Abstract

πολυσιαλικά οξύ (PSA), μια α2,8-συνδεδεμένη ομοπολυμερές Ν-ακετυλονευραμινικό οξύ (Neu5Ac), ρυθμίζεται αναπτυξιακά και η έκφρασή της πιστεύεται ότι περιορίζονται σε λίγες ιστούς στους ενήλικες. Πρόσφατα, αποδείξαμε ότι δύο ανθρώπινα παθογόνα εξέφρασαν ένα παράγωγο του PSA που περιέχουν κατάλοιπα σιαλικού οξέος απο-Ν-ακετυλο (NeuPSA). Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι ένα επιτόπιο που προσδιορίζονται από το αντι-NeuPSA μονοκλωνικό αντίσωμα, SEAM 3 (ραφή 3-δραστικό αντιγόνο ή S3RA), εκφράζεται σε ανθρώπινα μελανώματα, καθώς επίσης και ενδοκυτταρικά σε μια κυτταρική γραμμή ανθρώπινου μελανώματος (SK-MEL-28), μία κυτταρική γραμμή λευχαιμίας κυτταρική ανθρώπινων Τ (Jurkat), και δύο κυτταρικές σειρές νευροβλαστώματος (CHP-134 και SH-SY5Y). SEAM 3 πρόσδεση που επάγεται απόπτωση στα τέσσερα κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν. Η ασυνήθιστη ενδοκυτταρική κατανομή S3RA ήταν παρόμοια με εκείνη που περιγράφεται για τις polysialyltransferases PSA, STX και PST, τα οποία επίσης εκφράζονται στις τέσσερις κυτταρικές γραμμές που χρησιμοποιήθηκαν εδώ. Είναι ενδιαφέρον ότι, η καταστολή της έκφρασης του mRNA PST με επιμόλυνση του SK-MEL-28 κυττάρων με PST-ειδικό σύντομης παρεμβολής RNA (siRNA) είχε ως αποτέλεσμα μειωμένη ραφή 3 δεσμευτική. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν περαιτέρω μελέτες σχετικά με τη χρησιμότητα των αντισωμάτων, όπως η ραφή 3 ως θεραπευτικοί παράγοντες για ορισμένες κακοήθειες

Παράθεση:. Steirer LM, Moe GR (2011) ένα αντίσωμα προς De-Ν-ακετυλο σιαλικά οξέα-πολυσιαλικά Acid προσδιορίζει ένα ενδοκυτταρικό αντιγόνο και επάγει την απόπτωση σε ανθρώπινα καρκινικά Κυτταρικές Γραμμές. PLoS ONE 6 (11): e27249. doi: 10.1371 /journal.pone.0027249

Επιμέλεια: Roger Chammas, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, Βραζιλία

Ελήφθη: 18 του Αυγούστου 2011? Αποδεκτές: 12 Οκτωβρίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 9 του Νοεμβρίου 2011

Copyright: © 2011 Steirer, Moe. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Χρηματοδότηση ήταν που παρέχεται από NIH NIAID αριθμό επιχορήγηση AI064314 (www.niaid.nih.gov/Pages/default.aspx), ΝΙΗ NCRR αριθμούς επιχορήγηση CO6 RR-16226 και S10RR025472 (www.ncrr.nih.gov), Νοσοκομείο Παίδων Υποκαταστήματα, Inc. ( www.childrenshospitalbranches.org), NIH NHLBI Τ-32 5T32DK078514-09 (grants.nih.gov/training/nrsa.htm), Κολυμπήστε σε ολόκληρη την Αμερική San Francisco Bay Area (www.swimacrossamerica.org), και η οικογένεια Jennifer Leigh Wells (www.moonlight4meningitis.com/). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τροποποίηση PSA φαίνεται να περιορίζεται σε μερικά ζωικές πρωτεΐνες και τους πολυσακχαρίτες της κάψας των νευροεπεκτατική βακτήρια

Neisseria meningitidis

ομάδα Β (ΝΜΒ) και

Ε. coli

K1 [1]. Στον άνθρωπο, η PSA έχει αποδειχθεί ότι είναι παρόντες σε νευρωνικά μόριο προσκόλλησης κυττάρου (NCAM) [2], συναπτική μόριο κυτταρικής προσκόλλησης 1 [3], η άλφα υπομονάδα της ευαίσθητου διαύλου νατρίου τάσης [4], η ιντεγκρίνη άλφα 5 υπομονάδα [ ,,,0],5] ο υποδοχέας CD36 καθαριστή [6], νευροπιλίνη-2 [7], και οι polysialyltransferases PSA ST8Sia2 και ST8Sia4, επίσης γνωστή ως STX και PST, αντίστοιχα [8]. NCAM είναι το πιο άφθονο πολυσιαλυλιωμένων πρωτεΐνη, ειδικά κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης, και ο ρόλος των polysialylation σε λειτουργία NCAM είναι η πιο διερευνηθεί διεξοδικά [9]. NCAM μπλοκ polysialylation οι συγκολλητικές ιδιότητες του NCAM να επιτρέψει τη μετανάστευση των κυττάρων και ρυθμίζουν άλλες λειτουργίες NCAM [9]. Σε ενήλικα ποντίκια, η έκφραση PSA περιορίζεται σε λίγους ιστούς του εγκεφάλου που επιδεικνύουν συναπτική πλαστικότητα όπως στον οσφρητικό βολβό και τον υποθάλαμο [9] και μπορεί να έχει ένα ρόλο στην ανάπτυξη των κυττάρων Τ [10]. Μερικά ανθρώπινων όγκων, συμπεριλαμβανομένων των αστροκυτώματος [11], μικροκυτταρικό και καρκίνωμα μη-μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα [12], του πολλαπλού μυελώματος [13], το νευροβλάστωμα [14], ραβδομυοσάρκωμα [15] και του όγκου του Wilms [16] ρητή PSA και η σχετική επίπεδο έκφρασης του PSA σε μερικούς καρκίνους έχει συσχετιστεί με φτωχή πρόγνωση [12], [17].

κατά την ανάπτυξη εμβολίων για την πρόληψη της νόσου που προκαλείται από NmB, ανακαλύψαμε ότι ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (mAb ) SEAM 3, το οποίο παρήχθη με ανοσοποίηση με ένα Ν-προπιονυλο παράγωγο NmB καψικού πολυσακχαρίτη (Ν-Pr Mbps) με έδρα εμβόλιο [18], που αναγνωρίζεται PSA αντιγόνα που περιείχε δε-Ν-ακετυλιωμένη νευραμινικό οξύ (Neu) υπολείμματα [19] , [20], [21]. Η παρουσία του Neu υπολειμμάτων στην MBPS-τετάνου εμβόλιο ανατοξίνης Ν-Pr ήταν μια ακούσια παραπροϊόν που προκύπτει από ατελή re-Ν-ακυλίωση. Στη συνέχεια, δείξαμε ότι το PSA νευραμινικού περιέχει οξύ (NeuPSA), συμπεριλαμβανομένων πλήρως απο-Ν-ακετυλιωμένη PSA, ήταν ανοσογόνος και προκάλεσε αντισώματα τα οποία ήταν προστατευτική έναντι NmB και NmC στελέχη [19].

Αν και NeuPSA δεν είχε έχουν περιγραφεί προηγουμένως σε ανθρώπους, συντομότερη Neu-αντιγόνα που περιέχουν σιαλικό οξύ (NeuSia), όπως γαγγλιοσίδια είχε αναφερθεί ότι υπάρχουν σε μερικούς ανθρώπινους όγκους και κυτταρικές γραμμές καρκίνου [22], [23], [24]. αντιγόνα NeuSia που εκφράζονται σε ανθρώπινους όγκους περιλαμβάνουν NeuSia παραλλαγές του μονο- και disialylogangliosides GM3 και GD3 [22], [23], [24], [25], [26], αντίστοιχα. Hakomori και συνεργάτες έδειξαν ότι NeuSia GD3 που εκφράζεται στον ανθρώπινο επιθηλιακό κυτταρική γραμμή καρκινώματος Α431 ήταν ένας ισχυρός ενεργοποιητής της κινάσης του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα σε Triton Χ-100-κατεργασμένα κύτταρα [27], [28]. Το αποτέλεσμα δείχνει ότι το παράγωγο NeuSia GM3 μπορεί να έχει ένα ρόλο στην ενεργοποίηση του υποδοχέα μονοπάτια που προάγουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Χρησιμοποιώντας ραδιενεργά πειράματα σήμανσης σε κυτταρικές σειρές μελανώματος, Varki και συνεργάτες έδειξαν ότι οι ομάδες Ν-ακετυλο σε γαγγλιοσίδια GD3 και GM3 αναποδογυρίζεται ταχύτερα από τα γονικά μόρια, γεγονός που υποδηλώνει την ύπαρξη NeuSia περιέχουν γαγγλιοσίδια σε αυτά τα κύτταρα [25]. Πρόσφατα, Popa et al απομονώνονται και χαρακτηρίζονται δομικά NeuSia περιέχει GD3 από πρωτογενείς όγκους ανθρώπινου μελανώματος [26]. Δεδομένου ότι ορισμένα καρκινικά κύτταρα εκφράζουν αντιγόνα NeuSia, έθεσε το ερώτημα κατά πόσον οι πλέον NeuPSA-τροποποιημένα αντιγόνα εκφράζονται επίσης από ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η δραστικότητα των SEAM 3 με φυσιολογικό ανθρώπινο δέρμα, πρωτογενών όγκων ανθρώπινου μελανώματος και αρκετές ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές συμπεριλαμβανομένης της λευχαιμίας, του μελανώματος, και κύτταρα νευροβλαστώματος, και τη λειτουργική δραστηριότητα των SEAM 3 έναντι αυτών των κυτταρικών γραμμών καρκίνου.

Αποτελέσματα

Εξειδίκευση του mAb ραφή 3

Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι ραφή 3 είναι αντιδραστικές με μια ποικιλία από Neu-περιέχει oligosialic οξέος (OSA) /παράγωγα PSA [18], [19], [20]. Για να καθορίζεται η ιδιοτυπία ραφή 3 σε σχέση με τα αντιγόνα NeuOSA /PSA πιθανόν να εκφράζονται με φυσικό τρόπο (δηλ. Ν-ακετυλο-που περιέχουν παράγωγα), παρασκευάσαμε μερικώς απο-Ν-ακετυλιωμένη παράγωγα της OSA με ήπια κατεργασία βάσης του καθαρισμένου ολιγοσακχαρίτες που έχουν ένα βαθμός πολυμερισμού (DP) από 2, 3, και 4. Η μέση ποσότητα Neu προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μια τροποποιημένη δοκιμασία ρεσορκινόλης που μπορεί να μετρήσει την ποσότητα του νευραμινικού οξέως (Neu) και Ν-ακετυλονευραμινικό οξύ (Neu5Ac) σε PSA [19] . Μετά ήπια κατεργασία βάσης, οι ολιγοσακχαρίτες που περιέχονται -25% Neu και υπήρχε κάποια υποβάθμιση των πλέον ολιγοσακχαριτών έτσι ώστε το τριμερές περιείχε και τα δύο διμερή και τριμερή και το τετραμερές περιείχε διμερή, τριμερή και τετραμερή. Η σχετική ικανότητα των ολιγοσακχαριτών να αναστέλλουν τη δέσμευση ραφής 3 με την ονομαστική αντιγόνο Ν-Ργ MBPS προσδιορίστηκε με ELISA. Τα αποτελέσματα συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Οι συγκεντρώσεις των ολιγοσακχαριτών που απαιτείται για να αναστείλει ραφή 3 δεσμευτικός αντιπροσωπεύουν ανώτατα όρια αφού τα παρασκευάσματα περιέχουν ένα μίγμα ολιγοσακχαριτών βραχύτερη εκτός από τη μεγαλύτερη που υποδεικνύεται από την DP. Επίσης, ο αριθμός που δίνεται για το DP δεν λαμβάνει υπόψη την πιθανή επίδραση της μείωσης της ομάδας καρβονυλίου C2 του αναγωγικού άκρου υπόλειμμα, το οποίο είναι απαραίτητο για την πρόληψη της υποβάθμισης διάρκεια της θεραπείας βάσης. Λαμβάνοντας υπόψη αυτές τις θεωρήσεις, οι ολιγοσακχαρίτες έχουσα DP 4 ήταν οι καλύτεροι αναστολείς ραφής 3 δεσμευτική. Η ικανότητα των ολιγοσακχαριτών να αναστέλλουν ραφή 3 πρόσδεση δεν επηρεάζεται από επώαση τους σε ρΗ 5 με ή χωρίς exoneuraminidase στους 37 ° C για 48 ώρες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Οι επεξεργασίες εμπλουτισμό των ολιγοσακχαριτών για τις αλυσίδες που έχουν Neu στο τέλος μη αναγωγικό [19]. SEAM 3 πρόσδεση δεν αναστέλλεται από στενά συνδεδεμένα MCPS (δηλ. Πολυ α2,9 Ν-ακετυλονευραμινικό οξύ) είτε όταν είναι πλήρως Ν-ακετυλιωμένη ή περιέχουν απο-Ν-ακετυλιωμένη υπολείμματα (Πίνακας 1). Στο σύνολό τους, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι ραφή 3 αναγνωρίζει ολίγο ή πολυσιαλικού οξέος παράγωγα έχουσα DP 4 ή μεγαλύτερο, όπου περίπου κάθε τέταρτο κατάλοιπο είναι Neu, το οποίο μπορεί να βρίσκεται στο μη αναγωγικό άκρο ή σε εσωτερικές τοποθεσίες του πολυμερούς (Σχήμα 1 ).

η

Ανοσοϊστοχημική (IHC) χρώση του φυσιολογικού ανθρώπινου δέρματος και πρωτογενείς όγκους μελανώματος

σε φυσιολογικούς ιστούς, de-Ν-ακετυλο GD3 αναφέρθηκε ότι εκφράζεται «στο χαμηλά επίπεδα σε λίγα αιμοφόρα αγγεία, διεισδύοντας μονοπύρηνα κύτταρα του δέρματος και του παχέος εντέρου και σε μέτρια επίπεδα στα μελανοκύτταρα του δέρματος »[22]. Υψηλότερα επίπεδα εκφράστηκαν σε μελανώματα [22]. PSA-NCAM εκφράζεται ευρέως σε ενδοδέρματος, μεσοδερμικής, εξωδερμικής και νευρο-εξωδερμικής προέρχονται ιστών σε διάφορα στάδια της εμβρυϊκής ανάπτυξης, αλλά η έκφραση σε ενήλικες περιορίζεται σε λίγες περιοχές του εγκεφάλου που παρουσιάζουν νευρο-πλαστικότητα [29]. Για να προσδιοριστεί αν τα αντιγόνα που αντιδρούν με ραφή 3 εκφράστηκαν σε φυσιολογικό ανθρώπινο δέρμα και τα πρωτογενή μελανώματα, εκτελέσαμε IHC σε κατεψυγμένα και σταθεροποιημένα με φορμαλίνη δείγματα ιστών ενσωματωμένα σε παραφίνη. Το mAb R24 χρησιμοποιήθηκε για να σηματοδοτήσει GD3. Chammas et al., Έχουν αναφέρει ότι φορμαλίνη επεξεργασία των δειγμάτων ιστού μπορεί να οδηγήσει σε τροποποίηση των αμινομάδων de-Ν-ακετυλο GD3 με φορμαλδεΰδη, με αποτέλεσμα την απώλεια της αντιδραστικότητας με αντι-δε-Ν-ακέτυλο GD3 mAbs [22]. Επίσης, IHC χρώση για την παρουσία GD3 σε δείγματα ενσωματωμένα σε παραφίνη ιστούς σταθεροποιημένο με φορμαλίνη έχει περιγραφεί ως ευαίσθητα σε απώλεια των αντι-GD3 αντιδραστικότητα ως αποτέλεσμα των διαδικασιών ανάκτησης αντιγόνου [30]. Βρήκαμε τα αντίστοιχα πρότυπα χρώσης που παρατηρήθηκε για κάθε mAb που εξετάσθηκαν ήταν παρόμοια ανεξάρτητα από το ποια μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή των δειγμάτων, εκτός από το ότι χρώση μειώθηκε σε κάποιο βαθμό σε κατεψυγμένα, μη στερεωμένα δείγματα σε σύγκριση με ενσωματωμένα σε παραφίνη, σταθεροποιημένα με φορμαλίνη ιστούς. Επίσης, ήταν πιο δύσκολο να ληφθούν μεγάλες, αδιάσπαστη τμήματα ιστού στις αόριστης δείγματα. Δεδομένου ότι για τον καθορισμό των δειγμάτων οδήγησε στην ανώτερη διατήρηση της δομής των ιστών και μεγαλύτερη ευαισθησία της χρώσης, μόνο τα αποτελέσματα που λαμβάνονται με τη χρήση σταθερών ιστούς δείχνεται.

IHC χρώση των σταθερών κανονικό ανθρώπινο δέρμα δεικνύει ότι ραφή 3 σήματα κύτταρα του πλακώδους επιθήλιο και διηθητικά λεμφοκύτταρα (Σχήμα 2Α), ενώ ο αρνητικός μάρτυρας άσχετο μυοειδούς IgG2b και IgG3 mAbs δεν έδειξαν αντιδραστικότητα. Σε αντίθεση, το αντι-GD3 mAb ήταν αντιδραστικά μόνο με αντιγόνα που υπάρχουν σε μερικά μελανοκύτταρα σε κανονικό δέρμα (Σχήμα 2Α, παράδειγμα υποδεικνύεται από το βέλος). χρώση ραφή 3 φαίνεται να είναι σε μεγάλο βαθμό κυτταροπλασματική με χαρακτηριστική κοκκώδη εμφάνιση. SEAM 3 σύνδεσης με αντιγόνα που υπάρχουν σε φυσιολογικό δέρμα θα μπορούσε να ανασταλεί από περισσότερο από 90%, όταν το mAb προ-επωάστηκαν με Ν-Pr MBPS (50 μg /ml). Ν-Pr MBPS είναι το αντιγόνο πολυσακχαρίτης χρησιμοποιείται για την παραγωγή ραφή 3 [18]. Το αποτέλεσμα δείχνει ότι ραφή 3 πρόσδεση που διαμεσολαβείται από την θέση συνδυασμού αντισώματος.

IHC ανάλυση ραφής 3 και αντι-GD3 δέσμευση σε κανονικό ανθρώπινο δέρμα (Α) και ένα πρωτογενές μελάνωμα (Β). Σταθεροποιημένα με φορμαλίνη κανονικό ανθρώπινο δέρμα (Α) και πρωτογενές μελάνωμα (Β) επωάστηκαν με άσχετο IgG2b, ραφή 3, SEAM 3 με έναν αναστολέα πολυσακχαρίτη Ν-Ργ MBPS, άσχετο IgG3, και αντι-GD3 mAb R24 όπως υποδεικνύεται. Η δέσμευση ανιχνεύθηκε με τη χρήση DAB, το οποίο παράγει ένα καφέ ίζημα. Αντιχρωματισμός διεξήχθη χρησιμοποιώντας αιματοξυλίνη. Το βέλος στην μικρογραφία ραφής 3 σύνδεση σε φυσιολογικό δέρμα παρουσιάζει ένα παράδειγμα ραφή 3 σημειώνοντας λεμφοκυττάρων διηθούντα και για την μικρογραφία αντι-GD3, ένα μελανοκυττάρων. ράβδοι αναφοράς = 40 μm.

Η

Το σκοτεινό χρώση του δείγματος μελανώματος που προκύπτουν από ραφή 3 δέσμευσης (Σχήμα 2Β) δείχνει ότι τα αντιγόνα S3RA εκφράστηκαν στον όγκο. Όπως και με κανονικό δέρμα, SEAM 3 δέσμευσης σε αντιγόνα στο δείγμα μελανώματος ανεστάλη με διαλυτό Ν-Pr MBPS (Σχήμα 2Β). Η έντονη χρώση του δείγματος μελανώματος υποδηλώνει ότι S3RA εκφράστηκε σε υψηλότερα επίπεδα στον όγκο σε σύγκριση με φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα. Όλα τα κύτταρα του όγκου εντός του τμήματος, το οποίο είχε διαστάσεις περίπου 1 cm × 2 cm, βάφτηκαν. Σε αντίθεση, το αντι-GD3 mAb παρουσίασαν ετερογενείς δεσμευτικές στον ιστό όγκου με ορισμένα κύτταρα που χαρακτηρίζεται από την mAb, ενώ άλλοι δεν έδειξαν χρώση (Σχήμα 2Β).

Εκτός από το παράδειγμα πρωτογενούς ανθρώπινου μελανώματος δείχνεται στο Σχήμα 2Β , μια σειρά από 12 μικρότερων πρωτογενών ανθρώπινων δειγμάτων μελανώματος που λαμβάνονται από το δέρμα, του οισοφάγου, παρωτίδας, και του ορθού όγκοι αξιολογήθηκαν για ραφή 3 και άσχετο αντιδραστικότητα IgG2b με IHC. Όλα τα δείγματα μελανώματος στη συστοιχία ήταν αντιδραστικά με ραφή 3, ενώ η άσχετος IgG2b mAb δεν έδειξε αντιδραστικότητα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η ένταση της χρώσης που προκύπτουν από ραφή 3 δεσμευτικός συστοιχία όγκου μελανώματος ήταν παρόμοιο με το παράδειγμα που φαίνεται στο σχήμα 2Β. Δείγματα του φυσιολογικού δέρματος που λαμβάνονται από περιοχές που γειτονεύουν με κάποια από τα μελανώματα που συμπεριλήφθηκαν στη συστοιχία δείγμα παρουσίασαν το ίδιο μοτίβο ραφής 3 αντιδραστικότητας, όπως αυτή που φαίνεται στο Σχήμα 2Α με κανονικό δέρμα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Έκφραση του S3RA σε καρκινικές κυτταρικές σειρές

Δεδομένου ότι η de-Ν-ακετυλο σιαλικού παράγωγο του disialyloganglioside GD3 έχει αναφερθεί ότι υπάρχει σε κυτταρικές σειρές μελανώματος που περιέχει οξύ [24], καθώς και σε πρωτογενείς ανθρώπινους όγκους [26 ] και βρήκαμε ότι ραφή 3 ήταν αντιδραστικό με πρωτοπαθή μελανώματα (Σχήμα 2Β), πραγματοποιήσαμε κυτταρομετρία ροής για να μετρηθεί ραφή 3 δέσμευση με τέσσερις ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές που εκφράζουν διαφορετικά Sia περιέχουν αντιγόνα (Πίνακας 2).

η

το Σχήμα 3 δείχνει πρόσδεση της υποκατηγορίας ταιριαστό άσχετο mAb IgG2b σε σύγκριση με ραφή 3, το αντι-GD3 mAb R24 και αντι-NCAM (CD56) mAb δέσμευση σε SK-MEL-28 μελανώματος και κύτταρα νευροβλαστώματος SH-SY5Y στην απουσία και παρουσία της θεραπείας Triton Χ-100, όπως υποδεικνύεται. Gates καθορισμό κυττάρων ως θετικοί για σύνδεση καθορίστηκαν χρησιμοποιώντας υποτάξη μάρτυρες ισοτύπου και υποδεικνύονται σε κάθε ιστόγραμμα φαίνεται στο Σχήμα 3. Σε περίπτωση απουσίας απορρυπαντικού, το 29% των SK-MEL-28 κύτταρα ήταν θετικά για ραφή 3 σύνδεση σε σύγκριση με το 80% για αντι-GD3 και 3% για το άσχετο mAb. Ωστόσο, όταν τα κύτταρα έγιναν διαπερατά με τα mAbs με επεξεργασία απορρυπαντικού, 82% των κυττάρων SK-MEL-28 ήταν θετικά για ραφή 3 δεσμευτικός και ο σχετικός φθορισμός αυξήθηκε περισσότερο από 10 φορές. Το ποσοστό του αντι-GD3 θετικών κυττάρων αυξήθηκε ελαφρώς σε 92%. Η πρόσδεση του αντι-ΝΟΑΜ mAb ήταν συγκρίσιμο με το άσχετο IgG1 mAb παρουσία ή απουσία απορρυπαντικού και, ως εκ τούτου, Ν-ΟΑΜ δεν εκφράστηκε σε SK-MEL-28 κύτταρα. Για την κυτταρική σειρά SH-SY5Y, το 20% των μη-απορρυπαντικό κατεργασμένα κύτταρα ήταν θετικά για ραφή 3 πρόσδεσης, το οποίο αυξήθηκε σε 96% με την παρουσία του απορρυπαντικού (Σχήμα 3). Επίσης, η σχετική φθορισμός αυξήθηκε κατά περισσότερο από 10 φορές. Μεγαλύτερη από 85% των κυττάρων SH-SY5Y ήταν θετικά για αντι-ΝΟΑΜ και λιγότερο από 21% για το αντι-GD3 πρόσδεσης σε αμφότερες τις ανέπαφες ή διαπερατών κυττάρων. Τα αποτελέσματα συνοψίζονται στον Πίνακα 3 για τις τέσσερις κυτταρικές γραμμές δείχνουν ότι το ποσοστό των κυττάρων που ήταν θετικά για ραφή 3 δεσμευτική και το μέσο φθορισμό των κυττάρων ήταν μεταβλητή μεταξύ των κυτταρικών σειρών που δοκιμάστηκαν. Ωστόσο, τα άθικτα κύτταρα της κάθε κυτταρικής σειράς ήταν σε μεγάλο βαθμό αρνητικό για ραφή 3 δεσμευτική. Αντιθέτως, σχεδόν όλα τα κύτταρα της κάθε κυτταρικής σειράς που περιέχεται ενδοκυτταρικά ραφή 3-δραστικά αντιγόνα (S3RA). Η κυρίαρχη ενδοκυττάρια κατανομή της S3RAs δεν αντιστοιχούσε στην κατανομή των GD3 ή PSA-NCAM, τα οποία εντοπίζεται κυρίως στην κυτταρική επιφάνεια. Το αποτέλεσμα δείχνει ότι S3RAs δεν απο-Ν-ακετυλο Sia παράγωγα είτε GD3 ή PSA-NCAM ή ότι οι ενδοκυτταρικές ομολόγους αυτών των μορίων δεν ήταν αντιδραστικά με τους αντίστοιχους mAbs.

SK-MEL-28 και SH -SY5Y κύτταρα είτε χωρίς θεραπεία για να ανιχνεύσει (άνω πάνελ σε κάθε σύνολο δύο πινάκων) σύνδεση επιφάνεια, ή σε επεξεργασία με Triton-X 100 ανιχνεύει (κάτω πίνακας) δεσμευτικός ενδοκυτταρική με κυτταρομετρία ροής. Τα κύτταρα επωάστηκαν με 5 μg /ml από κάθε πρωτογενές αντίσωμα, που ακολουθείται από επώαση με 2 μg /ml Alexa Fluor 488 δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο. Άσχετο ποντικού IgG2b, IgG3, και IgG1 mAbs χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί μάρτυρες για ραφή 3, αντι-GD3, και αντι-ΝΟΑΜ, αντίστοιχα, και χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό βασικής γραμμής φθορισμού. Δεσμευτική ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας γκουάβα EasyCyte κυτταρομετρητή ροής. Gates χρησιμοποιείται για να ορίσει τα κύτταρα θετικά για σύνδεση υποδεικνύονται στην κορυφή κάθε ιστόγραμμα.

Η

Για να καταδειχθεί η ειδικότητα της δέσμευσης, σταθερές και permabolized Jurkat ή SK-MEL-28 κύτταρα επωάστηκαν με ραφή 3 με την απουσία και παρουσία του αναστολέα Ν-Pr Mbps. Σε αντίθεση με τα δείγματα σταθερού ιστού όμως, οι σχετικά υψηλές συγκεντρώσεις ραφής 3 (5 μg /ml) σε συνδυασμό με το διαλυτό Ν-Ργ MBPS αναστολέα παράγεται διφορούμενα αποτελέσματα. Σε μερικά πειράματα παρατηρήθηκε μερική αναστολή αλλά σε άλλα ο αναστολέας πολυσακχαρίτη είχε καμία επίδραση είτε ή ως αποτέλεσμα την αύξηση στη σύνδεση. Είναι πιθανό ότι οι μεταβλητές αποτελέσματα της προσθήκης Ν-Pr Mbps σε αντίδραση δέσμευσης προέκυψε από την τάση των παραγώγων NeuPSA υπάρχει στο παρασκεύασμα Ν-Pr MBPS να σχηματίζουν συσσωματώματα που είναι πολύ μεγάλα για να ξεφύγουν από τα διαπερατά κύτταρα ή ότι τα κύτταρα έχουν υποδοχείς για NeuPSA που δεσμεύονται επίσης σε Ν-Pr Mbps.

μικροσκοπία φθορισμού.

μικροσκοπία ανοσο-φθορισμού (IFM) χρησιμοποιήθηκε για να διερευνήσει περαιτέρω την κυτταρική τοποθεσία ραφής 3-αντιδραστικά επιτόπια σε απορρυπαντικό χωρίς θεραπεία και υποβλήθηκε σε επεξεργασία SK-MEL-28 και CHP-134 κύτταρα (Σχήμα 4). Τα αποτελέσματα της κυτταρομετρίας ροής πειράματα σύνδεσης με SK-MEL-28 κύτταρα δεν αντιμετωπίζονται ή αντιμετωπίζονται με απορρυπαντικό (Σχήμα 3) πρότειναν ότι ραφή 3 αντιδραστικά επιτόπια είχε ένα κυτταρικό εντοπισμό που ήταν διαφορετικό από GD3 και PSA-NCAM. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα αυτά, μόνο ένα υποσύνολο των SK-MEL-28 και CHP-134 κύτταρα που δεν αντιμετωπίζονται με απορρυπαντικό ήταν αντιδραστικά με ραφή 3 με IFM (ερυθρός φθορισμός στο Σχήμα 4). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, SK-MEL-28 κύτταρα που ήταν πιο αντιδραστικά με ραφή 3 ήταν «στρογγυλοποίηση» κύτταρα με σχετικά συμπυκνωμένο πυρηνικό DNA, όπως φαίνεται από χρώση ϋΑΡΙ. Επίμηκες κύτταρα ήταν λιγότερο αντιδραστικά με ραφή 3 (σύγκρινε SK-MEL-28 κυττάρων σε φως μικρογράφημα φαίνεται στο Σχήμα 4 με IFM). Αντιθέτως, τα αντι-GD3 σημασμένα όλα τα κύτταρα (πράσινο φθορισμό όπως υποδεικνύεται στο Σχήμα 4). Ωστόσο, όταν τα κύτταρα SK-MEL-28 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με απορρυπαντικό, όλα τα κύτταρα ήταν θετικά για ραφή 3 δέσμευσης (Σχήμα 4). Στα κύτταρα απορρυπαντικό επεξεργασμένα, SEAM 3 αντιδραστικότητα διασπείρεται σε όλο το κυτταρόπλασμα στον κόκκο-όπως δομές (Σχήμα 4, παράδειγμα υποδεικνύεται με ένα βέλος). Αντι-GD3 αντιδραστικότητα χαρακτηρίζεται από ένα διάχυτο πρότυπο χρώσης με κηλίδες πυκνού αντιδραστικότητα σε αμφότερες τις μη επεξεργασμένα και απορρυπαντικό-επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 4). Υπήρχε κάποιος βαθμός συν-εντοπισμό εμφανής σε σύνθετες εικόνες ραφής 3 και αντι-GD3-σημασμένο κύτταρα (κίτρινο στο σχήμα 4), αλλά σαφείς διαφορές, καθώς και. Έτσι, SEAM 3 αντιδραστικότητα δεν συσχετίζεται άμεσα με GD3 πλην παρεπόμενες εντόπιση στη μεμβράνη εν απουσία ή παρουσία του απορρυπαντικού και έκφραση της S3RAs περιορίστηκε σε ένα υποσύνολο των κυττάρων.

Φως μικροφωτογραφίες του SK-μελωδία 28 και CHP-134 δείχνουν το γενικό σχήμα των κυττάρων με πυρηνική DNA υποδεικνύονται με μπλε χρώμα. Αντι-NeuPSA mAb ραφή 3 δέσμευση (σε κόκκινο) για να SK-MEL-28 και τα κύτταρα CHP-134 δεν αντιμετωπίζεται ή σε επεξεργασία με Triton Χ-100 για να permeablize τα κύτταρα, συγκρίθηκε με αντι-GD3 και -PSA σε πράσινο, όπως υποδεικνύεται . Υποκυτταρικός εντοπισμός των S3RA σε SK-MEL-28 κύτταρα με Golgi (Giantin, golgin 97 και Τούμπα) και ER είναι (καλνεξίνης) δείκτες φαίνεται στον κάτω πίνακα με κίτρινο χρώμα. Τα βέλη δείχνουν κοκκώδη φυσαλιδώδη-όπως δομές με σχετικά έντονη χρώση ραφή 3. μπαρ αναφοράς = 20 μm.

Η

Σε CHP-134 κύτταρα, ραφή 3-αντιδρώσα επιτόπων (κόκκινο φθορισμό στην Εικόνα 4 CHP-134 κύτταρα όπως υποδεικνύεται) εντοπίστηκαν κυρίως στα σύνορα της επαφής μεταξύ των κυττάρων. αντιγόνα PSA, όπως ανιχνεύεται με το αντι-PSA mAb 2-1-Β [31] (πράσινο φθορισμό στην Εικόνα 4 όπως υποδεικνύεται), επίσης βρίσκονται κυρίως σε περιοχές επαφής κυττάρου-κυττάρου. Παρά το γεγονός ότι ο φθορισμός που προκύπτει από ραφή 3 πρόσδεση ήταν χαμηλότερη, τόσο η σχετική ένταση και την κατανομή του φθορισμού που προκύπτει από την πρόσδεση ήταν παρόμοια με εκείνη του στρώματος 3 σε ακέραια κύτταρα αντι-PSA, όπως φαίνεται από το κίτρινο χρώμα που προκύπτει από υπέρθεση του κόκκινου και του πράσινου φθορισμού σε η σύνθετη εικόνα (Σχήμα 4). Αυτή ήταν ενδεικτική της ραφής 3-σημασμένο αντιγόνο που βρίσκεται στην επιφάνεια των κυττάρων. Επιπλέον, SEAM 3 επισήμανση συσχετίστηκε με την επισήμανση αντι-PSA (Manders «συντελεστής για πράσινο = 0.998) και σε μικρότερο βαθμό με την επισήμανση αντι-ΝΟΑΜ (Manders« συντελεστής για πράσινο = 0.642? Μικρογραφήματα δεν φαίνεται) είτε στην απουσία ή την παρουσία Triton Χ-100. Ωστόσο, όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με απορρυπαντικό υπήρχε λιγότερη επικάλυψη μεταξύ ραφή 3 και επισήμανση αντι-PSA (που υποδεικνύεται από σχετικώς μεγαλύτερη ποσότητα κόκκινου φθορισμού στο απορρυπαντικό αγωγή σύνθετο μικρογραφία) υποδεικνύοντας ότι υπήρχε ένα κλάσμα των αντιγόνων που αναγνωρίζονται από τα mAbs σε κοινές και ξεχωριστά αντιγόνα που αναγνωρίζονται ξεχωριστά.

Δεδομένου ότι σε SK-MEL-28 κύτταρα η πλειονότητα των αντιγόνων που αντιδρούν με ραφή 3 βρίσκονταν σε κοκκώδη όπως δομές στο εσωτερικό των κυττάρων, εκτελέσαμε IFM χρησιμοποιώντας δείκτες για την Golgi και στο ενδοπλασματικό δίκτυο ( ER) για να διαπιστωθεί αν ραφή 3 αντιδραστικότητα σχετίζεται με τα συγκεκριμένα υποκυτταρικά οργανίδια. σημειωτές Golgi περιλαμβάνονται Giantin και golgin-97 για cis /έσω και trans Golgi μεμβράνες, αντίστοιχα, και τούμπα, μια πολυλειτουργική πρωτεΐνη που πιστεύεται ότι εμπλέκονται στη ρύθμιση της κυτταρικής διασταύρωση και ενδοκυτταρική διακίνηση [32] του Golgi που προέρχεται κυστίδια στο κυτταρόπλασμα [33] . Καλνεξίνη, ένας μοριακός συνοδός πρωτεΐνη χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης ER [34]. Όπως φαίνεται από την παρουσία ή την απουσία κίτρινο φθορισμό σε σύνθετες εικόνες, SEAM 3 ήταν ουσιαστικά συν-εντοπισμένη με την Golgi και ER (όπως υποδεικνύεται στο Σχήμα 4) δείκτες. Συν-εντοπισμό αναλύθηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας JACoP [35] σε Εικόνα J. Όλες των δεικτών Golgi και ER βρέθηκαν να έχουν υψηλή colocalization για το δείκτη έναντι ραφή 3 (συντελεστές Manders »για πράσινες όλες μεγαλύτερες από 0,92) με προφανή διανομή S3RAs εκτός των οργανιδίων καθώς και. Το πιο κοντινό συνολική colocalization ήταν μεταξύ 3 και SEAM Tuba όπως φαίνεται στο Σχήμα 4. Έτσι, NeuPSA αντιγόνα ανιχνεύονται χρησιμοποιώντας ραφή 3 ήταν κυρίως που βρίσκεται στο εσωτερικό των κυττάρων και σχετίζεται με το Golgi, ER και κυτταρική μήτρα, αλλά ήταν επίσης παρόντες στην επιφάνεια των υποπληθυσμών κάθε κυτταρική γραμμή.

Έκφραση polysialyltransferases PST και STX σε κυτταρικές σειρές καρκίνου

Οι κυτταρικές σειρές νευροβλαστώματος CHP-134 και SH-SY5Y ήταν γνωστό ότι εκφράζουν υψηλά επίπεδα PSA, με τη μορφή του PSA -NCAM, ενώ Jurkat και SK-MEL-28 κύτταρα δεν ήταν γνωστό ότι εκφράζουν PSA ή ΝΟΑΜ. Δεδομένου NeuPSA είναι πιθανό να προέρχεται από την PSA, μετρήσαμε την έκφραση του polysialyltransferases α2,8 ST8Sia2 (STX) και ST8Sia4 (PST) mRNA στις τέσσερις κυτταρικές γραμμές με ποσοτική PCR. τα κύτταρα SH-SY5Y δειχθεί ότι εκφράζουν και STX και PST [36], και χρησιμοποιήθηκαν για τη σύγκριση των STX και έκφραση PST στις άλλες κυτταρικές σειρές. Χρησιμοποιώντας την απόλυτη ποσοτικοποίηση, προσδιορίσαμε έκφραση STX ήταν υψηλότερη στα κύτταρα SH-SY5Y, με 1,2 × 10

6 αντίγραφα /1 × 10

7 αντίγραφα GAPDH (Σχήμα 5). CHP-134 που εκφράζεται παρόμοια επίπεδα STX, ενώ SK-MEL-28 κύτταρα εξέφρασαν σχεδόν 100-φορές λιγότερο και τα κύτταρα Jurkat που εκφράζονται σχεδόν 1.000 φορές λιγότερο STX. κύτταρα SH-SY5Y εξέφρασε το λιγότερο ποσό των PST σε σύγκριση με τις άλλες τρεις κυτταρικές σειρές, με 9,0 × 10

2 αντίγραφα /1 × 10

7 αντίγραφα GAPDH. CHP-134, SK-MEL-28, και Jurkat κύτταρα εξέφρασαν 60, 140, ή 550-φορές περισσότερο PST, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τα κύτταρα SH-SY5Y (Σχήμα 5).

1 μg συνολικού RNA από κάθε κυτταρική γραμμή μεταγραφεί αντίστροφα σε cDNA, τότε χρησιμοποιείται ως μήτρα στην αντίδραση qRT-PCR. Το mRNA αριθμό αντιτύπου του STX, PST, και GAPDH προσδιορίζεται από μία πρότυπη καμπύλη του σειριακά αραιώνονται πρότυπα δείχνεται στην γραφική παράσταση ως στόχο αντίγραφα mRNA ανά 10

7 αντίγραφα GAPDH mRNA. Οι ράβδοι σφαλμάτων είναι τα SEM τριπλών μετρήσεων από τρία ανεξάρτητα πληθυσμούς κάθε κυτταρική γραμμή.

Η

Εξάρτηση ραφής 3 αντιδραστικότητας με SK-MEL-28 κύτταρα για την έκφραση του polysialyltransferase PST

Για να διαπιστωθεί ότι ραφή 3 αντιδρά με ένα αντιγόνο που προέρχεται από την PSA, ερευνήσαμε αν αναστολή της έκφρασης του polysialyltransferase PST mRNA σε SK-MEL-28 κυττάρων με PST-ειδικό μικρό RNA παρεμβολής (siRNA) θα είχε ως αποτέλεσμα μια μείωση στην ραφή 3-θετικών κυττάρων με κυτταρομετρία ροής. Αρνητικός έλεγχος κωδικοποιημένα siRNA ή PST ειδικού siRNA διαμολύνθηκε σε SK-MEL-28 κύτταρα και μετά από 72 ώρες, η σχετική ποσότητα (RQ) του PST παρούσας μειώθηκε σημαντικά (Ρ & lt? 0,0001) στα κύτταρα επιμολυσμένα με PST siRNA (RQ = 0,124) σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με αρνητικό έλεγχο siRNA (RQ = 1) (Σχήμα 6).

SK-MEL-28 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με 50 ηΜ siRNA επί 72 ώρες εις τριπλούν, τότε το συνολικό RNA από κάθε κυτταρική γραμμή μεταγραφεί αντίστροφα σε cDNA και χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα στην αντίδραση qRT-PCR. Σχετική ποσοτικοποίηση προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη συγκριτική μέθοδο CT, κανονικοποιημένη προς GAPDH mRNA.

Η

Σε αυτό το πείραμα, μόνο το υποσύνολο των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με το siRNA και εξαντλημένο των προϋπαρχόντων παράγωγα PSA θα αναμένεται να δείξουν θανών αντιδραστικότητα με ραφή 3 εάν το αντιγόνο που αντιδρά με το mAb εξαρτώνταν από την δραστηριότητα του PST. Παρά τους περιορισμούς αυτούς, σε τρία ξεχωριστά πειράματα με δύο εκτελέστηκαν εις τριπλούν, το κλάσμα του στρώματος 3-θετικών κυττάρων μειώθηκε σημαντικά σε κύτταρα επιμολυσμένα με PST siRNA σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με περιπλεγμένο siRNA (Πίνακας 4). Το αποτέλεσμα δείχνει σαφώς ότι τα αντιγόνα που αναγνωρίζονται από ραφή 3 σε SK-MEL-28 κύτταρα εξαρτώνται από την έκφραση της PST.

Η

Τα κυτταροτοξικά λειτουργική δραστηριότητα της ραφή 3 εναντίον καρκινικών κυττάρων

Η λειτουργία των S3RA στα κύτταρα είναι άγνωστη. Για να προσδιοριστεί τι επίδραση παρεμβαίνουν στην λειτουργία του S3RA εκφράζονται στην επιφάνεια των κυττάρων θα μπορούσε να έχει, τα κύτταρα επωάστηκαν όλη τη νύκτα με ραφή 3 σε συγκεντρώσεις mAb χρησιμοποιήθηκαν στις μελέτες σύνδεσης που περιγράφονται παραπάνω. Υπό μικροσκοπική εξέταση, τα κύτταρα παρουσίασαν χαρακτηριστικά που υφίστανται απόπτωση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Με βάση αυτή την αρχική παρατήρηση, χρησιμοποιήσαμε δύο ανεξάρτητες δοκιμασίες για να μετρηθεί η επίδραση της ραφή 3 για την βιωσιμότητα των τεσσάρων κυτταρικών γραμμών: κυτταρομετρίας ροής με το αντιδραστήριο ViaCount και δοκιμασία απελευθέρωσης γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH). Η πρώτη βασίζεται στη μεμβράνη διαπερατή και αδιαπέραστη φθορίζουσες χρωστικές δέσμευσης του DNA και την δοκιμασία LDH για την απελευθέρωση της LDH που προκύπτει από την απώλεια της ακεραιότητας της μεμβράνης. Τα αποτελέσματα για την εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση επίδραση της ραφή 3 για την βιωσιμότητα των τεσσάρων κυτταρικών σειρών μετά από 16 ώρες επώασης χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό LDH φαίνεται στο σχήμα 7Α. Καθαρισμένο SEAM 3 ήταν κυτταροτοξική κατά των τεσσάρων κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν, αλλά το αποτέλεσμα ήταν μεταβλητή για κάθε κυτταρική γραμμή. Jurkat κύτταρα ήταν η πιο ευαίσθητη σε ραφή κυτταροτοξικότητα εξαρτώμενη από 3 με τη μεσολάβηση αντισώματος (ADC), ενώ SK-MEL-28 κύτταρα ήταν το λιγότερο ευαίσθητο. Περίπου το 45% των κυττάρων Jurkat και το 25% των κυττάρων SH-SY5Y SK-MEL-28, CHP-134, και σκοτώθηκαν στην υψηλότερη συγκέντρωση ραφή 3 δοκιμάστηκαν. SEAM 3-κυτταροτοξικότητα φάνηκε να σταθεροποιείται σε ένα σταθερό κλάσμα των κυττάρων. Για παράδειγμα, ADC κατά Jurkat και SH-SY5Y κυττάρων που προκαλείται από ραφή 3 πλησίασε ένα μέγιστο σε περίπου 10 μg /ml ραφής 3 με μόνο μια οριακή αύξηση στην θανάτωση στα 20 μg /ml (Σχήμα 7Α). Τα αποτελέσματα μπορεί να αντικατοπτρίζουν το γεγονός ότι τόσο ο αριθμός των κυττάρων και το ποσό της S3RA εκφράζονται από τα κύτταρα ήταν μεταβλητή μεταξύ των κυτταρικών σειρών (βλέπε Πίνακα 3) και ότι η ποσότητα του αντιγόνου παραμένει σχετικά σταθερή στον πληθυσμό των κυττάρων κατά τη διάρκεια της 16 hr χρονική περίοδος. Αποτελέσματα παρόμοια με αυτά που δείχνονται στο Σχήμα 7Α, ελήφθησαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία γκουάβα ViaCount (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για να καταδειχθεί η ειδικότητα του SEAM 3 δραστηριότητα ADC, επιχειρήσαμε να αναστέλλουν τη θανάτωση με διαλυτό Ν-Pr Mbps. Ωστόσο, το πείραμα αναστολή συγχέονται επειδή διαλυτό Ν-Ργ MBPS παρελήφθη από ζώντα κύτταρα με αποτέλεσμα την αξιοσημείωτη αύξηση στην έκφραση του S3RA (BT Hagen και GR Moe, μη-δημοσιευμένο).

(Α), Antibody κυτταροτοξικότητα εξαρτώμενη ραφής 3 έναντι των κυττάρων Jurkat SK-MEL-28, CHP-134, SH-SY5Y, και όπως μετράται με προσδιορισμό απελευθέρωσης LDH. Κάθε κυτταρική γραμμή επωάστηκε με αυξανόμενες συγκεντρώσεις ραφή 3 για 16 ώρες. απελευθέρωση LDH μετρήθηκε και τοις εκατό κυτταροτοξικότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας αυθόρμητης απελευθέρωσης και μέγιστη απελευθέρωση μετά από θεραπεία με Triton Χ-100. (Β), Ανάλυση ραφή 3 απόπτωσης που διαμεσολαβείται από SK-MEL-28 κυττάρων μελανώματος με κυτταρομετρία ροής. SK-MEL-28 κύτταρα επωάστηκαν με ένα άσχετο mAb IgG2b (5 μg /ml), DMSO, 0.1 μΜ σταυροσπορίνη, ή 5 μg /ml ραφή 3 για 12 ή 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με σημασμένο με φθορισμό αννεξίνη V και ιωδιούχο προπίδιο και το κλάσμα των ζωντανών (ανοικτές μπάρες), αποπτωτικά (cross-διαγραμμισμένες ράβδοι), και τα νεκρά κύτταρα (μαύρες ράβδοι) μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής.

Η

ραφή 3 δέσμευσης επάγει απόπτωση σε Jurkat και SK-MEL-28 κύτταρα

για να προσδιορίσετε αν ραφή 3 κυτταροτοξικότητα προέκυψαν από την απόπτωση των κυττάρων Jurkat και SK-MEL-28, συγκρίναμε την επίδραση της ραφή 3 δεσμευτική για τα κύτταρα με την επίδραση της σταυροσπορίνης, ένας γενικός αναστολέας κινάσης ότι είναι ένα κλασικό επαγωγέας απόπτωσης [37]. Στο παράδειγμα που φαίνεται στο Σχήμα 7Β, SK-MEL 28 κύτταρα επωάστηκαν για 12 και 24 ώρες με το άσχετο mAb, DMSO, σταυροσπορίνη, ή ραφή 3, και ο αριθμός των ζωντανών, αποπτωτικών και τα νεκρά κύτταρα ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία κυτταρομετρίας ροής που μετρήθηκε την εμφάνιση της φωσφατιδυλοσερίνης επί της επιφανείας του κυττάρου μέσω δέσμευσης αννεξίνης περιεχόμενο DNA με χρώση ιωδιούχου προπιδίου V και. Όπως φαίνεται στο σχήμα 7Β, η θεραπεία με ραφή 3 ή σταυροσπορίνη αύξησε το ποσοστό των αποπτωτικών και νεκρών κυττάρων μετά από 12 ώρες και 24 ώρες σε σύγκριση με τους ελέγχους IgG2b και DMSO, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα για τα κύτταρα Jurkat επωάστηκαν με 10 μg /ml ραφή 3 ήταν παρόμοια με αυτά που δείχνονται για SK-MEL 28 κύτταρα στο Σχήμα 7Β (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Συζήτηση

Λίγα είναι γνωστά για η έκφραση των αντιγόνων de-Ν-ακετυλο περιέχουν σιαλικό οξύ σε φυσιολογικά ή νοσούντα ανθρώπινους ιστούς. Μελέτες που δημοσιεύτηκαν μέχρι σήμερα έχουν παρουσιάσει στοιχεία για την έκφραση γαγγλιοσιδίων GM3 και GD3 περιέχουν Neu σε μερικές κυτταρικές σειρές καρκίνου και Neu περιέχουν GD3 σε πρωτογενείς ανθρώπινους όγκους μελανώματος [23], [24], [26]. Το εργαστήριο μας έχει δείξει ότι NmB στελέχη και το πρωτοζωικό παράσιτο

Leishmania major

εκφράζουν NeuPSA [19], [20], [38], [39], η οποία δεν είχε περιγραφεί προηγουμένως για οποιοδήποτε οργανισμό.