Abstract

Τα στοιχεία παρουσιάζονται για την πυρηνική παρουσία ενός λειτουργικού ετερομερές σύμπλοκο του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), Src και το Signal Transducer και ενεργοποιητής της μεταγραφής (Stat) 3 πρωτεΐνες σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Stat3 παραμένει πυρηνικό και συνδέονται με Src ή EGFR, αντίστοιχα, από την knockdown siRNA του EGFR ή Src, καταδεικνύοντας την αντίσταση του συγκροτήματος προς την διαμόρφωση του EGFR ή Src μόνο. Σημαντικά, χρωματίνη ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) αναλύσεις αποκαλύπτουν το πυρηνικό EGFR, Src και σύνθετο Stat3 είναι συνδεδεμένο με τον υποκινητή c-Myc. Η knockdown siRNA του EGFR ή Src, ή τη φαρμακολογική αναστολή της δραστηριότητας Stat3 μόνο οριακά κατέστειλε την έκφραση c-Myc. Αντίθετα, η ταυτόχρονη διαμόρφωση του Stat3 και EGFR, ή Stat3 και Src, ή EGFR και Src κατέστειλε έντονα την έκφραση c-myc, αποδεικνύοντας ότι το νέο πυρηνικό ετερομερές σύμπλοκο ρυθμίζει περίπλοκα το γονίδιο c-Myc. Η επικράτηση του μεταγραφικά λειτουργικών EGFR, Src, και Stat3 πυρηνικό συγκρότημα παρέχει ένα πρόσθετο και νέο μηχανισμό για την υποστήριξη του παγκρεατικού φαινότυπο καρκίνου και εξηγεί εν μέρει την έλλειψη ευαισθησίας των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων στην αναστολή του EGFR, Src ή Stat3 μόνο. ​​

Παράθεση: Jaganathan S, Yue P, Paladino DC, Μπογκντάνοβιτς J, Χούο Q, Turkson J (2011) Μια λειτουργική Πυρηνική υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού Factor, Src και Stat3 ετερομερείς Complex σε κύτταρα καρκίνου του παγκρέατος. PLoS ONE 6 (5): e19605. doi: 10.1371 /journal.pone.0019605

Επιμέλεια: Marcelo Γ Bonini, Πανεπιστήμιο του Ιλινόις στο Σικάγο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 30 Νοεμβρίου του 2010? Αποδεκτές: 12η Απριλίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 5 Μαΐου 2011

Copyright: © 2011 Jaganathan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το National Cancer Institute Επιχορηγήσεις CA106439 (JT) και CA128865 (JT), Φλόριντα Τμήμα Ιδρύματος Υγείας Bankhead-Coley (Γέφυρα Grant) (HQ), μερική υποστήριξη από το World Gold Council (GROW Program) (HQ), και η εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας Overseas Βραβείο Νέου ερευνητή (20828006) (HQ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή οι

Πολλές ενδοκυτταρικές βιοχημικές διεργασίες που προκλήθηκε από τη συναρμολόγηση των πρωτεϊνών σε μακρομοριακές συγκροτήματα. Η σχέση μεταξύ των πρωτεϊνών ή των πρωτεϊνών με άλλες μοριακές οντότητες διαμορφώνει διαμόρφωση πρωτεΐνης, παρέχοντας ένα μέσο για τη ρύθμιση της μυριάδες των βιοχημικών διαδικασιών που χρησιμεύουν για την αποτελεσματική διαχείριση ζωτικών βιολογικές αποκρίσεις. δυναμική των πρωτεϊνών και της εμπορίας ανθρώπων, και τη σταθερότητα της πρωτεΐνης είναι επίσης διαδικασίες που μπορεί να ρυθμιστεί με τη σύνδεση των πρωτεϊνών με άλλους. Με την ευρύτερη έννοια, μεταξύ των μοριακών ενώσεων επιτρέπουν ειδικότητας πρωτεΐνες, όπως οι υποδοχείς, προσαρμογείς, ένζυμα και παράγοντες μεταγραφής για να διαμορφώσουν διαφορετικά ενδοκυττάρια γεγονότα, δημιουργώντας έτσι την ποικιλομορφία σε φυσιολογικές αντιδράσεις και την προώθηση της εξάρτησης από το πλαίσιο.

Κατά τη διάρκεια της επαγωγή της μεταγωγής σήματος, υπάρχει συναρμολόγηση των διαφορετικών πρωτεϊνών, καθένα από τα οποία έχει συγκεκριμένες λειτουργίες σημαντική για την μεταγωγή σήματος και τη συνοδευτική βιολογική απόκριση. Ο υποδοχέας παραδοσιακή επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) μονοπατιού μεταγωγής σήματος περιλαμβάνει την ενεργοποίηση του ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης κινάσης (ΜΕΚ) -mitogen-ενεργοποιημένης πρωτεΐνης κινάσης /εξωκυτταρικό σήμα ρυθμιζόμενη κινάση (Erk

ΜΑΡΚ) και προωθεί μιτογόνες ανταποκρίσεις [ ,,,0],1], [2]. Η επαγωγή EGFR προάγει επίσης την ενεργοποίηση του αισθητηρίου σήματος και ενεργοποιητής μεταγραφής (STAT) οικογένεια πρωτεϊνών, οι οποίες έχουν ομοίως έναν κεντρικό ρόλο στην προκαλούμενη από EGF βιολογικές αποκρίσεις [1]. Οι πρωτεΐνες STAT είναι λανθάνουσα κυτταροπλασματικές παράγοντες μεταγραφής που ενεργοποιούνται σε απόκριση σε κυτταρική διέγερση από κυτοκίνες και αυξητικούς παράγοντες [3] μέσω της φωσφορυλίωσης ενός υπολείμματος τυροσίνης κρίσιμης (Tyr705 για Stat3). Η φωσφορυλίωση τυροσίνης του STATs διαμεσολαβείται από τις κινάσες τυροσίνης των υποδοχέων αυξητικών παραγόντων και με κυτταροπλασματικές κινάσες τυροσίνης, όπως Src και Janus κινάση (Jaks) οικογένειες. Ενεργοποιημένος STATs ως διμερή στον πυρήνα προσδένονται στα στοιχεία ειδικής απόκρισης DNA στους υποκινητές των γονιδίων-στόχων για την επαγωγή μεταγραφής του γονιδίου. Ο μηχανισμός πυρηνική μετατόπιση για δΤΑΤδ αποτέλεσε το αντικείμενο της πρόσφατης έντονης έρευνας. Stat3 πυρηνική μετατόπιση έχει αναφερθεί ότι διαμεσολαβείται από την αναγνώριση και την μεταφορά με importin-α και ο Ran-ΟΤΡάσης [4], και με μηχανισμούς που περιλαμβάνουν τη συνοδό με MgcRacGAP [5], υποδοχέα EGF ενδοκυττάρωση [6], και με μεμβράνη που σχετίζονται πλάσματος των λιπιδίων σχεδίες εμπορίας ανθρώπων [7].

η επικράτηση πολλών υπερκινητικά μονοπάτια μεταγωγής σήματος που υποστηρίζουν το φαινότυπο του καρκίνου είναι μια μεγάλη πρόκληση για την θεραπεία. Πέρα από την κλασική τρόπος προώθησης crosstalks μεταξύ πολλαπλές οδούς σηματοδότησης, συνελεύσεις μακρο-μοριακών πρωτεΐνη παρέχουν πρόσθετη μοναδική μηχανισμούς για την πρόκληση γεγονότα που θα στηρίξει την κακοήθη φαινότυπο. Μια τέτοια μη παραδοσιακών μηχανισμός σηματοδότησης έχει καθοριστεί για το EGFR, το οποίο έχει ανιχνευθεί στον πυρήνα του κυττάρου και παρατηρήθηκε ότι λειτουργεί ως παράγοντας μεταγραφής [8], [9]. Μελέτες αποκάλυψαν περαιτέρω τα σύμπλοκα πυρηνικών EGFR με Stat3 σε κύτταρα καρκίνου του μαστού, και αυτό το σύμπλοκο διεγείρει συγκεκριμένα γονίδια, συμπεριλαμβανομένου του διεγέρσιμης συνθάσης νιτρικού οξειδίου (iNOS) [10]. Η πρόσθετη λειτουργία EGFR θα επιδείνωνε τον ρόλο της ως μιτογόνο και έναν υποκινητή της επιβίωσης των κυττάρων, τα οποία όλα ευνοούν τον καρκίνο. Συναφώς, η ταυτόχρονη ανώμαλη ενεργοποίηση του EGFR και κατάντη μεσολαβητών σήματος, συμπεριλαμβανομένων των Src και Stat3, οι οποίες εμφανίζονται με υψηλή συχνότητα σε ανθρώπινους καρκίνους αντικατοπτρίζει μια συνολική πολυπλοκότητα σηματοδότησης που υποστηρίζει το φαινότυπο του καρκίνου. Για παράδειγμα, με αναφορά στο καρκίνο του παγκρέατος, ανώμαλη ενεργοποίηση του EGFR εμφανίζεται σε 30-50% των περιπτώσεων [11], με ενεργοποιημένη c-Src σημειώνεται σε περισσότερο από το 70% των περιπτώσεων, και συχνά συνοδεύει EGFR υπερέκφραση [12], ενώ παρεκκλίνουσα ενεργοποίηση Stat3 είναι επίσης εξαιρετικά διαδεδομένη [13], [14], [15]. Σημαντικά, πρόσφατη έκθεση μας ότι ο καρκίνος του παγκρέατος είναι πιο ευαίσθητο στην ταυτόχρονη αναστολή της παρεκκλίνουσας Stat3 και EGFR ή Src [16] δείχνει την χρησιμοποίηση του πολλαπλές οδούς παρεκκλίνουσα σηματοδότηση για τη διατήρηση του φαινοτύπου του καρκίνου και πώς αυτό επηρεάζει την ανταπόκριση στη θεραπεία. Να επεκτείνει προηγούμενες μελέτες μας [16], επιδιώξαμε να εξετάσει τη μοριακή και λειτουργική αλληλεπίδραση μεταξύ των Stat3, EGFR και Src και των υποκείμενων μηχανισμών στήριξης του φαινοτύπου του καρκίνου του παγκρέατος. Εμείς εδώ παρέχουν μαρτυρία για μία λειτουργική πυρηνική ετερομερή EGFR, Src και Stat3 συγκρότημα σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, η οποία προάγει την επαγωγή του γονιδίου c-Myc. Η έκθεσή μας είναι η πρώτη για τον εντοπισμό ενός πυρηνικού EGFR, Src και Stat3 ετερομερές σύμπλοκο που προωθεί την επαγωγή του γονιδίου c-Myc. Η κατανόηση της δυναμικής του EGFR, Src και Stat3 μοριακές αλληλεπιδράσεις σε καρκίνο του παγκρέατος θα παρέχει βάση για το σχεδιασμό νέων αποτελεσματικών πολλαπλών στοχευμένη θεραπεία προσεγγίσεις για τον καρκίνο του παγκρέατος.

Υλικά και Μέθοδοι

Κύτταρα και Αντιδραστήρια

Το ανθρώπινο καρκίνο του παγκρέατος, Panc-1 και Colo-357 γραμμές όλα έχουν περιγραφεί προηγουμένως [16], [17]. Η απαθανάτισε ανθρώπινη παγκρεατικού πόρου επιθηλιακών κυττάρων (HPDEC) γραμμή ήταν ένα είδος δώρο του Dr. Τσάο, OCI, UHN-PMH, Τορόντο) [18]. HPDEC αναπτύχθηκαν σε κερατινοκύτταρα SFM μέσα συμπληρωμένα με 0,2 ng EGF, 30 μg /mL εκχύλισμα υπόφυσης βοοειδούς και περιέχουν antimycol. Όλα τα άλλα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε Dulbecco τροποποιημένο μέσο Eagle (DMEM) που περιέχει 5% βόειου ορού μόσχου συμπληρωμένου με σίδηρο και 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη.

Σύνθεση πεπτιδίων

Το πεπτίδιο τομέα Stat3 SH2 αναστολέα (SPI), FISKERERAILSTKPPGTFLLRFSESSK, το πεπτίδιο EGFR μοτίβα, pY1068EGFR (pY1068), PEpYINQS και η pY1086EGFR (pY1086), PVpYHNQP αγοράστηκαν από Peptide 2.0 (Fairfax, VA) σε & gt? καθαρότητα 95%

Πυρηνική. απόσπασμα προετοιμασία και Gel Αναλύσεις Shift

προετοιμασία Πυρηνική εκχύλισμα από κύτταρα διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17].

Υπο-κυτταρική κλασματοποίηση, και SDS-PAGE /Western Blot ανάλυση

ανάλυση Western blotting πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19], [20] για λύματα ολόκληρων κυττάρων, και σε κλάσματα κυτοσολίου και της μεμβράνης, και σε πυρηνικά εκχυλίσματα. Υπο-κυτταρικά κλάσματα παρασκευάστηκαν σύμφωνα τυπικό πρωτόκολλο. Εν συντομία, τα κύτταρα πλύθηκαν χρησιμοποιώντας PBS, επαναιωρήθηκαν και λύθηκαν σε ρυθμιστικό χαμηλού άλατος (20 mM HEPES (ρΗ 7,9), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 20 mM NaF, 1 mM Na

3νο

4, 1 mM Na

4P

2O

7, 1 mM διθειοθρεϊτόλη, 1 mM TLA, 0.5 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο και 0,5% Nonidet Ρ-40), και φυγοκεντρήθηκαν (13,000 χ

g

, 4 ° C, 30 s) για να ληφθεί το κυτοσολικό κλάσμα. Το σφαιρίδιο πλύθηκε τρεις φορές με ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS), επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα μεγάλης περιεκτικότητος άλατος (420 mM NaCl, 20 mM HEPES (ρΗ 7,9), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 20% γλυκερόλη, 20 mM NaF, 1 mM Na

3νο

4, 1 mM Να

4P

2O

7, 1 mM διθειοθρεϊτόλη, 1 mM TLA και 0.5 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο), επωάστηκαν στους 4 ° C για 30 λεπτά , με λίκνισμα, και φυγοκεντρήθηκε σε (13.000 χ

g

, 4 ° C, 30 λεπτά) για να ληφθεί το πυρηνικό κλάσμα (υπερκείμενο). Το ίζημα που λαμβάνεται πλένεται τρεις φορές με PBS, επαναιωρήθηκαν σε RIPA ρυθμιστικό λύσης (50 mM Tris (ρΗ 7,4), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Nonidet Ρ-40, 0.1% SDS, 1 mM TLA και 0,5 mM φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο), επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 4 ° C με ανακίνηση, και φυγοκεντρήθηκε (13.000 xg, 4 ° C, 20 min). Το υπερκείμενο συλλέχθηκε ως κλάσμα μεμβράνης. Πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιούνται είναι κατά pY845EGFR (Upstate Biotech, Millipore, Billerica, ΜΑ), pY705Stat3, Stat3, pY1068EGFR, pY1086EGFR, pY1173EGFR, EGFR, pY416Src, Src, και β-ακτίνης (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ), και Tata- δεσμευτική πρωτεΐνη (TBP) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Τα πεπτίδια κλείδωμα αγοράστηκαν από τις αντίστοιχες εταιρείες.

Μικρές-παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) Επιμόλυνση

αλληλουχίες siRNA για EGFR και Src παραγγέλθηκαν από Dharmacon RNAi Technologies, Thermo Scientific (Lafayette, CO) . Ακολουθίες που χρησιμοποιούνται είναι: EGFR νοηματικού κλώνου, 5′-GAAGGAAACUGAAUUCAAAUU-3 ‘? EGFR αντιπληροφοριακό κλώνο, 5’-pUUUGAAUUCAGUUUCCUUCUU-3 ‘? ελέγχου siRNA νοηματικού κλώνου, 5’-AGUAAUACAACGGUAAAGAUU-3 ‘? και τον έλεγχο siRNA αντινόημα κλώνου, 5’-pUCUUUACCGUUGUAUUACUUU-3 ‘. Το αντιδραστήριο c-Src SMARTpool siRNA (NM-005417, Catalog # Μ-003175-01-05) χρησιμοποιήθηκε για Src. Η επιμόλυνση σε κύτταρα διεξήχθη χρησιμοποιώντας 20 ηΜ siRNA EGFR ή 25 ηΜ siRNA Src και 8 μΙ λιποφεκταμίνη RNAiMAX (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) σε μέσο καλλιέργειας ΟΡΤΙ-ΜΕΜ (GIBCO, Invitrogen Corporation).

ανοσοκατακρήμνισης (ΙΡ), και Διαδοχική Ανοσοκαταβύθιση μελέτες

Αυτές οι μελέτες διεξήχθησαν όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [21] χρησιμοποιώντας λύματα ολόκληρων κυττάρων ή πυρηνικά εκχυλίσματα (250 μg ολικής πρωτεΐνης) και 5 μί αντι-EGFR ή αντι-Src πολυκλωνικό αντίσωμα ή το μονοκλωνικό αντι-Stat3 αντίσωμα (Cell Signaling Technology). Για ειδικότητα, ανάλυση ανοσοκηλίδωσης με τη χρήση αντι-ΕΟΡΚ, αντι-Src και αντι-Stat3 αντισώματος πραγματοποιήθηκε με την παρουσία του αντίστοιχου πεπτιδίου δέσμευσης. Διαδοχική μελέτες IP διεξήχθησαν σύμφωνα με δημοσιευμένες διαδικασίες [10] με μερικές τροποποιήσεις ως εξής: πυρηνικά εκχυλίσματα, που παρασκευάστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21], υποβλήθηκαν σε μία παρόμοια ανοσοκαταβύθιση σε σχέση με το πρώτο πρωτεύον αντίσωμα, αντι-ΕΟΡΚ αντίσωμα (κυτταρική σηματοδότηση ) ή IgG (Santa Cruz) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Το ανοσοσύμπλεγμα στη συνέχεια σφαιροποιήθηκε με σφαιρίδια αγαρόζης πρωτεΐνης 20 μί A /G (Santa Cruz), πλύθηκαν τρεις φορές χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό έκπλυσης Α (0.1% SDS, 1% Triton Χ-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, ρΗ 8.0 ), και στη συνέχεια δύο φορές με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης Β (0.1% SDS, 1% Triton Χ-100, 2 mM EDTA, 500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, ρΗ 8,0). Στη συνέχεια, οι πρωτεΐνες εκλούστηκαν με πρόσφατα παρασκευασμένο ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης (1% SDS, 100 mM NaHCO

3) και υποβλήθηκε σε δεύτερο ανοσοκαταβύθιση με επώαση με αντι-Src αντίσωμα ή IgG (Santa Cruz). Τα σύμπλοκα στη συνέχεια καθιζάνει, πλένεται, εκλούεται με ρυθμιστικό lamelli και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και κηλίδωση Western ανάλυση σχολαστικά για Stat3.

ανοσοχρώση με λέιζερ σάρωσης συνεστιακή απεικόνιση

κύτταρα Panc-1 αναπτύσσονται σε καλυπτρίδες σε πλάκες 12-φρεατίων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς αναστολείς για 1 ή 24 ώρες και υποβλήθηκαν σε ανοσοχρώση και ο φθορισμός ή λέιζερ σάρωσης ομοεστιακό μικροσκόπιο, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 15 λεπτά, πλύθηκαν τρεις φορές με PBS, κατέστησαν διαπερατά με 0,25% Triton Χ-100 για 10 λεπτά, και πλύθηκαν τρεις φορές με PBS. Τα δείγματα στη συνέχεια δεσμεύθηκαν σε 0.1% BSA σε PBST για 30 λεπτά και επωάστηκε όλη τη νύκτα στους 4 ° C με μονοκλωνικό αρουραίου αντι-EGFR (Santa Cruz), μονοκλωνικό ποντικού αντι-Src (Cell Signaling) και πολυκλωνικό κουνελιού αντι-Stat3 (Cell Signaling ) αντισώματα σε αραίωση 1:50 (σε 0,1% BSA). Ακολούθως, τα κύτταρα ξεπλύθηκαν τρεις φορές σε PBST, επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι με 1:1000 αραιώσεις των τριών AlexFluor δευτερογενή αντισώματα, ALexaFLuor405 (αιγός), AlexaFluor488 (γαϊδάρου αντι-κουνελιού) και AlexaFluor546 (αντι κατσίκας -αρουραίου) (Molecular Probes, Invitrogen) για EGFR, Src και ανίχνευση Stat3, αντιστοίχως. Δείγματα στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις με PBST. Στη συνέχεια, καλυπτρίδες αφαιρέθηκαν και τοποθετήθηκαν σε πλακίδια με τη χρήση Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL) και εμποδίζεται η ξήρανση με τη σφράγιση των άκρων με το χρώμα των νυχιών. Τα πλακίδια φυλάχθηκαν στο σκοτάδι στους 4 ° C μέχρι συλλήφθηκαν εικόνων. Για αρνητική χρώση, δευτερογενή αντισώματα προστέθηκαν χωρίς τα πρωτογενή αντισώματα. Συνεστιακή ανάλυση πραγματοποιήθηκε από την εξέταση των διαφανειών στο πλαίσιο Leica TCS SP5 ομοεστιακό μικροσκόπιο (Γερμανία) σε κατάλληλα μήκη κύματος. Εικόνες συνελήφθησαν και επεξεργασία χρησιμοποιώντας το λογισμικό Leica TCS SP 5.

χρωματίνης Ανοσοκαθίζηση (μάρκας) και Διαδοχική αναλύσεις ChIP

Για την δοκιμασία ChIP, κύτταρα σε καλλιέργεια υποβλήθηκαν σε θεραπεία με φορμαλδεΰδη σε τελική συγκέντρωση 1%, για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου που ακολουθείται από επεξεργασία με γλυκίνη σε μια τελική συγκέντρωση των 0.125 Μ για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου για εγκάρσια σύνδεση. Ακολούθως, τα κύτταρα πλύθηκαν με παγωμένο PBS και επαναιωρήθηκαν σε και λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (20 mM HEPES, ρΗ 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaF, 1 mM Na

3νο

4, 1 mM Na

4P

2O

7, 1 mM διθειοθρεϊτόλη), 1Χ TLA, 1 mM φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο, 5% Nonidet Ρ-40, και φυγοκεντρήθηκε. Στη συνέχεια, η πυρηνική ίζημα επαναιωρήθηκε σε πυρήνες ρυθμιστικού λύσης (50 mM Tris-HCl, ρΗ 8.0, 10 mM EDTA, 1% SDS και αναστολείς πρωτεάσης) (Roche, Indianapolis, ΙΝ). Τα πυρηνικά λύματα σε υπερήχους (Omni International, Kennesaw, GA) σε 30% ισχύ για 3 παλμούς για διαστήματα 10 δευτερολέπτων σε πάγο για να κουρέψει DNA. Το διάλυμα χρωματίνη προ-εκκαθαρίστηκε με σφαιρίδια αγαρόζης πρωτεΐνης Α /G (Santa Cruz) για 1 ώρα στους 4 ° C με ανακίνηση. Στη συνέχεια, οι προ-διαυγασμένα λύματα ανοσοκαταβυθίστηκαν με επώαση με αντι-ΕΟΡΚ, αντι-Src, ή αντι-Stat3 αντισώματα ή με IgG (χωρίς αντίσωμα) (Santa Cruz) στους 4 ° C όλη τη νύκτα με ανακίνηση. Τα σύμπλοκα συνελέγησαν με σφαιρίδια αγαρόζης πρωτεΐνης 20 μί A /G (Santa Cruz), πλύθηκαν τρεις φορές χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό έκπλυσης Α (0.1% SDS, 1% Triton Χ-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, ρΗ 8.0) και δύο φορές με ρυθμιστικό πλύσης Β (0.1% SDS, 1% Triton Χ-100, 2 mM EDTA, 500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, ρΗ 8,0). Στη συνέχεια, τα σύμπλοκα εκλούστηκαν με πρόσφατα παρασκευασμένο ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης (1% SDS, 100 mM NaHCO

3). Cross-συνδέσεις αντιστράφηκαν με θέρμανση στους 65 ° C υπό την παρουσία NaCl ακολουθούμενη από επεξεργασία με πρωτεϊνάση Κ (20 μΙ ενός 20 mg /ml) για 6 ώρες. Το DNA ανακτήθηκε και καθαρίστηκε με χρήση κιτ καθαρισμού DNA από Qiagen (Valencia, CA). Το καθαρισμένο χρωματίνη ανοσοκαταβυθισμένο ΟΝΑ δίπλα χρησιμοποιήθηκε ως εκμαγείο για την ενίσχυση αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) του υποκινητή c-Myc χρησιμοποιώντας τους εκκινητές, Προώθηση, 5’AAAAGGGGAAAGAGGACCTGG-3 ‘, και Reverse, 5′-TAAAAGGGGCAAGTGGAGAGC-3′ ή ο υποκινητής TWIST χρησιμοποιώντας τους εκκινητές, Forward, 5’-AGTCTCCTCCGACCGCTTCCTG -3 ‘

Αντίστροφη:. 5′-CTCCGTGCAGGCGGAAAGTTTGG -3′ (Invitrogen). Τα προϊόντα PCR, 133 bp για c-myc και τα 332-bp για TWIST [22] αναλύθηκαν σε 2% πηκτή αγαρόζης. Οι διαδοχικές μελέτες ChIP πραγματοποιήθηκαν όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [10] και ακολουθώντας τις διαδοχικές μελέτες ανοσοκαταβύθισης περιγράφεται, χρησιμοποιώντας το πρώτο πρωτεύον αντίσωμα (anti-EGFR) και το δεύτερο πρωτεύον αντίσωμα (αντι-Src). Τα ανακτηθέντα σύμπλοκα μετά τη δευτερογενή ανοσοκαταβύθιση εκλούστηκαν με ρυθμιστικό έκλουσης και στη συνέχεια υποβάλλεται σε δοκιμασία τσιπ, όπως περιγράφεται.

Gel χρωματογραφία διήθησης

Ο προσυσκευασμένα Superdex 200 στήλη γυαλιού 10/30 GL αγοράστηκε από την GE Healthcare Life Sciences (Piscataway, NJ). Το σύστημα χρωματογραφίας που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη ήταν το Duoflow Σύστημα BioLogic (Bio-Rad, Hercules, CA). Η ανάλυση χρωματογραφίας εκτελέσθηκε ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή με μια γενική ακολουθία διεκπεραίωσης της εξισορρόπησης, φορτίου, έκλουση, αναγέννηση και την αποθήκευση. RIPA ρυθμιστικού (50 mM Tris, ρΗ 7,4, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0.1% SDS, 1% Nonidet Ρ-40) χρησιμοποιήθηκε ως το ρυθμιστικό κινητής φάσης. Δείγματα (Panc-1 κυτταρόλυμα, ολικής πρωτεΐνης 2 mg σε έναν όγκο 250 μΙ) φορτώθηκαν εις την στήλη, τότε η ταχύτητα ροής ρυθμίστηκε σε 0,25 ml /min, και στη συνέχεια, κλάσμα (500 μΙ) συλλογή ξεκίνησε αμέσως μετά το δείγμα φόρτωσης και παρακολουθείται από την απορρόφηση μέσον έκλουσης στα 280 nm. Σύμφωνα με τις κορυφές απορρόφησης, τα κλάσματα 21-34 επελέγησαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση ανοσοκηλίδωσης χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι EGFR, Stat3 και Src (Cell Signaling), και έναντι RNA ελικάσης A (RHA) (Abcam, Cambridge, ΜΑ). Για δοκιμασία ανοσοκαταβύθισης, 100 μΐ το καθένα από τα κλάσματα 23-27 συνενώθηκαν, από το οποίο ανοσοσύμπλεγμα EGFR καταβυθίστηκε χρησιμοποιώντας αντι-EGFR αντίσωμα (Cell Signaling) και υποβλήθηκε σε ανοσοκηλιδώσεως ανάλυσης για Stat3, Src και EGFR.

Παρασκευή αντι-EGFR και ποντικού IgG1-ΑΕΠ ανιχνευτές

τα νανοσωματίδια χρυσού (ΑΕΠ), 0,1 nM, με διάμετρο 40 nm αγοράστηκαν από την Ted Pella Inc. (Redding, CA). Mouse μονοκλωνικό αντι-EGFR [F4] αντίσωμα αγοράστηκε από Abcam (αρ. Κατ. Ab62, συμπ. 1.2 mg /ml), και μη-ειδικού μονοκλωνικού IgG1 ποντικού αγοράστηκε από τη Sigma (αρ. Κατ. M9629, συγκ. 1 mg /ml). Πολυκλωνικά αντι-Stat3 (συμπ. 0.2 mg /ml), πολυκλωνικά αντι-Src (0,1 mg /ml), πολυκλωνικά αντι-EGFR (0,2 mg /ml) και μη-ειδικής IgG κουνελιού (0,4 mg /ml) αγοράστηκαν από την Santa Cruz. Όλα τα άλλα χημικά και τα συστατικά ρυθμιστικού για την ανάπτυξη δοκιμασία αγοράστηκαν από την Sigma. Ο ανιχνευτής αντι-EGFR-ΑΕΠ παρασκευάστηκε με προσθήκη 10 μΐ μονοκλωνικού αντι-EGFR αντίσωμα σε 1 ml ΑΕΠ. Μετά από επώαση για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, ο ανιχνευτής μπλοκαρίστηκε με 2,5 mg BSA για 30 λεπτά. Μετά τη φυγοκέντρηση στις 10.000 rpm για 5 λεπτά, το υπερκείμενο απορρίφθηκε και το υπόλειμμα νανοσωματιδίων είχε επαναδιασπείρονται σε 0.5 ml από 0.25% BSA σε 10 mM φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (ΡΒ). Ο ανιχνευτής χρησιμοποιήθηκε έπειτα στη δοκιμασία. Ο αρνητικός ποντικός ελέγχου IgG1-ΑΕΠ ανιχνευτής παρασκευάστηκε με την προσθήκη 10 μΙ IgG1 μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού σε 1 ml ΑΕΠ, και ακολουθώντας την διαδικασία όμοια με εκείνη που χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή ανιχνευτή EGFR. Mouse IgG1 χρησιμοποιήθηκε εδώ για την παρασκευή του ανιχνευτή ελέγχου, επειδή το αντι-EGFR μονοκλωνικό αντίσωμα είναι ένα αντίσωμα ποντικού τύπου IgG1.

Ανίχνευση και κινητικής πρόσδεσης μελέτη του EGFR από πυρηνικό εκχύλισμα με τους ανιχνευτές ΑΕΠ

Το δείγμα πυρηνικό εκχύλισμα Panc-1 αραιώθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (ΡΒ) σε 1 mg /ml ολικής πρωτεΐνης. Σε ένα κύτταρο δείγματος για Δυναμικής Σκέδασης Φωτός (DLS) μέτρησης (Hellma κυψελίδα QS 3 mm), 20 μΙ του ιχνηλάτη αντι-EGFR-ΑΕΠ αναμίχθηκε με 2 μΙ του δείγματος, και η αύξηση του μεγέθους των σωματιδίων μετρήθηκε με ένα όργανο DLS (σύστημα Zetasizer Nano ZS90 DLS, Malvern Instruments Ltd, England) σε ακριβώς 1, 6, 11, 16, και 30 λεπτά μετά την ανάμιξη. Το ίδιο πείραμα εκτελέστηκε επίσης με τη χρήση του ανιχνευτή ποντικού IgG1-ΑΕΠ. Για να επιβεβαιωθεί η ειδικότητα του ανιχνευτή αντι-ΕΟΡΚ-ΑΕΠ στην ανίχνευση του EGFR από πυρηνικού εκχυλίσματος, ένα πείραμα αναστολής διεξήχθη με κατεργασία 5 μΐ του δείγματος με 1 μΙ μονοκλωνικού αντι-ΕΟΡΚ αντίσωμα σε θερμοκρασία δωματίου για 7 λεπτά και 24 λεπτά πριν από τη χρήση του δείγματος στην δοκιμασία. Μετά από αυτή την επώαση, 20 μΙ του ιχνηλάτη αντι-EGFR-ΑΕΠ αναμίχθηκε με 2 μΙ του δείγματος υποβάλλεται σε θεραπεία, και το μέγεθος των σωματιδίων μετρήθηκε στα 1, 6 και 11 λεπτά μετά την ανάμιξη.

σύμπλοκο σύνδεσης Protein μελέτη εταίρος χρησιμοποιώντας πολυκλωνικό αντίσωμα

σε ένα σωλήνα μικροφυγοκέντρησης 1.5 ml, 80 μΙ του ιχνηλάτη αντι-EGFRGNP αναμίχθηκε με 8 μΙ του δείγματος. Μετά από επώαση για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, αυτό το διάλυμα διαιρέθηκε σε τέσσερα τμήματα 20 μλ. Μετά τη μεταφορά εντός του κυττάρου του δείγματος, το μέγεθος των σωματιδίων του καθενός από αυτά τα τμήματα διαβάστηκε με ένα όργανο DLS. Μετά από αυτή την ανάγνωση, το διάλυμα εμβολιάζεται με πολυκλωνικό αντίσωμα: είτε με 1 μΐ αντι-Stat3 ή 2 μΙ αντι-Src ή 1 μΐ αντι-EGFR ή 0,5 μΙ IgG κουνελιού. Η αύξηση του μεγέθους των σωματιδίων μετρήθηκε σε ακριβώς 5 λεπτά και 10 λεπτά μετά την έναρξη της πρώτης ανάγνωσης.

Dynamic Light Scattering (DLS) μετρήσεων

Οι μετρήσεις DLS όλων των διαλυμάτων δείγματος διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα Zetasizer Nano ZS90 DLS είναι εξοπλισμένα με ένα κόκκινο (633 nm) με λέιζερ και έναν ανιχνευτή Avalanche φωτοδίοδο (APD) (κβαντική απόδοση & gt? 50% στα 633 nm) (Malvern Instruments Ltd). DTS εφαρμογές 5.10 λογισμικό χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των δεδομένων. Το μέσο μέγεθος σωματιδίων (Ζ-μέσος όρος) του διαλύματος ελήφθη χρησιμοποιώντας Cumulant μέθοδο. Για κάθε δείγμα, δέκα DLS μετρήσεις διεξήχθησαν με μία κίνηση, και κάθε τρέξιμο διήρκεσε για 10 δευτερόλεπτα. Όλες οι μετρήσεις έγιναν σε γωνία 90 ° ανίχνευσης.

Αποτελέσματα

Ανίχνευση των πυρηνικών EGFR, Src και Stat3 heterocomplex

Σας ζητείται να διερευνηθεί η σηματοδότηση πολύπλοκη συναρμολόγηση και τη δυναμική των αλληλεπιδράσεων του υπερκινητικά Stat3, EGFR και Src [14], [16], [23], στο πλαίσιο του φαινοτύπου ανθρώπινου παγκρεατικού καρκίνου. Συν-ανοσοκαταβύθιση (συν-ΙΡ) με ανάλυση ανοσοστύπωσης δείχνει, EGFR ανοσοσύμπλεγμα από Panc-1 ή Colo-357 ολικών κυττάρων προϊόντα λύσης περιέχονται τόσο Src και Stat3 (Εικ. 1Α (θ)), Src ανοσοσύμπλεγμα περιέχονται τόσο EGFR και Stat3 (Εικ . 1Α (ii)), ενώ Stat3 ανοσοκατακρήμνισμα περιέχονται EGFR και Src (Εικ. 1Α (iii)). Για ειδικότητα, η μη-ειδική IgG κουνελιού στην ανοσοκαταβύθιση και ανοσοστύπωση ανάλυσης για Src, Stat3 ή EGFR δεν έδειξαν ανιχνεύσιμη πρωτεΐνη (Εικ. 1Α, IgG, και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), και η ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως εκτελούνται επί του ανοσοποιητικού καθιζάνει με την παρουσία των αντίστοιχων μπλοκαρίσματος πεπτίδια (ΒΡ) έδειξε μία πλήρη ή σχεδόν πλήρη μπλοκ του ανοσοποιητικού ανίχνευση του Stat3, Src ή EGFR, σε σύγκριση με τα επίπεδα που ανιχνεύθηκαν στην απουσία των μπλοκαρίσματος πεπτιδίων (Σχήμα 1Β (ί) -. (iii), συγκρίνουν + BP, κάτω πάνελ για – BP, άνω πάνελ). Προσδιορίσαμε την επίδραση της siRNA knockdown του EGFR ή Src επί του σχηματισμού του συμπλόκου. Συν-ανοσοκατακρήμνιση με μελέτες ανοσοστύπωμα ολικού-κυττάρου προϊόντων λύσης από κύτταρα Panc-1 έδειξε ότι όταν Ο EGFR knockdown με siRNA (Σχ.1 Γ (i), άνω ζώνη), Src ανοσοσύμπλεγμα παραμένει συνδεδεμένη με Stat3 (Εικ. 1 C (i), IP: Src), και αντίστροφα (Σχήμα 1C (i.), IP: Stat3). Ομοίως, όταν Src είναι νοκ ντάουν με siRNA (Εικ. 1Γ (ii), άνω ζώνη), ανοσοσύμπλεγμα EGFR παραμένει συνδεδεμένη με Stat3 (Σχήμα 1C (ii), IP:. EGFR)., Και αντίστροφα (Σχήμα 1C (ii) , IP: Stat3). Κωδικοποιημένα (con) siRNA δεν έχει κανένα αποτέλεσμα. Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι σε σχέση με το EGFR, Src και Stat3 ετερομερές σύμπλοκο, Stat3 πρωτεΐνες παραμένει συνδεδεμένη με Src ή EGFR, αντίστοιχα, από την knockdown siRNA του EGFR ή Src.

ανοσοαποτύπωσης αναλύσεις immunecomplexes του EGFR (ΙΡ : EGFR), Src (IP: Src), και Stat3 (IP: Stat3), ή της μη ειδικής IgG μη ανοσοκαθιζάνουν παρασκευάστηκε από λύματα ολόκληρων κυττάρων του Panc-1 ή Colo-357 κύτταρα μη επιμολυσμένα (Α και Β) ή επιμολυσμένα με EGFR siRNA, Src siRNA, ή ελέγχου (con) siRNA (C) και σχολαστικά για Src, Stat3 και EGFR απουσία (Α και C) ή παρουσία (Β) του Stat3 πεπτιδίου αποκλεισμού (Stat3 ΒΡ), Src πεπτίδιο μπλοκαρίσματος (Src BP) ή EGFR πεπτίδιο κλείδωμα (EGFR BP). Οι ζώνες που αντιστοιχούν σε πρωτεΐνες στη γέλη δείξει? εισόδου: εκτός όπου υποδεικνύεται, αντιπροσωπεύει την ανοσοστύπωση για την αντίστοιχη πρωτεΐνη ανοσοκαταβυθίστηκε στην ίδια ποσότητα του προϊόντος λύσης που χρησιμοποιείται στη δοκιμασία? Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά 3 ανεξάρτητων μελετών.

Η

Ζητήσαμε από το ζήτημα αν η παρατηρούμενη EGFR, Src και Stat3 ετερομερές σύμπλοκο ήταν παρούσα στον πυρήνα. Συν-ανοσοκατακρήμνιση με ανάλυση ανοσοστύπωσης των πυρηνικών εκχυλισμάτων δείχνει ότι EGFR ανοσοσύμπλεγμα περιέχονται τόσο Stat3 και Src (Σχήμα 2Α (i), IP:. EGFR), Src ανοσοσύμπλεγμα περιέχονται τόσο Stat3 και EGFR (Εικόνα 2Α (ii), IP:. Src) , ενώ Stat3 ανοσοσύμπλεγμα περιέχονται τόσο EGFR και Src (Σχήμα 2Α (iii), IP:. Stat3). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν την παρουσία του EGFR, Src και Stat3 ετερομερές σύμπλοκο στον πυρήνα. Για εξειδίκευση των ανοσοαντιδραστήρια, οι μη-ειδικές IgG κουνελιού δείγματα pull-down που παρομοίως ανοσοστυπώθηκαν δεν έδειξαν ανιχνεύσιμη EGFR, Src ή Stat3 (Σχ. 2Α, IgG και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ανάλυση ανοσοκηλίδωσης σχολαστικά για την Tata δέσμευσης πρωτεΐνης (ΤΒΡ) επιβεβαίωσε ότι τα εκχυλίσματα που χρησιμοποιούνται σε αυτές τις μελέτες είναι πυρηνικής προέλευσης (Σχ. 2Α (iv)). Το ετερομερές σύμπλοκο ελέγχθηκε με διεξαγωγή διαδοχική ανάλυση ανοσοκαταβύθισης, όπου EGFR ανοσοσύμπλεγμα (IP: EGFR) υποβλήθηκε περαιτέρω σε μία δευτερεύουσα ανοσοκαθίζηση χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-Src (IP: EGFR /IP: Src) και, στη συνέχεια, ανοσοστυπώθηκαν για EGFR και Stat3. Τα αποτελέσματα αυτών των μελετών έδειξαν την παρουσία του EGFR και Stat3 στα διαδοχική ανοσοϊζήματα (Σχήμα 2Β, IP:. EGFR /IP: Src). Αντίθετα, IgG pull-down που υποβλήθηκε σε ανοσοκηλίδωση για EGFR ή Stat3 δεν έδειξαν ανιχνεύσιμα επίπεδα (Σχ. 2Β, IgG), επιβεβαιώνοντας περαιτέρω την εξειδίκευση των ανοσοαντιδραστήρια χρησιμοποιούνται.

αναλύσεις (Α και Β) Ανοσοκηλίδωση της immunecomplexes του EGFR (IP: EGFR), Src (IP: Src), Stat3 (IP: Stat3), EGFR /Src (IP: EGFR /IP: Src), ή της μη-ειδικής IgG μη immuneprecpitate παρασκευάζεται από πυρηνικά εκχυλίσματα του Panc-1 ή Colo-357 κύτταρα και ανίχνευση για Stat3, EGFR, Src, ή την πρωτεΐνη Tata δέσμευσης (ΤΒΡ)? και (Γ), ανάλυση ανοσοκηλίδωσης μεμβράνης (ΜΕΜ) και κυτοσολική (κυτταροπροστατευτικές) κλάσματα και πυρηνικών (Nuc) εκχυλίσματα από κύτταρα Panc-1 σχολαστικά για (i) EGFR, (ii) Stat3 και (iii) Src. Οι ζώνες που αντιστοιχούν σε πρωτεΐνες στη γέλη δείξει? εισόδου: εκτός όπου υποδεικνύεται, αντιπροσωπεύει την ανοσοκηλίδωση για το αντίστοιχο ανοσοκαταβυθίζονται πρωτεΐνη στην ίδια ποσότητα του πυρηνικού εκχυλίσματος που χρησιμοποιείται στη δοκιμασία? IP: EGFR /IP: Src, διαδοχική ανοσοκαταβύθιση με αντι-ΕΟΡΚ και στη συνέχεια αντι-Src αντίσωμα? Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά 3 ανεξάρτητων μελετών.

Η

Η παρουσία του EGFR, Src και Stat3 συγκρότημα στον πυρήνα των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος ερευνήθηκε περαιτέρω με την υποβολή προετοιμασίες πυρηνικό εκχύλισμα από την ανάλυση χρωματογραφία στήλης διήθησης γέλης (Superdex200 , όριο αποκλεισμού 200 kD), όπως περιγράφεται στο «Υλικά και Μέθοδοι», σε συνδυασμό με ανάλυση ανοσοστύπωσης. Τα συλλεγέντα κλάσματα, η οποία έδειξε κορυφή απορρόφησης στα 280 nm (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται) έχουν ανοσοιχνηθετούνται. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η πρωτεΐνη EGFR εμφανίζεται για πρώτη φορά στο κλάσμα 23 και είναι παρόν μαζί με Stat3 και Src, και οι τρεις πρωτεΐνες ταυτόχρονα ανιχνεύθηκε στα κλάσματα 23-29 (Εικ. S1 Α). Τα αποτελέσματα έδειξαν επίσης ανιχνεύσιμη πρωτεΐνες Stat3 και Src στα κλάσματα 30 έως 32 και μετά EGFR εκλούσθηκε εντελώς (Εικ. S1 Α). Ανάλυση του προηγουμένως αναφερθεί πρωτεΐνη EGFR εταίρος, RNA ελικάση Α (RHA) [24] έδειξε επίσης ανιχνεύσιμα επίπεδα που ήταν κατά κύριο λόγο στα κλάσματα 23 και 24 (Σχ. S1A, RHA). Αυτά τα κλάσματα περαιτέρω υποβλήθηκαν σε ανάλυση συνανοσοκαθίζησης για την επικύρωση της παρουσίας του συμπλόκου. Ανάλυση ανοσοκηλίδωσης του EGFR ανοσοσύμπλεγμα που παρασκευάζονται από τα ενοποιημένα κλάσματα 23-27 έδειξαν περαιτέρω την παρουσία της Src και Stat3 (Εικ. S1B). Η πρώιμη και η ταυτόχρονη έκλουση του EGFR, Src και Stat3 εγείρουν την πιθανότητα ότι κάθε μία από τις πρωτεΐνες είναι μέρος ενός υψηλότερου συμπλόκου πρωτεΐνης μοριακού βάρους, και επίσης ότι οι τρεις πρωτεΐνες συνεργάτης ως μέρος του ίδιου συγκροτήματος, όπως προτείνεται από το ανοσοσύμπλεγμα σχηματισμό . Υπήρξε μια προηγούμενη έκθεση σχετικά με EGFR συγκρότημα πυρηνικών /Stat3 υπό συνθήκες κυτταρικής διέγερσης από το ΕΤΠ [10]. Ως εκ τούτου, ερευνήθηκε κατά πόσον η πυρηνική EGFR, Src, Stat3 συγκρότημα ήταν παρούσα ιδιοσυστατικώς (χωρίς διέγερση συνδετήρα) σε κύτταρα όγκου. Ανάλυση ανοσοκηλίδωσης δεν ανίχνευσε καμία αξιόλογη επίπεδα Stat3 ή Src σε ανοσοσύμπλεγμα EGFR ή του Src ή EGFR σε Stat3 ανοσοΐζημα από τα πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάζονται από ανθρώπινο καρκίνο του μαστού, MDA-MB-231 και το ανθρώπινο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, γραμμές Α549 (Εικ. S1c), υποδηλώνοντας μία ελάχιστη πιθανότητα ύπαρξης ενός συστατικού πυρηνικής EGFR, Src, Stat3 συγκρότημα στους δύο τύπους καρκινικών κυττάρων. Αυτές οι μελέτες δείχνουν μαζί για πρώτη φορά ότι EGFR, Src και Stat3 σχηματίζουν ένα ετερομερές σύμπλοκο στον πυρήνα των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων.

Με δεδομένη την ανίχνευση του EGFR, Src και Stat3 συγκρότημα στο ολικού κυττάρου και πυρηνική λύματα , ήμασταν ενδιαφέρονται για να καθορίσει τα σχετικά επίπεδα και τα μεγέθη του EGFR, Src και Stat3 στα διάφορα υπο-κυτταρικά κλάσματα. Μεμβράνη και κυτοσολικά κλάσματα, και πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν από Panc-1 κύτταρα σύμφωνα με καθιερωμένα πρωτόκολλα και η οποία συνεπαγόταν τη χρήση 10% Nonidet Ρ-40 λύσης, και ένα χαμηλής περιεκτικότητας σε αλάτι HEPES εκχύλιση ρυθμιστικό για κυτοσολικό εκχύλισμα, ένα υψηλής περιεκτικότητας σε αλάτι HEPES εκχύλιση ρυθμιστικού για πυρηνικά εκχυλίσματα (18, 22), και 0,5% SDS ρυθμιστικό διάλυμα για το κλάσμα μεμβράνης. Ανάλυση ανοσοκηλίδωσης των δειγμάτων της ίσης ολικής πρωτεΐνης από τα υπο-κυτταρικά κλάσματα δείχνει ότι σε σχέση με κάθε της πρωτεΐνης EGFR, Src, ή Stat3, το μέγεθος είναι το ίδιο στη μεμβράνη (ΜΕΜ), κυτοσολικό (Cyto), ή πυρηνικό κλάσμα (Nuc) (Σχ. 2C). Τα αποτελέσματα δείχνουν επίσης ότι το επίπεδο της συνολικής πρωτείνης EGFR είναι υψηλότερα στην μεμβράνη, και είναι υψηλότερη στο κυτοσολικό κλάσμα σε σχέση με το πυρηνικό εκχύλισμα (Εικ. 2C (θ)). Αντιθέτως, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα επίπεδα Stat3 είναι υψηλότερα στο κυτοσολικό κλάσμα, και υψηλότερη στο πυρηνικό εκχύλισμα, σε σύγκριση με τα επίπεδα που σχετίζονται με την κυτταρική μεμβράνη (Εικ. 2C (ii)). Τα αποτελέσματα για Src επίσης έδειξαν αξιοσημείωτες διαφορές, με τα επίπεδα που συνδέονται με μεμβράνες υψηλότερο τόσο κυτοσολικό και πυρηνικά επίπεδα, τα οποία ήταν σχεδόν όμοια (Εικ. 2C (iii)).