Αφηρημένο

Μια μείωση στο ποσοστό θνησιμότητας σχεδόν πενήντα τοις εκατό από τον καρκίνο του στόματος χρειάζεται επειγόντως. Βελτιώσεις στην έγκαιρη διάγνωση και πιο αποτελεσματικές προληπτικές θεραπείες θα μπορούσαν να επηρεάσουν μια τέτοια μείωση. Προς το σκοπό αυτό, αναλάβαμε για πρώτη φορά μια εις βάθος φασματομετρία μάζας με βάση ποσοτικούς κυνηγετικό όπλο μελέτη πρωτεομική των μη επεμβατικά συλλέγονται προφορικές βιοψίες βούρτσα. Πρωτεΐνες που απομονώθηκαν από βιοψίες βούρτσα από υγιή φυσιολογικό ιστό, από του στόματος προκαρκινικές βλάβη ιστού (OPMLs), στοματικό καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (OSCC) και συμφωνημένα ιστός ελέγχου συγκρίθηκαν. Σε αναπαραχθεί πρωτεομική σύνολα δεδομένων, το εκκριτικό αναστολέα πρωτεάσης λευκοκυττάρων (SLPI) πρωτεΐνη ξεχώρισαν με βάση τη μείωση της σε αφθονία στα δύο OPML και OSCC βλάβη των ιστών σε σύγκριση με υγιή φυσιολογικό ιστό. Western κηλίδωση σε επιπλέον βουρτσισμένο δείγματα βιοψίας επιβεβαίωσαν μια τάση της σταδιακής φθίνουσα SLPI αφθονία μεταξύ υγιών φυσιολογικών και OPML ιστό, με μια μεγαλύτερη μείωση στην OSCC βλάβη ιστού. Παρατηρήθηκε μία παρόμοια μείωση SLPI

in-vitro

σύγκριση μοντέλο OPML και κυτταρικές σειρές OSCC. Επιπλέον, απολέπιση του στόματος κύτταρα σε ολόκληρο σίελο των ασθενών εμφάνισαν απώλεια SLPI συσχετίζονται με από του στόματος εξέλιξη του καρκίνου. Αυτά τα αποτελέσματα, σε συνδυασμό με τα δεδομένα πρωτεομική υποδεικνύοντας μία μείωση στην SLPI σε συμφωνημένα υγιή ιστό ελέγχου από ασθενείς OSCC σε σύγκριση με ιστό από υγιή φυσιολογικό ιστό, πρότεινε μια συστημική μείωση του SLPI σε στοματική κύτταρα συσχετίζεται με την ανάπτυξη του καρκίνου του στόματος. Τέλος,

in-vitro

πειράματα έδειξαν ότι η θεραπεία με SLPI μειώθηκε σημαντικά δραστηριότητα NF-kB σε ένα OPML κυτταρική σειρά. Τα ευρήματα υποδεικνύουν αντι-φλεγμονώδη δράση σε OPML, υποστηρίζοντας μια μηχανιστική ρόλος του SLPI στην πρόοδο OSCC και προτείνοντας δυναμικό της για προληπτική θεραπεία του σε κίνδυνο στοματικές βλάβες. Συλλογικά, τα αποτελέσματά μας δείχνουν για πρώτη φορά η δυνατότητα για SLPI ως μηχανισμός που βασίζεται σε μη επεμβατικές βιοδείκτη της καρκίνο του στόματος εξέλιξη με δυνατότητες στην προληπτική θεραπεία

Παράθεση:. Yang Υ, Rhodus NL, Ondrey FG, Wuertz ΒΚΚ, Chen X, Zhu Y, et al. (2014) Ποσοτική πρωτεομική ανάλυση των Προφορική Πινέλο βιοψίες Αναγνωρίζει Εκκριτική λευκοκυττάρων αναστολέα πρωτεάσης ως μια πολλά υποσχόμενη, Μηχανισμός-βάση τον καρκίνο του στόματος βιοδεικτών. PLoS ONE 9 (4): e95389. doi: 10.1371 /journal.pone.0095389

Συντάκτης: John M. Koomen, Moffitt Κέντρο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3 του Γενάρη, 2014? Αποδεκτές: 25, Μαρτίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 18 Απριλίου του 2014

Copyright: © 2014 Yang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει με επιχορήγηση 1R01DE017734 από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (ΗΠΑ) για να TJG και ερευνητικές επιχορηγήσεις 81000439 και 81271134 από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας να Υ.Υ. και Y.Z. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Δυστυχώς, το ποσοστό επιβίωσης για τους ανθρώπους διαγνωστεί με καρκίνο του στόματος, κυρίως με τη μορφή της από του στόματος καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (OSCC), είναι μόνο ελαφρώς καλύτερη από το 50% [1]. OSCC προηγείται από την εμφάνιση μιας από του στόματος προ-κακοήθη αλλοίωση, συνήθως λευκοπλακία, η οποία μετατρέπει σε διηθητικό καρκίνο σε 5% έως 17% των περιπτώσεων [2], [3]. Αν διαγνωστεί νωρίς, προληπτικές θεραπείες είναι πιο αποτελεσματικές, αυξάνοντας το ποσοστό επιβίωσης σε 80% ή καλύτερα [4]. Έτσι, υπάρχει επιτακτική ανάγκη για καλύτερους τρόπους για τη διάγνωση και τη θεραπεία σε κίνδυνο OPML ή /και σε πρώιμα στάδια OSCC στοματικές αλλοιώσεις [2].

Επεμβατική τομής βιοψία που ακολουθείται από ιστοπαθολογική εξέταση είναι το τρέχον πρότυπο χρυσού για από του στόματος διάγνωση του καρκίνου του [5]. Δυστυχώς, έχει πολυάριθμους περιορισμούς. Η επεμβατική και δαπανηρή φύση οδηγεί σε λιγότερο συχνή δοκιμή των ύποπτων αλλοιώσεων, και, κατά συνέπεια, μια καθυστερημένη διάγνωση της OSCC [6], [7]. Μια αναδρομική μελέτη διαπίστωσε μόνο για ένα ποσοστό παρακολούθησης 14% για τις βιοψίες νυστέρι μέσα σε μια περίοδο 3 ετών [2]. Επιπλέον, βιοψία νυστέρι είναι επιρρεπείς σε υπο-δειγματοληψία των βλαβών [8], [9], οδηγώντας σε λάθη στη διάγνωση.

Επειδή αυτοί οι περιορισμοί της βιοψίας νυστέρι, μεγάλη προσοχή έχει δοθεί στην ταυτοποίηση μοριακών βιοδεικτών ενδεικτικό της νόσου σε μη επεμβατικά συλλέγονται δείγματα ασθενών [10]. Μία πολλά υποσχόμενη μέθοδος μη επεμβατική δειγματοληψία είναι η χρήση των βιοψιών βούρτσας [11], [12]. Εδώ, ένα σχετικά δύσκαμπτο βούρτσα χρησιμοποιείται για τη συλλογή απαλά ένα δείγμα trans-επιθηλιακά κύτταρα απ ‘ευθείας από τη στοματική βλάβη, ή συμφωνημένα στοματικού βλεννογόνου. Αυτή η συλλογή είναι απλή και φθηνή, με ελάχιστη δυσφορία για τον ασθενή. Το πιο σημαντικό είναι ότι παρέχει μια δυνητικά πλούσια σε πληροφορίες δειγματοληψία των κυττάρων απευθείας από τη βλάβη που μπορεί να αναλυθεί περαιτέρω [11], [12].

Για την ανάπτυξη μη επεμβατικά συλλέγονται μοριακοί βιοδείκτες από βιοψίες πινέλο, υποσχόμενος υποψήφιος μόρια μέσα σε αυτά τα δείγματα πρέπει πρώτα να προσδιοριστούν. τεχνολογίες μεγάλης κλίμακας για το μοριακό προφίλ (π.χ. γονιδιωματική, πρωτεομική) μπορεί να εντοπίσει τέτοια υποψηφίους. Ειδικότερα, η ανάλυση με τη χρήση μάζας πρωτεομικής φασματομετρία με βάση θα μπορούσε να παρέχει όχι μόνο οδηγεί σε αγώγιμη πρωτεΐνη βιοδείκτες από αυτά τα δείγματα, αλλά επίσης υποκείμενες γνώση των μηχανισμών εξέλιξης του καρκίνου και πιθανούς στόχους για θεραπεία. Ωστόσο, η πρωτεομική ανάλυση του στόματος βιοψιών βούρτσα μέσω πρωτεομική MS-based έχει δει περιορισμένη προσοχή [13], [14], ιδίως με τη χρήση των πιο σύγχρονων τεχνολογιών στον τομέα αυτό. Μέχρι σήμερα, κανείς δεν έχει εφαρμοστεί ποσοτική πρωτεομική καραμπίνα MS-που βασίζεται, αναμφισβήτητα το πιο ευέλικτο και σε βάθος μέθοδος για τον χαρακτηρισμό των πρωτεϊνών [15], με την ανάλυση βιοψίας βούρτσα του στόματος.

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε εφαρμόσει ποσοτικούς καραμπίνα MS-based πρωτεομική με την ανάλυση των βιοψιών βούρτσα που συλλέγεται από υγιείς φυσιολογικούς ιστούς, OPML, και OSCC. Μεταξύ ενός αριθμού αναπαραχθεί πρωτεΐνες εμφανίζουν διαφορές αφθονία, η εκκριτική αναστολέα πρωτεάσης λευκοκυττάρων (SLPI) πρωτεΐνης έδειξε δραματική μείωση σε σχέση με φυσιολογικούς ιστούς συσχετίζονται με τα στάδια της εξέλιξης του καρκίνου του στόματος. Αυτή η μειωμένη αφθονία του SLPI επαληθεύτηκε μέσω Western κηλίδωσης σε δείγματα βιοψίας βούρτσα, και παρατηρήθηκε επίσης σε αποφλοιωμένα κύτταρα σε ολόκληρο σίελο από OPML και OSCC ασθενείς. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα των ασθενών, το μοντέλο κυτταρικές γραμμές OPML και OSCC έδειξε επίσης μια μείωση στην SLPI. Επιπλέον, θεραπεία ενός μοντέλου κυτταρικής γραμμής OPML με SLPI έδειξαν αναστολή της δραστικότητας του ΝΡ-κΒ, έναν παράγοντα μεταγραφής που είναι γνωστό ότι παίζει ένα ρόλο σε φλεγμονώδεις μηχανισμούς υποκείμενη ανάπτυξη καρκίνου του στόματος. Συλλογικά, τα αποτελέσματα μας δείχνουν, για πρώτη φορά μια προοδευτική απώλεια του SLPI αφθονία κατά τη μετάβαση από OPML να OSCC, και προτείνουν ένα νέο ρόλο για SLPI ως μηχανισμός σύνδεσης, μη επεμβατική βιοδείκτη του καρκίνου του στόματος, με δυναμικό ως θεραπεία OPML παράγοντα.

Υλικά και Μέθοδοι

ασθενείς και δείγματα

Η μελέτη έγινε με ενημερώθηκε γραπτή συγκατάθεση όλων των δωρητών του δείγματος χρησιμοποιώντας ένα υποκείμενο πρωτόκολλο του ανθρώπου εγκρίθηκαν από το Διοικητικό Institutional Review σε το Πανεπιστήμιο της Μινεσότα (IRB αριθμό μελέτης 0001M34501). Όλες οι συλλογές σάλιο έγιναν χωρίς διέγερση μέσω παθητικής τρέχουν τα σάλια, κατά τη διάρκεια της ημέρας μεταξύ των ωρών 9:00 π.μ. και 17:00. Ολόκληρο το σάλιο και βούρτσα βιοψίες συλλέχθηκαν από 11 ασθενείς που διαγιγνώσκονται με δυσπλαστικών OPML και 11 ασθενείς με OSCC στο Πανεπιστήμιο της Μινεσότα ΩΡΛ κλινική. Για κάθε ασθενή, δείγματα σιέλου αρχικά συλλέχθηκαν, ακολουθούμενη από συλλογή των βιοψιών βούρτσας από τη βλάβη και την υγιή βλεννογόνο του αντίστοιχου ετερόπλευρο περιοχή, χρησιμοποιώντας βούρτσες Ρόβερς Orcellex (Rovers Medical Devices B.V., Ολλανδία). Βούρτσα βιοψίες από βλεννογόνο του στόματος, και ολόκληρο το σάλιο επίσης συλλέχθηκαν από 10 υγιείς εθελοντές. Οι υγιείς εθελοντές δεν είχαν μείζονες παράγοντες κινδύνου για OSCC (μη-καπνιστές, μέτρια έως χαμηλή κατανάλωση αλκοόλ) και ήταν απαλλαγμένα από στοματικές αλλοιώσεις. Αμέσως μετά τη συλλογή, τα δείγματα φυλάχθηκαν στους -20 ° C, και στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε -70 ° C μέχρι τη χρήση. Επιπλέον, συλλέχθηκαν πληροφορίες σχετικά με τον καπνό και το αλκοόλ χρήση των ασθενών. Τα χαρακτηριστικά του πληθυσμού της μελέτης συνοψίζονται στον Πίνακα S1.

τηλέφωνα Γραμμές

κύτταρα MSK Leuk1 [16], που προέρχονται από το στοματικό βλεννογόνο δίπλα στην στοματική λευκοπλακία βλάβες, ήταν ένα δώρο από τον Δρ Peter Σακούλες, Πανεπιστήμιο της Νέας Υόρκης. κύτταρα MSK Leuk1 αναπτύχθηκαν σε KGM-2 Medium (Lonza Walkersville, MD) συμπληρωμένο με εκχύλισμα βόειας υπόφυσης, ανασυνδυασμένο ανθρώπινο παράγοντα επιδερμικής ανάπτυξης, ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ινσουλίνη, υδροκορτιζόνη, επινεφρίνη, και τρανσφερίνης σε 37 ° C σε 5% CO

2 .

τα μετασχηματισμένα ανθρώπινα επιδερμικά κερατινοκύτταρα (rHEK) αθανατοποιημένα με ιό Ad-12 SV40 [17] ελήφθησαν από τον Dr. S. Jhong Rhim στο Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, (Frederick, MD). Η OSCC κυτταρική σειρά CA-9-22 [18], ήταν ένα δώρο από τον Toshio Kuroki, MD. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε ελάχιστο βασικό μέσο Eagle συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, L-γλουταμίνη (5,8 mg /ml), και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (50 μg /ml) στους 37 ° C σε 5% CO

2 ως προσκολλητικά μονοστρωματικές καλλιέργειες.

βουρτσισμένο Προετοιμασία βιοψία δείγματος

Για το MS-με βάση μελέτες πρωτεομικής ανακάλυψη και δυτικές μελέτες κηλίδα επικύρωσης, δείγματα βιοψίας βούρτσα από θέματα που εμπίπτουν στις δύο ομάδες προετοιμάστηκαν με τον ίδιο τρόπο. Προκειμένου να μεγιστοποιηθεί η ανάκτηση των πεπτιδίων και την ελαχιστοποίηση βήματα χειρισμού του δείγματος, χρησιμοποιήσαμε ένα «on-βούρτσα» μέθοδο της πέψης για να παραχθεί ένα διάλυμα πεπτιδίου για ανάλυση MS-based πρωτεομική (βλέπε σχήμα 1, στο τμήμα Αποτελέσματα). Η κεφαλή της βούρτσας βυθίστηκε και λύθηκαν σε 50 mM Tris ρΗ 8,0 με 2% SDS στους 95 ° C για 10 λεπτά με διαλείπουσα περιδίνηση. Κυτταρικά θραύσματα απομακρύνθηκαν με φυγοκέντρηση στα 16 100 χ g και την ανάκτηση του υπερκείμενου σε καθαρό σωλήνα μικροφυγοκέντρησης. ανάκτηση πρωτεΐνης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία BCA (Thermo Scientific). Οι ανακτηθεί πρωτεΐνες στη συνέχεια πέψη και επεξεργασία για μετέπειτα ανάλυση φασματομετρίας μάζας ή χρησιμοποιούνται για την επικύρωση κηλίδας western.

Α. Βουρτσίστε βιοψία συλλογή και το πρωτόκολλο προετοιμασία του δείγματος. Β Πειραματικό σχέδιο για την ποσοτική πειράματα MS-based πρωτεομική. Ένα πείραμα που χρησιμοποιούνται συμφωνημένα ιστών από ασθενείς OPML, ενώ το δεύτερο πείραμα χρησιμοποιήθηκαν συμφωνημένα ιστών από ασθενείς OSCC.

Η

Ισοβαρής Peptide tagging και Προετοιμασία δείγματος

Οι πρωτεΐνες από βουρτσισμένο κύτταρα μειώθηκαν σε DTT για 1 h στους 55 ° C και θρυψίνη πέψη χρησιμοποιώντας ένα τροποποιημένο πρωτόκολλο FASP [19]. Ιωδοακεταμίδιο χρησιμοποιήθηκε ως το αντιδραστήριο αλκυλίωσης κυστεΐνη. Τα προκύπτοντα πεπτίδια αφαλατώθηκαν χρησιμοποιώντας φύσιγγες εκχύλισης στερεάς φάσης (tC18 Sep-pak, Waters). Τα πεπτίδια στη συνέχεια διαλύθηκε σε κατασκευαστή που παρέχονται ρυθμιστικό και σημάνθηκαν με αντιδραστήριο iTRAQ (Applied Biosystems) σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα και αφαλατώθηκε με φυσίγγια Sep-Pak.

Τα δείγματα ήταν επόμενο κλασματωμένο με off-line ημιπαρασκευαστικής HPLC. Τα συνδυασμένα, iTRAQ-επισημασμένα πεπτίδια επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα Α (10 mM μυρμηκικό αμμώνιο ρΗ 10 σε 98:2 νερό: ακετονιτρίλιο) και κλασματοποιήθηκε offline με υψηλό ρΗ C18 ανάστροφης φάσης (RP) χρωματογραφία [20]. Μια MAGIC 2002 HPLC (Michrom BioResources, Inc., Auburn, CA) χρησιμοποιήθηκε με μία στήλη C18 Gemini-NX, 150 mm × 2 χιλιοστά εσωτερική διάμετρο, 5 um σωματιδίων, 110 Μέγεθος A πόρων (Phenomenex, Torrence, CA). Το ρυθμιστικό Α ήταν 10 mM μυρμηκικό αμμώνιο, ρΗ 10 σε 98:2 νερό: ακετονιτρίλιο και το ρυθμιστικό Β ήταν 10 mM μυρμηκικό αμμώνιο, ρΗ 10 σε 10:90 νερό: ακετονιτρίλιο. Ο ρυθμός ροής ήταν 150 μl /min. με μία διαβάθμιση από 0-35% Ρυθμιστικού Β επί 60 λεπτά., ακολουθούμενο από 35-60% επί 5 λεπτά. Κλάσματα συλλέχθηκαν κάθε 2 λεπτά και UV απορρόφηση παρακολουθήθηκε στα 215 nm και 280 nm. Peptide κλάσματα που περιέχουν χωρίστηκαν σε δύο ίσες ομάδες αριθμημένες, «νωρίς» και «αργά». Το πρώτο «νωρίς» κλάσμα συνενώνονται με το πρώτο «αργά» κλάσμα, και ούτω καθεξής. Συνεχόμενα δείγματα ξηράνθηκαν υπό κενό, επανεναιωρήθηκε σε διαλύτη φορτίο (98:2:0.01, νερό: ακετονιτρίλιο: μυρμηκικό οξύ). Πριν από την ανάλυση φασματομετρίας μάζας

Ανάλυση φασματογράφου μάζας

Μια γραμμική παγίδα ιόντων -Orbitrap (LTQ-Orbitrap) μέσου Βέλος (Thermo Fisher Scientific) [21] χρησιμοποιήθηκε για φασματομετρία μάζας. Το όργανο λειτούργησε σε ένα top-ten δεδομένα λειτουργίας εξαρτάται απασχολούν σαρώνει έρευνα σε 30.000 ψήφισμα 300 έως 1.800 m /z. Tandem MS (MS /MS) σαρώσεις αποκτήθηκαν με εύρος απομόνωση των 2 m /z και λειτουργία του κατακερματισμού υψηλότερη ενεργειακή collisional διαστάσεως (HCD). 40% της ενέργειας κανονικοποιημένη σύγκρουσης χρησιμοποιήθηκε με διάρκεια 20 millisecond. Οι αυτόματες ρυθμίσεις ελέγχου κέρδους ήταν 3 × 10

5 ιόντων στην παγίδα ιόντων, και 1 × 10

6 στην Orbitrap. Δυναμική αποκλεισμού χρησιμοποιήθηκε με διάρκεια 15 δευτερόλεπτα και μια καταμέτρηση επαναλήψεων 1.

Πρωτεΐνη Ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση

Raw αρχεία μετατράπηκαν σε mzXml χρησιμοποιώντας msconvert (διανέμεται ως μέρος της ProteoWizard 06/01/1260) . MS /MS φάσματα αναζήτηση ενάντια στην ανθρώπινη βάση δεδομένων UniProt συμπεριλαμβανομένων των κωδικοποιημένων ακολουθιών και πρωτεΐνες κοινή πρόσμειξη (συνολικά 136.002 εγγραφές) χρησιμοποιώντας Sequest v27.0. παραμέτρους αναζήτησης περιλάμβανε 1.6 amu (μονάδες ατομικής μάζας) προδρόμου και 0,8 amu κομμάτι ανοχή μάζα, 2 αναπάντητες διασπάσεις, μερική εξειδίκευση θρυψίνη, σταθερές τροποποιήσεις carbamidomethylated κυστεΐνη, iTRAQ τροποποίηση αντιδραστηρίου σε λυσίνες και το Ν-τελικό άκρο, και μεταβλητή τροποποίηση της οξείδωσης μεθειονίνης. Αποτελέσματα αναζήτησης διηθήθηκαν έως 99% πιθανότητα πρωτεΐνη και 95% πεπτίδιο πιθανότητα σε ικριώματος (v3.3.1, Proteome Software), παράγοντας ένα ποσοστό ψευδών ανακάλυψη του 1%. Πρωτεΐνες ποσοτικά χρησιμοποιώντας προσαρμοσμένες λογισμικό που αναπτύχθηκε στο εσωτερικό [22]. Μόνο πρωτεΐνες που ταυτοποιήθηκαν από δύο ή περισσότερες MS /MS φάσματα αντιστοιχίζονται με τα πεπτίδια θεωρήθηκαν για την ποσοτική ανάλυση. Ρ-τιμές αποδόθηκαν σε κάθε πρωτεΐνη ποσοτικά με τρία ή περισσότερα φάσματα MS /MS, όπως περιγράφεται [22]. Πίνακας S2 δείχνει όλες τις πληροφορίες για τις πρωτεΐνες αναγνωριστούν και να ποσοτικοποιηθούν σε αυτά τα πειράματα.

Western Blotting Πειράματα

Για στύπωση Western τα πειράματα, ένα ανεξάρτητο σύνολο δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε λόγω έλλειψης υλικού δείγματος από το αρχικό σύνολο του δείγματος που χρησιμοποιούνται στην πρωτεομική πειράματα MS-βάση. Τριάντα μικρογραμμάρια (μα) της πρωτεΐνης βιοψίας βούρτσα από κάθε άτομο υποκείμενο αναλύονται σε πειράματα επικύρωσης, ή πενήντα μg πρωτεΐνης από κυτταρολύματα κυτταρικών γραμμών, μαζί με τριάντα μα θετικού πρωτεΐνης ελέγχου, διαχωρίστηκαν με 12% SDS-PAGE. Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη PVDF (Millipore), και ανιχνεύθηκαν με αντι-SLPI πολύκλωνο αντίσωμα κουνελιού (1:250? Abcam ab46763). Οι κηλίδες σημάνθηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση αρμορακίας (1:10,000) και οπτικοποιείται με ένα σύστημα ανίχνευσης ECL (Thermo Scientific).

Στην περίπτωση του πλήρους σιέλου, μη διεγερμένα δείγματα συλλέχθηκαν από έναν ανεξάρτητο σύνολο θέματα (4 υγιείς εθελοντές, 5 ασθενείς με OPML και 5 ασθενείς με πρωτοπαθή OSCC). Ολόκληρο το σάλιο φυγοκεντρήθηκε στα 3000 χ g στους 4 ° C, το υπερκείμενο που περιείχε το διαλυτό κλάσμα των πρωτεϊνών σιέλου συλλέχθηκε, και τα σφαιρίδια του κυττάρου πλύθηκαν με PBS και λύθηκαν για να ληφθούν κυτταρικές πρωτεΐνες. Η συνολική πρωτεΐνη προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία BCA (Thermo Pierce).

Reporter Gene Δοκιμασίες

Οι κυτταρικές γραμμές απλώθηκαν σε 50000 κύτταρα /φρεάτιο σε 12 φρεατίων και συν-επιμολύνθηκαν παροδικώς μέσω TransIT Express Αντιδραστήριο (MirusBio, Madison, WI) με ένα πλασμίδιο γονιδίου αναφοράς pIgκB-Luc 24 ώρες αργότερα μαζί με ένα ρεπόρτερ pCMV Lac-Z περιέχει τον υποκινητή CMV και το γονίδιο Lac-Z σε pcDNA3 για την προσαρμογή για την αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης. Το κατασκεύασμα ανταποκριτή pIgκB-Luc περιέχει τρεις ανοσοσφαιρίνη G-κ αλυσίδα ΝΡ-κΒ sites οδηγεί το γονίδιο λουσιφεράσης δεσμευτική και παρεσχέθη ευγενώς από τον Dr. Κ Brown (NIAID, ΝΙΗ). Μετά από ολονύκτια διαμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη SLPI (R &? Συστήματα D, Minneapolis, ΜΝ). Τα κυτταρικά λύματα αναλύθηκαν μέσω Tropix Διπλή Δοκιμασία Light Reporter Gene (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) σε μια διπλή Tristar ένεση φλας φωτόμετρο (Berthold Technologies, Oak Ridge, ΤΝ). Εννέα επαναλήψεις μετρήθηκαν ανά σημείο δεδομένων.

Αποτελέσματα

Profiling τον καρκίνο του στόματος Εξέλιξη σχετίζονται Dynamics πρωτεΐνη μέσω του MS-based Ποσοτική Πρωτεομική

Δύο γύροι ποσοτικής πρωτεομικής MS-βάση ήταν χρησιμοποιήθηκε (Σχήμα 1Β), με τη χρήση ισοβαρικών επισήμανση πεπτιδίου με το αντιδραστήριο iTRAQ [23] για την ανάλυση διαλυτές πρωτεΐνες απομονώθηκαν από κυτταρικά λύματα ολόκληρων από δείγματα βιοψίας βούρτσα του στόματος. Οι πρώτες σύγκριση ξεχωριστά μίγματα πρωτεΐνης συγκεντρώθηκαν από δύο ιστούς OPML, δύο συμφωνημένα ιστούς έλεγχο OPML, δύο ιστούς OSCC και δύο υγιείς φυσιολογικούς ιστούς. Η δεύτερη σύγκριση ξεχωριστά μίγματα πρωτεΐνης συγκεντρώθηκαν από τέσσερις ιστούς OPML, τέσσερις ιστούς OSCC, τέσσερις συμφωνημένα ιστούς έλεγχο OSCC και τέσσερις υγιείς φυσιολογικούς ιστούς. Ο σχεδιασμός του δείγματος προσδιορίζεται κυρίως από τη διαθεσιμότητα των κλινικών δειγμάτων, η ποσότητα της πρωτεΐνης που διατίθενται από κάθε βιοψία πινέλο και στόχος μας είναι να συγκρίνουμε όλους τους διαφορετικούς τύπους ιστών διαθέσιμα. Ένα σύνολο 643 και 1.164 πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν και ποσοτικοποιούνται, για το πρώτο και δεύτερο ανάλυση iTRAQ και αντίστοιχα. Ο αυξημένος αριθμός των πρωτεϊνών που εντοπίζονται στην δεύτερη ανάλυση ήταν πιο πιθανό να οφείλεται στην αυξημένη ολική πρωτεΐνη λόγω συνένωση περισσότερα δείγματα ασθενών σε σύγκριση με την πρώτη ανάλυση. Πίνακας S2 εμφανίζει πληροφορίες σχετικά με όλες τις πρωτεΐνες προσδιοριστούν και να ποσοτικοποιηθούν σε αυτά τα πειράματα.

Για να δοθεί προτεραιότητα πρωτεϊνών για τα επόμενα πειράματα επικύρωσης, κοιτάξαμε αλλαγές αφθονία για OPML ή OSCC ιστούς σε σύγκριση με τους υγιείς φυσιολογικούς ιστούς ελέγχου σε κάθε πείραμα iTRAQ. Εμείς περαιτέρω περιορισμούς αυτά τα αποτελέσματα από την εξέταση μόνο για εκείνες τις πρωτεΐνες που έδειξαν συνεπή σχετικές διαφορές αφθονία και στα δύο πειράματα iTRAQ. Ένα σύνολο των 21 και 15 πρωτεΐνες πληρούνται αυτά τα κριτήρια για OPML και OSCC ιστούς, αντίστοιχα (Πίνακας 1). Παρά τις αναγνωρισμένες φαινόμενα συμπίεσης λόγου αφθονίας λόγω πρόδρομος παρεμβολή σε μελέτες που βασίζονται tagging ισοβαρή πεπτίδιο [24], [25], παρατηρήσαμε μια σειρά από μάλλον μεγάλο μεταβολών των σχετικών αφθονία (& gt? 2 φορές) στη μελέτη μας. Είναι ενδιαφέρον, μόνο τρεις από αυτές τις πρωτεΐνες έδειξαν αλλαγές αφθονία στους δύο τύπους ιστών (OPML και OSCC) σε σύγκριση με τους υγιείς κανονικό (bold κείμενο στον Πίνακα 1).

Η

αυτών των πρωτεϊνών φαίνεται στον Πίνακα 1, η εκκριτική λευκοκυττάρων αναστολέα πρωτεάσης (SLPI), ξεχώρισαν με βάση την μεγάλη μείωση του στις δύο OPML και OSCC ιστούς σε σύγκριση με υγιή φυσιολογικά (19.5 και 12.4 μέση μείωση αφθονίας για OPML και OSCC ιστούς, αντίστοιχα). Με βάση αυτά τα ευρήματα, και η γνωστή ρόλος του SLPI ως αναστολέας πρωτεάσης με συνδέσεις με καρκίνο του στόματος [26], επιλέξαμε να περαιτέρω επικύρωση και τη διερεύνηση αυτής της πρωτεΐνης. Για το σκοπό αυτό ανέκριναν πρώτος περαιτέρω τα δεδομένα ποσοτική πρωτεομική για SLPI. Αξιοσημείωτη ήταν τα αποτελέσματα από το δεύτερο πείραμα iTRAQ η οποία περιελάμβανε την συμφωνημένα OSCC ιστός υγιούς ελέγχου. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι δεν ήταν μόνο SLPI μειώθηκε στην βλάβη ιστού OSCC σε σύγκριση με υγιείς φυσιολογικούς, αλλά επίσης μειώθηκε στο συμφωνημένα υγιή ιστό σε σύγκριση με υγιή φυσιολογικούς ιστούς (Σχήμα 2). Μια σχετικά μικρή μείωση παρατηρήθηκε επίσης στο πρώτο πείραμα iTRAQ μεταξύ συμφωνημένα ιστών από ασθενείς OPML και υγιείς φυσιολογικούς ιστούς (Πίνακας S2).

Η

Επικύρωση του καρκίνου Εξέλιξη-εξαρτώμενη Dynamics Αφθονία SLPI σε ανεξάρτητα δείγματα

για να επικυρώσετε την παρατηρούμενη μείωση της αφθονίας των SLPI τόσο OPML και τους ιστούς OSCC, επιδιώξαμε πρώτο ημι-ποσοτική δυτική αποτύπωση πειράματα σε επιπλέον δείγματα βιοψίας βούρτσα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, οι κηλίδες Western επιβεβαίωσε τα αποτελέσματα MS-βασίζεται, όπως SLPI αφθονία εμφάνισαν σταδιακή μείωση μεταξύ υγιών φυσιολογικού ιστού και OPML ιστό, με μια πιο δραματική μείωση σε ιστούς OSCC. Σχήμα S1 παρουσιάζει τα αποτελέσματα του ελέγχου φόρτωσης μέσω συνολική χρώση των πρωτεϊνών των μεμβρανών που χρησιμοποιούνται για τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο Σχήμα 3. Επιπλέον, συλλέξαμε δείγματα un-τόνωσε ολόκληρη σάλιου από τους ίδιους τους ασθενείς που συναίνεσε να βουρτσίζετε βιοψίες. Απομονώσαμε τα αποφλοιωμένα κύτταρα στα δείγματα αυτά μέσω φυγοκέντρησης και ανιχνεύθηκαν οι απομονωμένες πρωτεΐνες για SLPI μετά από κυτταρική λύση. Τα αποτελέσματα έδειξαν παρόμοια τάση σε αφθονία μείωση του SLPI μεταξύ υγιών φυσιολογικούς ιστούς και τόσο OPML και ιστών OSCC (Σχήμα 3Β). Ανάλυση των διαλυτών πρωτεϊνών που περιέχονται σε υπερκείμενα σάλιο έδειξε λιγότερο σταθερή τάση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

A. Επαλήθευση της μειώθηκε SLPI σε ιστούς που συλλέγονται από βιοψία βούρτσα. επίπεδα αφθονίας Β SLPI μετράται σε αποφλοιωμένα κύτταρα από ολόκληρα σάλιο. επίπεδα αφθονίας C. SLPI μετράται σε μοντέλο κυτταρικές σειρές. Θετικός μάρτυρας είναι ένα φυσιολογικό υγιές δείγμα ανθρώπινου σάλιου? κύτταρα rHEK είναι από ένα φυσιολογικά επιθηλιακά κυτταρική γραμμή, MSK είναι ένα μοντέλο OPML κυτταρική σειρά (MSK-Leuk1) και CA9-22 είναι ένα μοντέλο OSCC κυτταρική σειρά.

Η

Επίσης, δοκιμάστηκε αφθονία SLPI πρωτεΐνης σε μοντέλο OPML και κυτταρικές σειρές OSCC (Σχήμα 3C). Εδώ, επιλέξαμε να συγκρίνουμε διαλυτές πρωτεΐνες απομονώθηκαν από κυτταρικά λύματα ολόκληρων κυττάρων από τον έλεγχο rHEK, κύτταρα MSK-leuk1 (ένα μοντέλο κυτταρική γραμμή του OPML [27]) και κύτταρα Ca9-22 (ένα μοντέλο κυτταρική γραμμή OSCC [28]). Παρόμοια με τα αποτελέσματα από τις βιοψίες βούρτσα ασθενή, παρατηρήσαμε μια δραματική μείωση στην SLPI στην MSK-leuk1 και κυτταρικές σειρές Ca9-22 σε σύγκριση με τα υγιή κύτταρα ελέγχου.

Δοκιμές Πιθανές αντιφλεγμονώδεις επιδράσεις του SLPI Θεραπεία για OPMLs

Ο ρόλος της ενεργοποίησης του ΝΡ-κΒ και ρύθμιση των προ-φλεγμονωδών παραγόντων στον μηχανισμό υποκείμενες μετάβαση από OPML να OSCC είναι γνωστό [29], [30], [31]. Υπάρχουν στοιχεία που δείχνουν ότι ο SLPI παρεμποδίζει ΝΡ-κΒ [32], [33], αν και αυτό δεν έχει αποδειχθεί σε μοντέλα καρκίνου του στόματος. Λαμβάνοντας υπόψη αυτά τα στοιχεία, επιδιώξαμε να διερευνήσει κατά πόσον ή όχι ο SLPI μειώνει την δραστηριότητα NF-κΒ σε κύτταρα MSK-Leuk1, χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης με βάση [34]. Εμείς αντιμετωπίζονται τα επιμολυσμένα κύτταρα MSK Leuk1 με δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις καθαρού πεπτιδίου SLPI (20 μg /ml και 40 μg /mL), και μετράται ΝΡ-κΒ σε διαφορετικούς χρόνους μετά την αγωγή (Σχήμα 4). Αποτελέσματα για τις δύο θεραπείες ήταν συγκρίσιμα, τόσο με δείχνει περίπου μια πτώση 40% στο NF-κΒ μετά από 24 ώρες θεραπείας SLPI. Η θεραπεία με χαμηλότερη ποσότητα SLPI (10 μg /mL) εμφάνισαν μια μικρότερη και λιγότερο αξιόπιστα μείωση της δραστηριότητας του ΝΡ-κΒ (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα).

πολλαπλή μεταβολή ενός ΝΡ-κΒ γονίδιο αναφοράς δοκιμασία σε σχέση προς ελέγχου του οχήματος χαράσσεται σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά τη θεραπεία.

η

Συζήτηση

Έχουμε πραγματοποίησε μια πρώτη-του-είδος, σε βάθος ποσοτική πρωτεομική κυνηγετικό όπλο ανάλυση των μη επεμβατικά συλλέγονται δείγματα βιοψίας βούρτσα του στόματος, επιδιώκοντας να εντοπίσει τις αλλαγές αφθονία πρωτεΐνης που σχετίζεται με το στόμα εξέλιξη του καρκίνου. βιοψίες Brush είναι καλά γνωστά για την αξία τους ως μη επεμβατικά συλλέγονται κυτταρικό δείγμα για τον καρκίνο του στόματος διαγνωστικές εφαρμογές [11], [12]. Ωστόσο, MS-based πρωτεομική μελέτες εκμεταλλευόμενοι αυτά τα δείγματα δυνητικά πλούσια σε πληροφορίες ήταν περιορισμένες. Αξίζει να σημειωθεί ότι, Driemel et al [13] χρησιμοποιείται στην επιφάνεια ενισχυμένη εκρόφησης λέιζερ /ιονισμού (SELDI) MS με ποσοτικά δείγματα προφίλ βιοψία πινέλο και τον εντοπισμό δυνητικών βιοδείκτες της εξέλιξης. Remmerbach et al [14] χρησιμοποιείται περισσότερο τυπική MALDI-MS για την ανάλυση πρωτεϊνών που απομονώθηκαν από βιοψίες πινέλο, καθώς και. Αν και αυτές οι μελέτες είχαν κάποια επιτυχία, η χρήση ενός SELDI ή μεθόδων MALDI-βασίζεται σε πολύπλοκο μίγμα είναι περιορισμένη σε ένα υποσύνολο των σχετικά μικρών πρωτεϊνών ή /και πεπτιδίων στα δείγματα του ενδιαφέροντος.

MS-based πρωτεομική κυνηγετικό όπλο από την άλλη πλευρά προσφέρει μια διευρυμένη όψη του των πρωτεϊνών βιοψίας βούρτσα, δεδομένης της ικανότητάς του για τον εντοπισμό και τον ποσοτικό προσδιορισμό των πρωτεϊνών όλων των κατηγοριών μοριακού βάρους [15]. Η μελέτη μας παρέχει την πρώτη απόδειξη της πρωτεομική κυνηγετικό όπλο εφαρμόζεται σε δείγματα βιοψίας βούρτσα του στόματος. Ένα ερώτημα κατά την έναρξη της μελέτης αυτής ήταν εάν τα κύτταρα που συλλέγονται μέσω βιοψίας βούρτσα θα παρέχουν άφθονες συνολικής πρωτεΐνης για μια πρωτεομική ανάλυση μεγάλης κλίμακας. Βρήκαμε ότι μια μέθοδος κυτταρικής λύσης on-βούρτσα παρείχε καλύτερη απόδοση (τουλάχιστον δεκάδες μικρογραμμάρια συνολικής πρωτεΐνης) από ό, τι προσπαθεί να πλύνει τα κύτταρα δωρεάν της βούρτσας πριν από την λύση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τα ευρήματά μας θα πρέπει να ανοίξει το δρόμο για πρόσθετες πρωτεομική κυνηγετικό όπλο αναλύσεις των βιοψιών βούρτσα για τον χαρακτηρισμό του στόματος βλάβες σε διαφορετικά περιβάλλοντα.

επαναληπτικές μας αναλύει τη σύγκριση υγιή φυσιολογικό ιστό για να OPML και OSCC ιστού, καθώς και μάρτυρες, αποκάλυψε μια σειρά ενδιαφέρουσες πρωτεΐνες που δείχνουν αλλαγές στην αφθονία. Παρά το γεγονός ότι εντοπίστηκαν άλλοι υποψήφιοι άξια περαιτέρω επικύρωση, επιλέξαμε να εστιάσουμε σε SLPI, δίνεται μεγάλη και επαναλήψιμη μείωση της σε αφθονία σε δύο ιστούς OPML και OSCC σε σύγκριση με υγιή φυσιολογικό ιστό. Οι ερευνητές έχουν αναγνωρίσει παραδοσιακά το ρόλο του SLPI στην αναστολή των πρωτεασών σερίνης? Ωστόσο, η γνώση των λειτουργιών του συνέχισαν να επεκταθεί για να συμπεριλάβει αντιμικροβιακή, ασυλία και αντι-φλεγμονή ρόλους [35]. ρόλος SLPI στην στοματική εξέλιξης του καρκίνου είναι λιγότερο γνωστό, ωστόσο, πρόσφατα αποτελέσματα σε βιοψία φέτες ιστού έδειξε μια μείωση στην SLPI σε ιστούς OSCC σε σύγκριση με υγιείς, καθώς και ένα πιθανό ρόλο στην αναστολή της ικανότητας εισβολής [26].

μας μελέτη αποκάλυψε πολλά νέα ευρήματα σχετικά με τον πιθανό ρόλο SLPI στον καρκίνο του στόματος. Για το ένα, τα αποτελέσματά μας είναι η πρώτη που επιδεικνύουν μια σημαντική πτώση στην SLPI σε μη επεμβατικά συλλέγονται δείγματα βιοψίας βούρτσα του στόματος, καθώς και το κυτταρικό κλάσμα του ολικού σάλιο. Αυτά τα ευρήματα είναι συνεπή με τα πρόσφατα αποτελέσματα δείχνουν μια μείωση της αφθονίας SLPI σε OSCC φέτες ιστού που συλλέγονται μέσω της παραδοσιακής βιοψία νυστέρι [26]. Είναι σημαντικό ότι η μελέτη μας είναι η πρώτη που εξετάζει τόσο OPML και τους ιστούς OSCC, επιδεικνύοντας μια προοδευτική απώλεια της SLPI στην προ-κακοήθη κατάσταση, που ακολουθείται από μια πιο δραματική μείωση OSCC. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν έναν πιθανό ρόλο για SLPI ως μη επεμβατικά συλλέγονται διαγνωστική ή προγνωστική βιοδείκτη είτε OPML ή OSCC ιστούς – ένα σημαντικό εύρημα δεδομένη την επείγουσα ανάγκη για απλούστερες και φθηνότερες εξετάσεις για τον καρκίνο του στόματος που παρακάμπτουν τα μειονεκτήματα της βιοψίας νυστέρι [8] , [9].

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν επίσης μια μηχανιστική ρόλο για SLPI σε προφορική εξέλιξης του καρκίνου. Πρόσφατα ευρήματα χρησιμοποιώντας

in-vitro

κυτταρικής καλλιέργειας έχουν δείξει ότι η SLPI αναστέλλει την εισβολής του στόματος καρκινικών κυττάρων [26]. Η επέκταση αυτών των ευρημάτων, τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν μια συστηματική μείωση στην SLPI, τουλάχιστον σε από του στόματος επιθηλιακά κύτταρα, σε ασθενείς επιρρεπείς σε ανάπτυξη καρκίνου του στόματος. Ο ισχυρισμός υποστηρίχθηκε από περίπου μια μείωση κατά 5 φορές σε SLPI σε συμφωνημένα υγιή ιστό σε σύγκριση με υγιείς φυσιολογικούς ελέγχους, με συγκλίνουσες μείωση στην αφθονία του σε αποφλοιωμένα κύτταρα σε ολόκληρο το σάλιο. Τον καθορισμό της βάσεως (π.χ. γενετική, επιγενετικές κ.λπ.) για τη συνολική αυτή απώλεια SLPI αφθονία σε ασθενείς που αναπτύσσουν OSCC θα χρειαστεί περισσότερο έρευνα.

Τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν ότι SLPI αναστέλλει τη δράση μεταγραφικής ΝΡ-κΒ in-vitro σε κύτταρα OPML υποστηρίζει την περαιτέρω μηχανιστικό ρόλο της στη στοματική εξέλιξης του καρκίνου. Αυξημένη δραστηριότητα μεταγραφικής ΝΡ-κΒ, ενεργοποιώντας την έκφραση των προ-φλεγμονωδών κυτοκινών, είναι ένα πολύ γνωστό παράγοντα ανάπτυξης OSCC [29], [30], [31]. Μια μείωση στην SLPI αφθονία μπορεί, τουλάχιστον εν μέρει, να είναι ένας παράγοντας που συμβάλλει στην προ-φλεγμονώδη κατάσταση που οδηγεί σε OSCC. Άλλοι έχουν δείξει έναν ρόλο για SLPI ως αναστολέας της δραστικότητας του ΝΡ-κΒ, αποδεικνύοντας ότι μπορεί να διαταράξει την οδό σηματοδότησης που οδηγεί την ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ [36] και /ή πιθανώς ανταγωνίζονται για δέσμευση με DNA σε ρυθμιστικές θέσεις ΝΡ-κΒ [32 ]. Η μελέτη μας είναι η πρώτη που δείχνει SLPI ως αναστολέας του ΝΡ-κΒ στο πλαίσιο του καρκίνου του στόματος, ειδικά σε ένα μοντέλο κυτταρικής γραμμής OPML. Κατανοώντας τον ακριβή μηχανισμό της αναστολής θα διαρκέσει περισσότερο την έρευνα. Η παρατήρησή μας ανοίγει την ενδιαφέρουσα δυνατότητα SLPI ως θεραπευτική επιλογή για υψηλού κινδύνου βλάβες OPML, όπως τέτοιες θεραπείες χρειάζονται επειγόντως για να αποτρέψει την ανάπτυξη της διεισδυτικής OSCC. SLPI προσφέρει πιθανά πλεονεκτήματα σε μία τέτοια εφαρμογή, δεδομένου ότι είναι μια μικρή πρωτεΐνη (περίπου 11 kDa), που είναι γνωστό ότι είναι ελεύθερη από μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, και φαίνεται να παραλαμβάνεται από τα κύτταρα άμεσα [32].

Τα ευρήματά μας δημιουργούν μια σειρά από ενδιαφέρουσες υποθέσεις για τις δοκιμές στο μέλλον. Για το ένα, η πιθανότητα SLPI ως μη επεμβατικά συλλέγονται διαγνωστική ή προγνωστική βιοδείκτη θα μπορούσε να δοκιμαστεί σε μεγαλύτερες ομάδες του OPML και OSCC ασθενείς. Ο ρόλος της ως ένας αναστολέας του ΝΡ-κΒ σε OPML, με δυνατότητες για προληπτική θεραπεία θα μπορούσε να δοκιμαστεί και να διερευνηθεί σε έναν αριθμό τρόπων. Πειράματα εξέταση της φύσης της αναστολής, όπως η άμεση σύνδεση σε θέσεις ΝΡ-κΒ, και επιδράσεις στην γονιδιακή έκφραση πρωτεΐνης θα διαφωτιστική. Δοκιμές περικομμένες εκδοχές του SLPI μπορεί επίσης να εμφανίζουν αυξημένη ανασταλτικά αποτελέσματα επί της ΝΡ-κΒ λόγω της καλύτερης κυτταρικής πρόσληψης και /ή δέσμευσης του DNA. Σε μια τελική σημείωση ενδιαφέροντος, τα τελευταία στοιχεία δείχνουν επίσης ένα ρόλο για SLPI στην αναστολή του ιού των θηλωμάτων (HPV) των ανθρώπων και την επακόλουθη ανάπτυξη καρκίνου κεφαλής και τραχήλου [37]. Διερεύνηση των επιπτώσεων της θεραπείας SLPI στον HPV + καρκινικά κύτταρα θα είναι έντονο ενδιαφέρον. Τα ευρήματα που παρουσιάζουμε εδώ παρέχουν ένα σημείο εκκίνησης για τις εν λόγω μελλοντικές έρευνες, το οποίο θα μπορούσε να σταθεροποιήσει SLPI ως εξαιρετικά πολύτιμη πρωτεΐνη στη διάγνωση, πρόγνωση και θεραπεία του καρκίνου του στόματος.

Τα στοιχεία μαζικής πρωτεομική φασματομετρία έχουν κατατεθεί στην ProteomeXchange Consortium (https://proteomecentral.proteomexchange.org) μέσω του αποθετηρίου συνεργάτη PRIDE [38] με την PXD000807 αναγνωριστικό συνόλου δεδομένων και DOI 10.6019 /PXD000807.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Coommassie βάφονται εικόνες του συνολικού φορτίου πρωτεΐνης (Α) βουρτσισμένο ασθενείς cellsfrom στόματος? (Β) απολέπιση cellsfrom ασθενείς ολόκληρη salivafrom? (C) Πρωτογενής γραμμές κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων rHEK κερατινοκύτταρα, MSK κύτταρα του στόματος λευκοπλακία και CA-9-22 στόματος καρκινικά κύτταρα. Αυτές οι μεμβράνες χρησιμοποιήθηκαν για western αποτύπωση αποτελέσματα φαίνονται στο Σχήμα 3 του κειμένου

DOI:. 10.1371 /journal.pone.0095389.s001

(DOC)

Πίνακα S1. .

Χαρακτηριστικά των ασθενών

doi: 10.1371 /journal.pone.0095389.s002

(DOC)

Πίνακας S2.

Όλες οι πρωτεΐνες προσδιοριστούν και να ποσοτικοποιηθούν σε πρωτεομική ανάλυση. Τα αποτελέσματα από τις δύο ξεχωριστές iTRAQ αναλύσεις αντιδραστήριο βάσεις πρωτεομική, σε χωριστά φύλλα εργασίας

doi:. 10.1371 /journal.pone.0095389.s003

(XLSX)

Ευχαριστίες

οι συγγραφείς είναι ευγνώμονες για το Κέντρο Φασματομετρίας μάζας του Πανεπιστημίου της Μινεσότα, ιδίως Leeann Higgins και Todd Markowski, για βοήθεια σχετικά με την προετοιμασία του δείγματος και οργανική ανάλυση. Οι συγγραφείς αναγνωρίζουν επίσης τη Μινεσότα υπερυπολογιστών Ινστιτούτο για τη συντήρηση τους, του λογισμικού και του υλικού που χρησιμοποιείται για την ανάλυση δεδομένων.