Abstract

Σκοπός

Ερευνήσαμε τις επιδράσεις της πεγκυλιωμένης ιντερφερόνης-α2Α (PEG-IFN-α2Α) στην ανάπτυξη των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του ήπατος.

Μέθοδοι

Η επίδραση της PEG-IFN-α2Α επί του πολλαπλασιασμού των κυτταρικών γραμμών καρκίνου του ήπατος 13 διερευνήθηκε

σε

vitro

. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν με μέσο που περιέχει 0-4,194 ng /mL του PEG-IFN-α2Α, και μετά από 1, 2, 3, ή 4 ημέρες καλλιέργειας, μορφολογικές και παρατήρησης δοκιμασία ανάπτυξης διεξήχθησαν. Αφού τα κύτταρα ηπατοκυτταρικού καρκινώματος (HCC) (HAK-1B και ΚΙΜ-1) μεταμοσχεύθηκαν σε γυμνούς ποντικούς, διάφορες δόσεις PEG-IFN-α2Α χορηγήθηκαν υποδορίως στους ποντικούς μία φορά την εβδομάδα για 2 εβδομάδες, και ο όγκος του όγκου, του βάρους, και εξετάστηκαν ιστολογία.

Αποτελέσματα

PEG-IFN-α2Α ανέστειλε την ανάπτυξη των 8 και 11 κυτταρικές γραμμές σε ένα χρόνο- και δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, αντίστοιχα, αν και οι ανασταλτικές συγκεντρώσεις 50% αύξηση 7 μετρήσιμων κυτταρικών σειρών για την Ημέρα 4 ήταν σχετικά υψηλά και κυμάνθηκαν από 253 ng /mL έως 4.431 ng /mL. Διάφορα επίπεδα της επαγωγής απόπτωσης επιβεβαιώθηκαν σε 8 κυτταρικές σειρές. PEG-IFN-α2Α προκάλεσε μια δοσοεξαρτώμενη μείωση στον όγκο του όγκου και του βάρους, καθώς και μια σημαντική αύξηση των αποπτωτικών κυττάρων στον όγκο. Η υποδόρια χορήγηση της κλινικής δόσης για χρόνια ηπατίτιδα C (3 μg /kg, 0,06 μg /ποντικό) ήταν αποτελεσματική και προκαλούμενη μείωση περίπου 30-50% του όγκου του όγκου και του βάρους, σε σύγκριση με τον έλεγχο.

Συμπεράσματα

Αν και

στο

vitro

αντι-πολλαπλασιαστικές επιδράσεις της PEG-IFN-α2Α ήταν σχετικά αδύναμη, PEG-IFN-α2Α που προκαλείται ισχυρή αντι-καρκινικές επιδράσεις στα κύτταρα HCC

στην

vivo

. Τα δεδομένα υποδεικνύουν πιθανή κλινική εφαρμογή του PEG-IFN-α2Α για την πρόληψη και θεραπεία του HCC

Παράθεση:. Kusano Η, Akiba J, Ogasawara S, Sanada S, Yasumoto Μ, Nakayama Μ, et al. (2013) πεγκυλιωμένη ιντερφερόνη-α2Α αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του ήπατος

In Vitro

και

In Vivo

. PLoS ONE 8 (12): e83195. doi: 10.1371 /journal.pone.0083195

Επιμέλεια: Ντιέγκο Calvisi, Institut für Pathologie, Greifswald, Γερμανία, Γερμανία

Ελήφθη: 19 Αυγ του 2013? Αποδεκτές: 10 του Νοέμβρη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 12 του Δεκέμβρη 2013

Copyright: © 2013 Kusano et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε εν μέρει από τις Cousins ​​Sarah Memorial Ταμείο, Βοστώνη, Μασαχουσέτη, και από μια Grant-in-Aid από το Υπουργείο Υγείας, Εργασίας και Πρόνοιας της Ιαπωνίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

οι ιντερφερόνες (IFNs) είναι τύποι κυτοκίνης που παράγονται από κύτταρα ξενιστές, όπως τα λευκοκύτταρα, σε απόκριση σε φλεγμονή. Από IFNs έχουν αντι-ιική δράση, αντιπολλαπλασιαστική δραστικότητα και διάφορες ανοσορυθμιστικές δραστηριότητες, θεραπεία με IFN χρησιμοποιείται για τη θεραπεία ασθενών με χρόνια ιογενή ηπατίτιδα ή ορισμένων τύπων καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων κακοήθους μελανώματος, σύνδρομο επίκτητης ανοσοανεπάρκειας που σχετίζονται με το σάρκωμα Kaposi και μερικές αιματοποιητικές κακοήθειες [1,2]. Lai et αϊ επίσης έδειξαν ότι η ανασυνδυασμένη ΙΡΝα είναι χρήσιμη στην παράταση επιβίωσης μεταξύ των ασθενών με ανεγχείρητο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) [3]. Επιπλέον, ορισμένες μελέτες έδειξαν θεραπεία με IFN μπορεί να αποτρέψει είτε εμφάνιση ή υποτροπή μετά την αρχική θεραπευτική αγωγή ηπατοκυτταρικού καρκινώματος, όπως εκτομή ήπατος και καυτηρίαση με ραδιοσυχνότητες, σε ασθενή με χρόνια ιογενή ηπατίτιδα [4-7]. Αυτός ο καρκίνος προληπτικό αποτέλεσμα του IFNs θεωρείται κυρίως ως αποτέλεσμα του αντι-ιική δράση τους και την επακόλουθη καταστολή της φλεγμονής, και μπορεί να οφείλεται σε άμεση αντικαρκινική δράση τους έναντι κλινικώς μη ανιχνεύσιμη HCC, καθώς και. Η λεπτομερής μηχανισμός της αντικαρκινικής επίδρασης των IFN, ωστόσο, παραμένει ασαφής.

PEG-ιντερφερόνη-α2Α (PEG-IFN-α2Α) και πεγκυλιωμένη ιντερφερόνη-α2b (PEG-IFN-α2b), τα οποία χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία ασθενών με τον ιό της χρόνιας ηπατίτιδας C (HCV) ή τον ιό Β (HBV) μόλυνση, τα τροποποιημένα IFNs που έχουν μακρύτερες ημιζωή ορού στο σώμα από ό, τι μη πεγκυλιωμένη μορφές IFNs, ως εκ τούτου μπορούν να χορηγούνται σε ασθενείς μόνο μία φορά την εβδομάδα, ενώ ένα πρότυπο IFN χωρίς πολυαιθυλενογλυκολίωση χρησιμοποιούνται πρέπει να εγχυθεί μέχρι τρεις έως πέντε φορές μια εβδομάδα. Αυτό ένεση μία φορά την εβδομάδα πολυαιθυλενογλυκολιωμένης IFNs σε συνδυασμό με την καθημερινή στοματική δοσολογία του αναλόγου νουκλεοζίτη ριμπαβιρίνη έχει βελτιώσει σημαντικά τον ρυθμό της παρατεταμένης ιολογικής ανταπόκρισης σε ασθενείς με χρόνια λοίμωξη HCV και πήρε μια θέση ως θεραπεία πρώτης γραμμής [8,9] . Αναφέραμε προηγουμένως ότι η PEG-IFN-α2b το οποίο περιέχει 12 kDa πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG) έχει ισχυρότερες επιπτώσεις κατά του όγκου

in vivo

από μη πεγκυλιωμένη IFNs και αυτό το αποτέλεσμα θα μπορούσε να υποδεικνύει ότι η συνεχής έκθεση σε IFNs καρκινικά κύτταρα στο σώμα είναι πιο αποτελεσματική από τη συνεχή έγχυση [10]. Με βάση την ανωτέρω περιγραφείσα φόντο, εξετάσαμε την δράση αναστολής αναπτύξεως της PEG-IFN-α2Α το οποίο περιέχει δύο αλυσίδες 20 kDa PEG και έχει το χρόνο ημιζωής μεγαλύτερο ορού μεταξύ κλινικά διαθέσιμα IFNs σχετικά με τον καρκίνο του ήπατος κυτταρικές σειρές

σε vitro

και

in vivo

.

Μέθοδοι

γραμμές κυττάρων και κυττάρων Πολιτισμού

Αυτή η μελέτη χρησιμοποίησε 11 κυτταρικές σειρές HCC (ΚΙΜ-1, Kyn-1, Kyn-2, Kyn-3, HAK-1A, HAK-1Β, HAK-2, HAK-3, HAK-4, HAK-5, και HAK-6) και 2 του ανθρώπου σε συνδυασμό ηπατοκυτταρικό και χολαγγειοκαρκίνωμα (CHC ) κυτταρικές σειρές (KMCH-1 και KMCH-2). Αυτές οι κυτταρικές σειρές HCC και CHC είχαν αρχικά ιδρύθηκε το εργαστήριο μας, και κάθε κυτταρική σειρά διατηρεί τα μορφολογικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά του αρχικού όγκου, όπως περιγράφεται αλλού [11-20]. Από ογκογενετικότητας είναι υψηλότερη σε HAK-1Β και κύτταρα ΚΙΜ-1 από ό, τι στις άλλες 11 κυτταρικές σειρές που έχουμε, χρησιμοποιήσαμε αυτές τις δύο κυτταρικές σειρές για

in vivo

μελέτη.

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε Dulbecco Τροποποιημένο Μέσο Eagle (Nissui Seiyaku, Οο, Japan) συμπληρωμένο με 2.5% θερμο-απενεργοποιημένο (56 ° C, 30 λεπτά) βόειο εμβρυϊκό ορό (FBS, Bioserum, Βικτώρια, Αυστραλία ), 100 U /mL πενικιλλίνη, 100 μg /mL στρεπτομυκίνη (GIBCO BRL /Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) και 12 mmol /L διττανθρακικό νάτριο, σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 στον αέρα σε 37 ° C.

IFN και Αντιδραστήρια

PEG-IFN-α2Α (PEGASYS

®, Chugai Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo, Japan) με την ειδική δραστηριότητα 1,4 Χ 10

7 IU /mg πρωτεΐνης και μη πεγκυλιωμένη ΙΡΝ-α2Α (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Γερμανία) με εκείνη του 2,0 Χ 10

8 IU /mg πρωτεΐνης χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη.

Anti-βρωμοδεοξυουριδίνης (BrdU) αντίσωμα και ισοθειοκυανική φθορεσκεΐνη-συζευγμένη ανοσοσφαιρίνη αντι-ποντικού κατσίκας (FITC-GAM) αγοράστηκαν από την Becton Dickinson Immunocytometry Systems USA (San Jose, CA)? ελέγχει την κανονική IgG ποντικού

1, από την ϋΑΚΟ (Glostrup, Δανία)? αντίσωμα αρουραίου έναντι ενδοθηλιακών κυττάρων ποντικού (αντι-CD34, κλώνος MEC14.7), από Serotec Co., UK? και μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού κατά της ανθρώπινης α-λείου μυός ακτίνη (SMA) που αντιδρά εγκάρσια με α-SMA ποντικού (κλώνος 1Α4).

Επίδραση της PEG-IFN-α2Α επί του πολλαπλασιασμού του HCC και CHC Κυτταρικές Γραμμές

in vitro

η

Οι επιδράσεις της PEG-IFN-α2Α για την ανάπτυξη των καλλιεργημένων κυττάρων εξετάστηκαν με χρωματομετρία χρησιμοποιώντας 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) 2,5- διφαινυλ τετραζόλιο (ΜΤΤ) κιτ δοκιμασίας (Chemicon, Temecula, CA), όπως περιγράφεται αλλού [18,21]. Εν συντομία, τα κύτταρα (1,5 ~ 8 Χ 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων (Nunc, Inc., Roskilde, Denmark), καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες, και το μέσο καλλιέργειας αλλάχθηκε με ένα νέο μέσο με ή χωρίς PEG-IFN-α2Α (0.016, 0.064, 0.256, 1.024, 4.096, 16.4, 65.5, 262, 1048, ή 4194 ng /mL). Μετά από καλλιέργεια για 24, 48, 72 ή 96 ώρες, ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων μετρήθηκε με ImmunoMini NJ-2300 (Nalge Nunc International, Tokyo, Japan) με τον καθορισμό του μήκους κύματος δοκιμή στα 570 nm και το μήκος κύματος αναφοράς στα 630 nm. Για να διατηρείται η οπτική πυκνότητα εντός γραμμικής περιοχής, όλα τα πειράματα διεξήχθησαν ενώ τα κύτταρα ήταν στη λογαριθμική φάση ανάπτυξης.

Ποσοτική ανάλυση των αποπτωτικών κυττάρων που επάγεται από PEG-IFN-α2Α

HAK-1Β ή κύτταρα που καλλιεργήθηκαν μόνο με μέσο (έλεγχος) 1 ΚΙΜ-μη πεγκυλιωμένη ΙΡΝ-α2Α (10 ng /ml = 2000 IU /ml) ή PEG-IFN-α2Α (144 ng /ml = 2000 IU /ml) για 72 ώρες βάφτηκαν με αννεξίνης V-EGFP (ενισχυμένη πρωτεΐνη uorescent πράσινο fl) Apoptosis Detection κιτ (Medical & amp? Biological Laboratories Co., Ltd.) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά τη χρώση, τα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας FACScan (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA), και αννεξίνης V-EGFP-θετικό ποσοστό αποπτωτικών κυττάρων προσδιορίστηκε.

μορφολογική παρατήρηση

Για μορφολογική παρατήρηση κάτω από ένα μικροσκόπιο φωτός, καλλιεργημένα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες Lab-Tek καλλιέργειας ιστού θάλαμο (Nunc, Inc.), καλλιεργήθηκαν με ή χωρίς PEG-IFN-α2Α (262, 1048 ή 4194 ng /mL) για 72 ώρες, σταθεροποιήθηκαν για 10 λεπτά σε διάλυμα Carnoy, καθώς και χρώση με αιματοξυλίνη-ηωσίνη (ΗΕ).

Επιπτώσεις της PEG-IFN-α2Α για HCC κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε άτριχα ποντίκια

Όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από την θεσμική επιτροπή για τα πειράματα σε ζώα στον Kurume University School of Medicine (Αριθμός Άδειας: 1334) , και διεξάγεται σύμφωνα με τον οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας και των κανονισμών για τα πειράματα σε ζώα των Kurume University School of Medicine. Τα ποντίκια θανατώθηκαν με αυχενική εξάρθρωση υπό αναισθησία με διαιθυλαιθέρα και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία. Καλλιεργημένα HAK-1Β ή ΚΙΜ-1 (10

7 κύτταρα /ποντικό) υποδορίως (sc) με ένεση μέσα στις πλάτες των 5 εβδομάδων θηλυκών BALB /c αθυμικά γυμνά ποντίκια (Clea Japan, Inc., Osaka, Ιαπωνία ). Πέντε έως επτά ημέρες αργότερα, όταν η μεγαλύτερη διάμετρος του όγκου, η οποία μετρήθηκε με τη χρήση πάχους, έφθασαν περίπου 5 ~ 10 mm (Ημέρα 0), ο όγκος του όγκου (mm

3) υπολογίστηκε με την εξίσωση «η μεγαλύτερη διάμετρος Χ (η μικρότερη διάμετρος)

2 Χ 0,5 ‘, και στη συνέχεια, οι ποντικοί διαιρέθηκαν σε 5 ομάδες (η = 8 κάθε φορά). Ο όγκος του όγκου μετρήθηκε την ημέρα 0, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, και 14. Mouse σωματικό βάρος μετρήθηκε την ημέρα 0, 8, και 14. Μετά τη θεραπεία 2 εβδομάδων, οι ποντικοί θανατώθηκαν την Ημέρα 15 και το πραγματικό βάρος όγκου μετρήθηκε επίσης. Στο πείραμα 1, οι 5 ομάδες των 8 ποντικών έλαβαν είτε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) (έλεγχος) ή PBS με τις διαφορετικές δοσολογίες των PEG-IFN-α2Α (0,06 – 60 μg) μία φορά την εβδομάδα για 2 συνεχόμενες εβδομάδες (Ημέρα 1 και την Ημέρα 8). Η κλινική δόση των PEG-IFN-α2Α σε χρόνια θεραπεία της ηπατίτιδας C είναι περίπου 3 μg /kg και είναι ισοδύναμη με τη χαμηλότερη δόση (0,06 μg /ποντικό = 840 IU /ποντικό) σε αυτό το πείραμα. Μετά τη θανάτωση, χειρουργικά αφαιρεθέντων όγκων χρησιμοποιήθηκαν για μορφολογικές μελέτες (π.χ., ΗΕ χρώση και ανοσοϊστοχημεία) και ενζυμική ανάλυση ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA). Κάθε ποντικός έλαβε μία ενδοπεριτοναϊκή ένεση 1 mg των BrdU 30 λεπτά πριν από τη θανάτωση. Στο πείραμα 2, για την εξέταση της διαφοράς μεταξύ μη πεγκυλιωμένη και πεγκυλιωμένη IFNs, 5 ομάδες των 8 ποντικών έλαβαν είτε PBS (έλεγχος), PBS με 0,0042 ή 0,042 μg ΙΡΝ-α2Α (840 ή 8400 IU, αντίστοιχα), ή PBS με 0,06 ή 0,6 μg του PEG-IFN-α2Α (840 ή 8400 IU, αντίστοιχα). Σε αυτό το πείραμα, τα βάρη των όγκων την ημέρα 15 και οι αριθμοί των αποπτωτικών κυττάρων συγκρίθηκαν μεταξύ των ομάδων.

μορφολογική εξέταση των υποδόριων όγκων γυμνών ποντικών

Ο αριθμός των κυττάρων που παρουσιάζουν τα χαρακτηριστικά της απόπτωσης (π.χ. κυτταροπλασματική συρρίκνωση, συμπύκνωση χρωματίνης, και η πυρηνική κατάτμηση) μετρήθηκε σε τρεις τουλάχιστον 0,25 mm

λήφθηκε 2-περιοχές μέσα σε ένα HE-χρωματισμένο δείγμα, και ο μέσος αριθμός ανά περιοχή. Η τεχνική TUNEL (ApopTag

® υπεροξειδάσης

In Situ

απόπτωση Detection Kit, Chemicon International, Inc., CA) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση αποπτωτικών κυττάρων, και λήφθηκε ο μέσος αριθμός των TUNEL θετικών κυττάρων ανά περιοχή, όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα δείγματα επίσης ανοσοχρώση για ενσωματώνεται BrdU χρησιμοποιώντας BrdU Χρώση Kits (Oncogene Research Products, Boston, ΜΑ), και ο μέσος αριθμός των θετικών κυττάρων ανά περιοχή λήφθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω. Επιπλέον, διπλό ανοσοχρώση πραγματοποιήθηκε με αντίσωμα ενδοθηλιακού κυττάρου αντι-ποντικού, αντι-ανθρώπινο αντίσωμα α-SMA, Histofine απλή κηλίδα ποντίκι MAX-ΡΟ (Rat) σετ (Nichirei, Tokyo, Japan), και HistoMouse ™ -συν κιτ για ανιχνεύουν αρτηρία-όπως τα αιμοφόρα αγγεία, όπως περιγράφεται στην προηγούμενη έκθεσή μας [21,22]. Ο αριθμός διπλών-ανοσοχρώση-θετικά αιμοφόρα αγγεία στον όγκο μετρήθηκε σε κάθε δείγμα. Κοκκοποίηση ιστός εντός του όγκου αποκλείστηκαν σε καταμέτρηση των αιμοφόρων αγγείων. Το μέγεθος της περιοχής υπολογίζονται μετρήθηκε από τον εντοπισμό το περίγραμμα εμφανίζεται σε μια οθόνη υπολογιστή, χρησιμοποιώντας το Mac ΠΕΔΙΟ (Mitani Corp., Chiba, Japan). Από το ληφθέν αριθμό των σκαφών ανά μονάδα επιφάνειας (mm

2), η μέση ομάδα λήφθηκε για σύγκριση ομάδα.

Ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA)

Τμήματα του εκτομή ξενομοσχεύματος όγκοι ομογενοποιήθηκαν σε 500 μΙ παγωμένου Ca

+ και Mg2

2 + -δωρεάν PBS που περιείχε 100 mg /ml φαινυλμεθυλσουλφονυλο fl uoride χρησιμοποιώντας ένα γουδοχέρι σφαιρίδιο. Το μίγμα φυγοκεντρήθηκε για 10 λεπτά (12.000 g, 4 ° C), και το υπερκείμενο αποθηκεύθηκε στους -20 ° C μέχρι τη χρήση. Μετά τον προσδιορισμό της ποσότητας της πρωτεΐνης ιστού στο υπερκείμενο χρησιμοποιώντας ένα αντιδραστήριο ανιχνεύσεως BCA πρωτείνης (Pierce, Rockford, IL), η ποσότητα του βασικού αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών (bFGF) και IL-8 μετρήθηκε με χρήση εμπορικά διαθέσιμων κιτ ELISA ( R &? D Systems, Minneapolis, MN)

Στατιστικά

συγκρίσεις του υπολογιζόμενου όγκου του όγκου και χρωματομετρική ανάπτυξη των κυττάρων πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση δύο παράγοντα παραγοντική ANOVA και Φοιτητών

t

-. δοκιμή, αντίστοιχα. Οι άλλες συγκρίσεις δεδομένων πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το Mann-Whitney U.

Αποτελέσματα

Επιπτώσεις της PEG-IFN-α2Α για τον Καρκίνο του ήπατος κυτταρικού πολλαπλασιασμού

in vitro

Η

Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την προσθήκη 4194 ng /mL του PEG-IFN-α2Α, ήπια αύξηση του σχετικού αριθμού βιώσιμων κυττάρων συνέβη σε 9 κυτταρικές σειρές (όλες οι κυτταρικές σειρές εκτός Kyn-2, HAK-1A, HAK- 6, και KMCH-1). Ωστόσο, μετά από 72 ώρες ή αργότερα, ένα 10% ή περισσότερο μείωση του αριθμού των κυττάρων συνέβη σε όλες τις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 1Α). Σε HAK-2, HAK-3, και HAK-4, HAK-6, και KMCH-2, ο πολλαπλασιασμός κατεστάλη έως 72 ώρες και ο αριθμός των κυττάρων έφθασε σε πλατώ ή ελαφρώς αυξημένη μετά. Στις άλλες κυτταρικές σειρές 8, πολλαπλασιασμός κατεστάλη σε διάφορους βαθμούς έως 96 ώρες.

(Α) Χρονική μεταβολές στις σχετικές αριθμού βιώσιμων κυττάρων (% του ελέγχου) μετά την προσθήκη 4194 ng /mL του PEG-IFN-α2Α. Η ανάπτυξη καταστέλλεται με το χρόνο σε 8 κυτταρικές σειρές. (Β) 96 ώρες μετά την προσθήκη 10 διαφορετικών συγκεντρώσεων PEG-IFN-α2Α. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων καταστέλλεται με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε 11 κυτταρικές γραμμές. Η καταστολή ήταν σημαντική (

P

& lt? 0.0001 ~ 0,05) στις σειρές των 0.016 ~ 4.194 ng /mL της PEG-IFN-α2Α στη HAK-6, 0.256 ~ 4.194 ng /mL σε Kyn-3 και HAK-1A, 4.096 ~ 4.194 ng /mL σε KIM-1, Kyn-1, HAK-1Β, HAK-2 και KMCH-2, 16.4 ~ 4.194 ng /mL σε Kyn-2, HAK-5 και KMCH-1, 262 ~ 4194 ng /mL σε HAK-4, και σε 4.194 ng /mL σε HAK-3 (Student

t

-τεστ). Οκτώ δείγματα χρησιμοποιήθηκαν σε κάθε πείραμα (η = 8). Το πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον 3 φορές για κάθε κυτταρική γραμμή. Οι αριθμοί αντιπροσωπεύουν μέσες ± SE των πειραμάτων.

Η

Ο σχετικός αριθμού βιώσιμων κυττάρων καταστάλθηκε σε 11 κυτταρικές γραμμές (όλες οι κυτταρικές σειρές εκτός HAK-1A και KMCH-2) σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο μετά από τις 96 ώρες την επώαση με ΡΕΟ-ΙΡΝ α2Α (Εικόνα 1Β). Σε 7 κυτταρικές γραμμές (HAK-1B, KMCH-1, ΚΙΜ-1, Kyn-1, HAK-6, Kyn-3, και Kyn-2), ο αριθμός κατεστάλη στο 50% ή λιγότερο με 4194 ng /mL του PEG-IFN-α2Α, και η 50% ανασταλτική συγκέντρωση (IC50) ήταν 253 ng /mL για HAK-1Β, 670 ng /mL για KMCH-1, 1105 ng /mL για ΚΙΜ-1, 1128 ng /mL για KYN- 1, 1302 ng /mL για HAK-6, 1524 ng /mL για Kyn-3, και 4431 ng /mL για Kyn-2. Καμία σχέση δεν ανιχνεύθηκε μεταξύ των ιστολογικών επίπεδο διαφοροποίησης του αρχικού όγκου και ευαισθησία στον αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση των PEG-IFN-α2Α.

Εβδομήντα δύο ώρες μετά την προσθήκη 4194 ng /mL του PEG-IFN-α2Α , 8 κυτταρικές σειρές (όλες οι κυτταρικές σειρές εκτός Kyn-3, HAK-1A, HAK-2, HAK-3, και KMCH-2) έδειξε χαρακτηριστικά της απόπτωσης, π.χ., κυτταροπλασματική συρρίκνωση, η συμπύκνωση της χρωματίνης, και η πυρηνική κατάτμηση, σε διάφορους βαθμούς και με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 2). Η εμφάνιση της απόπτωσης επιβεβαιώθηκε περαιτέρω σε HAK-1Β και ΚΙΜ-1 κύτταρα καλλιεργήθηκαν με 10 ng /ml (= 2.000 IU /ml) του ΙΡΝ-α2Α ή 144 ng /ml (= 2.000 IU /ml) των PEG-ΙΡΝ α2Α με δοκιμασία ανίχνευσης απόπτωσης (Πίνακας 1). Μη-πεγκυλιωμένα ΙΡΝ-α2Α επάγεται πολύ περισσότερο από ό, τι απόπτωση PEG-IFN-α2Α.

(α) χωρίς PEG-IFN-α2Α σε μέσο καλλιέργειας. (Β) Με 4194 ng /mL του PEG-IFN-α2Α σε μέσο καλλιέργειας. Αποπτωτικών κυττάρων (σύντομη βέλη) που χαρακτηρίζεται από κυτταροπλασματική συρρίκνωση, χρωματική συμπύκνωση και πυρηνική κατακερματισμό σημειώθηκαν (χρώση HE, Χ 200).

Η αννεξίνη V-EGFP αποπτωτικών κυττάρων (%)

κυτταρική σειρά

α

Ελέγχου

IFN-α2Α

PEG-IFN-α2Α

HAK- 1B4.1 ± 0,5

b18.5 ± 0.310.9 ± 0.5KIM-19,4 ± 0.447.0 ± 0.229.8 ± 2.1Table 1. Ποσοτική ανάλυση της απόπτωσης σε HAK-1Β ή ΚΙΜ-1.

a Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν μόνο με μέσο (έλεγχος), IFN-α2Α (10 ng /ml = 2000 IU /ml) ή PEG-IFN-α2Α (144 ng /ml = 2000 IU /ml).

b Μέσος όρος ± SE. CSV Λήψη CSV

Επιπτώσεις της PEG-IFN-α2Α για HCC κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε άτριχα ποντίκια

Χρονολογική αλλαγές στο εκτιμώμενο όγκο των όγκων μετά από υποδόρια ένεση των καλλιεργημένων HAK-1Β ή KIM-1cells σε γυμνούς ποντικούς συνοψίζονται στον Σχήμα 3. δοσοεξαρτώμενη καταστολή του όγκου του όγκου παρατηρήθηκε σε ποντικούς που λαμβάνουν PEG-IFN-α2Α. Στο πείραμα των όγκων HAK-1Β, μια σημαντική διαφορά στις αλλαγές στον όγκο του όγκου και του όγκου βάρους παρατηρήθηκε μεταξύ των ποντικών ελέγχου και στα ποντίκια που έλαβαν 0,06, 0,6, 6 ή 60 μα PEG-IFN-α2Α (

P

& lt? 0,0001 με δύο παράγοντα παραγοντική ANOVA? και

P

& lt? 0.001 ~ 0.02 από το Mann-Whitney U, Σχήμα 3Α και Πίνακας 2). Στο πείραμα του ΚΙΜ-1 όγκων, μια σημαντική μείωση του μεγέθους του όγκου παρατηρήθηκε επίσης με τη χρήση της PEG-IFN-α2Α (

P

& lt? 0.001 από δύο παράγοντα παραγοντική ANOVA, Σχήμα 3Β). Υπήρχαν σημαντικές διαφορές στην πραγματικό βάρος του όγκου μεταξύ της ομάδας ελέγχου και των ομάδων PEG-IFN-α2Α, εκτός από το PEG-IFN-α2Α (0.06 μg) ομάδα (Πίνακας 2). Το πραγματικό βάρος του όγκου στο τέλος του πειράματος 2 συνοψίζονται στον Πίνακα 3. Η υποδόρια ένεση του 0.6 μg του PEG-IFN-α2Α επαγόμενη τη σημαντική μείωση του βάρους του όγκου, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου και την ομάδα που έλαβε την ίδια διεθνή μονάδα μη πεγκυλιωμένη IFN-α2Α (

P

& lt? 0.005 και

P

& lt? 0,03, αντίστοιχα). Σε αυτό το πείραμα, δεν υπήρξε σημαντική διαφορά μεταξύ της ομάδας ελέγχου και της PEG-IFN-α2Α (0.06 μg) ομάδα (

P

= 0,078).

Οι ποντικοί έλαβαν υποδόρια ένεση 0,06 (▲), 0.6 (○), 6 (●), ή 60 (Δ) μg του PEG-IFN-α2Α, ή μέσο μόνο (έλεγχος) (□) , μία φορά την εβδομάδα για 2 συνεχόμενες εβδομάδες. Τα βέλη δείχνουν τις ημέρες της ένεσης. Οι αριθμοί αντιπροσωπεύουν μέσες ± SE. *

P

& lt? 0,0001, έναντι των άλλων ομάδων. †

P

& lt? 0.01, έναντι των άλλων ομάδων.

Η

όγκου βάρους (g)

ομάδα Θεραπεία

α

HAK-1Β

ΚΙΜ-1

Control0.303 ± 0,05

b

c1.050 ± 0,24

ePEG-IFN-α2Α (0.06 μg) 0.141 ± 0.03

d0.725 ± 0,17

ΟΕΠΑ-IFN-α2Α (0,6 μg) 0,033 ± 0.010.439 ± 0.04PEG- IFN-α2Α (6 μg) 0,015 ± 0.010.434 ± 0.04PEG-ΙΡΝ-α2Α (60 μg) 0,0 0,076 ± 0.05Table 2. Το βάρος του υποδόριων όγκων του HAK-1Β ή κυττάρων σε γυμνούς ποντικούς 1 ΚΙΜ-κατά τη θανάτωση ( Πείραμα 1).

ένα καλλιεργημένο HAK-1Β ή ΚΙΜ-1 κύτταρα (1.0 Χ 10

7) μεταφυτεύθηκαν υποδορίως σε γυμνούς ποντικούς. Πέντε ομάδες των 8 ποντικών έλαβαν είτε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) (έλεγχος) ή PBS με τις διαφορετικές δοσολογίες των PEG-IFN-α2Α (0,06 – 60 μg) μία φορά την εβδομάδα. Όλα τα ποντίκια θανατώθηκαν και το βάρος όγκου μετρήθηκε την 15η ημέρα.

b Μέσος όρος ± SE.

γ

P

& lt? 0.02, έναντι της ομάδας PEG-IFN-α2Α (0.06 μg)?

P

& lt? 0,001, έναντι της ομάδας PEG-IFN-α2Α (0,6 μg)?

P

& lt? 0,001, έναντι της ομάδας PEG-IFN-α2Α (6 μg).

d.

P

& lt? 0.02, έναντι PEG-IFN-α2Α (60 μg).

e δεν είναι σημαντική, έναντι της ομάδας PEG-IFN-α2Α (0,06 μg)?

P

& lt? 0.03, έναντι της ομάδας PEG-IFN-α2Α (0,6 μg)?

P

& lt? 0.05, έναντι της ομάδας PEG-IFN-α2Α (6 μg)?

P

& lt? 0.01, έναντι της ομάδας PEG-IFN-α2Α (60 μg).

f.

P

& lt? 0.05, έναντι της ομάδας PEG-IFN-α2Α (60 μg). CSV CSV Κατεβάστε ομάδα Θεραπεία

ένα

δράση της ιντερφερόνης (IU)

βάρος του όγκου (ζ)

απόπτωση (Αριθμός κυττάρων /0,25 χιλιοστών

2)

Control0 IU0.726 ± 0,09

b, c7.6 ± 0,9

dIFN-α2Α (0,0042 μg) 840 IU0.588 ± 0,07

d7.9 ± 0,9

gIFN-α2Α (0.042 μg) 8.400 IU0.531 ± 0.04

e7.6 ± 0,7

hPEG-IFN-α2Α (0.06 μg) 840 IU0.493 ± 0,04

f8.9 ± 0.9PEG-IFN-α2Α (0,6 μg) 8.400 IU0.355 ± 0,03 9,7 ± 1,0 * Πίνακας 3. Το πραγματικό βάρος και τον αριθμό των αποπτωτικών κυττάρων υποδόριων όγκων κατά τη θανάτωση (Πείραμα 2).

ένα καλλιεργημένο HAK-1Β κύτταρα (1.0 Χ 10

7) υποδορίως μεταμοσχεύθηκαν σε γυμνούς ποντικούς. Πέντε ομάδες των 8 ποντικών έλαβαν είτε PBS (έλεγχος), PBS με 0,0042 ή 0,042 μg ΙΡΝ-α2Α (840 ή 8400 IU, αντίστοιχα), ή PBS με 0,06 ή 0,6 μg του PEG-IFN-α2Α (840 ή 8400 IU, αντίστοιχα). Όλα τα ποντίκια θανατώθηκαν και το βάρος όγκου μετρήθηκε την 15η ημέρα. Ο αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων μετρήθηκε σε τουλάχιστον τρία 0,25 mm

2-περιοχές σε κάθε τμήμα βάφονται με αιματοξυλίνη και ηωσίνη, και ο μέσος αριθμός ανά περιοχή σε κάθε ομάδα αποκτήθηκε.

b Μέσος όρος ± SE.

γ

P

& lt? 0,005, έναντι της ομάδας PEG-IFN-α2Α (0,6 μg).

d

P

& lt? 0.02, έναντι της ομάδας PEG-IFN-α2Α (0,6 μg).

e

P

& lt? 0.03, έναντι της ομάδας PEG-IFN-α2Α (0,6 μg).

f

P

& lt? 0.02, έναντι της ομάδας PEG-IFN-α2Α (0,6 μg).

g

P

& lt? 0.05, έναντι της ομάδας PEG-IFN-α2Α (0,6 μg).

h

P

& lt? 0,001, έναντι της ομάδας PEG-IFN-α2Α (0,6 μg). CSV Λήψη CSV

Η ιστολογική εξέταση των δειγμάτων όγκου HAK-1B βάφτηκαν με ΗΕ αποκάλυψε ότι ο αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων στα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με PEG-IFN-α2Α (0,06 ή 0,6 μg) ήταν σημαντικά υψηλότερη από εκείνη του ελέγχου, και ο αριθμός τους αυξήθηκε κατά εξαρτώμενο από τη δόση (Σχήμα 4, Α και Β? Πίνακας 4). Η συχνότητα εμφάνισης της απόπτωσης σε TUNEL-χρωματισμένες τομές έδειξαν τις ίδιες τάσεις όπως εκείνα που λαμβάνονται σε HE-χρωματισμένες τομές (Σχήμα 4C και Πίνακας 4). Ανοσοϊστοχημική εξέταση της πρόσληψης BrdU σε όγκους HAK-1B αποκάλυψε ότι δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο δείκτη σήμανσης BrdU μεταξύ του ελέγχου και των ομάδων PEG-IFN-α2Α (0,06 ή 0,6 μg) (Πίνακας 4). Όσο για την απόπτωση, παρόμοια ευρήματα παρατηρήθηκαν στο πείραμα 2 στην οποία χρησιμοποιήθηκε ΚΙΜ-1. Η ομάδα που έλαβε αγωγή με 0,6 μg του PEG-IFN-α2Α έδειξε αύξηση του αριθμού των αποπτωτικών κυττάρων από την ομάδα ελέγχου. Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ της ομάδας ελέγχου και της ομάδας ΙΡΝ-α2Α. Επιπλέον, η ομάδα που υπέστη αγωγή με 0,6 μg του PEG-IFN-α2Α (8400 IU) έδειξε μεγαλύτερο αριθμό των αποπτωτικών κυττάρων από αυτούς με 0.042 μα ΙΡΝ-α2Α (8400 IU).

(α) έλεγχο ποντίκι που έλαβαν μόνο μέσο καλλιέργειας. Ο όγκος δείχνει μια συμπαγή διάταξη των κυττάρων του όγκου και μια ημιτονοειδής δομή που μοιάζει στο στρώμα. (Β) Ένα ποντίκι που έλαβαν s.c. ένεση 0,06 μα PEG-IFN-α2Α. Υπάρχουν κάποιες αποπτωτικά καρκινικά κύτταρα χαρακτηρίζονται από συρρίκνωση και ηωσινοφιλική αλλαγή στο κυτταρόπλασμα, συμπύκνωση χρωματίνης και /ή ο κατακερματισμός των πυρήνων (βέλη, ΗΕ χρώση, Χ200). (Γ) Το ίδιο όγκο όπως φαίνεται στο (Β). Υπάρχουν κάποιες TUNEL-θετικά κύτταρα δείχνουν καφέ πυρήνες (βέλη, βάφονται με την τεχνική TUNEL, X200).

Η απόπτωση

b (Αριθμός κυττάρων /0,25 χιλιοστών

2)

BrdU επισήμανση Δείκτης

C (Αριθμός θετικών κυττάρων /0,25 χιλιοστών

2)

ομάδα Θεραπεία

α

HE λεκέ

μέθοδο TUNEL

ελέγχου 8,4 ± 0,8

δ, ε 9,6 ± 1,1

e32.3 ± 1,6

ΟΕΠΑ-IFN-α2Α (0.06 μg) 12,2 ± 1.015.4 ± 1.827.0 ± 2.6PEG-IFN-α2Α (0,6 μg) 12,4 ± 0.916.1 ± 1.531.3 ± 6.9Table 4. Οι αριθμοί των αποπτωτικών κυττάρων και BrdU-θετικών κυττάρων σε ανθρώπινους όγκους HCC υποδορίως μεταμοσχευθεί σε γυμνούς ποντικούς.

α κύτταρα καλλιεργημένα HAK-1Β (1,0 Χ 10

7) μεταφυτεύθηκαν υποδορίως σε γυμνούς ποντικούς. Πέντε ομάδες των 8 ποντικών έλαβαν είτε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) (έλεγχος) ή PBS με τις διαφορετικές δοσολογίες των PEG-IFN-α2Α (0,06 – 60 μg) μία φορά την εβδομάδα. Όγκοι των ποντικών που έλαβαν 6 ή 60 μα PEG-IFN-α2Α δεν θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν επειδή οι όγκοι ήταν πολύ μικρά για να αξιολογηθεί. Όλα τα ποντίκια θανατώθηκαν την 15η ημέρα. β Ο αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων μετρήθηκε σε τουλάχιστον τρία 0,25 mm

ελήφθη

2-περιοχές σε κάθε τμήμα βάφονται με αιματοξυλίνη και ηωσίνη, και ο μέσος αριθμός ανά περιοχή σε κάθε ομάδα. Ο αριθμός των TUNEL θετικών κυττάρων μετρήθηκε επίσης με τον ίδιο τρόπο.

C Ο αριθμός των BrdU-θετικών κυττάρων μετρήθηκε σε τουλάχιστον τρία 0,25 mm

2-περιοχές σε κάθε τμήμα, και ο μέσος αριθμός ανά περιοχή σε κάθε ομάδα ελήφθη ως το δείκτη σήμανσης.

D Μέσος όρος ± SE.

e

P

& lt? 0.02, έναντι των άλλων ομάδων.

f. Δεν είναι σημαντική, έναντι των άλλων ομάδων. CSV Λήψη CSV

Η εκτομή του όγκου της ομάδας PEG-IFN-α2Α έδειξε κοκκιώδη ιστό στο μέσον του όγκου σε διάφορους βαθμούς (Σχήμα 5). Αρτηρίες που εμφανίστηκε στην κοκκιώδη ιστό αποκλείστηκαν σε αιμοφόρο αγγείο μετρούν εντός του όγκου. Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στον αριθμό των αιμοφόρων αγγείων ανά μονάδα επιφάνειας εντός του όγκου HAK-1Β και την έκφραση του bFGF και IL-8 στους όγκους μεταξύ της ομάδας PEG-IFN-α2Α και την ομάδα ελέγχου (Σχήμα 5? Πίνακας 5 ). Οι

(Α) Τα κύτταρα όγκου αντικαθίσταται με μεγάλα κοκκιώδη ιστό στο μέσον της εκτομή όγκου. (Αιχμές βελών, HE χρώση, X20). (Β) αρτηρία-όπως τα αιμοφόρα αγγεία στον όγκο (βέλος, ΗΕ χρώση, Χ200). (C) αρτηρία-όπως αιμοφόρων αγγείων στον όγκο (βέλος, CD34 /α-SMA διπλή ανοσοχρώση, X200).

Η αρτηρία-όπως αιμοφόρων αγγείων

b (Αριθμός σκαφών /mm2 )

Επίπεδα στο λύμα όγκου

C (pg /40 μg κυτταρικής πρωτεΐνης)

ομάδα Θεραπεία

ένα

Μέσα του όγκου

bFGF

IL-8

Control0 0,104 ± 0,02

d, e14.0 ± 1,8

e2.8 ± 1,0

ePEG-IFN-α2Α (0.06 μg) 0,194 ± 0.0519.8 ± 2.14.9 ± 1.3Table 5. Αριθμοί αρτηρία-όπως τα αιμοφόρα αγγεία, και Enzyme-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA) των παραγόντων αγγειογένεσης σε ανθρώπινους όγκους HCC υποδορίως μεταμοσχευθεί σε γυμνούς ποντικούς.

α κύτταρα καλλιεργημένα HAK-1Β (1,0 Χ 10

7) ήταν υποδορίως μεταμοσχευθεί σε γυμνούς ποντικούς. Πέντε ομάδες των 8 ποντικών έλαβαν είτε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) (έλεγχος) ή PBS με τις διαφορετικές δοσολογίες των PEG-IFN-α2Α (0,06 – 60 μg) μία φορά την εβδομάδα. Όγκοι των ποντικών που έλαβαν 0,6, 6 ή 60 μα PEG-IFN-α2Α δεν θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν επειδή οι όγκοι ήταν πολύ μικρά για να αξιολογηθεί. Όλα τα ποντίκια θανατώθηκαν την 15η ημέρα.

b Ο αριθμός των αρτηρίας-όπως τα αιμοφόρα αγγεία εντός του όγκου μετρήθηκε σε κάθε ενότητα, και λήφθηκε ο μέσος αριθμός ανά περιοχή σε κάθε ομάδα.

C τα επίπεδα έκφρασης του βασικού αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών (bFGF) και IL-8 των εκτομή όγκων μετρήθηκαν με ELISA.

D Μέσος όρος ± SE.

e. Δεν είναι σημαντική, έναντι της ομάδας PEG-IFN-α2Α (0.06 μg). CSV Λήψη CSV

Συζήτηση

Στο

in vitro

μελέτη, δείξαμε ότι PEG-IFN-α2Α αναστέλλουν την ανάπτυξη των 8 και 11 από τα 13 κυτταρικές σειρές σε ένα χρόνο και δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, ωστόσο, PEG-IFN-α2Α ήταν προφανώς λιγότερο δραστικό σε IC50 βάση, σε σύγκριση είτε με PEG-IFN-α2Β ή IFN-α2Β ή συναίνεσης ΙΡΝ-α ή BALL-1 λεμφοβλαστοειδούς ΙΡΝ-α η οποία δοκιμάστηκε σε η ίδια πειραματική κατάσταση σε προηγούμενες εκθέσεις μας [10,18,21]. Για παράδειγμα, IC50 για κύτταρα HAK-1b ήταν περίπου 253 ng /ml PEG-IFN-α2Α, 13,1 ng /ml PEG-IFN-α2b, 2,4 ng /ml ΙΡΝ-α 2b, 0,7 ng /ml ΙΡΝ συναίνεσης α και 1,1 ng /ml BALL-1 λεμφοβλαστοειδούς IFN-α. Από την άλλη πλευρά, στην

in vivo μελέτη

, s.c. ένεση του PEG-IFN-α2Α μία φορά την εβδομάδα έδειξε καλύτερη αντικαρκινική δράση σε έναν όγκο όγκου ή βάρους βάση, σε σύγκριση με εκείνη των μη-πεγκυλιωμένη IFN-α2Α. Αυτά τα αποτελέσματα θα μπορούσε να υποστηρίξει την υπόθεσή μας ότι η συνεχής επαφή με IFNs επάγει ισχυρή

in vivo

αντικαρκινική δράση, και δεν είναι εκπληκτικό επειδή είχε αναφερθεί ότι η PEG-IFN-α2Α έδειξε λιγότερο ενεργή in vitro αντι-ιική δράση και αλλά είχε πολύ πιο

in vivo

αντικαρκινική δραστικότητα από ό, τι μη πεγκυλιωμένη ΙΡΝ-α2Α [23]. Δείξαμε επίσης ότι η PEG-IFN-α2Α μπορούν να αναστείλουν τον πολλαπλασιασμό των κυτταρικών σειρών CHC καθώς HCC. Στην δοκιμασία ΜΤΤ, η αύξηση των KMCH-1 ήταν καλά κατασταλεί αν και μια άλλη κυτταρική γραμμή CHC, KMCH-2 δεν ήταν. Μια πιθανή εξήγηση για τη διαφορετική ευαισθησία μεταξύ KMCH-1 και KMCH-2 είναι ότι η προέλευση των KMCH-1 είναι CHC, κλασσικού τύπου και της KMCH-2 CHC με χαρακτηριστικά βλαστικών κυττάρων, ενδιάμεσο κύτταρο υποτύπου σύμφωνα με την τελευταία WHO ταξινόμηση [24]. Τέτοιες ιδιότητες μια βλαστικών κυττάρων του όγκου θα μπορούσε να είναι ο λόγος για αντίσταση IFN. Ένα άλλο ενδιαφέρον εύρημα στο

in vitro

μελέτης είναι η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων του ΜΤΤ δοκιμασία και δοκιμασία ανίχνευσης απόπτωσης. Όταν HAK-1Β ή ΚΙΜ-1 καλλιεργήθηκε με PEG-IFN-α2Α, IC50 για HAK-1Β ήταν πολύ χαμηλότερη από εκείνη για την ΚΙΜ-1 αν και HAK-1B έδειξε μικρότερο ποσοστό αποπτωτικών κυττάρων από ΚΙΜ-1. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι μπορεί να υπάρχουν ορισμένοι μηχανισμοί εκτός από την απόπτωση, που επηρεάζουν την ευαισθησία στην αντικαρκινική δράση των PEG-IFN-α2Α. Αναφέραμε προηγουμένως ότι τόσο πεγκυλιωμένη και μη πεγκυλιωμένη ΙΡΝ-α παρεμπόδισε τον πολλαπλασιασμό των καλλιεργημένων κυττάρων HCC επάγοντας τη σύλληψη του κυτταρικού κύκλου [10,18]. Η έκφραση του υποδοχέα ιντερφερόνης στα κύτταρα του όγκου θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός παράγοντας που σχετίζονται με την κατά του όγκου αποτέλεσμα. Για παράδειγμα, Nagano et al ανέφεραν ότι η έκφραση αυτού του τύπου Ι IFN υποδοχέα επί HCC ιστός μπορεί να είναι ένα χρήσιμο προγνωστικό για την εξεύρεση πιθανών ανταπόκρισης σε θεραπεία συνδυασμού /5-φθοριοουρακίλη INF-α [25]. Ανοσοτροποποιητική από IFNs έχει επίσης μελετηθεί καλά ως παράγοντας που σχετίζονται με αντικαρκινική δράση. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε αθυμικούς ποντικούς, τα οποία στερούνται ώριμων Τ-κυττάρων, και την ανθρώπινη IFN. Δεδομένου Οι IFN είναι εξειδικευμένοι σε είδος [26], μπορούμε να υποθέσουμε ότι αυτή η επίδραση ανοσοτροποποιητικές περιορίζεται στη μελέτη μας, αλλά αυτό θα πρέπει να επιβεβαιωθεί στο μέλλον μελέτη χρησιμοποιώντας το ποντίκι IFN.

Η μορφολογική παρατήρηση των υποδόριων όγκων γυμνών ποντικών αποκάλυψαν ότι s.c. ένεση του PEG-IFN-α2Α επάγουν την σημαντική αύξηση των αποπτωτικών κυττάρων σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Αυτό το αποτέλεσμα στο

in vivo

μελέτη είναι συνεπής με ότι στο

in vitro

μελέτη που δείχνει χαρακτηριστικές αλλαγές της απόπτωσης μετά την προσθήκη PEG-IFN-α2Α.