότητα ως προγνωστικός δείκτης επιβίωσης των ασθενών [17], [18] και την απαρίθμηση μελετάται επί του παρόντος σε έναν αριθμό κλινικών μελέτες, η παρουσία μολυσματικών λευκοκυττάρων εμποδίζουν την κατάντη χρησιμότητα του συσκευές καταγραφής CTC, στο εν λόγω δοκιμασίες που βασίζονται σε RNA ή πρωτεΐνη ποσοτικοποίηση καθίστανται ασαφή από την ανάγκη για στερέωση και το υλικό των λευκοκυττάρων προέλευσης.

για να διευκολυνθεί η σύλληψη υψηλής απόδοσης της ΚΜΑ προστάτη, έχουμε αναπτύξει μια microfluidic πρωτότυπη συσκευή που χρησιμοποιεί μια προσέγγιση που ονομάζουμε γεωμετρικά ενισχυμένο διαφορικό ανοσοσύλληψης (GEDI). Αυτή η συσκευή συνδυάζει ένα γεωμετρία που μειώνει σύλληψη των μολυσματικών λευκοκυττάρων μέσω της παραγωγής μέγεθος που εξαρτάται από συγκρούσεις κυτταρικού τοιχώματος. Συνδυάζουμε αυτή γεωμετρική προσέγγιση με μια επιφάνεια ανοσοσύλληψης ειδικού προστατικού χρήση του μονοκλωνικού αντισώματος J591 που αναγνωρίζει τον εξωκυτταρικό τομέα του αντιγόνου ειδικού προστατικού μεμβράνης (PSMA) [10]. PSMA είναι ένα κυτταρικής επιφάνειας πεπτιδάσης υψηλά εκφράζονται από κακοήθη κύτταρα επιθηλιακά προστάτη. PSMA είναι ένας ελκυστικός στόχος για τον καρκίνο του προστάτη CTC σύλληψη, όπως εκφράζεται σε όλα σχεδόν τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη και αυξήσεις έκφρασης μετά τον ευνουχισμό. Αναφέρουμε εδώ μια λεπτομερή επίδειξη των πολλαπλών υπηρεσιών κοινής ωφελείας της συσκευής GEDI, συμπεριλαμβανομένης σύγκρισης της CTC απαρίθμησης με CellSearch®, η ανίχνευση ενός ειδικού AR μετάλλαξη από δείγματα αίματος εμπλουτίστηκαν με μόνο 50 κύτταρα? ο προσδιορισμός της σύντηξης TMPRSS2-ERG από ανοσοχρώση, και το

ex-vivo

αξιολόγηση της CTC ευαισθησία σε ταξάνη θεραπεία με τη χρήση μικροσωληνίσκων δεματοποίησης ως δείκτης της δέσμευσης φαρμάκου-στόχου.

Υλικά και μέθοδοι

κατασκευή συσκευών

Όλα κατασκευής της συσκευής πραγματοποιήθηκε στο Cornell νανοκλίμακα Επιστήμης και Τεχνολογίας διευκόλυνσης (Ithaca, NY). Πρότυπες τεχνικές φωτολιθογραφία χρησιμοποιήθηκαν για να καθορίσουν γεωμετρίες συστοιχία σε δισκία πυριτίου. Οι γκοφρέτες χαράχτηκαν με ένα πλάσμα οξυγόνου βαθιά αντιδραστική χαράκτης ιόντων (Uniaxis SLR770) σε ένα βάθος 100 μm, και καθαρίζονται με θειικό οξύ και υπεροξείδιο του υδρογόνου πριν από την επιφάνεια αντίσωμα λειτουργοποίηση. Το J591 μονοκλωνικό αντίσωμα (που κατασκευάζεται από την Lonza plc (Slough, England) για BZL Biologics, inc.) Ακινητοποιήθηκε πάνω στις επιφάνειες συσκευή χρησιμοποιώντας MPTMS-GMBS-NeutrAvidin-βιοτίνης χημεία [10]. Πολυδιμεθυλοσιλοξάνη (PDMS) φύλλα (5:01 base:curing παράγων), πάχους περίπου 3 mm, πολυμερίσθηκαν επί 18 ώρες στους 60 ° C και κόβεται για να σχηματίσει καλύμματα για τη συσκευή GEDI. Ένα φύλλο PDMS συσφίγγεται στο επάνω μέρος της συσκευής με ένα προσαρμοσμένο χορεύω για τη δημιουργία κλειστού κανάλια συμπληρωθεί με ανάρτηση συστοιχίες. Εισόδου και εξόδου τρύπες δημιουργήθηκαν με μια γροθιά βιοψία, και σωλήνες μέταλλο 23-gauge εισήχθησαν στα PDMS να συνδεθείτε εισόδου και εξόδους σε εξωτερικές σωληνώσεις. Συσκευές πριμοδοτήθηκαν με ένα μίγμα 50/50 ισοπροπανόλης /νερού, και στη συνέχεια ξεπλένεται με απιονισμένο νερό και PBS πριν τα πειράματα.

Συλλογή Δείγματος και Microfluidic Capture

δείγματα περιφερικού αίματος συλλέχθηκαν σε σωλήνες που περιέχουν νάτριο κιτρικό αντιπηκτικό (Becton-Dickinson) από υγιείς εθελοντές και ασθενείς με μεταστατικό ευνουχισμού ανθεκτικά καρκίνο του προστάτη κάτω από ένα κλινικό πρωτόκολλο με τίτλο «Ανάλυση των κυκλοφορούντων κυττάρων του όγκου στον καρκίνο του προστάτη. Πρόβλεψη απάντηση ταξάνες:. Πιλοτική μελέτη », το οποίο εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review (IRB) του Weill Cornell Medical College του Πανεπιστημίου Cornell αίματος ελήφθησαν από ασθενείς ή σε υγιείς δότες μετά από έγγραφη συγκατάθεση, η οποία εγκρίθηκε επίσης από την επιτροπή IRB του Weill Cornell Medical College του Πανεπιστημίου Cornell. Όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10], 1 ml αίματος από κάθε δείγμα υποβλήθηκε σε επεξεργασία μέσω του τσιπ GEDI εντός 24 ωρών από τη λήψη αίματος από την ώθηση του αίματος μέσω της συσκευής σε ένα ογκομετρικό ρυθμό ροής 1 ml /hr (Chemyx αντλία σύριγγας)

χρώση των κυττάρων και ανάλυση

Οι κυτταρικές γραμμές που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτά τα πειράματα ως έλεγχοι για χρώση ή σε εμβολιασμένο πειράματα είναι:. η κυτταρική γραμμή λευχαιμίας του ανθρώπου U937, και ο .. ανθρώπινου προστάτη καρκινικές κυτταρικές σειρές PC-3, LNCaP και C4-2 Όλες οι κυτταρικές σειρές αγοράστηκαν από την ATCC Μετα-σύλληψη, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν επί-τσιπ με PHEMO στερεωτικό στους 37 ° C (ρυθμιστικό PHEMO: ΣΩΛΗΝΕΣ οξύ, HEPES οξύ, EGTA δινάτριο άλας, Mg-Cl2-6H

20, 10% DMSO), γλουταραλδεΰδη, και 3,7% φορμαλδεΰδης. Τα κύτταρα στη συνέχεια δεσμεύτηκαν (10% φυσιολογικό ορό αιγός – Jackson Immuno Research) και ανοσοχρώση με FITC-συζευγμένο ανθρωποποιημένο mAb J591 για την ανίχνευση της έκφρασης PSMA. Τα μονοκλωνικά αντι-CD-45 (Βϋ Biosciences) που ακολουθείται από επισημασμένο AlexaFluor568 κατσίκας αντι-ποντικού δευτερογενούς (Invitrogen) και ποντικού αντι-ΕρΟΑΜ συζευγμένο άμεσα με AlexaFluor647 (Biolegend). Για την ανίχνευση του ενδοκυτταρικά αντιγόνα, τα κύτταρα διαπερατά με 0,1% Triton Χ-100 (Sigma-Aldrich) σε PBS και χρωματίστηκαν με χρήση αντι-άλφα αρουραίου τουμπουλίνης (YL1 /2, Millipore) και κουνελιού αντι-ERG μονοκλωνικό αντίσωμα (κλώνος EPR 3864? Epitomics, Burlingame, CA). Το αντίσωμα αντι-ERG ήταν ένα γενναιόδωρο δώρο από τον Dr. Mark Rubin (Weill Cornell Medical College, Νέα Υόρκη, Νέα Υόρκη). Όλα τα πρωτεύοντα αντισώματα επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου? δευτερογενή αντισώματα βάφτηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. DAPI χρησιμοποιήθηκε για το DNA αντιχρωματισμός. συσκευές GEDI τοποθετήθηκαν σε καλυπτρίδες με Mowiol και αποθηκεύτηκαν στους -20 ° C πριν από την ανάλυση.

CTC απαρίθμηση

Τυφλωμένος CTC απαρίθμηση ακόλουθη επισήμανση αντισωμάτων διεξήχθη με τη χρήση ενός σάρωσης σημείου Zeiss LSM-700 ομοεστιακό μικροσκόπιο, εξοπλισμένα με 405-, 488-, 555-, και οι γραμμές λέιζερ 632-nm. Όλα PSMA CD45-εμπύρηνα κύτταρα + /προσδιορίστηκαν ως ΚΜΑ. Αρχική επικύρωση της CTC καταμέτρηση πραγματοποιήθηκε από δύο ανεξάρτητους, τυφλωμένοι δοκιμαστές. Θετικοί και αρνητικοί έλεγχοι για την απόδοση του αντισώματος και χρώση συμπεριελήφθησαν σε κάθε πείραμα: κύτταρα U937 ανθρώπινης λευχαιμίας (CD45 + /PSMA- /EpCAM-), και οι καρκινικές κυτταρικές γραμμές ανθρώπινου προστάτη (C4-2 και LNCaP: PSMA + /CD45-/EpCAM + και PC-3 (PSMA- /CD45-/EpCAM dim). Ατομική

z

-stacks αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας 100X /NA 1.46 και 63X /ΔΑ 1,3 Plan-Apo στόχους Zeiss ελέγχεται από Zen λογισμικού (Zeiss) και παρουσιάζονται ως μέγιστη προεξοχές ένταση.

RNA εκχύλιση

Μετά σύλληψης κυττάρων, η συσκευή GEDI ξεπλύθηκε με ροή PBS για 30 λεπτά σε ένα ρυθμό 1 ml /hr. τα κύτταρα λύθηκαν με 700 μΙ ρυθμιστικό RLT λύσης συμπληρωμένο με 1% β-μερκαπτοαιθανόλη σε ένα ρυθμό ροής 15 ml /hr. το λύμα συλλέχθηκε, και το RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας την QiagenRNEasy Micro Plus Kit (Qiagen Inc, Valencia, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

θεραπείες φαρμάκων ex-vivo και Ανάλυση

για

ex vivo πειράματα

θεραπείας από τα ναρκωτικά, το δείγμα αίματος από κάθε ασθενή χωρίστηκε και 1 ml πέταξε σε καθένα από τρεις συσκευές GEDI ταυτοχρόνως. Μετά τη σύλληψη CTC και την επακόλουθη πλύση με PBS, κάθε μικροσυσκευή GEDI απαλά τοποθετήθηκε σε ένα δίσκο καλλιέργειας με RPMI-1640 που περιέχει 2% ορό και συμπληρωμένο με είτε 0.1% DMSO ελέγχου ή πακλιταξέλη σε συγκεντρώσεις 100 ηΜ ή 1 μΜ και επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες. Στο τέλος της θεραπείας, τα κύτταρα GEDI-συλλαμβάνονται μονιμοποιήθηκαν με PHEMO ρυθμιστικό διάλυμα και υποβάλλονται σε επεξεργασία για multiplex συνεστιακή μικροσκοπία εξής ανοσοχρώση με διαφορετική επιφάνεια των κυττάρων και κυτταροπλασματική αντισώματα όπως υποδεικνύεται. Όλα ΚΜΑ (PSMA + /CD45-/DAPI +) αξιολογήθηκαν για την παρουσία των δεσμίδων μικροσωληνίσκων ως απόδειξη της αποτελεσματικής δέσμευσης φαρμάκου-στόχου. Το ποσοστό της ΚΜΑ με ενδείξεις δέσιμο μικροσωληνίσκων υπολογίστηκε. Σε όλα τα δείγματα που αναλύθηκαν, δεματοποίησης ήταν εμφανής από το χαρακτηριστικό του σχήμα, το πλάτος, τον προσανατολισμό και την αυξημένη ένταση φθορισμού δεσμίδων μικροσωληνίσκων σε σύγκριση με μικροσωληνίσκους από μη επεξεργασμένα κύτταρα. Επιπλέον, χρησιμοποιήσαμε DAPI επίχρωση να εκτιμηθεί η παρουσία της μιτωτικής ή αποπτωτικών πυρήνων μετά από φαρμακευτική αγωγή.

Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση έγινε για να συγκρίνουν τις μέσες μετρήσεις CTC που λαμβάνονται από CRPC ασθενείς και υγιείς δωρητές. Χρησιμοποιήσαμε μια μη-παραμετρική (Wilcoxon signed-rank) ανάλυση, καθώς μετράει CTC δεν εμφανίζουν κανονική κατανομή. Η στατιστική σημαντικότητα ορίσθηκε με α = 0,05.

Αποτελέσματα

Για να χαρακτηρισθεί η απόδοση της συσκευής (Σχήμα 1Α), προσδιορίσαμε τα ποσοστά σύλληψης κυττάρων με PSMA-θετικά καρκινικά κύτταρα. Προσδιορίσαμε σύλληψης κυττάρων ως συνάρτηση διαφόρων συγκεντρώσεων mAb J591 (1,5-20 μg /ml) με τη χρήση διατμήσεως μεγέθη στρες αντιπροσωπευτικά εκείνων που βιώνουν οι λειτουργικοποιημένη επιφάνειες της συσκευής (0,08 έως 0,24 Ρα). Αυτά τα πειράματα αποκάλυψαν μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση στην κυτταρική συλλάβει μέχρι συγκέντρωση mAb 10 μg /ml, το οποίο χρησιμοποιήθηκε για όλα τα επόμενα πειράματα (Σχήμα 1Β).

Επισκόπηση της συσκευής (Α) GEDI. Δεξιόστροφα από επάνω αριστερά: σχηματική της ροής του αίματος μέσω της συσκευής, η εικόνα της συσκευής πυριτίου με λάστιχο σιλικόνης, σύστημα ενεργοποιήσεως επιφάνεια. (Β) απόδοση σύλληψης κυττάρων ως συνάρτηση της διατμητικής τάσης και της συγκέντρωσης των αντισωμάτων. Οι καμπύλες τιτλοδότησης για το αντι-PSMA J591 αντίσωμα σε τυποποιημένη γεωμετρία δείχνουν βέλτιστη συγκέντρωση αντισώματος για σύλληψης κυττάρων.

Η

Αν και το αντίσωμα J591 είναι ειδικό για PSMA-εκφράζοντα κύτταρα, μη ειδική προσκόλληση λευκοκυττάρων υπήρξε μείζον πρόβλημα για όλες τις τεχνικές ανοσοσύλληψης με βάση το αίμα. Για να ελαχιστοποιηθεί προσκόλλησης λευκοκυττάρων, πραγματοποιήσαμε μια παραμετρική μελέτη για να χαρακτηρίσει ρυθμό σύγκρουσης (CPR? Σύγκρουση ανά σειρά) ως συνάρτηση του μεγέθους των κυττάρων και εμπόδιο όφσετ. ποσοστά σύγκρουσης από ένα υποσύνολο αυτών των μετατοπίσεων παρουσιάζουν μια απότομη αποκοπή ανάλογα με το μέγεθος των κυττάρων, όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α? ως εκ τούτου, επιλέξαμε ένα εμπόδιο offset (7 μm) που δημιουργεί μια απότομη αποκοπής στη διάμετρο των κυττάρων των 14 μm. Η φυσική περιγράφει αυτή αποκοπής απεικονίζεται καλύτερα από τις κυτταρικές τροχιογραμμές μέγεθος που εξαρτάται (Εικόνα 2Α), τα οποία δείχνουν πόσο μεγάλο κύτταρα επαναλαμβανόμενη εμπειρία σύγκρουσης, ενώ μικρά κύτταρα διαχωρίζονται από τα εμπόδια και να ξεφύγουν από τη σύλληψη. Στη συνέχεια δοκιμάστηκε αυτή την υπόθεση με μέτρηση της σύλληψη LNCaP κυττάρων καρκίνου του προστάτη (Σχήμα 2Β). Σε αυτό το πείραμα, ενισχυμένο κύτταρα LNCaP πέταξαν σε J591-ενεργοποιημένα συσκευές που είχαν 7 μm offset (GEDI)

έναντι

εκείνους που δεν είχαν αντισταθμιστεί (ευθεία). Αν και αυτές οι δύο συσκευές έχουν την ίδια αναλογία εμβαδού επιφανείας προς όγκο, η γεωμετρία GEDI αυξηθεί σημαντικά την αποτελεσματικότητα σύλληψης κυττάρων, όπως μετράται από συλλαμβάνονται και απαριθμεί τα κύτταρα κανονικοποιούνται με τον αριθμό των κυττάρων εισόδου

(Α) Αριστερά:. Top Λόγω της μικρορευστονικής σειρά εμποδίων με σειρά γεωμετρικές παραμέτρους. Δ = εμπόδιο offset. Λ = απόσταση εμπόδιο στην κατεύθυνση της ροής του χύδην. Γ = απόσταση εμπόδιο στην κατεύθυνση κάθετη προς τη ροή χύμα. 2

r

= διάμετρος εμπόδιο. Γραμμές ροής (γκρι) υποδηλώνουν τη ροή του υγρού. Τροχιές (διάφορα χρώματα) υποδηλώνουν τροχιές των κυττάρων διαφορετικών διαμέτρων. απόσταση σειρά εμπόδιο και ο προσανατολισμός παράμετροι ορίζονται επίσης. Δεξιά: Το ποσοστό συγκρούσεων κυτταρικών τοιχωμάτων για κύτταρα που διέρχονται από τη συστοιχία είναι μια ισχυρή συνάρτηση της παραμέτρου όφσετ της συστοιχίας? η μεθοδολογία σχεδιασμού GEDI συνεπάγεται τη χρήση ενός offset παράμετρος που οδηγεί σε μέγεθος που εξαρτάται από τα ποσοστά σύγκρουσης. Τα αποτελέσματα που προβλέπεται για τη ροή διαμέσου της γεωμετρίας στο αριστερό δείχνονται δεξιά από τη συνεχή γραμμή? τα τέσσερα ειδικά μεγέθη κυττάρων να οδηγήσει σε αποτελέσματα που συμβολίζεται από τις τέσσερις χρωματιστές τελείες σε αυτό το γράφημα. Άλλα γεωμετρικά ρυθμίσεις οδηγούν σε διαφορετικά αποτελέσματα, που φαίνεται στα δεξιά στις διακεκομμένες και διακεκομμένες γραμμές. (Β) Ευθεία πίνακες ή πίνακες με μικρές μετατοπίσεις (κουτιά χρυσό) να οδηγήσει σε χαμηλότερη απόδοση σύλληψης (αριστερά) και η ανεξαρτησία του μεγέθους (δεξιά). επιλεγεί προσεκτικά τα αντισταθμιστικά οφέλη (κουτιά ματζέντα) να οδηγήσει σε υψηλά ποσοστά σύλληψης (αριστερά) και την εξάρτηση από το μέγεθος (δεξιά). ποσοστά δέσμευσης στο αριστερό συγκρίνετε GEDI (7-μm offset) και κατ ‘ευθείαν (δεν offset) απόδοση γεωμετρίας, όπως μετράται με τη συλληπτήρια LNCaP σε συσκευές J591-ενεργοποιημένα. Τιμές στα δεξιά περιγράψει προσομοιωμένες τιμές σύγκρουση σε αυτές τις γεωμετρίες. Και τα δύο πειραματικά αποτελέσματα έχουν την ίδια αναλογία εμβαδού επιφανείας προς όγκο. (C) συσκευές με το ίδιο εμβαδόν επιφανείας προς όγκο δώσει πολύ διαφορετικά αποτελέσματα: ευθεία συστοιχίες οδηγήσει σε συγκρούσεις που μειώνουν καθώς το αίμα ταξιδεύει μέσα από τη συσκευή? συστοιχίες GEDI να οδηγήσει σε συγκρούσεις που αυξάνουν με τα ταξίδια μέσω της συσκευής.

Η

Λόγω της εξάρτησης των κυττάρων τροχιάς σε διάμετρο κυττάρων, τα ποσοστά σύγκρουση είναι μια πολύπλοκη λειτουργία και των δύο παραμέτρων διάμετρο των κυττάρων και τη σειρά, όπως τα αντισταθμιστικά οφέλη σειρά . Το ποσοστό σύγκρουσης ανά σειρά (CPR) είναι μια ισχυρή συνάρτηση της σειράς offset, που παρουσιάζουν ασυνέχειες, η εξάρτηση από το μέγεθος και την εκκίνηση ενέργειες που σχετίζονται με το πεπερασμένο μέγεθος του πίνακα (Σχήμα 2C). Η δραματική διαφορά μεταξύ της απόδοσης των διαφορετικών σχεδίων προκαλείται από την εκτροπή των σωματιδίων-in ανεπαρκώς επιλέξει γεωμετρίες, η παραμόρφωση προκαλεί τα κύτταρα να εκτρέψει σε γραμμές ροής που δεν έρχονται σε γειτνίαση με αργότερα εμπόδια, ενώ σε καλά επιλεγμένα γεωμετρίες, οι αιτίες παραμόρφωσης κύτταρα για να εκτρέψουν σε γραμμές ροής που έρχονται σε γειτνίαση με αργότερα εμπόδια. Έτσι ο ρυθμός σύγκρουση αυξάνει καθώς τα κύτταρα να προχωρήσει μέσα από τη συσκευή για το σχεδιασμό GEDI, και μειώνεται για κακή επιλογή σχεδίων, όπως ευθεία συστοιχίες (Σχήμα 2C). Αυτό αποκοπής επιτρέπει στο χρήστη να προσδιορίσει μια αποκοπής μεταξύ hematocytes (& lt? 14 μm) και ο πληθυσμός των κυττάρων που θα βιώσουν τη μέγιστη συγκρούσεις (& gt? 15 μm).

σύλληψης κυττάρων, απεικόνιση, και την καταμέτρηση της ΚΜΑ από μεταστατικό ασθενείς με καρκίνο προστάτη

Στη συνέχεια, θα χρησιμοποιήσει τη συσκευή GEDI να συλλάβει και να χαρακτηρίσει κυκλοφορούντων κυττάρων όγκου (ΚΜΑ) από το αίμα των ασθενών με μεταστατικό CRPC. Ένα ml περιφερικού αίματος είχε πετάξει μέσα από τη συσκευή, συλληφθέντα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν και ανοσοχρώστηκαν για PSMA, CD45, EpCAM και ϋΑΡΙ, και τα συλληφθέντα κύτταρα αναλύθηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία. ΚΜΑ ορίστηκαν ως άθικτα, πυρηνοποιημένα, PSMA + /CD45-κύτταρα. Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα ΚΜΑ και λευκοκυττάρων φαίνεται στο Σχήμα 3Α. Είναι ενδιαφέρον, PSMA + κύτταρα είχαν μεταβλητή EpCAM χρώσης, που κυμαίνονται από εξαιρετικά θετική σε ασθενή με αρνητικό από την άποψη της έντασης EpCAM φθορισμού. Σε μία υποομάδα ασθενών, έχουμε ποσοτικοποιείται το ποσοστό του PSMA-συλλαμβάνονται ΚΜΑ που ήταν EpCAM θετικές. Παρατηρήσαμε ότι 40-70% των GEDI-συλλαμβάνονται ΚΜΑ ήταν θετικά για τους δύο δείκτες, με το μεσαίο είναι 60% (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Έλεγχοι για την απόδοση των αντισωμάτων είχαν περιληφθεί σε κάθε πείραμα χρησιμοποιώντας δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη που εκφράζουν διαφορετικά επίπεδα του PSMA και EpCAM (C4-2: PSMA + /EpCAM + /CD45-και PC3: PSMA- /EpCAM- /CD45-) και το CD45 + κυττάρων λευχαιμίας γραμμή U937 (Σχήμα S1A).

(Α) Αντιπροσωπευτικές εικόνες των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων συλλαμβάνονται με τη συσκευή GEDI από 1 mL αίματος από ασθενείς με καρκίνο του προστάτη. ΚΜΑ Οι απεικονίζεται στη συσκευή και αναγνωρίζεται σύμφωνα με ανοσοχρώση με DAPI, PSMA, CD45, και EpCAM. Τα άθικτα, εμπύρηνων κυττάρων που είναι PSMA + /CD45-προσδιορίζονται ως ΚΜΑ. Τα λευκοκύτταρα προσδιορίζονται ως DAPI + /PSMA- /CD45 + (κάτω σειρά, βέλος). Σημειώστε την ετερογένεια της έκφρασης EpCAM στον κυτταρικό πληθυσμό PSMA + (πάνω και κάτω σειρές, EpCAM-? Μεσαία γραμμή, EpCAM +). μπαρ κλίμακας: 10 μm. (Β) Νόσος ειδικό GEDI σύλληψη της ΚΜΑ. CTC απαρίθμηση (CTCs /ml) πραγματοποιήθηκε με τη χρήση αίματος από υγιείς δότες (διάμεσος = 3) και CRPC ασθενείς (μέση τιμή = 54). (P & lt? .001? Wilcoxon) (C) Σύγκριση της CTC απαρίθμησης μεταξύ GEDI-based- και τη σύλληψη CellSearch®-based. Αυτή η σύγκριση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας την ίδια ημέρα αίμα αντλεί από 25 ατομικές CRPC ασθενείς. * Υποδηλώνει ότι CellSearch που βασίζεται απαρίθμηση εκτελέστηκε 1 εβδομάδα πριν GEDI απαρίθμησης βασίζεται? ∉ υποδεικνύει ίδιο ασθενή του οποίου λήφθηκε αίμα σε δύο διαφορετικές χρονικές στιγμές τριών μηνών (το αίμα Ισοπαλία χωρίς 14ης συνέβη 3 μήνες μετά από το αίμα κλήρωση 19)? # Υποδεικνύει ίδιο ασθενή του οποίου λήφθηκε αίμα σε δύο διαφορετικές χρονικές στιγμές (αντλήσει αίμα δεν 22 συνέβη ένα χρόνια πριν αίματος επιστήσει 23) 1 έτος χώρια.

Η

έχουμε επεξεργαστεί αίματος που λαμβάνεται από 10 υγιείς δότες (έλεγχοι ) και 30 ασθενείς με μεταστατικό CRPC χρήση της συσκευής GEDI. Ο διάμεσος αριθμός των CTCs /ml ανιχνεύθηκε ήταν 3 (εύρος 0 έως 22) και 54 (περιοχή 0 έως 1200), αντίστοιχα (ρ & lt? 0,001? Σχήμα 3Β). Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε μια άμεση σύγκριση της σύλληψης και καταμέτρηση CTC συγκρίνοντας την μικροσυσκευή GEDI με την εγκεκριμένη από την FDA EpCAM-based CellSearch® CTC Τεστ για την ίδια ημέρα αίμα αντλεί από 25 CRPC ασθενείς (Σχήμα 3C). Διαπιστώσαμε μία 2 έως 400-πλάσια αύξηση στον αριθμό των CTCs /ml αναφερθεί με τη GEDI μικροσυσκευή σε σχέση με το CellSearch ® CTC δοκιμής (Σχήμα 3C?

ρ

& lt? 0,0001, που υπολογίζεται με δοκιμή Wilcoxon), και μια ασθενή συσχέτιση (

r

= 0,44? ακραίες τιμές αφαιρεθεί με περιορισμό απόσταση του Cook) μεταξύ μετράει GEDI CTC και CellSearch® (Εικόνα S2)

Μοριακός χαρακτηρισμός των συλληφθέντων κυττάρων: Ανίχνευση ενός ενιαίου. σημειακή μετάλλαξη στον υποδοχέα ανδρογόνων και την έκφραση της σύντηξης TMPRSS2-ERG στο εμβολιασμένο κύτταρα και ΚΜΑ

Για να εκτιμηθεί κατά πόσον θα μπορούσαμε μοριακά χαρακτηρίζουν την GEDI-κατέλαβε ΚΜΑ, πραγματοποιήσαμε απόδειξη της αρχής πειράματα στα οποία τον καρκίνο του προστάτη κύτταρα εμπλουτίστηκαν σε 1 ml αίματος από έναν υγιή δότη, συλλαμβάνονται από την συσκευή και αναλύθηκαν για την παρουσία του υποδοχέα ανδρογόνου (AR) σημειακές μεταλλάξεις ή έκφραση του TMPRSS2: πρωτεΐνη συγχωνεύσεως του γονιδίου ERG. Για την ανίχνευση της T868A (ACT-GCT) μετάλλαξη μοναδικού σημείου στην επικράτεια δέσμευσης συνδέτη AR [19], 50 C4-2 κύτταρα προστέθηκαν σε 1 ml του υγιούς αίματος του δότη πετάξει μέσα από τη συσκευή GEDI, και το RNA εκχυλίζεται με απευθείας λύση στη συσκευή που ακολουθείται από προσδιορισμό της αλληλουχίας cDNA (Εικόνα 4Α). Παράλληλα, ο προσδιορισμός αλληλουχίας διεξήχθη σε RNA που εκχυλίζεται από 1 ml του ίδιου αίματος του δότη σε επεξεργασία παρομοίως (αρνητικός έλεγχος) και σε RNA που εκχυλίζεται από 50 C4-2 κύτταρα (θετικός έλεγχος). Όπως ήταν αναμενόμενο, η μετάλλαξη T868A σαφώς ανιχνεύθηκε στα κύτταρα C4-2 (Σχήμα 4Α, επάνω και μεσαίο πλαίσιο) αλλά απουσιάζει από τον αρνητικό μάρτυρα. Η μετάλλαξη σημείο ανιχνεύθηκε επίσης στο εμβολιασμένο δείγμα αίματος, με το μεταλλαγμένο κορυφής (Α) αντιπροσωπεύει το 70% του νουκλεοτιδίου παρόντες σε αυτή τη θέση και τον άγριου τύπου (Τ) για το 30%. Αυτό το αποτέλεσμα είναι σύμφωνο με το προηγουμένως αναφερόμενο ποσοστό καθαρότητας σύλληψης κυττάρων 68% που λαμβάνεται με σημασμένο με φθορισμό κύτταρα καρκίνου προστάτη εμβολιάζεται εντός 1 ml περιφερικού αίματος από έναν υγιή δότη και πετάξει μέσα από την μικροσυσκευή GEDI [10].

(Α ) Συλλαμβάνονται κύτταρα εμφανίζουν υψηλή καθαρότητα, που επιτρέπει τον προσδιορισμό των μεταλλάξεων ενός σημείου. Το T868A (ACT-GCT? Thr-Ala) AR μονού σημείου μετάλλαξη ανιχνεύεται από RNA που εξάγεται από 50 C4-2 κύτταρα εμπλουτίστηκαν σε 1 ml αίματος υγιών-δότη και συλλαμβάνονται από την συσκευή GEDI (τρίτη γραμμή, βέλος). Αλληλουχίας αποτελέσματα από 1 ml αίματος από το ίδιο υγιή δότη (πάνω σειρά) ή από 50 C4-2 κύτταρα σε καλλιέργεια (μεσαία γραμμή) είναι επίσης απεικονίζονται. (Β) Η TMPRSS2: ERG πρωτεΐνη σύντηξης ανιχνεύεται σε GEDI-κατέλαβε ΚΜΑ από CRPC ασθενή. PSMA-συλλαμβάνονται CTCs βάφτηκαν στη συσκευή με ένα αντίσωμα αντι-ERG. Τα αντιπροσωπευτικά παραδείγματα των τριών PSMA + /CD45-ΚΜΑ φαίνεται, δύο από τις οποίες είναι θετικές για την ERG. Ράβδοι κλίμακας: 10 μm

Η

Επιπλέον, η παρουσία του TMPRSS2:. Πρωτεΐνη σύντηξης ERG μπορούσε να ανιχνευθεί με ανοσοχρώση με αντι-ERG μονοκλωνικού αντισώματος κουνελιού [20] σε σύντηξη-θετικό καρκίνο του προστάτη VCAP κύτταρα συλλαμβάνονται από την συσκευή και αναλύθηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία multiplex (Σχήμα S3). Παρόμοια ανάλυση σε GEDI-συλλαμβάνονται CTCs από CRPC ασθενή αποκάλυψε την παρουσία και των δύο αρνητικών κυττάρων ERG θετικό και ERG, ενώ CD45 + λευκοκύτταρα ήταν αρνητικά για ERG πρωτεΐνης (Εικόνα S3, πάνελ C), υποδεικνύοντας την ειδικότητα της χρώσης ERG για καρκίνο του προστάτη που προέρχονται από κύτταρα

Λειτουργικές δοκιμασίες:. τουμπουλίνης ομαδοποίηση κατά την έκθεση σε ταξάνες

Λόγω της υψηλής καθαρότητας και της βιωσιμότητας των GEDI-κατέλαβε ΚΜΑ, είμαστε δίπλα ελεγχθεί η υπόθεση ότι η CTC χημειοευαισθησία να ταξάνες εξής

ex vivo

θεραπεία για την μικροσυσκευή GEDI θα μπορούσε να προβλέψει την κλινική ανταπόκριση του ασθενούς στη θεραπεία. Οι ταξάνες (πακλιταξέλη, δοκεταξέλη και καμπαζιταξέλη), τα οποία συνήθως χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία ασθενών CRPC [21] – [23] πράξη με τη σταθεροποίηση πολυμερών μικροσωληνίσκων και προκαλώντας το σχηματισμό δεσμίδων μικροσωληνίσκων. Μικτοσωληναρίων είναι εύκολα ανιχνεύσιμες με χρώση ανοσοφθορισμού, λόγω της αυξημένης έντασης φθορισμού τους, ξεχωριστό σχήμα και κυτταροπλασματική οργάνωση, όταν είδαν στο μέγιστο προβολή του σήματος [24]. Μικτοσωληναρίων είναι η πρώτη εκδήλωση που προκαλείται από τη θεραπεία ταξάνη, με αποτέλεσμα την κατάντη μιτωτική σύλληψη και αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, και συνεπώς είναι κατάλληλο δείκτη της αποτελεσματικής εμπλοκής ταξάνη ναρκωτικά στόχο.

Για να καθοριστεί πρώτα η βέλτιστη συγκέντρωση και τη διάρκεια της

ex vivo

on-chip θεραπεία του ασθενούς ΚΜΑ που προέρχεται, εμείς ενισχυμένο 200 C4-2 κυττάρων σε 1 ml αίματος από έναν υγιή δότη, επεξεργασία του δείγματος στη συσκευή GEDI, και στη συνέχεια επωάστηκαν τα συλληφθέντα κύτταρα επί η συσκευή για 24 ώρες σε μέσα που περιέχουν 100 ηΜ ή 1 μΜ δοκεταξέλης (DTX) στους 37 ° C. θεραπεία Docetaxel με 100 ηΜ οδήγησε σε διακριτές δέσμες μικροσωληνίσκων σε συλληφθέντα κύτταρα C4-2 (Σχήμα 5Α, βέλη μεσαίο πλαίσιο), σε αντίθεση με το πρόστιμο και περίπλοκο δίκτυο μικροσωληνίσκων των μη επεξεργασμένων GEDI-συλληφθέντα κύτταρα (Σχήμα 5Α, άνω πάνελ). Η θεραπεία με 1 μΜ DTX οδήγησε σε εύρωστη δεματοποίησης μικροσωληνίσκων και επαγωγή αποπτωτικά γεγονότα (Σχήμα 5Α, κάτω πάνελ αιχμές βελών). Αποπτωτικά γεγονότα προσδιορίστηκαν από την παρουσία των φωτεινών και κατακερματισμένη πυρήνες συνοδεύεται από απώλεια της χρώσης τουμπουλίνης. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με 48 ώρες, on-chip,

ex vivo

θεραπεία (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τα αποτελέσματα αυτά, σε συνδυασμό με το γεγονός ότι η AUC του ορού συγκέντρωσης docetaxel για ασθενείς στους οποίους χορηγήθηκε 55-100 mg /m

2 docetaxel είναι περίπου ίση με 1,5-5 ώρες mg /l [25], μας οδήγησε να επιλέξετε ένα 24 θεραπεία hr με 100 ηΜ ενός ταξανίου (1,92 mg ώρες /l), προκειμένου να αξιολογηθεί η

ex vivo

απόκριση του ασθενούς CTCs προέλευσης.

απόκριση τουμπουλίνης σε θεραπεία ταξάνης μπορεί να εκτιμηθεί GEDI-συλληφθέντα κύτταρα. τα καρκινικά κύτταρα (Α) C4-2 προστάτη εμπλουτίστηκαν στα 200 κύτταρα /ml σε υγιή δότη πλήρες αίμα. Ένα ml αιχμηρών αίμα στη συνέχεια έρεε σε κάθε μία από τρεις συσκευές GEDI. Συλλαμβάνονται κύτταρα επωάστηκαν σε κάθε συσκευή στους 37 ° C για 24 ώρες είτε με έλεγχο DMSO (άνω πάνελ) ή DTX 100 ηΜ (μεσαίο πάνελ) ή 1 μΜ (κάτω πίνακας). Μετά την αγωγή του φαρμάκου, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και επεξεργασία για χρώση ανοσοφθορισμού χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι τουμπουλίνης και CD45. DAPI χρησιμοποιήθηκε ως ΟΝΑ αντιχρώση για την αξιολόγηση της πυρηνικής ακεραιότητα. Σημειώστε το πρόστιμο και περίπλοκο δίκτυο των μικροσωληνίσκων στον έλεγχο DMSO (επάνω πάνελ) και τις ξεχωριστές δέσμες μικροσωληνίσκων στην DTX αντιμετωπίζονται συσκευές (βέλη, μέση και κάτω πάνελ). Αποπτωτικών πυρήνων παρατηρήθηκαν σε υψηλότερες συγκεντρώσεις DTX (κεφαλή βέλους, κάτω πλαίσιο). (Β) GEDI-συλλαμβάνονται CTCs από το αίμα ενός ασθενούς CRPC κατεργάστηκαν

ex vivo

στη συσκευή GEDI με 100 ηΜ DTX (άνω πάνελ) ή την προσθήκη 100 ηΜ ΡΤΧ (κάτω πίνακας) στους 37 ° C για 24 ώρες. Μετά την κατεργασία τα ναρκωτικά τα PSMA-συλληφθέντα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και επεξεργασία για χρώση ανοσοφθορισμού όπως στο (Α) με την προσθήκη κυτοκερατίνη-18, ως εναλλακτική λύση των επιθηλιακών δείκτη. Σε αυτόν τον ασθενή, η παρουσία ενός αδιατάρακτου δικτύου μικροσωληνίσκων μετά από αγωγή DTX (άνω πάνελ) δείχνει την έλλειψη αποτελεσματικών δέσμευσης φαρμάκου-στόχου. Σε αντίθεση, η προσθήκη του ΡΤΧ οδήγησε σε δεματοποίησης μικροσωληνίσκων (κάτω πίνακας).

Η

Ένας αριθμός δοκιμασιών έχουν διεξαχθεί για να δείξει το δυναμικό για λειτουργική δοκιμασία στη συσκευή που περιγράφεται. Σε αυτές τις περιπτώσεις τα κύτταρα σταματούν στη συσκευή υποβλήθηκαν σε επεξεργασία

ex vivo

με DTX ή /και ΡΤΧ για 24 ώρες (Σχήματα 5Β και S3). Αυτά τονίζουν την ικανότητα να εκτελούν λειτουργικές δοκιμασίες στην τεχνολογία chip και ποσοτικός προσδιορισμός των ναρκωτικών-στόχο εμπλοκή σε ασθενείς στο πλαίσιο της κλινικής ανταπόκρισης τους. Μη ανταπόκριση, όπως υποδεικνύεται από την έλλειψη αποδεικτικών στοιχείων των μικροσωληνίσκων δεματοποίησης ή αποπτωτικών πυρήνων μετά από

ex vivo

θεραπεία DTX, θα μπορούσε να παρατηρηθεί σε ορισμένους ασθενείς. Σχήμα S4C δείχνει έναν ασθενή που ήταν μη-απόκρισης από την δοκιμασία μικροσωληνίσκων, συνεπή με την έλλειψη αυτού του ασθενούς της κλινικής ανταπόκρισης με τη χρήση καθιερωμένων κριτηρίων RECIST και PSAWG2. Αυτή η απόκριση συχνά ήταν ετερογενής εντός του πληθυσμού κυττάρου σταματούν? Σύκο.