Αφηρημένο

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) είναι ένα μικρό υποσύνολο των καρκινικών κυττάρων υπεύθυνος για τη συντήρηση και την εξέλιξη των διαφόρων τύπων καρκίνου. Απομόνωση, διάδοση, και η διαφοροποίηση των ΚΕΠ στις κατάλληλες θέσεις του στελέχους εκθέσει τις εγγενείς δυσκολίες για περαιτέρω μελέτες. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι η επαγόμενη καρκίνου, όπως βλαστικά κύτταρα (iCLSCs) μπορούν να δημιουργηθούν με

in vitro

ογκογόνο χειρισμό των βλαστικών κυττάρων ποντικού εμβρυϊκά (MESCS) με σαφώς καθορισμένες ογκογόνο στοιχεία? SV40 LTG και Η

ras

V12 με τη χρήση ενός ιού στέλεχος ποντικού μακρά τερματική επανάληψη (LTR MSCV-) -με βάση ρετροϊικού συστήματος. Οι επαναπρογραμματιστεί MESCS χρησιμοποιώντας και τα δύο ογκογονίδια χαρακτηρίστηκαν μέσω ογκογόνο έκφραση των γονιδίων τους, την ενίσχυση της διάδοσης και απρόσκοπτη συντήρηση των ιδιοτήτων του στελέχους

in vitro

και

in vivo

. Επιπλέον, αυτά τα μετασχηματισμένα κύτταρα κατέληξε στο σχηματισμό κακοηθών, ανώριμων τερατώματα ωοθηκών

στο viv

o. Για την επιτυχή περαιτέρω επέκταση αυτών των ιδιοτήτων σε άλλα όργανα και είδη, περισσότερη έρευνα πρέπει να γίνει για να κατανοήσουμε πλήρως το ρόλο ενός από όγκο ευνοϊκό μικροπεριβάλλον. τρέχουσα μελέτη μας έχει προσφέρει μια νέα προσέγγιση για τη δημιουργία προκαλείται από τον καρκίνο, όπως τα βλαστικά κύτταρα μέσω

in vitro

ογκογόνο επαναπρογραμματισμό και ξεκίνησε με επιτυχία το σχηματισμό κακοήθους όγκου συγκεκριμένων οργάνων σε ένα ορθοτοπικό μικρό μοντέλο καρκίνου του ζώου.

Παράθεση : Cho S, Πάρκο H, Jarboe ΕΑ, Peterson CM, Bae YH, Janát-Amsbury MM (2015) Σχεδιασμός και Χαρακτηρισμός Οι βιομηχανικοί Καρκίνου-όπως βλαστικά κύτταρα. PLoS ONE 10 (10): e0141172. doi: 10.1371 /journal.pone.0141172

Επιμέλεια: Masaharu Seno, Πανεπιστήμιο Okayama, Ιαπωνία

Ελήφθη: 21 Ιουλ 2015? Αποδεκτές: 3η Οκτωβρίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: 21 Οκτώβρη του 2015

Copyright: © 2015 Cho et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

χρηματοδότηση:.. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν αντικρουόμενα συμφέροντα

Εισαγωγή

Η ιεραρχική θεωρία της οργάνωσης του καρκίνου δείχνουν ότι μόνο ένα μικρό υποσύνολο των κυττάρων είναι υπεύθυνος για την έναρξη και την περαιτέρω ανάπτυξη του καρκίνου [1-3]. Οι εν λόγω μικρούς πληθυσμούς κυττάρων έχουν οριστεί ως καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ). Μεταξύ άλλων, ΚΕΠ εμφανίζουν χαρακτηριστικά, όπως η αυτο-ανανέωση και η δυνατότητα διαφοροποίησης σε ετερογενή και ογκογόνων καρκινικών κυττάρων [1, 4]. Υποθετικές ΚΕΠ από διάφορους όγκους συμπεριλαμβανομένου του εγκεφάλου, του μαστού, των ωοθηκών και του καρκίνου απομονώθηκαν μέχρι σήμερα με βάση την έκφρασή τους των συγκεκριμένων μορίων ή συνδυασμός των κυτταρικών δεικτών (π.χ. CD133, CD44, ΑΙ_ϋΗ) [5-9]. Το ογκογόνο δυναμικό αυτών των κυττάρων έχει αποδειχθεί σε διάφορες μελέτες που χρησιμοποιούν ξενομόσχευμα ανοσοκατεσταλμένα ποντίκια [5, 6, 10]. Ωστόσο, περαιτέρω χαρακτηρισμό των ιδιοτήτων και ικανοτήτων ΚΕΠ »έχουν παρεμποδιστεί από τις εγγενείς δυσκολίες της απομόνωσης καθαροί πληθυσμοί ΚΕΠ, η διάδοση αυτών των απομονωμένων ΚΕΠ, και η διαφοροποίηση των ΚΕΠ στις κατάλληλες θέσεις στέλεχος [11].

Κανονική ινοβλαστών και τα κύτταρα του μαστού μπορεί να μετατραπεί σε καρκινικά κύτταρα επάγεται τους

in vitro

επαναπρογραμματισμό μέσω της εξωγενούς εισαγωγή γενετικών εναλλαγές υπεύθυνα για την αύξηση του μήκους του τελομερούς (hTERT), παρέχοντας συστατική σήματα πολλαπλασιασμού (H

ras

V12) και αναστέλλοντας οδούς καταστολέα ανάπτυξης όπως ρ53 και pRB από τον ιό πιθήκου 40 (SV40) αντιγόνα [12, 13]. Προς την ίδια κατεύθυνση του

in vitro

επαναπρογραμματισμό, Scaffidi

et al

ανέφεραν ότι σωματικά κύτταρα διαθέτουν αρκετή πλαστικότητα να επαναπρογραμματιστούν και να αποκτήσουν τις ιδιότητες CSC μέσω

in vitro

ογκογόνο εισαγωγή [ ,,,0],14]. Πολυάριθμες αναφορές, ειδικά στη μελέτη των αιματολογικών καρκίνων, ανέφερε ότι ΚΕΠ θα μπορούσαν να προέρχονται από βλαστικά ιστού, τα προγονικά κύτταρα, και ακόμη και από σωματικά κύτταρα [10, 14-18]. Ωστόσο, το δυναμικό της

in vitro

reprograming των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων σε ΚΕΠ παρέμεινε ασαφής.

Εδώ, μελετήσαμε το εάν το ποντίκι εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα (MESCS) μπορεί να επαναπρογραμματιστεί με επιτυχία σε επαγόμενη από καρκίνο, όπως βλαστικά κύτταρα (iCLSCs) μέσω

in vitro

ογκογόνο χειραγώγηση. Επιπλέον, εκθέτοντας iCLSCs σε διάφορες ειδικές μικροπεριβάλλοντα

in vivo

, θα μπορούσαμε να παρατηρήσουμε τις δυνατότητες αυτών των iCLSCs για να δημιουργήσει site-specific όγκων iCLSC στην ανοσολογική αρμόδια ποντικούς.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά και πλασμίδια

τα ακόλουθα υλικά ελήφθησαν από τους κατασκευαστές που αναφέρονται: (α) Fugene 6 (Promega, Madison, WI), (β) Polybrene και FBS (Sigma-Aldrich, St-Louis , ΜΟ), (γ) Geltrex (Invitrogen, Carlsbad, CA) (δ) Mycozap συν CL (Lonza, Allendale, NJ), (ε) ρΒΑΒΕ-Η

ras

V12 (# 1768), pBabe- SV40 LTG (# 10891), pMSCV-GFP (# 33336), και pMSCV-RFP (# 33337) (Addgene, Cambridge, ΜΑ), (στ) pVSV-G (Clontech, θέα στο βουνό, CA).

Cell Culture

GP2-293 κύτταρα (Clontech) και τα παράγωγά τους, και γ-ακτινοβολημένα ποντικού εμβρυϊκά κύτταρα ινοβλάστης (MEF) (Cyagen, Santa Clara, CA) διατηρήθηκαν σε ϋΜΕΜ (ATCC, Manassas, VA ) συμπληρωμένο με είτε 10% ή 15% εμβρυϊκό βόειο ορό (Sigma-Aldrich,), αντίστοιχα. Mouse εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα (MESCS) (εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα C57BL /6 ποντίκι, # MUBES-01001, Cyagen) διατηρήθηκαν σε Knockout DMEM (Invitrogen) συμπληρωμένο με 15% αντικατάσταση knockout ορού (Invitrogen), 1% Ε-γλουταμίνη (Invitrogen) , 1% μη απαραίτητα αμινοξέα (Invitrogen), 0,1% β-mercaptanol (Invitrogen), ανασταλτικό παράγοντα λευχαιμίας (LIF, 10 ng /ml σε μέσο καλλιέργειας? StemRD, Burlingame, CA). Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε υγροποιημένο επωαστή με 5% CO

2 ατμόσφαιρα στους 37 ° C.

Υπο-κλωνοποίηση των γονιδίων που pMSCV

Για την εκτέλεση υπο-κλωνοποίηση, Η

ras

V12 και SV40 μεγάλο Τ αντιγόνο (LTG) διαχωρίστηκαν από ρΒΑΒΕ-η

ras

V12 και ρΒΑΒΕ-SV40 LTG από την ενζυματική χώνευση με BamHI και EcoRI (ΝΕΒ, Ίπσουιτς, ΜΑ), ή με BamHI (ΝΕΒ), αντίστοιχα. Ένταξη της H

ras

V12 και SV40LTg είτε σε pMSCV-GFP ή pMSCV-RFP διεξήχθη σύνδεση με Τ4-λιγάση (ΕΕΦ) και παράγεται pMSCV-Η

ras

V12-GFP και pMSCV -SV40 LTG-RFP. Ενσωμάτωση των ενθεμάτων επιβεβαιώθηκε τόσο από την ενζυματική πέψη και το DNA αλληλούχιση.

Δημιουργία Ρετροϊών

Για να παραχθούν ρετροϊικά υπερκείμενο, GP2-293 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά είτε με pMSCV-Η

ras

V12-GFP ή pMSCV-SV40 LTG-RFP σε συνδυασμό με την αντιγραφή-ανίκανος βοηθού φορέα pVSV-G σε ένα δίσκο καλλιέργειας 60 mm με τη χρήση Fugene 6. Τα κύτταρα τροφοδοτήθηκαν σε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, και ρετροϊικές υπερκείμενο ήταν συγκεντρώθηκαν από τη συλλογή στις 48 και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. Το υπερκείμενο κλασματοποιήθηκε μετά από φυγοκέντρηση και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C για μελλοντική χρήση. Ο τίτλος ιού επιβεβαιώθηκε με ανάλυση FACS (FACSCanto Analyzer, BD Biosciences, San Jose, CA) μετά τη μόλυνση με 1x 10

5 ΝΙΗ-3Τ3 (ATCC) κύτταρα ινοβλαστών ποντικού.

Ίδρυση Σταθερό GP2- 293 παράγωγα

Για να δημιουργήσετε GP2-293 παραγώγων με σταθερή ενσωμάτωση του γονιδίου, GP2-293 κύτταρα είτε ήταν μολυσμένα με H

ras

V12 ή SV40 LTG χρησιμοποιώντας ένα ρετροϊικό σύστημα. FACS διαλογή διεξήχθη για την επιλογή σταθερά μολυσμένα κύτταρα σύμφωνα με GFP ή RFP έκφρασης (διαλογέα κυττάρων FACSAria, BD Biosciences, San Jose, CA). Η έκφραση του γονιδίου σε σταθερά κύτταρα επιβεβαιώθηκε με κηλίδα western.

ρετροϊική μόλυνση με MESCS

MESCS πλένονται και επεξεργάζονται με θρυψίνη. Μετά τη φυγοκέντρηση, αυτά επανα-εναιωρήθηκαν σε ελεύθερο ορού MESCS μέσου που περιέχει 8 μg πολυβρενίου ανά ml-PBS και επιστρώνονται σε 1×10

5 κύτταρα /1 ml ανά φρεάτιο ενός δώδεκα φρεατίων. Οι ρετροϊικοί υπερκείμενο από ενιαίο ιού προστέθηκαν σε 1 ml /1×10

5 κύτταρα ή ίδια αναλογία όγκου της ρετροϊικής υπερκειμένου από άτομο ιού προστέθηκαν για συν-μόλυνση. Μετά από 1 ώρα επώαση σε CO

2 θερμοκοιτίδα, η πλάκα φυγοκεντρήθηκε για 2 ώρες σε 1000 g σε θερμοκρασία δωματίου. Την επόμενη ημέρα, ο ρετροϊικός υπερκείμενα απομακρύνθηκαν? τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε μέσο MESCS και απλώθηκαν σε πιάτα, είτε επικαλυμμένη με Geltrex ή κάλυψη με ακτινοβολημένα ΥΠΟΙΟ. Τα σταθερά μολυσμένα MESCS ταξινομήθηκαν με FACS με βάση GFP ή RFP έκφρασης (διαλογέα κυττάρων FACSAria).

Western Blotting

Τα κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (# 9806, Cell Signaling) συμπληρωμένο με 1 mM PMSF (Sigma-Aldrich). Κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε με την χρησιμοποίηση 4-20% κλίση SDS-πολυακρυλαμιδίου Τρις-HCl γέλη (Mini-PROTEAN TGX

®, BioRad) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Biorad). Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για την κηλίδωση Western ήταν αντι-ras (# 610001, 1: 1000, BD Bioscience), αντι-SV40 μεγάλο Τ και μικρό t αντιγόνο (# 554150, 1: 1000, BD Bioscience), αντι-β-ακτίνης (# A5441 , 1: 2500, Sigma-Aldrich), και αντι-ποντικού IgG-HRP (# 7076S., 1: 5000, Cell Signaling)

αλκαλική φωσφατάση χρώσης και ανοσοκυτταροχημεία Χρώση των ζωντανών κυττάρων

χρώση αλκαλικής φωσφατάσης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ χρώσης αλκαλικής φωσφατάσης II σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Stemgent). Για τη χρώση ανοσοκυτταροχημεία των ζωντανών κυττάρων, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ένα πλακίδιο 12 μέχρι που δείχνει ορατές αποικίες υποβλήθηκαν σε αγωγή με αντίσωμα (StainAlive ™ SSEA-1 (DyLight 550 ™), Stemgent) διάλυμα παρασκευάζεται σε νωπό μέσο καλλιέργειας κυττάρων με μια τελική συγκέντρωση 2,5 μg /ml. Μετά από επώαση για 30 λεπτά στους 37 ° C και 5% CO

2, τα κύτταρα εξετάστηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού (αυτοματοποιημένο μικροσκόπιο, Nikon, Ιαπωνία) με φίλτρο TRITC.

δοκιμασία πολλαπλασιασμού κυττάρων

προσδιορισμός πολλαπλασιασμού κυττάρων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση δοκιμασίας μέτρησης κυττάρων kit-8 (CCK-8, Dojindo, Rockville, MD). Εν συντομία, τα 100 μΐ του κυτταρικού εναιωρήματος (3000 κύτταρα /φρεάτιο) απλώθηκε στην πλάκα καλλιέργειας των 96 φρεατίων επικαλυμμένες με Geltrex (Invitrogen). Κατά την περίοδο της ανάπτυξης, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κάθε φρεάτιο μετρήθηκε μετά από 1 ώρα επώαση με 10 μΙ CCK-8 λύση χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών (Spectramax 250, Molecular Device Inc., Sunnyvale, CA) σε μήκος κύματος 540 nm. Μετά την αφαίρεση της εγγενούς απορρόφησης των μέσων μαζικής ενημέρωσης σε μήκος κύματος 540 nm, η σχετική πολλαπλασιασμό των κυττάρων (%) υπολογίστηκε από ([Απορρόφηση]

δοκιμών /[Απορρόφηση]

έλεγχος) × 100. [Απορρόφηση]

έλεγχος αναφέρεται στην απορρόφηση των κυττάρων καλλιεργήθηκαν σε μέσα σε 1 ημέρα μετά τον εμβολιασμό των κυττάρων στην πλάκα.

In vivo παραγωγή όγκων χρησιμοποιώντας τροποποιημένα MESCS και ιστο-παθολογική αξιολόγηση

ιστού

Αυτή η μελέτη διεξήχθη από αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των πειραμάτων σε ζώα του Πανεπιστημίου της Γιούτα (Αριθμός Άδειας: 14-08011).

Και οι δύο, όπως τροποποιήθηκε MESCS και αφελής (έλεγχος) MESCS καλλιεργήθηκαν για μία εβδομάδα στο ΥΠΟΙΟ τροφοδότη κυττάρων έως ορατές αποικίες είχαν δει πριν από την εμφύτευση. Για ορθοτοπική θύλακο εμβολιασμό των ωοθηκών των κυττάρων σε ζώο, έξι έως οκτώ εβδομάδων, θηλυκοί C57BL /6 ποντίκια (Jackson Lab, λιμάνι Bar, ΜΕ) ζυγίστηκαν πριν ενδοπεριτοναϊκή αναισθητικό ενέσεις (xylazein-κεταμίνη? 0,1 ml /10 g σωματικού βάρους). Κάθε ζώο τοποθετήθηκε σε πρηνή θέση παρελήφθη περίπου ~ 1,5 εκατοστά σε μήκος του ραχιαίου τομή, ελαφρώς προς τα αριστερά του άξονα συμμετρίας. Το χόριο διαχωρίστηκε από τους υποκείμενους ιστούς, και μια μικρότερη τομή έγινε μέσω της ραχιαίας περιτονίας επίπεδη μυς να έχουν πρόσβαση στο κοιλιακό περιτόναιο. Μετά τον εντοπισμό αριστερό νεφρό, η περιοχή αμέσως κάτω από την νεφρό αποκόπηκε για να εντοπίσει το αριστερό ωοθήκη, το οποίο στη συνέχεια εξωτερικεύονται μέσω της τομής. 1x 10

5 κυττάρων (50 μΐ σε 1: 1 μίγμα PBS και matrigel (# 354248, Corning, Tewksbury ΜΑ)) έχουν απευθείας ένεση σε θύλακο των ωοθηκών χρησιμοποιώντας μία σύριγγα Hamilton (30 G βελόνας). Μετά τον ενοφθαλμισμό των κυττάρων, η ωοθήκη ήταν μέρος πίσω στην αρχική του θέση μέσα στην περιτοναϊκή κοιλότητα. 4-0 ράμματα χρησιμοποιήθηκαν για τις συρραφές τομή του πίσω τοιχώματος και του δέρματος [19, 20]. Ορθοτοπική εμβολιασμό των κυττάρων στο μητρικό ποντικών διεξήχθη με άμεση ένεση 1x 10

5 κυττάρων (50 μΐ σε 1: 1 μίγμα PBS και matrigel (# 354248, Corning, Tewksbury, ΜΑ)) προς την κάτω δεξιά λίπος θηλαστικών . pad

Αυτό το πιλοτικό

in vivo

μελέτη περιελάμβανε (n = 16? S1 πίνακα) ζώα. Εν συντομία, ανάλογα με τη θέση του όγκου (μαστικό αδένα έναντι των ωοθηκών θύλακο), είτε ανώριμα τερατώματα με κακοήθεις ιδιότητες (ωοθήκη) ή ώριμα τερατώματα (στήθος) που σχηματίζεται. Ο συνολικός αριθμός των ζώων (η = 16) διαιρέθηκαν σε τέσσερις πειραματικές ομάδες. Ομάδα1: Μαστικού αδένα εμβολιάζονται με MESC? Ομάδα 2: ωοθηκών Προύσα εμβολιάζονται με MESC? Ομάδα 3: Μαστικού αδένα που εμβολιάστηκαν με MESC-Ras-LTG (iCLSCs), Ομάδα 4: ωοθηκών Προύσα εμβολιάζονται με MESC-Ras-LTG (iCLSCs). Μετά ορθοτοπική τον ενοφθαλμισμό των κυττάρων, τα ποντίκια παρακολουθούνται δύο φορές την εβδομάδα καθόλη τη διάρκεια 15 εβδομάδα πειραματικές περιόδους. Τα ζώα στεγάστηκαν υπό κανονικές συνθήκες στο Κέντρο για τη διευκόλυνση Συγκριτικής Ιατρικής των ζώων, σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές της Επιτροπής Θεσμικών Animal Care and Use (IACUC) στο Πανεπιστήμιο της Γιούτα. Για την ιστο-παθολογική αξιολόγηση των ιστών, αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η & amp? Ε) λεκέδες έγιναν σε αντιπροσωπευτικά τμήματα της μάζας του όγκου από το εργαστήριο ARUP (ARUP, Salt Lake City, UT). Ένας παθολόγος με γυναικολογική ογκολογία εξειδίκευση αξιολογήθηκε ψηφιακές μικροσκοπικές εικόνες.

Η στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση και αποτύπωση των γραφημάτων διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας GraphPad Prism λογισμικό (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) . Όλα τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD, και η P & lt?. 0.05 χρησιμοποιήθηκε για τη στατιστική σημαντικότητα

Αποτελέσματα

Κατασκευή pMSCV-HrasV12 και pMSCV-LTG

η ρετροϊική πλασμίδια με την MSCV LTR (ιός βλαστικών κυττάρων ποντικού μακρά τερματική επανάληψη) κατασκευάστηκαν μέσω υπο-κλωνοποίησης είτε η

ras

V12 ή γονίδιο SV40 LTG σε μία θέση πολλαπλής κλωνοποίησης (MSC) που ακολουθείται από έκφραση οδήγηση IRES του γονιδίου GFP ή RFP εμφανίζονται ως σχηματικό διάγραμμα στο Σχήμα 1Α. Τα ένθετα σε κατασκευάσματα επαληθεύτηκαν με ενζυματική πέψη (Εικόνα 1Β), και της αλληλουχίας του DNA.

(Α) Γονίδια ενδιαφέροντος (π.χ. HrasV12 ή LTG) εισήχθησαν στο μεταξύ MSCV LTRs, και είτε GFP ή το γονίδιο RFP ήταν χρησιμοποιήθηκε ως ένα γονίδιο ιχνηθέτη. (Β) Εισάγει κλωνοποιήθηκε σε pMSCV πλασμίδια επιβεβαιώθηκε με ενζυματική πέψεις είτε με BamHI είτε EcoRI. Μ: DNA σκάλα, 1: pMSCV-GFP? 2: pMSCV-Η

ras

V12-GFP? 3: pMSCV-GFP

περικοπή? 4: pMSCV-Η

ras

V12-GFP περικοπή

? 5: ρΒΑΒΕ-Η

ras

V12

κοπής (+ μάρτυρας)? 6: pMSCV-RFP? 7: pMSCV-SV40 LTG-RFP? 8: pMSCV-RFP

κοπεί 9: pMSCV-SV40 LTG-RFP

περικοπή? 10: ρΒΑΒΕ-SV40 LTG

κοπής (+ έλεγχος). Λευκά βέλη δείχνουν ένθετα. Ακολουθίες ένθετο επίσης επαληθεύεται με προσδιορισμό της αλληλουχίας του DNA.

Η

Ίδρυση GP2-293 παραγώγων για να δημιουργήσει ρετροϊό

Για τη δημιουργία σταθερών κυτταρικών σειρών που παράγουν ρετροϊό, GP2-293 κύτταρα, ένα παράγωγο της 293 ανθρώπινη νεφρική κυτταρική γραμμή με σταθερή ενσωμάτωση

gag /pol

συστατικά ρετροϊικού, υπέστησαν μεταγωγή με pMSCV πλασμίδια. Τα κύτταρα που εκφράζουν είτε GFP ή RFP ταξινομούνται με FACS (Σχήμα 2Α και 2Β) έχουν επαληθευτεί περαιτέρω να παρατηρήσουμε αντίστοιχη γονιδιακή έκφραση τους με ανάλυση ανοσοστυπώματος που φαίνεται στο Σχ 2C. Τα επαλήθευσε σταθερά κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν περαιτέρω για την παραγωγή ρετροϊών μέσω επιμόλυνσης ενός ιικού πλασμιδίου φακέλου, pVSV-G. ικανότητα μόλυνση αυτών των ρετροϊών καταδείχθηκε με ανάλυση FACS, μέσω της μέτρησης της ποσότητας του ρετροϊό μολυσμένα-ΝΙΗ3Τ3 ινοβλάστες ποντικού που εκφράζουν είτε GFP ή RFP (Σχήμα 2D).

(α) επιβεβαίωση της επιτυχούς έκφρασης GFP στο GP2 -293 κύτταρα, και (β) επιβεβαίωση της επιτυχούς έκφρασης RFP σε GP2-293 κύτταρα μετά την εισαγωγή της pMSCV πλασμίδια. BF: φωτεινό πεδίο εικόνας? FL: φθορισμού εικόνα. Κλίμακα γυμνό είναι 400 μm. (C) Ανάλυση ανοσοκηλίδας απεικονίζει σταθερή έκφραση των H

ras

V12 και SV40 LTG σε GP2-293 παράγωγα κυττάρων? 1. BL: GP2-293 κενό κελί? 2. GFP: GFP που περιέχει GP2-293 κυττάρων 3. HrasV12-GFP: Η

ras περιέχει

GP2-293 κυττάρων? 4. BL: GP2-293 κενό κελί? 5. RFP: RFP περιέχει GP2-293 κυττάρων 6. SV40LTg-RFP: SV40LTg και RFP που περιέχουν GP2-293 κυττάρων? Μ: Πρωτεΐνη σκάλα. (Δ) Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής (FACS) της 1x 10

5 ΝΙΗ-3Τ3 ινοβλαστών ποντικού μετά τη μόλυνση με ρετροϊό που παράγεται από GP2-293 παράγωγα.

Η

Δημιουργία γενετικά τροποποιημένων MESCS

ποντίκι εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα (MESC) μεταμορφώθηκαν από μόλυνση με ρετροϊούς που παράγεται από σταθερά παράγωγα GP2-293 κυττάρων. Η έκφραση των γονιδίων που εισάγονται εντός MESCS επαληθεύτηκε με ανάλυση ανοσοστυπώματος (σχ 3Α και 3Β). Για την επιβεβαίωση των μεταβολών του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, προσδιορισμούς πολλαπλασιασμού των κυττάρων πραγματοποιήθηκαν σε μετασχηματισμένα MESCS, τα οποία συγκρίθηκαν επίσης με τον έλεγχο MESCS (Σχήμα 3C). MESC-Η

ras

V12 /SV40 LTG παρουσίασαν σημαντική αύξηση στον πολλαπλασιασμό σε σύγκριση με MESC-GFP και -Η

Ras

V12 ημέρα 7 (Σχήμα 3D). Περαιτέρω σύγκριση πολλαπλασιασμό των MESC-SV40 LTG και MESC-Η

ras

V12 /SV40 LTG με MESC-RFP, MESC-SV40 LTG και MESC-Η

ras

V12 /SV40 LTG έδειξαν σημαντική βελτίωση του πολλαπλασιασμού (Σχήμα 3D). Ωστόσο, δεν υπήρχε διαφορά στον πολλαπλασιασμό μεταξύ MESC-Η

ras

V12 /SV40 LTG και MESC-SV40 LTG (Σχήμα 3D)

Εκπρόσωπος εικόνες από ανάλυση ανοσοαποτύπωσης:. (Α) Η

ras

V12, (Β) SV40 LTG. Δοκιμασία πολλαπλασιασμού (C) CCK κυττάρων για 7 ημέρες της περιόδου πολλαπλασιασμού MESCS και μεταμορφώθηκε MESCS. (D) Σύγκριση των πολλαπλασιασμών κατά την ημέρα 7. Η μέση ± S.D. (N = 3), *, **, και #, ## ρ & lt? 0.05. δοκιμασία ANOVA πραγματοποιήθηκε με μετα-τεστ Tukey χρησιμοποιώντας το λογισμικό GraphPad Prism.

Η

Συντήρηση βλαστική ικανότητα μετά από ρετροϊική τροποποίηση του MESCS

Για να επιβεβαιώσετε τη βλαστική ικανότητα των μεταμορφωμένων MESCS, την έκφραση της αλκαλικής φωσφατάση (ΑΡ) και του σταδίου-ειδικών εμβρυϊκών anitigen-1 (SSEA-1) βλαστικών δείκτης κυττάρων αξιολογήθηκε. Τα μετασχηματισμένα MESCS (Σχήμα 4Α (γ) – (ε)) που εκφράζεται παρόμοια επίπεδα χρώσης ΑΡ σε σύγκριση με αφελή (μη-μετασχηματισμένα) MESCS (Σχ 4Α (β)) υποδεικνύοντας αδιάλειπτη διατήρηση των μη διαφοροποιημένων κυττάρων συγκράτησης δυναμικό αυτο-ανανέωσή τους . Κατά τη διάρκεια της περαιτέρω επαλήθευση της αδιαφοροποίητη κατάσταση των μετασχηματισμένων MESCS με SSEA-1 ειδικό αντίσωμα, μετασχηματισμένα MESCS (Εικ 4B- (b) – (δ)) έδειξαν θετική για αυτή την επιφάνεια δείκτη όπως σαν μη-μετασχηματισμένα MESCS (Εικ 4B- (α )). Η ανίχνευση των δύο AP και SSEA-1 σε μεταμορφωμένα MESCS κατέδειξε ότι οι διαδικασίες μετασχηματισμού δεν φαίνεται να επηρεάζει την βλαστική ικανότητα των MESCS.

Χρώση

(Α) αλκαλική φωσφατάση (ΑΡ). Κόκκινο χρώμα περιοχές δείχνουν δραστικότητα της αλκαλικής φωσφατάσης. (ένα). Φωτεινό πεδίο εικόνας της MESCS? χρώση AP: (β). MESCS? (ντο). MESC-Η

ras

V12? (ρε). MESC-SV40 LTG? (μι). MESC-Η

ras

V12 /SV40 LTG. Κλίμακα γυμνό είναι 10 μm. (Β) χρώση ανοσοϊστοχημείας των ζωντανών κυττάρων που εκφράζουν SSEA1. Ζεύγη φωτεινό κατατεθεί και εικόνες SSEA1: (α). MESCS? (σι). MESC-Η

ras

V12? (Γ) .mESC-SV40 LTG? (ρε). MESC-Η

ras

V12 /SV40 LTG. Οι αντιπροσωπευτικές εικόνες ελήφθησαν από μικροσκόπιο φθορισμού με φίλτρο TRITC. μπαρ κλίμακας είναι 100 μm.

Η

χαρακτηρισμούς bioengineered καρκίνο-όπως βλαστικά κύτταρα

Για να επιβεβαιώσετε την ογκογόνο δυναμικό του επαναπρογραμματιστούν MESCS, MESC-Η

ras

V12 /κύτταρα SV40 LTG είτε ορθοτοπικώς εμβολιάστηκαν στο αριστερό θύλακο των ωοθηκών ή εκκαθαριστεί βουβωνική μαστική μαξιλάρια του λίπους. Στις 31 ημέρες μετά τον εμβολιασμό, μια ωοθηκική μάζα είχε σχηματιστεί στα ποντίκια που υποβλήθηκαν σε ορθοτοπική εμβολιασμό του θυλάκου των ωοθηκών. Σε αντίθεση, οι ποντικοί που έχουν υποστεί ορθοτοπική εμβολιασμό του βουβωνικού μαστικό λιπώδες στρώμα δεν σχηματίζουν καμία μάζες. Η κοιλιακή τοποθεσίας του πράγματος σε ποντικούς μετά από εμβολιασμό των ωοθηκών έδειξε μια ωοθηκική μάζα (Σχήμα 5Α) σε μορφή διευρυμένης αριστερή ωοθήκη σε σύγκριση με την κανονική contra-πλευρική, μη-εγχυθεί δεξιά ωοθήκη (Σχήμα 5Β). Μετά επιπλέον ακαθάριστα εξέταση, η ένεση αριστερή ωοθήκη και εμφανώς αποδείξει την σχηματίζεται μάζα διαπερνούν την επιφάνεια των ωοθηκών, καθώς και την ένωση με την περιτοναϊκή πλευρικό τοίχωμα. Η οπισθοπεριτοναϊκή χώρος βρέθηκε επίσης να καταλαμβάνει η μάζα προσκολλημένο στο πίσω τοίχωμα, και αριστερός νεφρός (Σχήμα 5C). Δεν υπήρξε καμία ένδειξη για το ακαθάριστο κοιλιακό μεταστάσεων που προκύπτουν από αυτή των ωοθηκών μάζα.

(Α). Κοιλιακή περιοχή με ωοθηκών μάζας (μπλε κύκλος)? (ΣΙ). Του τραχήλου της μήτρας με Μήτρα, δεξιά κανονική ωοθήκη (μπλε βέλος) και το αριστερό μάζα των ωοθηκών (λευκό βέλος)? (ΝΤΟ). Αριστερά ωοθηκών με μερικώς ανέπαφη κάψουλα και μάζας διαπερνούν την επιφάνεια των ωοθηκών (μπλε κύκλος).

Η

Η ιστο-παθολογική ανάλυση των ωοθηκών ένεση με MESC αποκάλυψε την παραγωγή ενός ώριμου τεράτωμα που παρουσιάζουν καλά διαφοροποιημένο πλακώδες επιθήλιο με κερατινοποίησης και αναπνευστικό επιθήλιο που μοιάζει (Εικ 6a- (β)) σε σύγκριση με ιστολογικά χαρακτηριστικά των κανονικών ωοθηκών (σχ 6a- (α)). Είναι ενδιαφέρον ότι, οι ωοθήκες ένεση με MESC-Η

ras

V12 /SV40 LTG σχηματίζονται επίσης ώριμη τερατώματα, αλλά επιπλέον αποκάλυψε τμήματα ενός ανώριμου τεράτωμα περιέχουν διάσπαρτα εστίες ενός υψηλής ποιότητας κακοήθης νεοπλασία, η οποία χαρακτηρίζεται από κακοήθη κύτταρα διατεταγμένα γραμμικά , σε μικρές ομάδες, και περιστασιακά ως στοιχειώδεις δομές που μοιάζουν με αδένες (Σχήμα 6a- (γ) μικρό παράθυρο). Μεγαλύτερη μεγέθυνση αποκάλυψε αυτά τα κακοήθη κύτταρα να είναι ελάχιστα διαφοροποιημένη με υψηλή πυρήνα: κυτόπλασμα αναλογίες, αξιοσημείωτα άτυπα πυρήνες με χοντροκομμένο συσσωμάτωμα χρωματίνη, μεταβλητά εξέχοντα πυρήνια, και πολυάριθμα μιτωτικά σχήματα (Σχ 6a- (γ)). Οι ποντικοί που είχαν βουβωνικό μαστικά πέλματα λίπος τους ένεση με MESCS φάνηκε να έχουν δημιουργήσει ώριμα τερατώματα εμφανίζουν καλά διαφοροποιημένο πλακώδες επιθήλιο, το οποίο περιέχει επίσης παγκρεατικό ιστό, και το αναπνευστικό επιθήλιο που μοιάζει με καλοσχηματισμένα κροσσών (Εικ 6B- (β)) σε σύγκριση με την ιστολογική αξιολόγηση του φυσιολογικού ιστού του μαστού (Εικ 6B- (α). σε αντίθεση, το στήθος εγχέεται MESC-η

ras

V12 /SV40 LTG δεν παρουσίασαν αξιοσημείωτη ιστολογικές διαφορές σε σύγκριση με το κανονικό, μη-εγχυθεί … ιστού του μαστού

(α) ωοθηκών Panel: (α) Κανονική δεξιά (μη-ένεση) ωοθήκης (100Χ) μπάρα κλίμακας είναι 100 μm? (β) Αριστερό ωοθηκών μάζα (μετά από ορθοτοπική εμβολιασμό με MESC. ) δείχνει σημάδια μιας ώριμης τεράτωμα (μικρό παράθυρο, 100Χ), που χαρακτηρίζεται με μια εστίαση των ώριμων, κερατινίωση πλακώδες επιθήλιο εντός της περιοχής που απεικονίζεται στο εσωτερικό του κουτιού (200Χ) μπάρα κλίμακας είναι 100 μm?.. (γ) ωοθηκών μάζα (μετά από ορθοτοπική εμβολιασμό με MESC-η

ras

V12 /SV40-LTG) δείχνει σημάδια ανώριμο τεράτωμα (μικρό παράθυρο, 100Χ) χαρακτηρίζεται με διάσπαρτες εστίες υψηλής ποιότητας κακόηθες νεόπλασμα εντός της περιοχής που απεικονίζεται στο εσωτερικό του κουτιού (400Χ). μπαρ κλίμακας είναι 100 μm. (Β) Πίνακας μαστού: (α). Φυσιολογικό ιστό μαστού ποντικού (100Χ). μπαρ κλίμακας είναι 100 μm? (σι). μάζα του μαστού (μετά από ορθοτοπική εμβολιασμό MESC σε εκκαθαριστεί βουβωνική μαστικό λιπώδες στρώμα) παρουσιάζουν σημάδια της ώριμης τεράτωμα (μικρό παράθυρο, 100Χ), η οποία χαρακτηρίζεται με το αναπνευστικό επιθήλιο που μοιάζει με καλοσχηματισμένα βλεφαρίδες εντός της περιοχής που απεικονίζεται στο εσωτερικό του κουτιού (200Χ). μπαρ κλίμακας είναι 100 μm.

Η

Συζήτηση

Η παρούσα μελέτη αποδεικνύει ότι το ποντίκι τα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα (MESCS) μπορεί να reprogramed σε επαγόμενη από καρκίνο, όπως τα βλαστικά κύτταρα (iCLSC) με εισαγωγή καλά ορίζεται ογκογόνο στοιχεία, (ο ιός πιθήκου 40 μεγάλο Τ ογκογονίδιο (SV40 LTG) και ένα ογκογόνο ras (H

ras

V12)) με τη χρήση ενός ιού βλαστικών μακρά τερματική επανάληψη ποντικού (MSCV-LTR) -με βάση ρετροϊικού πλασμιδίου . Οι

in vitro

επαναπρογραμματιστούν MESCS παρουσίασαν βελτίωση της διάδοσης και τη συντήρηση των ιδιοτήτων των βλαστικών κυττάρων κάτω από το

in vitro

συνθήκες καλλιέργειας. Επιπλέον, οι εν λόγω μετασχηματισμένα κύτταρα έδειξαν επίσης τοπο-ειδικές διαφορές της ορθοτοπική σχηματισμού όγκου του μετά τον εμβολιασμό των ιστών ωοθήκης και μαστού σε ανοσοϊκανά ποντίκια. Έτσι, προτείνουμε ότι

in vitro

επαναπρογραμματισμό του MESCS με ογκογόνο στοιχεία μπορεί να είναι μια πιθανή προσέγγιση για τη δημιουργία προκαλείται από τον καρκίνο, όπως τα βλαστικά κύτταρα.

Το σύστημα ρετροϊικού MSCV-LTR βρέθηκε να είναι ένα δυνητικά χρήσιμο εργαλείο για την αποτελεσματική, ογκογόνο μετασχηματισμό της MESCS. ρετροϊική μόλυνση του MESCS φαίνεται εξαρτάται από ιούς που δημιουργούνται από διαφορετικούς τύπους ρετροϊού πλασμιδίων υψηλά. Στο σύστημά μας ρετροϊική MSCV-LTR, παρατηρήσαμε μεγαλύτερη ικανότητα και διατήρηση σταθερών γονιδιακής έκφρασης μόλυνση, σε σύγκριση με το κοινό σύστημα ρετροϊικού ιού που βασίζεται Moloney (δηλ σειρά ρΒΑΒΕ). πρόσφατα ευρήματα μας συμφωνούν με προηγούμενες αναφορές ότι ρετροϊό, η οποία δημιουργήθηκε από ένα ρετροϊικό πλασμίδιο MSCV-LTR-based, θα μπορούσε να διατηρήσει μακροχρόνια και σταθερή έκφραση των γονιδίων τόσο εμβρυϊκών βλαστικών (ES) κυττάρων και αιμοποιητικών βλαστικών (HS) κυττάρων [ ,,,0],21, 22].

In vitro

επαναπρογραμματισμό του MESCS να iCLSC πληρούνται οι απαιτήσεις των σαφώς καθορισμένων ογκογόνο γονίδια, η

ras

V12 και SV40 LTG, τόσο για νεοπλασματικές μετασχηματισμό και την καταπολέμηση της απόπτωσης. Ογκογονικών ras μετάλλαξη, η οποία εμφανίζεται σε περίπου 30% όλων των ανθρώπινων όγκων, είναι γνωστό ότι εμπλέκονται στη διαδικασία νεοπλασματικών μετασχηματισμό των κυττάρων

in vitro

και να έχει καλά αναφερθεί [13, 23, 24]. Ωστόσο, η εισαγωγή ενός συστατικώς δραστική μορφή του ras μόνο (δηλ H

ras

V12) έδειξαν δυναμικό της ευαισθητοποίησης κυττάρων σε απόπτωση [24-26] και ακόμη και επαγωγή πρόωρου κυτταρικής γήρανσης μέσω της σύνδεσης της συσσώρευσης p53 [27 ]. Σε προσδιορισμό πολλαπλασιασμού μας με επαναπρογραμματιστούν MESC, την έλλειψη ενός σημαντική ενίσχυση του πολλαπλασιασμού του επαναπρογραμματιστούν MESC με H

ras

V12 και μόνο θα μπορούσε να είναι εν μέρει εξηγείται από την επαγωγή είτε κυτταρικής γήρανσης ή απόπτωση μέσω της έκφρασης ενός μόνιμα ενεργό μορφή Η

ras

V12 μόνο. Σε αντίθεση, MESC-SV40 LTG και MESC-Η

ras

V12 /SV40 LTG αποδειχθεί ενίσχυση πολλαπλασιαστικές επιπτώσεις τους. Λαμβάνοντας υπόψη ένα αντι-αποπτωτικό ρόλο των SV40 LTG από αδρανοποίηση της p53 [28], προτείνουμε ότι η εισαγωγή του SV40 LTG σε MESC μπορεί να παίζει ρόλο στην πρόληψη MESC από την πρόωρη κυτταρική γήρανση ή επαγωγή της απόπτωσης. Επιπλέον, SV40-LTG θα μπορούσε να συνεργαστεί με H

ras

V12 κατά τη νεοπλασματική μετατροπή των MESCS με την πρόληψη της H

ras

V12-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο, η οποία βρέθηκε να είναι συνεπής με διάφορες προηγούμενες εκθέσεις [13, 29, 30].

Η επιτυχής διατήρηση των ιδιοτήτων των βλαστικών κυττάρων σε επαναπρογραμματιστούν MESCS θα μπορούσε να επιβεβαιωθεί

in vitro

και

in vivo

. Κατά τη διαδικασία της

in vitro

επαναπρογραμματισμό MESCS, χρησιμοποιήσαμε ρετροϊική μόλυνση για να εισαγάγει ογκογόνο συστατικά. Παρά το γεγονός ότι ρετροϊική εισαγωγή γονιδίων έχει τα πλεονεκτήματα της υψηλής μόλυνσης και σταθερή ενσωμάτωση εξωγενών γονιδίων στα χρωμοσώματα του ξενιστή, τυχαία εισαγωγή ρετροϊικών συστατικών στα γονιδιώματα υποδοχής δεν μπορεί να αποκλείσει την διαταραχή ή απώλεια της έκφρασης των ιδιοτήτων των βλαστικών κυττάρων σε MESCS. Ωστόσο, κάναμε παρατηρούμε μια σταθερή έκφραση των δύο δεικτών βλαστοκυττάρων, αλκαλική φωσφατάση (ΑΡ) και SSEA-1, μετά από ρετροϊική μετασχηματισμό της MESCS. Για να αποκτήσετε μια πιο ολοκληρωμένη κατανόηση των μηχανισμών του το υποκείμενο αυτής της συντήρησης της έκφρασης βλαστικών γονιδίων μετά από μόλυνση με ρετροϊό, απαιτείται περαιτέρω μελέτη. Εκτός από τη διατήρηση των βλαστικών κυττάρων ιδιοτήτων

in vitro

, ορθοτοπική εμβολιασμό επαναπρογραμματιστούν MESCS

in vivo

έδειξε επίσης τον σχηματισμό ανώριμων τερατώματα στην ωοθήκη των ποντικών. Στην πραγματικότητα, η παρατηρούμενη σχηματισμός τεράτωμα

in vivo

, συμπεριλαμβανομένων ανώριμων, κακοήθη συστατικά παραδειγματικά επίσης την επιτυχή συντήρηση των βλαστικών κυττάρων ιδιοτήτων

in vivo

σε όλη τη διαδικασία επαναπρογραμματισμού.

Εάν η ανάπτυξη των διαφόρων κακοήθων όγκων από τα βλαστικά κύτταρα θα είναι πράγματι δυνατό, αυτό μπορεί να απαιτεί πρόσθετες μελέτες για να διερευνήσει περαιτέρω το συγκεκριμένο ρόλο των διαφόρων μικροπεριβάλλοντα στην ογκογένεση [31]. πειράματα σε ζώα μας μας επέτρεψε να παρατηρήσουμε τις διαφορές του σχηματισμού τεράτωμα σε δύο διαφορετικές ορθοτοπική θέσεων εμφύτευσης (ωοθηκών και του μαστού). Σε ορθοτοπική εμφύτευση των ωοθηκών, MESC-Η

ras

V12 /SV40 LTG επάγει την παραγωγή ανώριμων τεράτωμα που παρουσιάζουν διάσπαρτα εστίες υψηλής ποιότητας κακόηθες νεόπλασμα. Ωστόσο, μαστού τοποθετείται με την MESC-Η

ras

V12 /SV40 LTG δεν δείχνουν το σχηματισμό της τεράτωμα. Παρά το γεγονός ότι η συμβολή των μικροπεριβάλλον σε αυτά τα δύο περιοχή για την παραγωγή της κακοήθειας απομένει να μελετηθεί, μια πρόσφατη έκθεση από τον Yan Τ

et al

πρότεινε τη δυνητική συνεισφορά του όγκου ευνοϊκή μικροπεριβάλλον παράγοντες κατά τη διάρκεια της μετατροπής των επαγόμενων πολυδύναμων ποντικιού βλαστικά κύτταρα (miPSCs) σε καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) [32]. Ως εκ τούτου, πιστεύουμε ότι ωοθηκών μικροπεριβάλλον μπορεί να είναι ο τόπος ευνοϊκές για την πρόοδο της ογκογένεσης του mESC- Η

ras

V12 /SV40 LTG σε σχέση με τον τόπο του μαστού.

Εν κατακλείδι, κατέδειξε την επιτυχημένη γενιά που προκαλείται από τον καρκίνο, όπως τα βλαστικά κύτταρα χρησιμοποιώντας ογκογόνο

in vitro

reprograming της MESCS. Οι επαναπρογραμματιστεί MESCS χαρακτηρίστηκαν μέσω ογκογόνο έκφραση των γονιδίων τους και απρόσκοπτη συντήρηση των ιδιοτήτων του στελέχους

in vitro

και

in vivo

. Επιπλέον, αυτά τα τροποποιημένα κύτταρα έδειξαν τον σχηματισμό τερατώματα περιέχουν ανώριμων, κακοήθη μέρη όταν αυξάνεται ορθοτοπικά σε θέση εμφύτευσης ευνοϊκές για την ογκογένεση. υπάρχουν περιορισμοί της παρούσας έρευνας με βάση τη διαμόρφωση των προηγμένων τερατώματα

in vivo

σε σχέση με το θέμα της από όγκο ευνοϊκές μικροπεριβάλλοντα. Επιπλέον, προτείνουμε την αναγκαιότητα μιας παρεκκλίνουσας μικροπεριβάλλον για την ανάπτυξη και τη συντήρηση των όγκων που προέρχονται από επαγόμενη καρκίνου, όπως βλαστικά κύτταρα. Για την καλύτερη κατανόηση των διαδικασιών των φυσικών ογκογένεσης, καθώς και για τη δημιουργία πιο προβλέψιμη καρκίνο ζωικά μοντέλα, συνεχή μελέτη των λεπτομερών ρόλους το μικροπεριβάλλον του όγκου, καθώς και ο προσδιορισμός των δυνητικά ανώμαλης μικροπεριβάλλον παράγοντες θα πρέπει να αποκτήσουν γνώσεις σχετικά με το

in vivo

παραγωγή διαφόρων καρκίνων που προέρχονται από επαγόμενη καρκίνου, όπως βλαστικά κύτταρα. Η δουλειά μας έχει προσφέρει πρωτοποριακές βάσεις για να μπορέσει μια ποικιλία επιπρόσθετων μελλοντικών ερευνητικών εφαρμογών για αυτά που προκαλείται από τον καρκίνο, όπως τα βλαστικά κύτταρα, αλλά απαιτείται περισσότερη έρευνα για να κατανοήσουμε καλύτερα υποκείμενων μηχανισμών της iCLSCs ογκογένεσης.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 πίνακα . σχηματισμό όγκων σε ποντίκια

doi:. 10.1371 /journal.pone.0141172.s001

(ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

Ο συγγραφέας θα ήθελε να ευχαριστήσει Dr.Yongen Sun για του υποστήριξη προβεί σε όλες τις χειρουργικές επεμβάσεις σε ζώα, η κα Kathy Harvey για την διόρθωση της του χειρογράφου, το biorepository και η ομάδα μοριακή παθολογία (BMP) σε Huntsman Ινστιτούτο Καρκίνου για την ευγενική υποστήριξή τους στο χειρισμό της ιστοπαθολογική χρώση των ιστών, και ο Δρ Τζέιμς Marvin και ο κ Chris Leukel για την ευγενική υποστήριξή τους FACS διαλογή κυττάρων εντός του Πανεπιστημίου της ροής της Γιούτα κυτταρομετρία πυρήνα.