, τα οργανίδια και κυτταρόπλασμα διαχωρίζεται στα αυτοφαγοσώματα και πέψη για τη διατήρηση της κυτταρικής ομοιόστασης. Υποθέσαμε ότι κατά τη διάρκεια autophagy επάγεται σε καρκινικά κύτταρα με i) ασιτία μέσω στέρηση ορού και αμινοξέων ή ii) αγωγή με ΡΙ-103, ένα κλάσης Ι ΡΙ3Κ αναστολέα /mTOR, γλυκολυτικά μεταβολισμός θα επηρεαστεί, μειώνοντας ροή σε γαλακτικό, και ότι αυτή η αποτέλεσμα μπορεί να είναι αναστρέψιμη. Εμείς ερωτάται μεταβολισμό κατά τη διάρκεια της αυτοφαγία στην παχέος ΗΤ29 και κύτταρα knock-out HCT116 Bax χρησιμοποιώντας υπερπολωμένα

φασματοσκοπία 13C-μαγνητικού συντονισμού (MRS) και σταθερής κατάστασης

1-MRS. 24 hr PI103-θεραπεία ή πείνα προκάλεσε σημαντική μείωση στην φαινόμενη σταθερά προς τα εμπρός ρυθμού (k

PL) για πυροσταφυλικού προς γαλακτικό ανταλλαγή σύγκριση με τους ελέγχους σε ΗΤ29 (100 μΜ ΡΙ-103: 82%, ρ = 0.05) και HCT116 Βαχ -ko κύτταρα (10 μΜ PI-103: 53%, p = 0,05? 20 μΜ PI-103: 42%, p & lt? 0,0001? πείνα: 52%, p & lt? 0.001), σχετίζεται με μειωμένη έκκριση του γαλακτικού οξέος και ενδοκυτταρική γαλακτικό σε όλα περιπτώσεις, και αμετάβλητη γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH) δραστηριότητα και αυξημένη αναλογία + /NADH NAD μετά από θεραπεία PI103 ή μειωμένη δραστηριότητα LDH και αμετάβλητο ποσοστό + /NADH NAD μετά από την πείνα. Μετά από 48 ανάρρωση ώρες από την επεξεργασία PI103, k

PL παρέμειναν κάτω από τα επίπεδα ελέγχου σε κύτταρα ΗΤ29 (74%, ρ = 0,02), και αυξάνεται πάνω τιμές αντιμετωπίζονται, αλλά παρέμεινε κάτω από τα επίπεδα ελέγχου υπό αγωγή με όχημα 24 ώρες σε HCT116 Βαχ-ko κύτταρα (65%, ρ = 0,004) και οι δύο συνοδεύτηκαν από παρατεταμένη μείωση στην απέκκριση γαλακτικό, ανάκτηση του NAD + λόγου /NADH και ενδοκυτταρική γαλακτικό. Μετά την ανάκτηση από την πείνα, k

PL ήταν σημαντικά υψηλότερη από 24 ώρες ελέγχους υπό αγωγή με όχημα (140%, ρ = 0,05), που συνδέονται με την αυξημένη δραστηριότητα LDH και ολικό κυτταρικό NAD (H). Αλλαγές σε k

PL και των κυτταρικών και εκκρίνεται γαλακτικό παρέχονται μετρήσιμα δείκτες των κύριων μεταβολικών διεργασιών που συνοδεύουν starvation- και τα ναρκωτικά που προκαλείται από αυτοφαγία. Οι αλλαγές είναι αναστρέψιμες, επιστρέφοντας προς και υπερβαίνουν τις τιμές ελέγχου για την κυτταρική ανάκαμψη, η οποία ενδεχομένως να προσδιορίζει την αντίσταση. k

PL (υπερπολωμένα

13C-MRS) και γαλακτικού (

1-MRS) παρέχουν χρήσιμες βιοδείκτες για τη διαδικασία αυτοφαγικά, επιτρέποντας μη επεμβατική παρακολούθηση της επίδρασης Warburg

Αιτιολογική αναφορά.: Lin G, Andrejeva G, Wong Te Fong AC, Λόφος DK, Orton MR, Parkes HG, et al. (2014) Μειωμένη Warburg Επίδραση στον Καρκίνο κύτταρα που υφίστανται Autophagy: σταθερή κατάσταση

1-MRS και Real-Time Υπερπολωμένα

13C-MRS Σπουδών. PLoS ONE 9 (3): e92645. doi: 10.1371 /journal.pone.0092645

Συντάκτης: Stephanie Filleur, Texas Tech University Κέντρο Επιστημών Υγείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 27, Ιουνίου του 2013? Αποδεκτές: 25, Φεβρουαρίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 25 Μαρτίου 2014

Copyright: © 2014 Lin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς αναγνωρίζει την ενίσχυση που έλαβε από το Cancer Research UK και Κέντρο EPSRC απεικόνισης καρκίνου σε συνεργασία με το MRC και το Υπουργείο Υγείας (Αγγλία) χορηγούν C1060 /A10334, επίσης NHS χρηματοδότηση του Κέντρου NIHR Ιατροβιολογικών Ερευνών, MRC-χρηματοδοτείται studentship, επίσης Chang Gung Ιατρική Ίδρυμα (Ταϊβάν) χορηγεί CMRPG370443 και CMRPG3B1922. Η MOL είναι μια NIHR ανώτερος ερευνητής. Οι συγγραφείς επίσης να ευχαριστήσω Alice Warley στο Κολέγιο Κέντρο του Λονδίνου του Βασιλιά για Υπερδομική Imaging (CUI) για βοήθεια σχετικά με το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου.

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η αυτοφαγία είναι ένα λυσόσωμα εξαρτώμενη αναστρέψιμη καταβολικές κυτταρική απόκριση ενεργοποιείται στην πείνα ή στρες σύμφωνα με την οποία οι πρωτεΐνες, τα οργανίδια και κυτταρόπλασμα απορροφάται μέσα σε διπλά-μεμβράνη αυτοφαγοσώματα και στη συνέχεια πέψη και ανακύκλωση για διατήρηση του κυτταρικού μεταβολισμού [1]. Αυτοφαγία είναι κρίσιμη για τη διατήρηση της κυτταρικής ομοιόστασης και είναι μια εξαιρετικά οργανωμένη διαδικασία που μπορεί να αναπληρωθούν τα εξαντλημένα αποθέματα ενέργειας κατά τη διάρκεια του λιμού από την αφαίρεση και την υποβάθμιση των κυτταροπλασματικών συστατικών. Ωστόσο, η παρατεταμένη ενεργοποίηση αυτοφαγικά οδών μπορεί να οδηγήσει στην εξάντληση των οργανιδίων και κρίσιμες πρωτεΐνες οι οποίες μπορεί να οδηγήσουν σε κυτταρικό θάνατο [2], [3]. Autophagy έχει ερευνηθεί σε πολλά πεδία έρευνας, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου [2] – [4], καρδιαγγειακής νόσου [5] και νευροεκφυλισμό [6], αφού από τη μια πλευρά παρέχει μια βιολογική μηχανισμό προστασίας σε απόκριση σε κυτταρικό στρες αλλά από την άλλη μπορεί επίσης να συμβάλει στην κυτταρική μηχανισμούς θάνατο. Αυτή η διαδικασία θα μπορούσε να επιτρέψει παραδόξως καρκινικά κύτταρα να επιβιώσουν σε εχθρικά περιβάλλοντα και ανάκτησης μόλις η πίεση αφαιρείται, παρέχοντας ένα δυναμικό μηχανισμό αντοχής στη θεραπεία [4]. Ορισμένες αντικαρκινικές θεραπείες, όπως οι αναστολείς της ΡΙ3Κ /mTOR, είναι γνωστό ότι επάγουν αυτοφαγία στα καρκινικά κύτταρα [7] και μπορεί επίσης να επάγει αυτοφαγία σε όγκους, πιθανώς παράταση της επιβίωσης του όγκου [4], [8]. Επί του παρόντος, autophagy καλύτερα αξιολογείται από την παρατήρηση του διπλού μεμβράνης αυτοφαγικά κενοτόπια με ηλεκτρονική μικροσκοπία (ΕΜ) και κηλίδωση Western της μετατροπής της ουβικιτίνης-πρωτεΐνης LC3I να LC3II [9]. Δεν υπάρχουν μη επεμβατικές μεθόδους για να παρακολουθούν την επαγωγή της αυτοφαγία ή επακόλουθη ανάκαμψη από αυτοφαγία. Επιπλέον, οι μεταβολικές αλλαγές που συνοδεύουν την αυτοφαγία και ανάκαμψη από τη διαδικασία αυτή είναι ελάχιστα κατανοητές.

Τα καρκινικά κύτταρα συχνά παρουσιάζουν αυξημένη αερόβια γλυκόλυση, επίσης γνωστό ως αποτέλεσμα Warburg, με αυξημένη μεταγραφική ρύθμιση ενός αριθμού γλυκολυτικών ενζύμων συμπεριλαμβανομένων γαλακτικής αφυδρογονάσης -Α (LDH-Α). Αυξημένη δράση Warburg έχει αποδειχθεί ότι οδηγεί τόσο την ανάπτυξη του όγκου και την εξάπλωση των μεταστάσεων και σχετίζεται με κακή έκβαση στον καρκίνο [10]. Αυτοφαγία περιλαμβάνει πολλές σημαντικές μεταβολικές διαδικασίες, μερικά από τα οποία ρυθμίζονται από μονοπάτια ογκογόνο σηματοδότηση. Υπάρχει σημαντική αλληλεπίδραση μεταξύ αυτοφαγικά σημείων ελέγχου και των βασικών κόμβων σε μονοπάτια ογκογόνο σηματοδότηση, που οδηγούν στην οδό αναστολείς, σε ορισμένες περιπτώσεις, επηρεάζουν άμεσα τη αυτοφαγικά διαδικασία, είτε έμμεσα διαμορφώνοντας τις ίδιες μεταβολικές οδούς που προκαλείται από αυτοφαγία [11], [12]. Για παράδειγμα, η αναστολή της mTORC1 είναι μια βασική κινητήρια δύναμη της επαγωγής της αυτοφαγία στα καρκινικά κύτταρα [11], [12]. Cellular στρες που προκύπτουν από έλλειψη των αμινοξέων ή άμεση αναστολή ΡΙ3Κ θα μπορούσε να προκαλέσει autophagy μέσω αναστολής της mTORC1 με τις δύο αυτές διεργασίες που προκαλούν μεταβολικές επιδράσεις πέραν εκείνων που προκύπτουν άμεσα από αυτοφαγία. Αυτές οι καταστάσεις θα μπορούσαν επίσης να προκύψουν κατά τη διάρκεια της θεραπείας του καρκίνου σε ασθενείς.

Απεικόνιση Μαγνητικού Συντονισμού (MRI) χρησιμοποιείται ευρέως για την απεικόνιση στην ιατρική και MR φασματοσκοπία (MRS) παρέχει χημικά ειδική ανάλυση των συγκεντρώσεων μεταβολίτη σε εκχυλίσματα κυττάρων, ολόκληρων κυττάρων , βιοψίες ιστού και

in vivo

[13]. Οι πρόσφατες εξελίξεις στην υπερπολωμένα

φασματοσκοπία 13C-μαγνητικά (MRS) απασχολώντας Δυναμική Πυρηνική Πόλωση (DNP) επέτρεψαν σημαντική βελτίωση της εγγενούς

σήμα 13C-MRS από πολλές τάξεις μεγέθους σε μια σειρά μεταβολιτών και επέτρεψε πραγματικές -Time μετρήσεις της κινητικής της μια σειρά σημαντικών αντιδράσεων ενδογενούς ενζύμου τόσο

in vitro

σε εναιωρήματα βιώσιμων ακέραια κύτταρα και

in vivo

σε όγκους [14]. Η φαινόμενη σταθερά συναλλαγματική ισοτιμία του υπερπολωμένα [1-

13C] πυροσταφυλικού σε γαλακτικό (k

PL) παρέχει ένα δυναμικό μεταβολικό βιοδείκτη για τη διάγνωση [15], καθώς και για την αξιολόγηση της ανταπόκρισης στη θεραπεία [16] – [20]. k

PL έχει επίσης αποδειχθεί ότι μειώνει εξής προκαλούμενη από φάρμακο κυτταρικό θάνατο, που αποδίδεται στην απόπτωση με την ενεργοποίηση του πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) και εξάντληση των συμπαραγόντων δινουκλεοτιδίου νικοτιναμιδίου-αδενίνης (NAD (H)) [14 ].

Ο κύκλος TCA αναμένεται να γίνουν πιο δραστήριοι κατά τη διάρκεια αυτοφαγία, όπως τα αμινοξέα και τα λιπαρά οξέα που παράγονται από τη διαδικασία αυτοφαγικά που χρησιμοποιείται για τη διατήρηση της ομοιόστασης ενέργειας [21], που οδηγεί σε διαμόρφωση των αερόβια γλυκόλυση σε αυτοφαγικά κύτταρα. Υποθέσαμε ότι αυτές οι αλλαγές θα οδηγήσουν σε μείωση της ροής από πυροσταφυλικού σε γαλακτικό, η οποία θα μπορούσε να αντιστραφεί εάν τα κύτταρα ανακτώνται από αυτοφαγία. Σε αυτή τη μελέτη, μετρήθηκε η φαινομενική [1-

13C] πυροσταφυλικού σε γαλακτικό συναλλαγματική ισοτιμία, k

PL, από DNP και

13C-MRS, προκειμένου να αναπτυχθεί μια μη επεμβατική βιοδείκτη της με τα ναρκωτικά που προκαλείται από αυτοφαγία και την επακόλουθη ανάκαμψη από αυτοφαγία, και να αποκτήσουν περαιτέρω γνώσεις σχετικά με τις μεταβολικές αλλαγές που συνοδεύουν το φάρμακο που προκαλείται από αυτοφαγία. Ερευνήσαμε τις διαμήκεις μεταβολικές αλλαγές που σχετίζονται με τα ναρκωτικά που προκαλείται από αυτοφαγία και την ανάκτηση και σύγκριση τους με τις μεταβολικές αλλαγές που σχετίζονται με το καθιερωμένο μοντέλο της αυτοφαγία, την επαγωγή από την πείνα. Χρησιμοποιήσαμε δύο κυτταρικές σειρές, ΗΤ29 και Bax-ανεπαρκή καρκίνωμα κόλου HCT116 (HCT116 Bax-ko) [22], σε αυτές τις μελέτες. κύτταρα HCT116 Bax-ko έχουν μειωμένη οδούς απόπτωσης επιτρέπει την αξιολόγηση των μεταβολικών αλλαγών που συνδέονται με την επαγόμενη από φάρμακα αυτοφαγία απουσία απόπτωσης. Autophagy προκλήθηκε σε αυτά τα κύτταρα είτε με ορό και πείνα αμινοξέων με ισορροπημένο αλατούχο διάλυμα Hanks (HBSS) μέσα, ή με επεξεργασία με PI-103, ένα κλάσης Ι ΡΙ3Κ αναστολέα /mTOR [7].

μας μελέτη επιβεβαίωσε υποθέσεις μας, που δείχνει ότι τα κύτταρα υφίστανται αυτοφαγία είχε μειωθεί k

PL μετράται με DNP και

13C-MRS, μαζί με μειωμένη ενδοκυτταρική γαλακτικό και γαλακτικό απέκκριση μετράται με

1-MRS, αντικατοπτρίζοντας μια μειωμένη επίδραση Warburg κατά τη διάρκεια starvation- και τα ναρκωτικά που προκαλείται αυτοφαγικά κυτταρικές διεργασίες. Αυτές οι σημαντικές μεταβολικές επιδράσεις αντιστρέφεται όταν τα κύτταρα ανακτήσει από starvation- και τα ναρκωτικά που προκαλείται από αυτοφαγία, παρέχοντας ένα δυναμικό μέσο ταυτοποίησης αντίστασης. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι μετρήσεις του k

PL με υπερπολωμένο

13C-MRS, καθώς επίσης και γαλακτικό από

1 Η-MRS παρέχουν ευαίσθητη βιοδείκτες από τις μεταβολικές επιδράσεις που σχετίζονται με starvation- και προκαλούμενη από φάρμακο autophagy μαζί με αποκατάστασης, παρέχοντας κρίσιμες πληροφορίες για μια σημαντική πτυχή του μεταβολισμού των καρκινικών κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων

Όλα τα μέσα και τα αντιδραστήρια για την καλλιέργεια κυττάρων αγοράστηκαν από την Life Technologies . ΗΤ29 κύτταρα (από την American Type Culture Collection, ATCC) καλλιεργήθηκαν σε μέσο McCoy 5Α με γλουταμίνη και HEPES. HCT116 Bax-ko κύτταρα (ένα είδος δώρο από τον Dr. Bert Vogelstein, Johns Hopkins Medical Center, USA? Μέσω δρ Paul Clarke, ICR, Sutton, Ηνωμένο Βασίλειο [23]) καλλιεργήθηκαν σε Μέσο Eagle Τροποποιημένο Μεσαίο με γλουταμίνη, και μη απαραίτητα αμινοξέα. 10% θερμικά απενεργοποιημένο FCS με 100 U /mL πενικιλλίνη και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη προστέθηκαν σε κάθε μέσο. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5%

2 ατμόσφαιρα CO και μέσα ανάπτυξης αναπληρώνονται κάθε 48 ώρες. ΗΤ29 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 μΜ PI-103 για 24 ώρες. κύτταρα HCT116 Bax-ko υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μέσο HBSS επί 6 ή 24 ώρες και με 10 μΜ ή 20 μΜ ΡΙ-103 για 24 ώρες.

Για την κυτταρική και μεταβολική ανάλυση των κυττάρων που ανακτώνται από αυτοφαγία, 24 ώρες HBSS ή 20 μΜ ΡΙ-103-κατεργασμένα κύτταρα HCT116 Bax-ko και 100 μΜ ΡΙ-103-κατεργασμένα κύτταρα ΗΤ29 διατηρήθηκαν για περαιτέρω 48 ώρες σε κανονικό DMEM (με γλουταμίνη, μη απαραίτητα αμινοξέα, 10% ορό εμβρύου μόσχου και πενικιλλίνη προστεθεί) ή μέσο McCoy 5Α (με γλουταμίνη και HEPES) μέσα καλλιέργειας υπό κανονικές συνθήκες, αντίστοιχα.

ανάλυση του κυτταρικού κύκλου

2 × 10

6 κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 70% αιθανόλη για 30 λεπτά στους 4 ° C, επωάστηκαν με 100 μg /ml ΚΝΑάσης και 40 μg /ml ΡΙ σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό για 301min στους 37 ° C. ιστογράμματα DNA παράχθηκαν με ανάλυση FACS.

ανάλυση

αννεξίνης V /PI

5 × 10

5 κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό σύνδεσης, επωάζονται στους 25 ° C για 5 λεπτά στο σκοτάδι με 5 μλ ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) -annexin-V και 5 μL ΡΙ (BioVision), και αναλύθηκαν με φθορισμό διαλογή κυττάρων ενεργοποιημένων (FACS, BD LSRII κυτταρόμετρο ροής) για τον προσδιορισμό δέσμευσης και ΡΙ αποκλεισμός αννεξίνης.

Western κηλίδωση

τα κυτταρολύματα αναλύθηκαν με κηλίδωση Western όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. κυτταρικής πρωτεΐνης λύμα μεταφέρθηκε σε μεμβράνες Immobilon-Ρ (Millipore? Bedford ΜΑ, USA). Οι κηλίδες μπλοκαρίστηκαν σε 5% γάλα χωρίς λιπαρά ή 5% αλβουμίνη βόειου και κατόπιν επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα για pS6RP (Cell Signaling), S6RP (Cell Signaling), p4E-ΒΡ1 (Cell Signaling), συνολικός 4Ε-ΒΡ1 (Cell Signaling) , pAkt (Cell Signaling), συνολικού Akt (Cell Signaling), διασπασμένη PARP (Cell Signaling), κασπάσης 3 (Cell Signaling), LC3 (Cell Signaling), MCT-1 (Millipore) ή MCT-4 (Santa Cruz Biotechnology). Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα αντι-κουνελιού (GE Healthcare). Western blots για α-τουμπουλίνης (Cell Signaling) έδωσε ένα έλεγχος φόρτωσης. Η ειδική σύνδεση αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης αντισώματος-στόχου ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ενισχυμένη χημειοφωταύγεια συν αντιδραστήρια (Amersham Biosciences, Buckingham-Shire, UK) και την έκθεση σε είτε Hyperfilm ECL (Amersham) ή ΧΟΜΑΤ Kodak (Rochester ΝΥ, USA) φιλμ αυτοραδιογραφίας.

Γαλακτική αφυδρογονάση ενζυματική

δοκιμασία

Σύνολο δραστηριοτήτων κυτταρικό LDH μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας πρότυπες μεθόδους φάσματο- φωτομετρική [24]. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με τυπική θεραπεία θρυψίνη, λύθηκαν επί πάγου εντός ρυθμιστικού διαλύματος εκχύλισης (Τριαιθανολαμίνη /HCL 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl

2 2 mM, μερκαπτοαιθανόλη 26 mM) και φυγοκεντρήθηκε στα 16.000 g για 10 λεπτά για να δώσει συνολικές συγκεντρώσεις πρωτεΐνης στα υπερκείμενα των περίπου 5 mg /ml. Οι αντιδράσεις ξεκίνησαν με την προσθήκη διαλυμάτων δοκιμασίας (Τριαιθανολαμίνη /HCL 60 mM, ΝΑϋΗ 0.17 mM, πυροσταφυλικό νάτριο 0,4 mM, Triton 0,05%), και οι δραστηριότητες των ενζύμων LDH μετρήθηκε φασματοφωτομετρικά στα 340 nm, με ενζυματικές δραστηριότητες μετρήθηκε ως nmol /min ανά εκατομμύρια των κυττάρων.

NAD + /NADH

μέτρησης

το συνολικό κυτταρικό αναλογίες NAD + /NADH μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ NAD + /NADH ποσοτικοποίηση (BioVision, Mountain View, CA, USA), σύμφωνα με το πρωτόκολλο παρέχεται.

Ηλεκτρονική μικροσκοπία

τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε τρυβλία 13 mm και σταθερό για 4 ώρες σε 2,5% γλουταραλδεΰδη στερεωτικό σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα στους 4 ° C. Μετά τη σταθεροποίηση, οι κυτταρικές μονοστοιβάδες τοποθετήθηκαν σε διάλυμα πλύσης γλουταραλδεϋδη και στη συνέχεια μονιμοποιήθηκαν σε Millonigs τετροξείδιο του οσμίου στερεωτικό, για 15-30 λεπτά. Οι καλλιέργειες αφυδατώθηκαν μέσω διαβαθμισμένης σειράς 10% έως 100% αιθανόλη, διεισδύσει, και στη συνέχεια ενσωματωμένων σε μέσο TAAB πρόμιγμα της ρητίνης. Εξαιρετικά λεπτές τομές συλλέχθηκαν σε πλέγματα χαλκού και χρωματίστηκαν με οξικό ουρανύλιο και κιτρικό μόλυβδο. Τομές παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Hitachi H7600 ηλεκτρονικό μικροσκόπιο.

DNP

μελέτες 13C-MRS

[1-

13C] πυροσταφυλικό οξύ που περιέχει 15 mM OX63 ελεύθερων ριζών ήταν πολωμένο για 1 ώρα σε ένα πολωτικό HyperSense DNP (Oxford Instruments Μοριακής Biotools Ltd, Abingdon, UK) σε 3.35T και 1.4 Κ όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Το πολωμένο δείγμα διαλύθηκε σε διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικό που περιέχει 50 mM μη σημασμένης γαλακτικό, EDTA και ΝβΟΗ για να επιτευχθεί μια τελική ρΗ 7. 100 μL αυτού του μίγματος προστέθηκε σε ένα εναιώρημα 500 μί κυττάρων (~40-80 εκατομμύριο κύτταρα) σε ένας σωλήνας NMR 5 mm. Η τελική συγκέντρωση του πολωμένου πυροσταφυλικού ήταν 8 mM, μετά το οποίο σειριακό

13C-MRS φάσματα αποκτήθηκαν σε ένα ανιχνευτή ΒΒΟ κάθε 2 sec με ένα παλμό 10 ° ραδιοσυχνοτήτων σε ένα σύστημα 500 MHz Bruker NMR (Bruker Biospin, Coventry, ΗΝΩΜΈΝΟ ΒΑΣΊΛΕΙΟ). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C καθ ‘όλη. φάσματα Serial ήταν φάσης και την έναρξη διορθωθεί, και ολοκληρώνονται με τη χρήση του λογισμικού Topspin (Bruker Biospin, Coventry, UK). Τα ολοκληρωμένα ολοκληρώματα κορυφής στα πειράματα πυροσταφυλικού /γαλακτικό σχεδιάστηκαν ως συνάρτηση του χρόνου και ελαχίστων τετραγώνων-τοποθέτηση διεξήχθη σε Matlab (The Mathworks Inc, Natick, ΜΑ, USA). Οι σταθερές εμφανή ρυθμό ελήφθησαν με την ταυτόχρονη τοποθέτηση πυροσταφυλικού και γαλακτικού ολοκληρώματα με τις τροποποιημένες εξισώσεις Bloch χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο ανταλλαγής δύο θέσεων που ενσωματώνουν διόρθωση flip-γωνίας όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Οι εμφανείς σταθερές ρυθμού (k

PL) για την προς τα εμπρός αντίδραση της μετατροπής του πυροσταφυλικού σε γαλακτικό κανονικοποιούνται με τον αριθμό των κυττάρων.

1-MRS ° μέσο και τα κυτταρικά εκχυλίσματα στ πολιτισμό

τα κύτταρα εκχυλίστηκαν με διαδικασίες εκχύλισης διπλής φάσης όπως περιγράφεται προηγουμένως [26]. Υδατοδιαλυτά εκχυλίσματα ξηράνθηκαν με ψύξη και να ανασυσταθεί σε 700 μL δευτεριωμένου ύδατος (D

2O, Sigma Aldrich) και τα εκχυλίσματα (500 μΙ) τοποθετήθηκαν σε σωλήνες 5 mm NMR. 50 μι 0,75% νατρίου 3-τριμεθυλσιλυλ-2,2,3,3-tetradeuteropropionate (TSP) σε D

2O (Sigma Aldrich) προστέθηκε στα δείγματα για διακρίβωση χημική μετατόπιση και ποσοτικοποίηση. δείγματα μέσα καλλιέργειας από τα κύτταρα μετά από διάφορες θεραπευτικές αγωγές αναλύθηκαν επίσης με

1-Κα, που συλλέγονται πριν από τα κύτταρα συλλέχθηκαν για την κυτταρική εκχυλίσεις. 500 μL δείγματος μέσων και 50 μL D

2O τοποθετήθηκαν στο σωλήνα NMR με 50 μι 0,75% TSP σε D

2O για τη βαθμονόμηση χημική μετατόπιση και ποσοτικοποίηση. Φασματική αναθέσεις βασίστηκαν σε βιβλιογραφικές τιμές [27].

φάσματα 1Η αποκτήθηκαν με ένα φασματόμετρο Bruker 500 MHz (Γερμανία) με φασματικό εύρος 7.500 Hz, 16384 χρονικά σημεία τομέα, 128 σαρώσεις, 298Κ θερμοκρασία, χρόνος απόκτησης περίπου 5 λεπτά. Ο συντονισμός νερού κατεστάλη με περίφραξη ακτινοβολία με επίκεντρο την συχνότητα νερό. Φασματική επεξεργασία πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του πακέτου λογισμικού Topspin-2 (Bruker Biospin, Κόβεντρυ, Ηνωμένο Βασίλειο), και οι συγκεντρώσεις μεταβολίτη ποσοτικά και ομαλοποιήθηκε ως προς τον αριθμό των κυττάρων.

Η στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου. Για τη σύγκριση των μεταβολική ροή, μεταβολίτης συγκεντρώσεις και αναλογίες, t-test unpaired Student χρησιμοποιήθηκε με μια τιμή Ρ ≤0.05 θεωρείται στατιστικά σημαντική. Όλες οι στατιστικές δοκιμασίες ήταν δύο όψεων.

Αποτελέσματα

PI-103-θεραπεία και την πείνα προκαλεί αναστρέψιμη αυτοφαγία στα κύτταρα ΗΤ29 και HCT116 Bax-ko

παρατηρήθηκε επαγωγή της αυτοφαγία σε HCT116 Bax-ko και τα κύτταρα ΗΤ29 σε επεξεργασία με ΡΙ-103, όπως επιβεβαιώθηκε από την υπερ-έκφραση του LC3II σε κηλίδες Western (Σχήμα 1α και β). Επαγωγή autophagy και υπερ-έκφραση LC3II βρέθηκε επίσης σε κύτταρα HCT116 Βαχ-ko μετά από 6 και 24 ώρες από την πείνα σε κύτταρα HCT116 Βαχ-ko (Σχήμα 1α). Ένα υψηλότερο επίπεδο έκφρασης LC3I και LC3II παρατηρήθηκε μετά από 24 ώρες από την πείνα, σε σύγκριση με 6 ώρες την πείνα. Μετά την απομάκρυνση του ΡΙ-103 αγωγή ή αναπλήρωση του φυσιολογικού μέσου ανάπτυξης μετά από 24 ώρες από ΡΙ-103 αγωγή ή ασιτίας, αντίστοιχα, η υπερ-έκφραση της LC3II επέστρεψαν στα βασικά επίπεδα μετά από 48 ώρες ανάκτησης (Σχήμα 1β-d). Ως εκ τούτου, ο 48 hr χρονικό σημείο μετά από 24 ώρες ασιτία ή θεραπεία ΡΙ-103 επιλέχθηκε για το DNP και

μετρήσεις ανάκτηση 1Η-MRS. Δεν υπήρχε καμία ένδειξη της απόπτωσης, όπως φαίνεται από την έλλειψη της διασπασμένης ΡΑΚΡ ή αλλαγή σε κασπάσης 3 εκφράσεις ΡΙ-103-κατεργασμένα ή πέθαναν από κύτταρα (Σχήμα 1α-δ). Προκειμένου να ληφθεί ένα θετικός έλεγχος για απόπτωση, απόπτωση προκλήθηκε σε κύτταρα HCT116 άγριου τύπου (WT) με επεξεργασία TRAIL, όπως TRAIL έχει αναφερθεί ότι επάγουν απόπτωση σε κύτταρα HCT116 WT [22]. Όπως ήταν αναμενόμενο, η παρουσία διασπασμένη PARP και μειωμένο επίπεδο κασπάσης 3 παρατηρήθηκαν σε TRAIL-επεξεργασμένα κύτταρα HCT116 WT σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου υπό αγωγή με όχημα (Εικόνα 1b και γ).

(α) κηλίδες Western LC3, Διασπασμένη PARP, κασπάσης 3 και α-τουμπουλίνης σε κύτταρα ελέγχου HCT116 Bax-ko και σε 10 μΜ ή 20 μΜ ΡΙ-103-κατεργασμένα ή 6 ώρες και 24 ώρες HBSS-κατεργασμένα κύτταρα HCT116 Bax-ko. (Β) στυπώματα Western του LC3, διασπασμένη PARP, κασπάσης 3 και α-τουμπουλίνης σε κύτταρα ΗΤ29 ελέγχου και σε 24 ώρες 100 μΜ PI-103-κατεργασμένα κύτταρα ΗΤ29 και στις 24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες από την ανάκτησή τους. Οι TRAIL-επεξεργασμένα κύτταρα HCT116 WT χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για απόπτωση, όπως TRAIL έχει αναφερθεί ότι επάγουν απόπτωση σε κύτταρα HCT116 WT [22]. Όπως ήταν αναμενόμενο, η παρουσία διασπασμένη PARP και εξαιρετικά μειωμένη κασπάσης 3 εκφράσεις παρατηρήθηκαν σε 24 ώρες WT κύτταρα HCT116 TRAIL-αγωγή σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου υπό αγωγή με όχημα. (Γ) Western blots του LC3, διασπασμένη PARP, κασπάσης 3 και α-τουμπουλίνης σε κύτταρα ελέγχου HCT116 Bax-ko και σε 24 ώρες 20 μΜ PI-103-κατεργασμένα κύτταρα HCT116 Bax-ko και στις 24 ώρες και 48 ώρες από την ανάκτησή τους . Οι TRAIL-επεξεργασμένα κύτταρα HCT116 WT χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για απόπτωση. (Δ) κηλίδες Western LC3, διασπασμένη PARP, κασπάσης 3 και α-τουμπουλίνης σε HCT116 κύτταρα ελέγχου Bax-ko και σε 24 ώρες από HBSS-κατεργασμένων κυττάρων HCT116 Bax-ko και στις 24 και 48 ώρες από την ανάκτηση τους.

Η παρουσία της αυτοφαγικά κενοτόπια επιβεβαιώθηκε με μικροσκοπία ηλεκτρονίων πραγματοποιείται σε πεινασμένα (όπως το διπλό μεμβράνη αυτοφαγοσώματα) ή PI-103-αγωγή (κυρίως ως δομές autolysosomal μεταγενέστερο στάδιο) κύτταρα HCT116 Bax-ko, δείχνοντας την επαγωγή autophagy (Σχήμα 2). Αυτοφαγικά κενοτόπια απουσίαζαν στα κύτταρα ελέγχου.

Ηλεκτρονική μικροσκοπία εικόνες των αυτοφαγικά κενοτόπια σε έλεγχο, 10 μΜ ή 20 μΜ ΡΙ-103-κατεργασμένα ή 6 ώρες και 24 ώρες HBSS-κατεργασμένα κύτταρα HCT116 Bax-ko. Κόκκινα βέλη δείχνουν μερικά από τα αυτοφαγικά κενοτόπια σε διάφορα στάδια της διαδικασίας αυτοφαγία.

Η

Τα επίπεδα της απόπτωσης και νέκρωσης στα κύτταρα ΗΤ29 και HCT116 Bax-ko κάτω από την πείνα και τη θεραπεία PI-103 αξιολογήθηκαν σε προσκολλημένα κύτταρα με αννεξίνη V /ανάλυση ΡΙ (Σχήμα 3α) επίδειξη ενός πλειοψηφία των βιώσιμων κυττάρων με ένα μικρό ποσοστό των νεκρωτικών (ΗΤ29 DMSO-αγωγή (όχημα-έλεγχος): 6,5 ± 2,2%? 100 μΜ ΡΙ-103: 10,7 ± 2,7% (ρ = 0,29)? HCT116 Bax-ko DMSO-αγωγή (όχημα-έλεγχος): 1.5 ± 0.1%? 6 ώρες πεινασμένο: 1.9 ± 0.2% (p = 0,06) και 24 ώρες πεινασμένο: 3.0 ± 0.4% (p = 0,01)? 10 μΜ ΡΙ-103: 4,6 ± 0,4% (ρ = 0,02) και 20 μΜ ΡΙ-103: 6,6 ± 0,4% (ρ = 0,79)) ή με τα αποπτωτικά κύτταρα (ΗΤ29 DMSO-αγωγή: 1,0 ± 0,7%? 100 μΜ ΡΙ- 103: 2.0 ± 1.4% (p = 0,54)? HCT116 Bax-ko όχημα-έλεγχος: 6,6 ± 0,5%? 6 ώρες πεινασμένο: 10,5 ± 0,8% (p = 0,001) και 24 ώρες πεινασμένο: 13,8 ± 0,8% (p = 0.003)? 10 μΜ ΡΙ-103: 4,0 ± 0,1% (ρ = 0,26) και 20 μΜ ΡΙ-103: 4,1 ± 0,2% (ρ = 0,30)) σε ομάδες ελέγχου και αγωγής. Δεν επιπλέοντα κύτταρα παρατηρήθηκαν σε οποιαδήποτε από τις ομάδες που υπέστησαν αγωγή.

(α) χρώση Annexin V και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) δοκιμασία μέτρησης της αναλογίας των κυττάρων που υφίστανται απόπτωση και νέκρωση σε κύτταρα ΗΤ29 μετά από 24 ώρες από 100 μΜ PI -103 θεραπεία και HCT116 Bax-ko κύτταρα μετά από 24 ώρες από 10 μΜ ή 20 μΜ θεραπεία ΡΙ-103, ή 6 ώρες ή 24 ώρες από την πείνα. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσο ποσοστό ± s.e.m. (Ελάχιστο

n

= 3 σε κάθε ομάδα). Οι στατιστικά σημαντικές αλλαγές υποδεικνύονται (* p & lt? 0,05). (Β) Ο αριθμός των κυττάρων σε σύγκριση με 24 ώρες DMSO-αγωγή ελέγχων σε κύτταρα ΗΤ29 ακόλουθες 24 ώρες DMSO-θεραπεία αποκατάστασης, 24 hr 100 μΜ PI-103 αγωγή και 48 ανάκτηση hr και 24 hr ελέγχους υπό αγωγή με όχημα του σε HCT116 Βαχ-ko κυττάρων μετά από 24 ώρες από 10 μΜ ή 20 μΜ θεραπεία PI-103, ή 6 ώρες ή 24 ώρες από την πείνα και την ανάκτηση της από 24 ώρες 20 μΜ θεραπεία PI-103 ή πείνα. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσο ποσοστό ± s.e.m. (Ελάχιστο

n

= 3 σε κάθε ομάδα). Οι στατιστικά σημαντικές αλλαγές υποδεικνύονται (* p & lt? 0,05). Ανάλυση (γ) του κυτταρικού κύκλου. Τα δεδομένα είναι μέσα ± s.e.m. ποσοστό ΗΤ29 κύτταρα 24 ώρες DMSO-θεραπεία ελέγχου, 24 ώρες DMSO-ανάκτηση του ελέγχου, 24 ώρες PI-103 που έλαβαν 100 μΜ, 24 ώρες PI-103-ανακτηθεί, 48 ώρες PI-103-ανακτάται, (

n

= 3 σε κάθε ομάδα)? HCT116 Bax-ko κύτταρα 24 ώρες ελέγχου DMSO-θεραπεία, 24 ώρες DMSO-ανάκτηση του ελέγχου, 24 ώρες PI-103 που έλαβαν 20 μΜ, 24 ώρες PI-103-ανακτηθεί, 48 ώρες PI-103-ανακτάται, (

n

= 3 σε κάθε ομάδα)? κύτταρα HCT116 Bax-ko 6 ώρες τον πλήρη έλεγχο των μέσων ενημέρωσης, 6 ώρες ασιτία (HBSS), 24 ώρες πλήρη έλεγχο των μέσων ενημέρωσης, 24 ώρες ασιτίας (HBSS), 48 ώρες HBSS-ανακτάται (

n

= 3 σε κάθε ομάδα) . * P & lt?. 0.01

Η

Ο μειωμένος αριθμός των προσκολλημένων κυττάρων βρέθηκε σε όλες τις ομάδες θεραπείας μετά από 24 ώρες από 100 θεραπείας μΜ σε κύτταρα ΗΤ29 (78 ± 2%, p & lt? 0.01), 6 ώρες και 24 ώρες από την πείνα (46 ± 0,1% και 36 ± 0,4%, αντίστοιχα, ρ & lt? 0,01) ή 24 ώρες από 10 μΜ και 20 μΜ ΡΙ-103 αγωγή (65 ± 0,1% και 58 ± 0,1%, αντίστοιχα, ρ & lt? 0,01 ) σε κύτταρα HCT116 Βαχ-ko σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Σχήμα 3b). Η αύξηση του αριθμού των προσφυόμενων κυττάρων πάνω από τα επίπεδα ελέγχου υπό αγωγή με όχημα 24 ώρες παρατηρήθηκε σε ΡΙ-103 που επάγεται (170 ± 8%, ρ & lt? 0,05 (HCT116 Bax-ko)? 303 ± 16%, ρ & lt? 0.01 ( ΗΤ29)) και πείνα που προκαλείται (117 ± 7%, ρ & lt? 0,05) και αυτοφαγικά κύτταρα μετά από 48 ώρες ανάκτησης (σχήμα 3β), υποδεικνύοντας ότι ο κυτταρικός πληθυσμός αυξήθηκε πάνω από τα επίπεδα ελέγχου μετά την ανάρρωση από αυτοφαγία. Τα 24 hr όχημα επεξεργασμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι τόσο για τις ομάδες θεραπείας και αποκατάστασης, καθώς τα κύτταρα ελέγχου θα πάρα συρρέοντα κατά 48 hr ανάκαμψης.

Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου με κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε σε κάθε ομάδα αγωγής , και μετά από 24 ώρες και 48 ώρες της ανάκτησης (Σχήμα 3c). A 24 ανάκτηση hr χρονικό σημείο για τους ελέγχους DMSO-αγωγή περιλαμβάνονται επίσης για κάθε πείραμα ΡΙ-103 καθώς οι αριθμοί των κυττάρων αυτών των ομάδων είναι παρόμοιες με τους αριθμούς των κυττάρων του ΡΙ-103 επεξεργασμένα κύτταρα μετά από 48 ώρες ανάκτησης. G1 σύλληψη παρατηρήθηκε σε κύτταρα ΗΤ29 και HCT116 Bax-ko μετά την αγωγή με ΡΙ-103, επιστρέφοντας στο επίπεδο DMSO-αγωγή 24 ώρες με 48 ώρες της ανάκτησης (Σχήμα 3c). Αυξημένη φάση G1 βρέθηκε επίσης σε 24 ώρες ανακτήθηκαν DMSO-αγωγή ΗΤ29 (9 ± 3%, ρ = 0,01) και HCT116 Bax-ko (11 ± 1%, ρ = 0.004), τα κύτταρα, σε σύγκριση με 24 ώρες τα κύτταρα DMSO-θεραπεία. Τα ποσοστά του 24 ώρες ανακτήθηκαν κύτταρα DMSO-κατεργασία σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου είναι πολύ παρόμοιο με το 48 hr ανακτάται PI-103-αγωγή χρονικό σημείο τόσο ΗΤ29 και κύτταρα HCT116 Bax-ko (Σχήμα 3c). Αυτό μπορεί να οφείλεται στην ανάκτηση ελέγχου (DMSO-αγωγή) και ΡΙ-103-κατεργασμένα κύτταρα είναι περισσότερο συρροή σε αυτά τα χρονικά σημεία, η οποία είναι συνεπής με συγκρίσιμο αριθμό κυττάρων τους.

Καμία αλλαγή στον κυτταρικό κύκλο Το προφίλ των κυττάρων HCT116 Bax-ko παρατηρήθηκε μετά 6 ή 24 ώρες από την πείνα (Εικόνα 3c). Μια μείωση στην G1 (12 ± 4%, ρ = 0.04) και μία αύξηση στην φάση G2 (5 ± 1%, ρ = 0,003) βρέθηκαν σε 48 ώρες ανακτηθέντα κύτταρα HCT116 Bax-ko, σε σύγκριση με 24 ώρες ελέγχου μέσων επεξεργασμένο κύτταρα και οι αριθμοί των κυττάρων είναι παρόμοια μεταξύ των δύο ομάδων (Σχήμα 3c). Δεν παρατηρήθηκε σημαντική αλλαγή στο μέγεθος των κυττάρων παρατηρήθηκε σε οποιαδήποτε από τις ομάδες θεραπείας σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου.

θεραπεία ΡΙ-103 μειώνει την ενεργοποίηση ΑΚΤ και μονοπάτι mTOR σε κύτταρα ΗΤ29 και HCT116 Bax-ko και αυτή η διαδικασία είναι αντιστρεπτή

Τα αποτελέσματα της θεραπείας PI-103 για την ΑΚΤ και μονοπάτια mTORC εξετάστηκαν σε κύτταρα ΗΤ29 και HCT116 Bax-ko κατά τη διάρκεια της θεραπείας και κατά τη διάρκεια της 24 και 48 ώρες της ανάκαμψης. Μειωμένη έκφραση pAkt και p4E-ΒΡ1 παρατηρήθηκε σε κύτταρα ΗΤ29 και HCT116 Bax-ko μετά από 24 ώρες θεραπείας ΡΙ-103 με έκφραση αυτών των πρωτεϊνών που επιστρέφουν στην προ της θεραπείας επίπεδα μετά από 48 ώρες ανάκτησης (Σχήμα 4α και β). Μειωμένη έκφραση PS6 βρέθηκε επίσης σε ΡΙ-103-κατεργασμένα κύτταρα HCT116 Bax-ko και το επίπεδο της ανακτώνται από 24 ώρες ανάκτησης (Σχήμα 4β). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η θεραπεία με PI-103 αναστέλλει την ΑΚΤ και mTOR μονοπάτι στις δύο κυτταρικές σειρές και η διαδικασία αυτή είναι αναστρέψιμη όταν το φάρμακο απομακρύνεται και τα κύτταρα αφέθηκαν να ανανήψουν.

Western blots του PS6 ριβοσωμικής πρωτεΐνης, συνολικής πρωτεΐνης ribsomal S6, p4E-BP1, συνολικής 4Ε-BP1, pAkt, ολική Akt και α-τουμπουλίνης (φόρτωση ελέγχου) σε PI-103-επεξεργασία και ανάκτηση της στα κύτταρα ΗΤ29 και HCT116 Bax-ko.

σε πραγματικό χρόνο εμφανής

13C-πυροσταφυλικού σε γαλακτικό συναλλαγματικές ισοτιμίες μειώνονται σε PI-103-και την πείνα που προκαλείται από αυτοφαγία, παραμένοντας μειώνονται μετά την ανάρρωση από PI-103, αλλά αυξάνεται με την ανάκαμψη από την πείνα

Υπερπολωμένα [1-

13C] πυροσταφυλικού σε γαλακτικό ανταλλαγή παρακολουθείται σε πραγματικό χρόνο από

13C-MRS για τη μέτρηση της κινητικής ανταλλαγή αυτοφαγικά κύτταρα. Σχήμα 5α δείχνει μέσο όρο

13C-MR φάσματα υπολογίζονται για κάθε ομάδα αθροίζοντας πάνω από το σύνολο της δυναμικής χρονοσειρών για την αναστολή των κυττάρων HCT116 Bax-ko μετά την προσθήκη του υπερπολωμένα [1-

13C] πυροσταφυλικού σε έλεγχο, 24 ώρες πείνα και 48 ώρες ανάκαμψης από αυτοφαγία. Το Σχήμα 5b δείχνει την αντίστοιχη χρονική σειρά της κανονικοποιημένης κορυφής ολοκλήρωμα του σήματος γαλακτικού στις ίδιες ομάδες. Προφανής ισοτιμία σταθερά k

PL μετρήθηκαν με μη γραμμική ελαχίστων τετραγώνων προσαρμογή για τα δυναμικά δεδομένα σε κάθε ομάδα και τα δεδομένα παρουσιάζονται ως δείκτες (που αντιμετωπίζονται ελέγχου φορέα /24 hr) στο Σχήμα 5γ.

(α) Υπερπολωμένα

13C-φάσμα από έναν προσδιορισμό των κυττάρων HCT116 Bax-ko δείχνει το άθροισμα για ολόκληρη την δυναμική χρονοσειράς από ένα πείραμα κύτταρο ελέγχου, μετά 6 ώρες ασιτία, 24 ώρες ασιτία με μέσο HBSS και μετά από 24 ώρες ασιτία ακολουθείται από 48 ανάκαμψη ώρες κυττάρων. Το φάσμα εμφανίζει κορυφές από πυροσταφυλικό (Πυρ), γαλακτικό (Lac) και ένυδρο πυροσταφυλικό (ΡντΗ). (Β) Plot της κορυφής γαλακτικό ολοκλήρωμα ως συνάρτηση του χρόνου ρυθμίζεται σύμφωνα με την αιχμή πυροσταφυλικό ολοκλήρωμα στο χρόνο t = 0 s και κανονικοποιημένα ανά εκατομμύριο κύτταρα που αποκτήθηκαν για τα κύτταρα ελέγχου HCT116 Bax-ko, 24 ώρες ασιτία με μέσο HBSS και 24 ώρες ασιτία που ακολουθείται από 48 ανάκτηση hr. (Γ) Η μέση αναλογία (θεραπεία /24 hr όχημα-έλεγχος) της εμφανούς εμπρός ρυθμού αντίδρασης του πυροσταφυλικού σε γαλακτικό ανταλλαγή k

PL (που προέρχεται από την τοποθέτηση των πειραματικών δεδομένων και ομαλοποιήθηκε ως προς τον αριθμό των κυττάρων) (± SEM) για 24 ώρες DMSO-θεραπεία αποκατάστασης, 100 μΜ PI-103 θεραπεία και αποκατάσταση 48 ώρες μετά από 100 μΜ θεραπεία PI-103 σε κύτταρα ΗΤ29? για 10 μΜ PI-103 αγωγή, 20 μΜ PI-103 θεραπεία και αποκατάσταση 48 ώρες μετά από 20 μΜ PI-103 θεραπείας σε κύτταρα HCT116 Bax-ko? και για 6 ώρες HBSS πείνα, 24 ώρες HBSS πείνα και 24 πείνα ώρα που ακολουθείται από 48 ανάκαμψη ώρες στα κύτταρα HCT116 Bax-ko. Ελάχιστη

n

= 3 σε κάθε ομάδα. Οι στατιστικά σημαντικές αλλαγές υποδεικνύονται (* p ≤ 0,05)

Η

Μειωμένη k

PL παρατηρήθηκαν σε κύτταρα ΗΤ29 αγωγή με PI-103. (82 ± 7% του ελέγχου? P = 0.05) ( Σχήμα 5c). Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στην k

PL βρέθηκε μεταξύ της ομάδας υπό θεραπεία 24 ώρες DMSO οχήματος και το 24 ώρες ανακτάται ομάδα DMSO-όχημα αγωγή (Σχήμα 5c) σε κύτταρα ΗΤ29, παρά τον αριθμό των κυττάρων και τον πληθυσμό των κυττάρων σε φάση G1 είναι υψηλότερη στην 24 ώρες ανακτάται ομάδα DMSO-αγωγή (Σχήμα 3b και c). Ως εκ τούτου, k

PL στις ομάδες ανάκτηση συγκρίθηκε με τις αντίστοιχες 24 ώρες ελέγχους που δέχτηκαν φορέα της. k

PL παρέμειναν χαμηλότερες σε κύτταρα ΗΤ29 ακόλουθες 48 ώρες της ανάκτησης από την επεξεργασία PI-103 (74 ± 4% του ελέγχου? p = 0.02)., σε σύγκριση με 24 ώρες ελέγχους DMSO-αγωγή (Σχήμα 5c)

μειωμένη k

PL βρέθηκαν σε κύτταρα HCT116 Βαχ-ko επεξεργασία με 10 μΜ (52.5 ± 9.4% του ελέγχου? p = 0.05) και 20 μΜ ΡΙ-103 (41,1 ± 5,3% του ελέγχου? ρ & lt? 0,0001 ) όταν συγκρίνεται με τους μάρτυρες DMSO-όχημα (Σχήμα 5c). Μετά από 48 ώρες ανάκαμψης η φαινομενική σταθερά ταχύτητας ήταν αυξημένα σε σύγκριση με τα ποσοστά θεραπείας, αλλά δεν επέστρεψαν σε ρυθμούς ελέγχου οχημάτων που έλαβαν 24 ώρες (65 ± 7% του ελέγχου? P = 0,004). (Σχήμα 5γ)