Αφηρημένο

Χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες DNA, δημιουργήσαμε δύο στοιχεία έκφρασης mRNA και miRNA από 6 μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) σε ιστούς και ταιριάζουν κανονικό έλεγχο τους από γειτονικούς ιστούς για τον εντοπισμό δυνητικών δείκτες miRNA για τη διάγνωση. Έχουμε αποδείξει ότι HSA-miR-96 είναι σημαντικά και με συνέπεια πάνω ρυθμισμένα σε όλες τις 6 NSCLCs. Εμείς επικυρωθεί αυτό το αποτέλεσμα σε ένα ανεξάρτητο σύνολο 35 ζεύγη όγκων και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών τους, καθώς επίσης και οι οροί τους που συλλέγονται πριν από χειρουργική εκτομή ή χημειοθεραπεία, και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι HSA-miR-96 μπορεί να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη NSCLC και έχει μεγάλες δυνατότητες για να χρησιμοποιηθεί ως μη επεμβατική δείκτης για τη διάγνωση NSCLC. Έχουμε προβλέψει δυναμικό mRNAs στόχο miRNA βασίζονται σε διαφορετικές μεθόδους (TargetScan και Μιράντα). Περαιτέρω κατάταξη των miRNA γονιδίων που ρυθμίζονται με βάση τη σχέση τους με miRNAs αποκάλυψε ότι HSA-miR-96 και ορισμένων άλλων miRNAs έχουν την τάση να ρυθμίζουν προς τα κάτω mRNAs στόχο τους στην ανάπτυξη NSCLC, τα οποία έχουν επίπεδα έκφρασης ανεκτική σε άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ των miRNAs και τα mRNA στόχο τους. Επιπλέον, εντοπίσαμε μια σημαντική συσχέτιση της ρύθμισης miRNA με γονίδια συμπίπτουν με υψηλή πυκνότητα των CpG νησίδων, η οποία προτείνει ότι miRNA μπορεί να αντιπροσωπεύει μια πρωτοταγή ρυθμιστικό μηχανισμό που διέπουν τις βασικές κυτταρικές λειτουργίες και διαφοροποιήσεις των κυττάρων, και ο μηχανισμός αυτός μπορεί να είναι συμπληρωματικό με το DNA μεθυλίωση για την καταστολή ή ενεργοποίηση της έκφρασης του γονιδίου

Παράθεση:. Ma L, Huang Υ, Zhu W, Zhou S, Zhou J, Zeng F, et al. (2011) Μια ολοκληρωμένη ανάλυση των miRNA και mRNA έκφρασης σε μη-μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα. PLoS ONE 6 (10): e26502. doi: 10.1371 /journal.pone.0026502

Επιμέλεια: Boris Zhivotovsky, του Ινστιτούτου Καρολίνσκα, στη Σουηδία

Ελήφθη: May 23, 2011? Αποδεκτές: 28 Σεπτεμβρίου, 2011? Δημοσιεύθηκε: 27 Οκτ, 2011

Copyright: © 2011 Ma et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίζεται από το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Zhejiang (Y2110960) και το Γραφείο Επιστήμης και Τεχνολογίας του Zhoushan στον καθηγητή Yongkui Zhang (20081059), και το Ταμείο Έρευνας του Zhoushan Νοσοκομείο απονεμήθηκε στον Δρ Λίνα Ma, και το Εθνικό πρόγραμμα βασικής έρευνας ( 973 Πρόγραμμα? 2011CB944100 και 2011CB944101) και το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (90.919.024) στον καθηγητή Ιούνιος Yu. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Επί του παρόντος, μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στον κόσμο [1]. Η χειρουργική εκτομή γίνεται κυρίως σε περιπτώσεις πρώιμου σταδίου και είναι επίσης αποτελεσματική, αλλά η επίδρασή της είναι περιορισμένη σε ασθενείς με τοπικά προχωρημένο καρκίνους, λόγω του υψηλού ποσοστού μακρινές μεταστάσεις και υποτροπής. Έτσι, η χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία, όπως επίσης και ένας συνδυασμός των δύο, είναι πάντα εκτελούνται στη θεραπεία των ασθενών με τοπικά προχωρημένους καρκίνους. Ωστόσο, το ποσοστό επιβίωσης 5-χρόνια των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα μειώνεται δραματικά με κλινικά στάδια της νόσου, για παράδειγμα, από το εκτιμώμενο 61% για τους ασθενείς με το στάδιο ΙΑ ασθένεια στο 38% για τους ασθενείς με τη νόσο σταδίου ΙΒ. Άλλες ποσοστό επιβίωσης 5 ετών το στάδιο που σχετίζονται με την ασθένεια είναι 34% για τους ασθενείς με νόσο του ΔΣ, 13% για τους ασθενείς με νόσο σταδίου ΙΙΙΑ, 5% για τους ασθενείς με νόσο σταδίου ΙΙΙΒ, και 1% για τους ασθενείς με σταδίου IV [2] , [3], [4], [5]. Οι περισσότεροι ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα διαγιγνώσκονται μόνο μετά την όγκοι έχουν εξαπλωθεί πέρα ​​από την πρωτοβάθμια περιοχές τους, και αυτό είναι ένας σημαντικός λόγος για την κακή έκβαση των θεραπειών κατά του καρκίνου του πνεύμονα. Επιπλέον, η ανάλυση διακύμανσης ανάμεσα σε μια ποικιλία καρκίνων πρότεινε ότι ο καρκίνος του πνεύμονα έχει μεγαλύτερο αριθμό μεταλλαγμένων γονιδίων από άλλες μορφές καρκίνου [6]. Ως εκ τούτου, η ανακάλυψη αποτελεσματικών διαγνωστικών δεικτών και ανακρίνει μηχανισμοί της ανάπτυξης του καρκίνου του πνεύμονα, είναι τόσο αναγκαία για τη βελτίωση του ποσοστού επιβίωσης των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα.

miRNAs είναι μικρή μη-κωδικοποίησης RNAs (~ 22 nt long) που προσδένονται συμπληρωματικές αλληλουχίες σε mRNAs στόχους, με αποτέλεσμα την επιλεκτική αποικοδόμηση τους ή επιλεκτική αναστολή της μετάφρασης. Ως εκ τούτου, μέσω της ρύθμισης γονιδίων στόχων τους, οι miRNAs είναι γνωστό ότι εμπλέκονται σε ένα ευρύ φάσμα βιολογικών λειτουργιών, όπως ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, διαφοροποίηση, και την απόπτωση [7], [8]. έκφραση παρεκκλίνουσα miRNAs έχει αναφερθεί ότι προκαλούν ασθένειες, όπως ο καρκίνος [9], η νόσος του Alzheimer [10], οι καρδιοπάθειες [11], το νωτιαίο ανωμαλίες του κινητικού νευρώνα [12], και κ.λπ .. Σε NSCLC, έχει προταθεί ότι το miR -31 μπορεί να δράσει ως ένα ογκογόνο miRNA με καταστολή καταστολείς όγκων: LATS2 και PPP2R2A [13], και την έκφραση του HSA-miR-205 έχει προταθεί να είναι σε θέση να διακρίνει πλακώδες καρκίνωμα από μη πλακώδη μη μικροκυτταρικό πνεύμονα [14]. Επιπλέον, μαρτυρίες δείχνουν ότι η υψηλή HSA-mir-155 και χαμηλής HSA-ας-7α-2 έκφραση συσχετίζεται με φτωχή επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα [15], και έχει-miRNA-126 μπορεί να προάγει την απόπτωση των κυττάρων NSCLC που επάγεται με ακτινοβολία μέσω της PI3K-Akt μονοπατιού [16]. miRNAs τώρα αναδύεται βιοδείκτες ως εξαιρετικά ιστο-ειδικών για διακρίσεις ως καρκίνους από noncancerous ιστό, και διάφορα είδη καρκίνου, καθώς και διαφορετικές προγνωστικός αποτελέσματα [15], [17].

mRNA profiling έχουν αποκαλύψει ότι μεταγραφική ανωμαλία του πολλά γονίδια είναι υπεύθυνα για την ανάπτυξη των NSCLC [18], [19], και η διαφορική έκφραση των miRNAs έχουν επίσης ανιχνευθεί μεταξύ ιστών καρκίνου του πνεύμονα και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών [15], [20]. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε μικροσυστοιχίες για να μετρήσει τα επίπεδα έκφρασης των miRNAs και mRNAs ταυτόχρονα σε ζεύγη NSCLC και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών τους να διερευνήσουν πιθανούς ρόλους των miRNAs. Οι αναλύσεις μας είναι τόσο ολοκληρωμένες και όχι στο βάθος έρευνα για πιθανή υποψήφια miRNAs και τους στόχους τους mRNA για περαιτέρω έρευνες και κλινικές εφαρμογές.

Αποτελέσματα

διαφορικά εκφράζονται mRNAs σε NSCLC ιστούς σε σύγκριση με ζεύγη φυσιολογικούς ιστούς τους

Πραγματοποιήσαμε γονιδιακής έκφρασης για ζεύγη δειγμάτων ιστού όγκου-φυσιολογική από 6 ασθενείς με NSCLC και διερευνήθηκαν 34.694 γονίδια /μεταγραφές. Ορίσαμε 581 up-ρυθμιζόμενα γονίδια και 1, 297 ρυθμισμένα προς τα κάτω γονίδια τα οποία ήταν σταθερά πάνω ή προς τα κάτω ρυθμισμένα σε όλους τους 6 καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με τα γειτονικά φυσιολογικούς ιστούς (Πίνακας S2 και S3 Πίνακας). Μεταξύ των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων, εντοπίσαμε 2 σημαντικά up-ρυθμίζονται και 22 σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται τα γονίδια σε False Discovery Rate (FDR) 0,1 (Πίνακας S2 και S3 Πίνακας). Εμείς στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ανάλυση εμπλουτισμό GO χρησιμοποιώντας υπεργεωμετρική δοκιμής και μέθοδο των πολλαπλών προσαρμογής δοκιμών BH μέσω WebGestalt2 [21] και καθόρισε τις εμπλουτισμένο μονοπάτια σε ένα

σ

αξία των & lt? 0.001. Η εκθετική κατανομή είναι μία διακριτή κατανομή πιθανότητας που περιγράφει τον αριθμό των επιτυχιών σε μια ακολουθία

ν

αντλεί από ένα πεπερασμένο πληθυσμό χωρίς αντικατάσταση, όπως ακριβώς και η διωνυμική κατανομή περιγράφει τον αριθμό των επιτυχιών για κληρώσεις με αντικατάσταση. Υπεργεωμετρικών τεστ βοηθά να βρείτε ποια GO όροι υπερεκπροσωπούνται σε μια μεγάλη λίστα γονίδιο. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της δοκιμής υπεργεωμετρική, η διαδικασία της φάσης-Μ και το DNA του μεταβολισμού του κυτταρικού κύκλου ήταν κατά κύριο λόγο ενεργοποιηθεί, ενώ οδών που εμπλέκονται στην ανοσολογική λειτουργίες ήταν σημαντικά κατασταλεί σε NSCLC (Πίνακας 1). Επιπλέον, τα επάνω ρυθμισμένη γονίδια κυρίως εμπλουτισμένο σε «χρωμόσωμα» σε αντίθεση με την κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια που είχαν κυρίως εμπλουτισμένο σε «κυτταρικής μεμβράνης» (Πίνακας 2).

Η

Διαφορικά εκφραζόμενο miRNAs σε NSCLC ιστούς σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς ζεύγη τους

Πραγματοποιήσαμε έκφραση miRNA προφίλ χρησιμοποιώντας τα ίδια 6 ζεύγη δειγμάτων του πρωτογενούς όγκου και γειτονικό φυσιολογικό ιστό του. Λάβαμε 25 επάνω ρυθμισμένη και 24 ρυθμισμένα προς τα κάτω miRNAs που ήταν σταθερά πάνω ή προς τα κάτω ρυθμισμένα σε όλους τους 6 καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με τα γειτονικά φυσιολογικούς ιστούς πριν από τη δοκιμή σημασία (Πίνακας S4 και S5 Πίνακας). Με βάση μια πιο αυστηρή ανάλυση, λάβαμε ένα ενιαίο σημαντικά πάνω ρυθμισμένα miRNA, HSA-miR-96, σε False Discovery Rate (FDR) 0.1. Εξετάσαμε περαιτέρω το επίπεδο έκφρασης των δυνητικών στόχων mRNA της (Οι στόχοι αυτοί έχουν συντηρημένες miRNA θέσεις μεταξύ των σπονδυλωτών ή θηλαστικών δεσμευτικό και προβλέφθηκαν χρησιμοποιώντας TargetScan): 13 από 728 σύνολο γονιδίων υποψήφιος στόχος (Πίνακας S2 και Πίνακας S6) (λογαριασμός για 2,24% των 581 ρυθμισμένα προς τα πάνω γονίδια) έχουν επάνω ρυθμισμένη και 48 από το σύνολο (Πίνακας S3 και Πίνακας S6) (λογαριασμός για 3,70% των 1, 297 ρυθμισμένα προς τα κάτω γονίδια) έχουν ρυθμισμένα προς τα κάτω (Σχήμα 1Α). Στη συνέχεια επικυρώνονται HSA-miR-96 έκφρασης με βάση την ποσοτική RT-PCR σε ένα ανεξάρτητο σύνολο 35 NSCLC και δείγματα ορού τους (για τους ορούς, οι τιμές έκφρασης κανονικοποιήθηκαν με τους κανονικούς ανθρώπους χωρίς ιστορικό καρκίνου ή άλλων ασθενειών εκείνη τη στιγμή), και βρέθηκε HSA-miR-96 ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε αμφότερα τα δείγματα ιστού και ορού από ασθενείς με NSCLC (Σχήμα 2). Ως εκ τούτου, HSA-miR-96 μπορεί να είναι ένας σημαντικός παράγοντας για να συμβάλουν στην ανάπτυξη NSCLC και μπορεί να έχουν μεγάλες δυνατότητες να χρησιμοποιούνται για τη διάγνωση.

(Α) αποτελέσματα μικροσυστοιχιών από τα κάτω-ρυθμίζονται οι υποψήφιοι στόχος της HSA-miR -96 σε NSCLC. Εμείς δοκιμάστηκαν 6 ζεύγη NSCLC εναντίον φυσιολογικό ιστό. C και N σταθεί για τον καρκίνο και γειτονικό φυσιολογικό ιστό, αντίστοιχα. Τα γονίδια σήματα αστερίσκο ανήκουν στην ομάδα συσχετίζονται και τα υπόλοιπα γονίδια ομαδοποιούνται σε αντι-συσχετίζονται ομάδα σύμφωνα με τη σχέση έκφραση αυτών των γονιδίων με τις ρυθμιστικές miRNAs τους. (Β) Επικύρωση των αποτελεσμάτων μικροσυστοιχιών από qRT-PCR. Έχουμε επιλέξει 10 κάτω ρυθμισμένα υποψηφίων στόχος της HSA-miR-96 και εκτελούνται πειράματα qRT-PCR για την επικύρωση της έκφρασης σε σχέση mRNA σε σχέση με αφυδρογονάση γλυκεραλδεΰδης-3-φωσφορικής (GAPDH). Οι σχετικές τιμές έκφρασης είναι τα μέσα ± SE. *,

P

& lt? 0.05 με

t

δοκιμή? **

P

& lt? 0.001 από

t

τεστ

Η

Δύο ομάδες των συγκρίσεων που πραγματοποιήθηκαν:. (1) του όγκου έναντι γειτονικών φυσιολογικών ιστών του πνεύμονα, και (2) ορό καρκίνος vs. ορό μη καρκινικά. Σχετική έκφραση HSA-miR-96 προσδιορίστηκε με αναφορά σε μια εσωτερική U6 ελέγχου snRNA. Οι σχετικές τιμές έκφρασης είναι η κανονικοποιημένη μέση τιμή ± SE.

Η

Όπως miRNAs καταστέλλουν πάντα την έκφραση των γονιδίων στόχων, οι 48 κάτω ρυθμισμένα στόχους της HSA-miR-96 μπορεί να είναι πιο πιθανό να συμβάλλουν στην NSCLC ανάπτυξης μέσω της ρύθμισης HSA-miR-96. Έχουμε επιλέξει 10 κάτω ρυθμισμένα στόχους της HSA-miR-96 για να επικυρώσει τα επίπεδα έκφρασης του mRNA τους χρησιμοποιώντας qRT-PCR σε 20 NSCLC και διαπίστωσε ότι όλοι τους ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα κάτω σε ιστούς όγκων σε σύγκριση με τα γειτονικά φυσιολογικούς ιστούς (Σχήμα 1 Β ). Για να διερευνήσουν πώς αυτά τα 48 κάτω-ρυθμίζονται πιθανοί στόχοι mRNA μπορεί να επηρεάσει την ανάπτυξη του NSCLC, μπορούμε να ταξινομούνται με βάση τους όρους GO, και διαπίστωσαν ότι αυτά τα γονίδια που εμπλέκονται σε μια ποικιλία βασικών βιολογική διαδικασία, συμπεριλαμβανομένου του μεταβολισμού, βιολογικών ρύθμιση, η επικοινωνία των κυττάρων, αναπτυξιακή διαδικασία, το ανοσοποιητικό σύστημα, και το κ.λπ. (Εικόνα S2).

η κατάταξη των mRNA με βάση τη σχέση τους με το miRNA ρύθμιση

για να χαρακτηρίσουμε τον τρόπο miRNAs μπορούν να ρυθμίζουν τα mRNA στόχο τους, πραγματοποιήσαμε μια εκτενή ανάλυση σχετικά με την συσχετισμένη έκφραση των miRNAs και mRNAs στόχο τους. Τα miRNAs εκφράζονται εφ πρόδρομος RNAs που υποβάλλονται σε επεξεργασία με μία κυτταρική νουκλεάση, Drosha, πριν μεταφερθεί από ένα Exportin-5-εξαρτώμενο μηχανισμό μέσα στο κυτταρόπλασμα [22], [23]. Μόλις στο κυτταρόπλασμα, τα miRNAs διασπώνται περαιτέρω από το ένζυμο Dicer [24], [25], και αυτό έχει ως αποτέλεσμα 17-24 nt miRNAs που σχετίζονται με μία κυτταρική συγκρότημα που είναι παρόμοιο με το να επιβάλλει σιωπή σύμπλεγμα RNA επαγόμενη που συμμετέχει στην παρεμβολή RNA. Ωστόσο, miRNAs ρυθμίζουν κυρίως τη μετάφραση του mRNA, ενώ η καταστροφή siRNAs άμεση RNA μέσω της οδού παρεμβολής RNA (RNAi) [8], [26]. Ως εκ τούτου, η αφθονία των miRNAs μπορεί να εξαρτάται κυρίως από την αρχική έκφραση της και δεν εισάγονται εξωγενώς. Επιπλέον, αρκετές σειρές αποδείξεων υποδεικνύουν ότι η ανύψωση του miRNA έκφρασης οδηγούν προς τα κάτω ρύθμιση των γονιδίων-στόχων, και τη μείωση του miRNA έκφρασης οδηγούν προς τα πάνω ρύθμιση των γονιδίων στόχων [13], [27]. Ως εκ τούτου, υποθέτουμε ότι η επίδραση των miRNAs στην mRNAs στόχος τους είναι το επίπεδο που εξαρτάται από την έκφραση. Χρησιμοποιήσαμε ένα νέο μέτρο για την αξιολόγηση του κανονισμού miRNA, που ονομάζεται

ρύθμιση αξία

. Πρέπει πρώτα να υποθέσουμε ότι μια τιμή ρύθμισης ενός miRNA συσχετίζεται θετικά με το επίπεδο έκφρασης του. Δεδομένου ότι ένα miRNA έχει πάντοτε περισσότερα από ένα γονίδια στόχους [28], μπορούμε τότε να υποθέσουμε ότι μία τιμή ρύθμιση μιας δεδομένης miRNA συσχετίζεται αρνητικά με τον αριθμό των στόχων της. Ως εκ τούτου, ορίζουμε μια τιμή ρύθμισης για miRNA ως η απόκλιση στο επίπεδο έκφρασης για ένα συγκεκριμένο miRNA διαιρείται με τον αριθμό των εξέφρασε στόχους mRNA.

Κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του καρκίνου, ο κανονισμός μπορεί να διαφέρει από περίπτωση σε έλεγχο για ένα συγκεκριμένο miRNA και, ως εκ τούτου, η ρύθμιση αξίας μιας δεδομένης miRNA ισούται με τη μεταβολή της έκφρασης miRNA διαιρείται με τον αριθμό των εκφράζονται στόχων. Όταν η έκφραση ενός miRNA ρυθμίζεται προς τα κάτω σε καρκίνους, ρύθμιση του αξία γίνεται αρνητική, αν ο αριθμός των εκφρασμένων στόχων της δεν αλλάζει σημαντικά. Για ένα mRNA στόχο, η ρύθμιση του αξία είναι το άθροισμα όλων των τιμών ρύθμισης από το κανονιστικό miRNA της. Με βάση αυτούς τους ορισμούς, θα κατατάσσονται όλα τα διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων σε καρκίνους σε διαφορετικές ομάδες με βάση τους συσχετισμούς-συσχετιζόμενων ή αντι-συσχετίζονται με ρύθμιση miRNA τους. Πριν γίνει αυτό, είχαμε προβλέψει τις πιθανές γονιδίων στόχων αυτών με συνέπεια πάνω ή προς τα κάτω-ρυθμίζονται miRNAs.

Εμείς χρησιμοποιούνται τρεις μέθοδοι για την πρόβλεψη των πιθανών στόχων των miRNAs. Το λογισμικό TargetScan εστιάζει περισσότερο στην miRNA σπόρων (2-8nt στο 5 ‘περιοχή του ώριμου miRNA), καθώς τα στοιχεία υποδεικνύουν τη σημασία της περιοχής αυτής για miRNA αναγνώριση στόχων [29], [30], [31], [32]. Επιπλέον, η διατήρηση αλληλουχίας των τόπων στόχου έχει θεωρηθεί ως ένα σημαντικό χαρακτηριστικό για τη μείωση των ψευδώς θετικό ποσοστό [30]. Ως εκ τούτου, προβλέπεται πιθανούς στόχους των miRNAs χρήση TargetScan και συντηρημένες θέσεις στόχους μεταξύ των σπονδυλωτών ή θηλαστικών χρησιμοποιώντας το

P

μέθοδο CT της TargetScan [33]. Ωστόσο, οι θέσεις των σπόρων δεν παρέχουν πάντα την καταστολή, καθώς και το λογισμικό Miranda λαμβάνει επίσης υπόψη της άλλης περιοχής της miRNA εκτός από τους σπόρους προς σπορά χώρους [34]. Στη συνέχεια χρησιμοποιείται Miranda ως μια άλλη εναλλακτική μέθοδος για την πρόβλεψη στόχων των miRNAs. Οι δύο λογισμικά συχνά χρησιμοποιούνται για την πρόβλεψη των στόχων miRNA, και επιπλέον, δύο από αυτά μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την πρόβλεψη των στόχων των νέων miRNAs ως illuminia miRNA μικροσυστοιχία «humanMI_V2» περιέχει πολλές νέες miRNAs που δημιουργούνται από τις προσπάθειες προσδιορισμού αλληλουχίας επόμενης γενιάς σε όλο τον κόσμο. Έχουμε λάβει 16.160 συντηρημένα ζεύγη miRNA-στόχο μεταξύ των σπονδυλωτών ή θηλαστικών χρησιμοποιώντας το

P

CT μέθοδος TargetScan (Πίνακας S6), 70.320 ζεύγη miRNA-στόχο χρησιμοποιώντας TargetScan χωρίς να λάβει υπόψη την κατάσταση διατήρησης (Πίνακας S8), και 77.988 ζεύγη miRNA-στόχο χρησιμοποιώντας Miranda (Πίνακας S10). Παρατηρήσαμε ότι 48.841 ζεύγη miRNA-στόχος ήταν παρόντες και στα δύο TargetScan και Miranda αποτελέσματα (69.46% των αποτελεσμάτων TargetScan, 62.63% της Miranda αποτέλεσμα), και 12.403 ζεύγη miRNA-στόχο των συντηρημένων αποτελέσματα TargetScan ήταν κοινά με τα αποτελέσματα Miranda (76.75% των διατηρημένων αποτελέσματα TargetScan). Ως εκ τούτου, υπήρχαν περίπου 70 αποτελέσματα% πρόβλεψη που ήταν κοινά και στις δύο διαφορετικές μεθόδους, και συντηρημένα αποτελέσματα πρόβλεψη της TargetScan exhibite μεγαλύτερο ποσοστό των κοινών γονιδίων.

Εμείς που χρησιμοποιούνται κατ ‘αρχάς τα συντηρημένα αποτελέσματα πρόβλεψη για την ταξινόμηση των mRNAs με βάση τη σχέση τους με τον κανονισμό miRNA. Ειδικότερα, ορίσαμε 197 και 190 γονίδια ως αντι-συσχετίζονται και συσχετίζονται, αντίστοιχα, και 1491 ως «άλλοι», του οποίου η miRNA ρύθμιση τιμές είναι μηδενική (Πίνακας S7). Ερευνήσαμε περαιτέρω την κατανομή της αξίας ρύθμιση miRNA, επίπεδο γονιδιακή έκφραση και την πιθανή σχέση μεταξύ αυτών των δύο παραμέτρων. Στα 197 αντι-συσχετιζόμενων γονιδίων, 171 (λογαριασμός για 13,18% των 1, 297 ρυθμισμένα προς τα κάτω γονίδια) έχουν ρυθμισμένα προς τα κάτω και 26 (λογαριασμός για 4,48% των 581 ρυθμισμένα προς τα πάνω γονίδια) ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω. διανομή Gene με βάση την αξία ρύθμιση πρότειναν επίσης ότι η αντι-συσχετισμένων ομάδα ήταν πάντοτε κάτω-ρυθμίζονται από miRNAs (Σχήμα 3Α). Στα 190 συσχετίζονται γονίδια, 140 (λογαριασμός για 10,79% των 1, 297 ρυθμισμένα προς τα κάτω γονίδια) ήταν κάτω-ρυθμιζόμενη και 50 (λογαριασμός για 8,61% των 581 ρυθμισμένα προς τα πάνω γονίδια) ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω. διανομή Gene με βάση την τιμή ρύθμισης πρότεινε ότι η συσχέτιση ομάδα ήταν πάντοτε κάτω ρυθμισμένα (Σχήμα 3Α). Για 1.491 γονίδια σε «άλλους», 986 (λογαριασμός για το 76.02% του 1297 κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια) ήταν κάτω-ρυθμίζονται και 505 (λογαριασμός για 86,92% των 581 έως ρυθμιζόμενα γονίδια) ήταν πάνω ρυθμισμένα (Πίνακας 3). Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι miRNAs τείνουν να ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφραση του γονιδίου, ειδικά για εκείνους του αντι-συσχετισμένη ομάδα. Ερευνήσαμε επίσης πιθανές λειτουργίες του αντι-συσχετισμένη ομάδα, η οποία υποτίθεται ότι πρέπει να ρυθμίζονται από miRNAs, και διαπίστωσε ότι είχαν εμπλακεί σε μια ποικιλία βιολογικών διεργασιών, συμπεριλαμβανομένου του μεταβολισμού, του ανοσοποιητικού συστήματος, θανάτωση κυττάρων, πολυκύτταροι ανάπτυξη οργανικό, και την επικοινωνία των κυττάρων ( Εικόνα S3).

Εμείς κατατάσσονται όλα τα έκφραση-μεταβλητή mRNAs κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του καρκίνου του πνεύμονα με βάση τη σχέση τους με miRNAs. Τα αποτελέσματα είναι ταξινομημένα σε συσχετίζονται, αντι-συσχετίζονται, και άλλοι (καμία συσχέτιση). Οι συσχετίζονται mRNAs δείχνουν συσχετίζονται εκφράσεις σε κανονιστικές εκφράσεις miRNA τους και οι αντι-συσχετίζονται mRNAs δεν είναι. Τρεις διαφορετικές μέθοδοι χρησιμοποιήθηκαν για την πρόβλεψη πιθανών στόχων miRNA: «προστατευμένη» είναι εκείνα τα γονίδια που έχουν συντηρημένες miRNA θέσεις μεταξύ των σπονδυλωτών ή θηλαστικών δεσμευτική, και αυτά τα γονίδια είχαν προβλεφθεί με τη χρήση της

P

μέθοδος CT του TargetScan ? «TargetScan» είναι εκείνα τα γονίδια που προβλέπονται από τη χρήση perl script του TargetScan χωρίς να λαμβάνεται υπόψη διατήρησης. «Miranda» είναι εκείνα τα γονίδια που έχουν προβλέψει πιθανούς στόχους με βάση Miranda v3.3a σε πλατφόρμα Linux. διανομής (Α) Gene των συσχετιζόμενων και αντι-συσχετιζόμενων mRNAs απεικονίστηκε γραφικά βάση τις τιμές τους ρύθμιση miRNA. διανομής (Β) Gene των τριών ομάδων των mRNAs παραστάθηκε γραφικώς με βάση τις αξίες έκφρασή τους. Η τιμή έκφρασης ορίστηκε με αναφορά εκείνη του παρακείμενο φυσιολογικό ιστό (log2). (Γ) Η σχέση μεταξύ της έκφρασης των γονιδίων και ρύθμιση των miRNAs.

Η

Επαληθεύσαμε περαιτέρω αυτό το αποτέλεσμα, χρησιμοποιώντας τις προβλέψεις των TargetScan χωρίς να ληφθεί υπόψη διατηρήσεως σειράς και τις προβλέψεις της Miranda. Χρησιμοποιώντας Miranda, έχουμε 482 και 294 γονίδια ως αντι-συσχετίζονται και συσχετίζονται, αντίστοιχα, και 1102 ως «άλλοι». Χρησιμοποιώντας TargetScan χωρίς να λάβει υπόψη της διατήρησης, έχουμε 472 και 285 γονίδια, όπως το αντι-συσχετίζονται και συσχετίζονται, αντίστοιχα, και 1121 ως «άλλοι». Ερευνήσαμε περαιτέρω την τομή μεταξύ TargetScan και Miranda, και διαπίστωσε ότι οι τρεις μέθοδοι μοιράζονται περίπου 80% στην αντι-συσχετισμένη ομάδα? TargetScan και Miranda μοιράζονται περίπου το 70% των γονιδίων στο συσχετίζονται ομάδα, ενώ

P

CT μέθοδο μοιράζεται μόνο περίπου το 50% των γονιδίων με τα υπόλοιπα δύο μεθόδους με τη συσχετισμένη ομάδα. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα των διατηρημένων προβλέψεις, miRNAs στην αντι-συσχετίζονται ομάδα φαίνεται ρυθμίζουν υψηλότερη αναλογία ρυθμίζεται προς τα κάτω mRNAs σε σύγκριση με τις υπόλοιπες ομάδες που ορίζονται με βάση τις ακόλουθες δύο μεθόδους (Πίνακας 3), και ο-συσχετιζόμενων αντι ομάδα εμφάνισε εντυπωσιακά διαφορετική κατανομή της αξίας ρύθμιση σε σύγκριση με την ομάδα συσχετισμένης (Σχήμα 3Α).

στη συνέχεια εξετάστηκε το επίπεδο έκφρασης στόχου των τριών ομάδων ρύθμισης και διαπίστωσε ότι το επίπεδο έκφρασης του-συσχετιζόμενων αντι ομάδα ήταν υψηλότερες από τις υπόλοιπες ομάδες (Σχήμα 3Β). Περαιτέρω διερεύνηση των τιμών ρύθμισης με το επίπεδο έκφρασης έδειξαν ότι υψηλά εκφρασμένα γονίδια στο αντι-συσχετίζονται ομάδα έτεινε να είναι κάτω-ρυθμίζονται από miRNAs, ενώ ταπεινός-εκφρασμένα γονίδια τείνουν να είναι up-ρυθμίζεται. Γονίδια στην συσχετισμένη ομάδα συμπεριφέρονται με τον αντίθετο τρόπο (Εικόνα 3C). Αυτό το αποτέλεσμα προτείνει ότι υψηλά εκφραζόμενα γονίδια μπορεί να συνεισφέρει περισσότερο στην κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια σε αντι-συσχετίζεται ομάδα από το να up-ρυθμιζόμενα γονίδια στην ίδια ομάδα.

Πιθανές σχέση miRNAs με μεθυλίωση στην ρύθμιση mRNA

έκφραση

Όπως μεθυλίωση είναι ένας άλλος σημαντικός μηχανισμός για τη ρύθμιση της έκφρασης του mRNA, μελετήσαμε περαιτέρω πώς μπορεί να αλληλεπιδράσει με τον κανονισμό miRNA. Έχουμε κατηγοριοποιούνται πρώτα τα γονίδια στόχους σε HCG (υψηλή περιεκτικότητα σε CpG), LCG (ενδιάμεσο περιεχόμενο CpG) και ICG (χαμηλή περιεκτικότητα CpG) τάξεις (Πίνακας S2 και S3 Πίνακας) σύμφωνα μια μέθοδο που περιγράφηκε προηγουμένως [35]. Βρήκαμε ότι στις συντηρημένες αποτελέσματα πρόβλεψη, τόσο το αντι-συσχετίζονται και συσχετισμένες ομάδες που περιέχονται περισσότερα γονίδια HCG από άλλους ή όλα τα γονίδια (Σχήμα 4Α), και το αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι τα γονίδια HCG είναι πιο πιθανό να ρυθμίζεται από miRNAs που έχουν συντηρημένες στόχος sites.

(Α) Η κατανομή των CpG-πυκνότητας ταξινομούνται γονίδια σε κάθε ομάδα. Αυτά τα γονίδια στόχους προβλέφθηκαν χρησιμοποιώντας τρεις διαφορετικές μεθόδους: «προστατευμένη» είναι εκείνα τα γονίδια που έχουν συντηρημένες miRNA θέσεις μεταξύ των σπονδυλωτών ή θηλαστικών δεσμευτική, και αυτά τα γονίδια προβλεφθεί χρησιμοποιώντας το

P

μέθοδος CT του TargetScan? «TargetScan» είναι εκείνα τα γονίδια που προβλέπονται από τη χρήση perl script του TargetScan χωρίς να λαμβάνεται υπόψη διατήρησης. «Miranda» είναι εκείνα τα γονίδια που έχουν προβλέψει πιθανούς στόχους με βάση Miranda v3.3a σε πλατφόρμα Linux. (Β) Σχέση μεταξύ των CpG πυκνότητας νησιού και γονιδιακής έκφρασης. Τρεις ομάδες ταξινομήθηκαν:. Όλα τα εκφραζόμενα γονίδια στον NSCLC, τα γονίδια miRNA-ρυθμίζονται και άλλα γονίδια που μπορεί να μην επηρεάζεται από miRNAs

Η

Δεδομένου ότι ένας μεγάλος αριθμός των υψηλής έκφρασης γονιδίων βρέθηκαν στο αντι-συσχετίζονται ομάδα, ζητήσαμε περαιτέρω εάν αυτά τα γονίδια HCG είναι πάντα εξαιρετικά εκφράζεται και τείνουν να miRNA-ρυθμίζεται. Σε όλα τα γονίδια που εκφράζονται σε NSCLC, γονίδια ΛΣ δεν είχαν θεωρηθεί ως κυρίαρχο σε εντόνως εκφρασμένα γονίδια σε σύγκριση με LCG ή ICG γονίδια. Οι εκφράσεις κορυφή του φάσματος HCG από 5 έως 10, ενώ εκείνες των ICG ή LCG γονίδια είναι σε μία περιοχή από 2 έως 7. miRNA τείνει να ρυθμίσει περισσότερα γονίδια στο σχετικό επίπεδο έκφρασης από 5 έως 10, ως εκ τούτου, όταν ρυθμίζονται από miRNAs, η κορυφή του ICG ή γονιδιακή έκφραση LCG θα πρέπει να είναι σε αυτό το εύρος, και παρατηρήσαμε ότι υπήρχαν λιγότερο γονίδια LCG σε αυτό το εύρος έκφρασης σε σύγκριση με HCG ή ICG γονίδια. Ωστόσο, η «άλλους» (γονίδια χωρίς μεταβολή αξία κανονισμού) έχει επίσης μία κορυφή στο φάσμα έκφραση αλλά δεν υπήρχε διαφορά στην πυκνότητα γονίδιο μεταξύ των τριών κατηγοριών CpG (Σχήμα 4Β). Συνοπτικά, τα γονίδια HCG μπορεί να εμπλουτιστεί γονίδια που ρυθμίζονται από miRNAs λόγω των υψηλών επιπέδων έκφρασής τους, αλλά αυτό δεν είναι προφανώς ο μόνος λόγος.

Επίσης πραγματοποιήθηκε ανάλυση GO μεταξύ των miRNA-ρυθμιζόμενη και miRNA-insensitive ομάδες για να δείξει ότι τα γονίδια και οι λειτουργίες τους είναι διαφορετικά από το αντι-συσχετισμένων και τις συσχετισμένες ομάδες (Σχήμα 5 και το Σχήμα S5). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5, το miRNA-ρυθμιζόμενη ομάδα περιέχει περισσότερα γονίδια στις ακόλουθες διεργασίες: ρύθμιση της μεταγραφής, η δέσμευση της επικοινωνίας κύτταρο ρύθμιση ανάπτυξης νουκλεϊκών οξέων, του μεταβολισμού και. Οι διαφορές αυτές καταδεικνύουν από μια άλλη οπτική γωνία γιατί miRNAs τείνουν να επηρεάζουν τα γονίδια HCG με συντηρημένες θέσεις στόχους miRNA ως CpG περιεχόμενο νησί είναι πάντοτε συσχετίζεται με γονιδιακή ρύθμιση και λειτουργική διαφοροποίηση, και αυτά τα γονίδια μπορεί να έχει σημασία για τις βασικές κυτταρικές λειτουργίες των διαφόρων σπονδυλωτών ή θηλαστικών [36 ]

P

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε ως σημαντική [67]

η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε το mRNA. και miRNA προφίλ του NSCLC. mRNA προφίλ αποκάλυψε ότι ένας αριθμός των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων εμπλέκονται στην ενεργοποίηση του κυτταρικού κύκλου σε NSCLC. Αυτό το εύρημα είναι σύμφωνο με τα αποτελέσματα προηγούμενων μελετών, οι οποίες δείχνουν ότι η μη φυσιολογική του κυτταρικού κύκλου σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο καρκίνου του πνεύμονα [37], [38]. Τα γονίδια ρυθμισμένα προς τα κάτω βρέθηκε να εμπλουτίζεται κυρίως στην ανοσοποιητικό σύστημα, καθώς και εκείνων εντοπισμένο στις κυτταρικές μεμβράνες, τα οποία συνήθως συσχετίζεται με την επικοινωνία κυττάρου-κυττάρου και να συμμετέχουν στην ανοσολογική διαδικασία. Οι αναστολές των γονιδίων αυτών έχουν υποτίθεται ότι διευκολύνουν την ανάπτυξη καρκίνου του πνεύμονα και της εξέλιξης, και αυτό μπορεί σε κάποιο βαθμό λόγω της διαφυγής των καρκινικών κυττάρων από τον εντοπισμό και την καταστροφή από το ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή [39], [40], [41].

σε miRNA προφίλ σύγκρισης, βρήκαμε HSA-miR-96 ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε NSCLC. 48 HSA-miR-96 πιθανοί στόχοι ήταν κυρίως εμπλουτισμένο στην ομάδα mRNA ρυθμίζεται προς τα κάτω και εμπλέκονται σε μία ποικιλία βιολογικών διεργασιών σύμφωνα με την GO σχολιασμούς. Με βάση τις εκτιμήσεις ρύθμιση αξία, δείξαμε ότι 42 από αυτούς ανήκουν στην αντι-συσχετισμένη ομάδα (Σχήμα 1Α, Πίνακας S7). Πειράματα επικύρωσης μας αποκάλυψαν ότι η ώριμη μορφή του HSA-miR-96 εκφράζεται έντονα, όχι μόνο σε καρκινικούς ιστούς, αλλά και σε ορούς ασθενών με καρκίνο. Το αποτέλεσμα αυτό υποδεικνύει ότι HSA-miR-96 έχει μεγάλες δυνατότητες για να χρησιμοποιηθεί ως μια μη επεμβατική βιοδείκτη για NSCLC διάγνωση.

τρέχουσα γνώση μας σχετικά με HSA-miR-96 είναι μάλλον περιορισμένη. Εδρεύει στη διαγονιδιακή περιοχή μεταξύ NRF1 και UBE2H στο ανθρώπινο χρωμόσωμα 7 [42] και έχει μια πολύ ευρεία κατανομή μεταξύ των ζώων, από νηματώδεις σε θηλαστικά, και είναι πιο συντηρημένη μεταξύ των σπονδυλωτών (Σχήμα S4). Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι λειτουργεί για τη ρύθμιση της εξέλιξης της διαφοροποίησης κοχλιακών εσωτερικά και εξωτερικά κύτταρα θηλαστικών μαλλιά [43], και συνδέεται με την επιθετική συμπεριφορά του ανθρώπου [44]. Στη σχέση με καρκίνους, HSA-miR-96 έχει αναφερθεί ότι είναι εξαιρετικά εκφρασμένη σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης [45], καρκίνωμα του προστάτη [46], και χρόνια μυελοειδή λευχαιμία [47]. Μπορεί να ανιχνευθεί στα ούρα και συσχετίζεται με το στάδιο και το βαθμό με βάση την ουρική κυτταρολογίας του καρκινώματος ουροθηλιακά [48]. Up-ρύθμιση της HSA-miR-96 έχει σαν αποτέλεσμα κάτω κανονισμούς του μεταγραφικού παράγοντα FOXO3a και FOXO1, και έτσι επάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε ανθρώπινο καρκίνο του μαστού [49], [50]. Σε αναλύσεις μας βρήκαμε μια σειρά πιθανών στόχων που μπορεί να συσχετίζονται με τη λειτουργία του HSA-miR-96 για την ανάπτυξη NSCLC, αλλά κανένας από τους δυνητικούς στόχους έχουν επικυρωθεί από πειράματα. Ως εκ τούτου, περαιτέρω πειραματισμός είναι κατ ‘ουσίαν στην αποκάλυψη της σχέσης μεταξύ HSA-miR-96 και NSCLC. Επιπλέον, θα αυξηθεί το μέγεθος του δείγματος για τη διερεύνηση πιθανής σχέσης της HSA-miR-96 έκφρασης με την πρόγνωση, και άλλα χαρακτηριστικά του NSCLC.

Σε γενικές γραμμές, τα miRNAs πιστεύεται ότι δεσμεύει την 3 ‘αμετάφραστη περιοχή ενός mRNA στόχου και ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφρασή του σε mRNA ή επίπεδα πρωτεΐνης αλλά ως επί το πλείστον στο επίπεδο του mRNA [51]. Ως εκ τούτου, όταν η έκφραση ενός miRNA είναι αυξημένη, mRNAs που ρυθμίζονται από το miRNA αναμένεται να είναι κάτω-ρυθμίζονται? όταν η έκφραση των miRNA καταστέλλεται, τα mRNA στόχο της θα πρέπει να εμφανιστεί-κανονισμούς. Ωστόσο, σύμφωνα με τα αποτελέσματα μας, τα αντι-συσχετίζονται mRNAs είναι πάντα ρυθμισμένα προς τα κάτω και μόνο ένα μικρό κλάσμα των γονιδίων είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω. Περαιτέρω εξέταση πρότεινε ότι στην αντι-συσχετισμένων ομάδα, ρυθμίζεται προς τα κάτω mRNAs είναι πάντα υψηλή έκφραση, και ρυθμίζεται προς τα πάνω mRNAs είναι πάντα ταπεινός εκφράζονται. Ως εκ τούτου, η ύπαρξη περισσότερο εντόνως εκφρασμένων γονιδίων μπορεί να είναι ένας σημαντικός συνεισφέρων στο φαινόμενο. Ο λόγος για τον οποίο εντόνως εκφρασμένο mRNAs τείνουν να ρυθμίζεται προς τα κάτω από miRNAs και τις ταπεινός-εκφράζεται mRNAs τείνουν να είναι up-ρυθμίζεται από miRNAs προτείνει μια ύπαρξη ενός ρυθμιστικού ισορροπίας που λειτουργεί για να κρατήσει ολόκληρο το μεταγραφικό σε μια βελτιστοποιημένη δυναμική περιοχή.

στην ανάλυσή μας, δεν καταφέραμε να βρούμε στοιχεία που είναι υπεύθυνες για τη διαφορά μεταξύ της αντι-συσχετίζονται και των συσχετιζόμενων mRNA. GO κατάταξη δεν δείχνουν καμία εμφανής διαφορά είτε (Σχήμα S5). Επιπλέον, τα επίπεδα έκφρασης των mRNA στόχου που έχουν υψηλή αξία κανονισμός δεν παρουσιάζουν σημαντική διακύμανση, και το αντίστροφο (Πίνακας S2, Πίνακας S3, Πίνακας S7, Πινγκ S9, Πίνακας S11), και τα γονίδια των οποίων η έκφραση είναι σημαντικά ποικίλες δεν είναι απαραίτητα σημαντικά ρυθμίζεται. Δεδομένου ότι ένα mRNA συχνά ρυθμίζεται από περισσότερες από μία miRNAs [28], είμαστε ακόμα σε θέση να γνωρίζει πώς αυτά τα miRNAs αλληλεπιδρούν μεταξύ τους, και η οποία είδος άμεσης αλληλεπιδράσεις είναι πιο αποτελεσματική. Επιπλέον, μπορεί να καταστείλει miRNAs γονίδια στόχους τους μόνο στο επίπεδο της πρωτεΐνης [52] και οι στόχοι δεν μπορούν να παρουσιάζουν αξιοσημείωτες αλλαγές στο επίπεδο του mRNA. Υπάρχουν και άλλοι παράγοντες που εμπλέκονται στη ρύθμιση mRNAs σε επιγενετικές επίπεδα, όπως ιστόνης μεθυλίωση [53], [54] και ακετυλίωση [55], [56], και που είναι πάντα σε θέση να παρεμβαίνει με miRNA-centric δίκτυα [57] , [58], καθιστώντας την αποκρυπτογράφηση τέτοιων δικτύων πιο δύσκολη.

μια άλλη ενδιαφέρουσα παρατήρηση είναι ότι τα γονίδια είτε στο συσχετισμένη ομάδα ή αντι-συσχετίζονται ομάδας έχουν ένα μεγαλύτερο ποσοστό των γονιδίων ΛΣ από ότι στην ομάδα «άλλοι». Τόσο η συσχετίζονται και οι αντι-συσχετίζονται ομάδες που θεωρούνται πιο πιθανό να επηρεάζονται ή ενδεχομένως ρυθμίζονται από miRNAs. Το αποτέλεσμα αυτό υποδεικνύει ότι miRNAs έχουν την τάση να ρυθμίζουν τα γονίδια ΛΣ. Περαιτέρω έρευνα έδειξε ότι τα γονίδια HCG έτειναν να εκφράσουν σε υψηλότερο επίπεδο σε σύγκριση με το ICG ή γονίδια LCG. Ως εκ τούτου, μπορεί να υπάρχει μια πιθανότητα ότι τα περισσότερα γονίδια ΛΣ επηρεάζεται από miRNAs. Ωστόσο, οι συγκρίσεις βασίζονται σε όλους τους εν δυνάμει στόχους απέτυχε να δείξει οποιαδήποτε διαφορά μεταξύ αυτών των ομάδων (Σχήμα 4Α). Δεδομένου ότι το αυστηρό πρότυπο επιλεγμένων στόχων έχουν συντηρημένες θέσεις πρόσδεσης των miRNAs μεταξύ των σπονδυλωτών ή θηλαστικών, τα γονίδια-στόχους περισσότερο HCG στα miRNA-επηρεασμένη ομάδα μπορεί να συσχετίζονται με την εξέλιξη γονιδίων μεταξύ των σπονδυλωτών.

GO σύγκριση μεταξύ ρυθμιζόμενης και μη ελεγχόμενα ομάδες απέδειξαν ήταν αρκετά διαφορετική, διότι ο πρώην πάντα περιέχει περισσότερα γονίδια που εμπλέκονται στη ρύθμιση της μεταγραφής, η δέσμευση της επικοινωνίας των κυττάρων κανονισμού ανάπτυξη νουκλεϊκών οξέων, του μεταβολισμού και. Η λειτουργία των γονιδίων και η έκφραση τους συσχετίζεται πάντα με το περιεχόμενο CpG νησίδα υποκινητών. Έχει προταθεί ότι οι λειτουργίες σπίτι διατήρησης υπερεκπροσωπούνται σημαντικά στην τάξη HCG, ενώ οι όροι που σχετίζονται με συγκεκριμένες λειτουργίες χαρακτηριστικό του πιο διαφοροποιημένα ή πολύ καλά ρυθμισμένη κύτταρα υπεραντιπροσωπεύονται σημαντικά στην τάξη LCG [36], [59]. miRNA έχει προταθεί να είναι ένας πρωταρχικός μηχανισμός ρύθμισης καθώς αυτό είναι παρόν από χαμηλό σε υψηλό οργανισμούς, ως εκ τούτου, μπορεί να προτιμούν να ρυθμίσουν ένα υψηλότερο ποσοστό των γονιδίων HCG για τις βασικές κυτταρικές λειτουργίες.