Αφηρημένο

Ο καρκίνος αναπτύσσεται μέσω μιας διαδικασίας πολλών σταδίων στην οποία τα φυσιολογικά κύτταρα να εξελιχθούν σε κακοήθεις όγκους με την εξέλιξη της τους γονιδιώματα, ως αποτέλεσμα της απόκτησης των μεταλλάξεων στα γονίδια του οδηγού του καρκίνου. Ο αριθμός, η ταυτότητα και ο τρόπος δράσης των γονιδίων οδηγού του καρκίνου, καθώς και τον τρόπο συμβάλλουν στην εξέλιξη του όγκου είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Η μελέτη αυτή αναπτύσσεται ο όγκος του ιού μαστού ποντικού (MMTV) ως παρεμβατικής μεταλλαξιογόνο να βρείτε τόσο τα γονίδια του οδηγού και τα δίκτυα στα οποία λειτουργούν. Χρησιμοποιώντας βαθιά αλληλουχίας θέση εισαγωγής εντοπίσαμε γύρω από 31000 τοποθεσίες ενσωμάτωση ρετροϊού σε 604 MMTV που προκαλείται από μαστικούς όγκους από τα ποντίκια με μαστικό αδένα ειδικά διαγραφή του

Trp53

,

PTEN

ετερόζυγα ποντίκια νοκ-άουτ, ή στελέχη άγριου τύπου . Εντοπίσαμε 18 γνωστές κοινές θέσεις ενσωμάτωσης (CISS) και 12 προηγουμένως άγνωστη CISs σήμανση νέα υποψήφια γονίδια του καρκίνου. Μέλη του

Wnt

,

Fgf

,

FGFR

,

RSPO

και

ΡϋΘΡΡ

οικογένειες γονιδίων ήταν συνήθως μεταλλαχθεί σε μια αμοιβαία αποκλειστική περιοχή της μόδας. Τα δεδομένα ακολουθίας που παράγεται έδωσε επίσης πληροφορίες σχετικά με την κλωνικότητας των παρεμβολών σε επιμέρους όγκους, που μας επιτρέπει να αναπτύξουμε ένα μοντέλο δεδομένων με γνώμονα της MMTV που προκαλείται από την ανάπτυξη του όγκου. Μεταλλάξεις παρεμβολής κοντά στο

Wnt

και

Fgf

γονίδια επισημάνετε τις πρώτες «έναρξη» γεγονότα στην MMTV προκαλούμενη ογκογένεση, ενώ

Οι FGFR

γονίδια στοχευμένες αργότερα κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι παρεμβατικής μεταλλαξογένεσης μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να ανακαλύψετε τις μεταλλάξεων δίκτυα, το χρονοδιάγραμμα των μεταλλάξεων, και τα γονίδια που κινεί και οδηγούν την εξέλιξη του όγκου

Παράθεση:. Klijn C, Koudijs MJ, Kool J, δέκα Hoeve J , Boer Μ, de Moes J, et al. (2013) Ανάλυση των όγκων ετερογένεια και Cancer Gene δίκτυα που χρησιμοποιούν Βαθιά αλληλουχίας των MMTV-Induced Ποντίκι μαστικούς όγκους. PLoS ONE 8 (5): e62113. doi: 10.1371 /journal.pone.0062113

Συντάκτης: Robert Oshima, Sanford Burnham Medical Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9 Φλεβάρη 2013? Αποδεκτές: 25 Φλεβάρη του 2013? Δημοσιεύθηκε: May 14, 2013

Copyright: © 2013 Klijn et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε οικονομικά από την ολλανδική Εταιρεία Καρκίνου (επιχορήγηση 2001-2489 με JH), του Συνδέσμου Διεθνών Ερευνών Καρκίνου (AICR χορηγήσει 07-585 να JJ), τις Κάτω Χώρες Genomics Πρωτοβουλία /Κάτω Χώρες Οργανισμού για την Επιστημονική Έρευνα (επιχορήγηση NGI /NWO Πρόγραμμα 050 -10-008 να MVL? NGI /NWO Horizon επιχορήγηση Θεαματική 40-41009-98-9109 και NGI /NWO Horizon Zenith χορηγήσει 40-41009-98-11097 να JJ), η Ολλανδία Κοινοπραξία Συστημάτων Βιολογίας (NCSB), ο καρκίνος Genomics Κέντρο (ΚΕΔ), και το Κέντρο Βιολογίας Καρκίνου Συστήματα (CSBC). D. J. Α χρηματοδοτείται από Cancer Research-UK και το Wellcome Trust (76.943). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Με την έλευση των τεχνολογιών προσδιορισμού αλληλουχίας DNA επόμενης γενιάς η μεταλλακτική τοπίο αρκετών τύπων όγκων έχει οριστεί αποκαλύπτοντας ότι υπάρχουν πολυάριθμες γενετικές μονοπάτια για κακοήθεια [1]. Όγκου ετερογένεια συμβάλλει περαιτέρω σε αυτό πολυπλοκότητα [2], [3], περιπλέκοντας έτσι την ικανότητά μας να διακρίνουμε τις μεταλλάξεις οδηγού από τους επιβάτες. μοντέλα όγκων ποντικιού παρουσιάσει μια καθαρή, να αναπαραχθεί

in vivo

σύστημα για τη μελέτη της συμβολής των γονιδίων οδηγό να ογκογένεση και να καθορίσει υποκείμενων βιολογικών μηχανισμών δράσης τους [4].

παρεμβολής μεταλλαξιγένεσης (IM) απασχολούν ρετροϊούς ή τρανσποζόνια υπήρξε ένα από τα κύρια εργαλεία για την επαγωγή όγκων σε ποντίκια [5] – [8]. Ιού μαστικού καρκίνου ποντικού (MMTV) είναι μια αργή-μετατρέποντας ρετροϊός που έχει χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη του μαστικού ογκογένεση σε ποντικούς. Αυτός ο ιός προκαλεί μαστικούς όγκους με ενσωμάτωση του προϊικού DNA του μέσα ή κοντά γονίδια του καρκίνου. Επαναλαμβανόμενοι κύκλοι μετάλλαξη παρεμβολής και κλωνική επέκταση οδηγεί σε μαστικούς όγκους που φέρουν πολλαπλούς κλωνική και υπο-κλωνικών εντάξεις MMTV, συμπεριλαμβανομένων μεταλλάξεων που συνδέονται με τα δύο γονίδια του οδηγού, καθώς και μεταλλάξεις των επιβατών.

μοριακή κλωνοποίηση του προϊού ενθέσεις σε MMTV- που προκαλείται από μαστικούς όγκους οδήγησε στην ανακάλυψη του πρώτου MMTV κοινή εισαγωγή του δικτυακού τόπου (CIS) και το σχετικό γονίδιο

Wnt1

(αρχικά ονομαζόταν

Int1

) το 1982 [9]. Διαπιστώθηκε ότι ΜΜΤν παρεμβολές κοντά το

Wnt1

γονίδιο προωθείται μαστικού ανάπτυξη του όγκου μέσω της ενεργοποίησης Wnt1, το ιδρυτικό μέλος του μονοπατιού σηματοδότησης Wnt. Λίγο μετά την ανακάλυψη του

Wnt1

άλλο ογκογονίδιο,

Fgf3

(αρχικά ονομάζεται

INT2

) αναγνωρίστηκε. Περαιτέρω έρευνα έδειξε ότι αυτό το μέλος της οικογένειας γονιδίων αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών συνεργάζεται αποτελεσματικά με το

Wnt1

σε σχηματισμό όγκου [10]. Μετά την υπόσχεση αυτές τις πρώιμες μελέτες, η αυξανόμενη δημοτικότητα του ΜΜΤν ως σύστημα διαλογής ως αποτέλεσμα την ανακάλυψη αρκετών πρόσθετων γονιδίων που εμπλέκονται στην ανάπτυξη του καρκίνου [11] – [17]

Η ετερογένεια και την εξέλιξη της MMTV-. επαγόμενων όγκων μπορεί να αξιολογηθεί με την ανάλυση της σχετικής αφθονίας ( «κλωνικότητα») των μεμονωμένων παρεμβολών σε ένα δεδομένο δείγμα. Εξαιρετικά πλούσια παρεμβολές δείχνουν νωρίς, έναρξη εκδηλώσεων εισαγωγής και ταπεινός άφθονη παρεμβολές διευκρινίζει τα γεγονότα που συμβαίνουν αργότερα κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του όγκου, ανάλογη με πρόσφατες μελέτες της ενιαίας μεταλλάξεις νουκλεοτιδίων σε ανθρώπινους όγκους [2], [3]. Προηγουμένως χρησιμοποιούνται προσεγγίσεις που βασίζονται στην PCR δεν είναι σε θέση να αξιόπιστα ποσοτικά την κλωνικότητας των χώρων εισαγωγής οφείλεται σε προκαταλήψεις ενίσχυσης αλληλουχίας. Ως εκ τούτου, αναπτύχθηκε μια μέθοδος για την ταυτόχρονη αναγνώριση και ποσοτική εκτίμηση των κλωνικότητα παρεμβατικής μεταλλάξεων που ονομάζεται Shear-Splink [18]. Εφαρμόσαμε αυτή τη μέθοδο για να αναλύσει ένα μεγάλο σύνολο MMTV που προκαλείται από όγκους από δύο στελέχη άγριου τύπου ποντικού (BALB /c και FVB /N) και δύο γενετικά ποντίκι (GEM) μοντέλα του καρκίνου του μαστού: το

PTEN

+/-

στέλεχος [19] και το

K14Cre? Trp53

μοντέλο [20]. Χρησιμοποιήσαμε το προκύπτον σύνολο δεδομένων για την αντιμετώπιση τέσσερα βασικά ερωτήματα: Πρώτον, μπορούμε να προσδιορίσουμε νέες MMTV CISs και με αυτόν τον τρόπο να επεκτείνει το ρεπερτόριο των γονιδίων καρκίνου του υποψηφίου που σχετίζονται με αυτά τα μοντέλα; Δεύτερον, μπορούμε να προσδιορίσουμε γονότυπο συγκεκριμένα γονίδια του οδηγού σε κάθε μία από τις γενετικό υπόβαθρο; Τρίτον, μπορούμε να προσδιορίσουμε συνυπάρχουσες ή αλληλοαποκλειόμενες σχέσεις μεταξύ CISs και έτσι καθορίζουν λειτουργικές σχέσεις μεταξύ των συνδεδεμένων γονιδίων του οδηγού; Τέλος, μπορούμε να δημιουργήσει ένα μοντέλο εξέλιξης του όγκου από τις πληροφορίες κλωνικότητα προέρχεται από την αλληλουχία διαβάζει των μεμονωμένων παρεμβολών; Ένα τέτοιο μοντέλο θα καθορίσετε τη σειρά των γεγονότων με βάση το προφίλ εισαγωγής και να ρίξει φως στις λειτουργικές σχέσεις μεταξύ των γονιδίων που εμπλέκονται στην MMTV που προκαλείται από μαστικούς ογκογένεσης.

Υλικά και Μέθοδοι

μοντέλα ποντίκι που χρησιμοποιείται για MMTV λοίμωξη

νεογέννητα BALB /c /He /Α (συμβολίζεται BALB /c) ποντικοί μολύνθηκαν με ΜΜΤν από τους Foster νοσηλευτικό επί C3H /A θηλυκά που φιλοξενούν το γάλα που μεταδίδεται MMTV [21]. Μολυσμένα BALB /c θηλυκά ποντίκια αναπτύσσουν μαστικούς όγκους με υψηλή συχνότητα (& gt? 95% πριν από την ηλικία 1 έτους). Τα ζώα μολυσμένα με ιό είχαν συμβολίζεται BALB /c

+ ποντίκια. Σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν δύο διαγονιδιακές σειρές του ποντικιού και ελέγχους άγριου τύπου τους: ένα στέλεχος όρους ανεπαρκή για

Trp53

σε επιθηλιακά ιστών σε ένα φόντο /c ποντίκια (Balb /c

K14Cre? Trp53

F /F

) και ένα μικρόβιο-line ετερόζυγα νοκ-άουτ για

PTEN

σε FVB /Ν φόντο

Η BALB /c

K14Cre?. Trp53

F /F

στέλεχος ποντικού που παράγεται από εννέα συνεχόμενες ανάδρομες διασταυρώσεις των

K14Cre? Trp53

F /F

ζώα σε μια μικτή 129P2 /Ola και FVB /Ν φόντο [22] σε ποντίκια BALB /c. Η προκύπτουσα Balb /c

K14Cre? Trp53

F /F

στέλεχος έδειξε μόνο μια μικρή μαστικού συχνότητα εμφάνισης όγκου πριν από την ηλικία των 300 ημερών. Αυτά όρους

Trp53

knockout ποντίκια μολύνθηκαν από ΜΜΤν μέσω Foster νοσηλευτικής από BALB /c

+ θηλυκά.

Για σύγκριση MMTV πρόκλησης ογκογένεσης μεταξύ άγριου τύπου και

PTEN

+/- ποντίκια, η υπό όρους

PTEN

αλληλόμορφο νοκ-άουτ [23] χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργήσει

PTEN

+/- FVB /Ν ποντίκια.

PTEN

+/- ποντίκια διασταυρώθηκαν με FVB ποντίκια άγριου τύπου /N. Τα θηλυκά αδερφάκια στους απογόνους, τόσο άγριου τύπου και ετερόζυγο για

PTEN

, μολύνθηκαν με MMTV από Foster νοσηλευτικής σε BALB /c

+ θηλυκά που φιλοξενεί το γάλα που μεταδίδεται MMTV.

Όλα MMTV μολυσμένα ζώα παρακολουθούνται για την ανάπτυξη των μαστικών όγκων που απομονώθηκαν όταν περίπου 1 cm σε διάμετρο. Η μελέτη αυτή πραγματοποιήθηκε σε αυστηρή συμφωνία με τον Κώδικα ολλανδικό Πρακτικής για Έρευνα με Εργαστήριο Ζώων στο Cancer Research. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την τοπική πειραματική Επιτροπή Δεοντολογίας Ζώων (DEC) (Αριθμοί Άδειας: 04065, 08061, 03008) και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία. Όλοι οι ποντικοί θυσιάστηκαν όταν ο όγκος έφθασε 1 cm

3 (τελικό σημείο) με διοξείδιο του άνθρακα. Kaplan-Meier οικόπεδα της διάρκειας ζωής του ποντικιού χαράχθηκαν και δοκιμές log-rank υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το πακέτο επιβίωσης όπως εφαρμόζεται στη στατιστική γλώσσα προγραμματισμού R.

μεσολάβηση Cre διαγραφή των floxed

Trp53

αλληλόμορφα σε όγκους από

K14Cre? Trp53

F /F

ποντικών αξιολογήθηκε με ανάλυση κηλίδας Southern όπως περιγράφηκε προηγουμένως 2001 [24]. Εν συντομία, υψηλού μοριακού βάρους γονιδιωματικό DNA από ΜΜΤν επαγόμενων όγκων υπέστη πέψη με ΒσΙΙΙ. DNA θραύσματα διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα αγαρόζης 0,6% και αποτυπώθηκε σε σε φίλτρα νιτροκυτταρίνης. Ένα PCR επισημασμένο 700 nt XbaI θραύσμα που αντιστοιχεί σε εξώνιο 11 του

Trp53

χρησιμοποιήθηκε ως ανιχνευτής για την ανίχνευση διαγραφεί και μη διαγραμμένα αλληλόμορφα. Cre μεσολάβηση διαγραφή εξόνιο 2-10 του floxed

Trp53

αλληλόμορφο θα μπορούσε να αξιολογηθεί με βάση μια μετατόπιση της κινητικότητας του

Βα θραύσμα DNA

II. Περίπου το 50% των όγκων έδειξε bi-αλληλική απώλεια των floxed εξόνια. αυτοί οι όγκοι χρησιμοποιούνται μόνο για την ανάλυση συνομιλίας.

μέθοδο Shear-Splink για την περιοχή εισαγωγής χαρτογράφηση

Για την ακολουθία των χώρων εισαγωγής σε όγκους που χρησιμοποιείται το πρωτόκολλο Shear-Splink όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Εν συντομία, το DNA διατέμνεται να 100-1000 bp θραύσματα, τα οποία αμβλείας απόληξης και συνδέθηκε προς splinkerette προσαρμογείς. Μια πρωτεύουσα PCR διεξήχθη για να ενισχύουν ειδικά θραύσματα ιικού-προς-ξενιστή διασταύρωση. Μία δεύτερη PCR πραγματοποιήθηκε για την εισαγωγή των αλληλουχιών του γραμμωτού κώδικα και τους προσαρμογείς που απαιτούνται για 454 αλληλούχιση. Αυτά τα προϊόντα PCR συνενώθηκαν και αλληλουχήθηκαν με 454 αλληλούχιση. Τα δεδομένα των πρώτων αλληλουχίας έχει κατατεθεί στο Διαβάστε Αρχείο Ακολουθία με αριθμό πρόσβασης ERP002483.

Η ανάλυση των δεδομένων

μέθοδοι ανάλυσης δεδομένων αναλύονται στα δικαιολογητικά Μεθόδων (Κείμενο S1).

RNA αλληλουχίας

το RNA που εξάγεται από 4 όγκους που μεταφέρουν

HBEGF

παρεμβολές, και 4 περιπτώσεις που μεταφέρουν ένα

Μγβ

εισαγωγής. Έχουμε καθορίζεται FPKMs τόσο για

HBEGF

και

Μγβ

χρησιμοποιώντας Μανικετόκουμπα [25] μετά την ευθυγράμμιση χρησιμοποιώντας BWA [26]

Αποτελέσματα

MMTV παρεμβατικής μεταλλαξογένεσης σε άγρια -τύπος και μεταλλαγμένα ποντίκια Trp53 ή PTEN

για να εκτιμηθεί η ετερογένεια των όγκων και να εντοπίσει τα δίκτυα γονιδίων του καρκίνου σε MMTV που προκαλείται από όγκους μαστού ποντικού, πραγματοποιήσαμε μια υψηλής απόδοσης, μεγάλης κλίμακας μελέτη παρεμβατικής μεταλλαξογένεσης σε συνδυασμό με βαθιά αλληλούχιση σε μια μεγάλη ομάδα ποντικών από 4 διαφορετικά γενετικά υπόβαθρα. Μια σχηματική επισκόπηση της προσέγγισής μας απεικονίζεται στο Σχήμα S1. Αναλύσαμε ομάδες των ποντικών δύο διαφορετικά γενετικά υπόβαθρα: FVB /N (εφεξής FVB) και BALB /c. Για κάθε γενετικό υπόβαθρο αποκτήσαμε όγκων τόσο από το στέλεχος άγριου τύπου καθώς και από ειδικά γενετικά ποντικού (GEM) μοντέλα. Εντός της FVB φόντο, μαστικούς όγκους συλλέχθηκαν από MMTV-μολυσμένα ποντίκια άγριου τύπου και

ΡΤΕΝ

+/-

ετερόζυγων ποντικών νοκ-άουτ. Στο φόντο του BALB /c MMTV επαγόμενη όγκοι ελήφθησαν από ζώα άγριου τύπου και

K14cre? Trp53

F /F

ποντικών με επιθήλιο-ειδική απαλοιφή ρ53. Όπως μπορεί να φανεί στο σχήμα 1α, υπάρχει μια διαφορά διάρκεια ζωής μεταξύ των ελέγχων άγριου τύπου και τις συμφωνημένα πρότυπα GEM, υποδεικνύοντας μία αλληλεπίδραση μεταξύ MMTV προκαλούμενη ογκογένεση και τη γενετική μηχανική μετάλλαξη. Είναι ενδιαφέρον ότι, η μέση καθυστέρηση των MMTV που προκαλείται από την ανάπτυξη των όγκων μειώθηκε στο

PTEN

+/-

ομάδα, αλλά αυξήθηκε στο

K14cre? Trp53

F /F

ομάδα σε σύγκριση με τους ελέγχους άγριου τύπου τους. Η παρατήρηση αυτή μας οδήγησε να υποθέσουμε ότι οι παρεμβολές ΜΜΤν μπορεί να χτυπήσει τα γονίδια που συνεργάζονται με το

PTEN

απλοανεπάρκεια στο

PTEN

+/-

ποντίκια. Σε αντίθεση, η μόλυνση ΜΜΤν θα μπορούσε να επηρεάσει αρνητικά την κακοήθη εξαλλαγή των

Trp53

– /-

επιθηλιακά κύτταρα του μαστού ή το αντίστροφο. Υπάρχει επίσης μια μεγάλη διαφορά στη διάρκεια ζωής μεταξύ MMTV-μολύνθηκαν άγριου τύπου FVB /N και ποντίκια BALB /c (Σχήμα 1β). Αυτό θα μπορούσε να δείξει απλώς ότι ο ιός έχει βραδύτερη αντιγραφή στο FVB στέλεχος σε σύγκριση με το στέλεχος BALB /c, ή θα μπορούσε να υποδεικνύει την παρουσία αλληλόμορφων BALB /c που προωθούν MMTV-προκαλούμενη ογκογένεση. Προς στήριξη του τελευταίου, BALB /c ποντίκια περιέχουν μια υποπλασμένα αλληλόμορφο του

Cdk2na

ογκοκατασταλτικό γονίδιο [27].

Κάθε γράφημα αντιπροσωπεύει μια σύγκριση ανάμεσα σε δύο ομάδες. Μια κατά ζεύγη δοκιμασία log-rank πραγματοποιήθηκε για όλα τα γραφήματα για να διαπιστωθεί αν υπάρχουν σημαντικές διαφορές διάρκεια ζωής μεταξύ των κλάσεων απεικονίζονται σε κάθε γράφημα. Οι Ρ-τιμές που εμφανίζονται στην επάνω δεξιά γωνία. A. Σε κάθε συγκεκριμένο στέλεχος φόντο ποντίκι (FVB ή BALB /c +) συγκρίναμε την MMTV-μολυσμένα άγριου τύπου κλάσης με το μολυσμένο γενετικά γραμμή (είτε

PTEN

ετερόζυγο για το FVB ομάδα ή

Trp53

ανεπαρκή για την /c + ομάδα BALB). B. Η διαφορά στη διάρκεια ζωής μεταξύ των δύο στελεχών άγριου τύπου παρουσιάζεται εδώ.

Η

Για να χαρτογραφήσει τις θέσεις εισαγωγής MMTV χρησιμοποιήσαμε το πρωτόκολλο Shear-Splink μας [18] για να εξάγει και να ενισχύουν το DNA του ιού-ξενιστή θραύσματα διασταύρωση περιέχει το MMTV 5 ‘LTR, καθώς και η γονιδιωματική αλληλουχία παρακείμενη ποντικού. Εμείς γραμμικό κώδικα τα θραύσματα που μας επιτρέπει να συγκεντρώσουν έως και 48 επιμέρους όγκους και την ακολουθία τους στο σύστημα 454 Γονιδιώματος Sequencer FLX. Πρώτες αλληλουχίες έτοιμη τροφή για τη χρήση προσαρμοσμένων Perl scripts. Έχουμε προσδιορίσει την αλληλουχία γονιδιώματος από το διαβάζει και να αντιστοιχίζεται με το γονιδίωμα αναφοράς C57BL /6J (MGSC37). Για κάθε διαβάσει επιβεβαιώσαμε την παρουσία του 5 ‘άκρου του ιικού ακολουθίας καθώς και η παρουσία του γραμμικού κώδικα DNA να de-convolve τις πισίνες σε ατομικά δεδομένα του όγκου. Μία από τις μοναδικές όψεις της προσέγγισής μας είναι ότι είμαστε σε θέση να προσδιορίσει ποσοτικά το κλωνικότητα των ενθέσεων μετρώντας τον αριθμό των μοναδικών θραυσμάτων διασταύρωση DNA όγκο-ξενιστή που χαρακτηρίζεται από μοναδικά σημεία πρόσδεσης (LPS) μεταξύ της γονιδιωματικής αλληλουχίας ποντικού και τον προσαρμογέα splinkerette. Δεδομένου ότι ο αριθμός των μοναδικών LPs αντιστοιχεί στον αριθμό των κυττάρων που φέρουν την αντίστοιχη εισαγωγή MMTV, ο αριθμός LP μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως μέτρο για τη σχετική κλωνικότητα των μεμονωμένων παρεμβολών ΜΜΤν εντός κάθε όγκου [18].

Πολλά επιπρόσθετα στάδια φιλτραρίσματος διεξήχθησαν όπως περιγράφεται στο τμήμα των Μεθόδων και απεικονίζεται στην Εικόνα S1 πριν εισαχθούν στη βάση δεδομένων εισαγωγική μεταλλαξογένεση (IMDb? https://imdb.nki.nl) τα δεδομένα. Μετά το φιλτράρισμα είχαμε μείνει με 30.942 εντάξεις σε 604 όγκους. Οποιεσδήποτε προσθήκες που έχουν

ν

μοναδική LPs είναι εγγυημένο ότι θα ήταν παρούσα σε τουλάχιστον

ν

ανεξάρτητα κύτταρα. Για τον εμπλουτισμό για ενθέσεις που είχαν ενσωματωθεί σε περισσότερες από μία των καρκινικών κυττάρων, μπορούμε αγνοηθεί ενθέσεις με ένα μόνο LP. Χρησιμοποιώντας αυτό το φίλτρο μειώσαμε τα δεδομένα στο 6605 μοναδικές προσθήκες σε 600 όγκους (4 όγκους πραγματοποιείται μόνο προσθήκες με 1 LP). Αυτή είναι μια μείωση του 78% του συνολικού αριθμού των θέσεων εισαγωγής, αλλά αποτελεί μόνο μία μείωση του 21% του συνολικού αριθμού των διαβάζει, γεγονός που υποδηλώνει ότι το φιλτράρισμα κατά ενθέσεις με ενιαία LPs μειώνει αποτελεσματικά τον αριθμό των μεταλλάξεων φόντου σε δεδομένα μας.

ανάλυση της ΚΑΚ θέσεις ενσωμάτωσης MMTV

Εμείς καθορίζεται παγκόσμια CISs για όλους τους όγκους στο σύνολο δεδομένων. Να καθορίσουν σημαντικά CISs χρησιμοποιήσαμε το πλαίσιο Gaussian πυρήνα συνέλιξης [28] εφαρμόζονται στο IMDB. Οι περισσότεροι από τους όγκους από ποντικούς άγριου-τύπου συνεισφέρει τουλάχιστον μία ένθεση σε CIS (Πίνακας 1). Το ποσοστό αυτό είναι χαμηλότερο για τους προδιάθεση υπόβαθρα. Αυτό οφείλεται πιθανότατα στο γεγονός ότι ορισμένα από τα

K14Cre? Trp53

F /F

και

PTEN

+/-

ποντίκια αναπτύσσουν μαστικούς όγκους που δεν οδηγούνται από MMTV εισαγωγική μεταλλαξογένεση. Συνολικά, βρήκαμε 30 σημαντικές CISs, εκ των οποίων 18 ήταν ήδη γνωστά και 12 ήταν νέα (Πίνακας 2). Όλες οι καταχωρήσεις που σχετίζονται με CIS είναι προσβάσιμα μέσω του IMDB. Εμείς το χέρι ανατεθεί πιθανών γονιδίων στόχων σε αυτά CISs. Ως παράδειγμα δείχνουμε Οι δύο πλέον συχνές νέες CISs και την χαρτογράφηση των ενθέσεων ΜΜΤν σε αυτά CISs σε σχέση με το γονίδιο στόχο στο Σχήμα 2. Τόσο

HBEGF

και

Μγβ

είναι πολύ εύλογη γονίδια υποψήφιος στόχος ως ολοκληρώσεις ΜΜΤν είναι πολύ πιθανό να ενισχυθεί η έκφραση (ανάντη και κατάντη εντάξεις) ή σταθεροποιούν το mRNA από πρόωρο τερματισμό της μεταγραφής και την ταυτόχρονη απομάκρυνση του mRNA αποσταθεροποιητικών μοτίβων λόγω εντάξεις στην 3 ‘UTR (στην περίπτωση του

HBEGF

). Επιπλέον, και τα δύο

HBEGF

[29], [30] και

Μγβ

[31] έχουν ήδη εμπλακεί στον καρκίνο. Τέλος, η έκφραση και των δύο HBEGF και Μγβ έχει υψηλή περιεκτικότητα σε δείγματα που φέρουν την ενσωμάτωση, δείχνοντας ότι αυτά τα γονίδια είναι άμεσοι στόχοι της ιικής ενσωμάτωσης (Εικόνα S2).

Η υποθετική στόχος γονίδιο δείχνεται, με το βέλος που υποδεικνύει η μεταγραφική κατεύθυνση. Αιχμές βελών δείχνουν την γονιδιωματική θέση των ιικών ολοκληρώσεις, με την κατεύθυνση του βέλους υποδεικνύει την κατεύθυνση ιική μεταγραφή. Τα χρώματα δείχνουν την ομάδα από την οποία ανακτήθηκαν οι εντάξεις.

Η

Η

Πολλά από Το Σύστημα θα ανακτηθεί είναι κανονική CISs για MMTV εισαγωγική μεταλλαξογένεση. Σε MMTV που προκαλείται από όγκους του μαστού, προϊικό παρεμβολές βρίσκονται συχνά κοντά στο

Wnt

μέλη της οικογένειας γονιδίων (

Wnt1

,

Wnt3

και

Wnt3A

), την ανάπτυξη γονίδια που σχετίζονται παράγοντα (

Fgf

και

FGFR

γονίδια,

PDGFR

γονίδια και

IGF2

), R-spondin μέλη της οικογένειας γονιδίων (

Rspo1

,

Rspo2

και

Rspo3

) και μιτογόνο σηματοδότηση γονίδια οδού (

Εποχές

και

MAP3K8

) [11]. Έχουμε εντοπίσει αρκετές νέες CISs σε αυτές τις οικογένειες που δεν είχαν προηγουμένως εντοπιστεί:

HBEGF

,

Rspo1

και

FGFR3

. Αυτές οι νέες στόχοι μπορούν να ανακτηθούν μόνο σε μια μεγάλη μελέτη, επειδή ανευρίσκονται πολύ λιγότερο συχνά σε σχέση με τα προηγουμένως ταυτοποιημένα μέλη της οικογένειας. Έχουμε ανακτηθεί επίσης πολλά σπάνια CISs που είναι πιθανό να είναι αληθινό MMTV χτυπά επειδή τα γονίδια υποψήφιος στόχος ανήκουν σε οικογένειες γονιδίων τα οποία περιλαμβάνουν επίσης τα μέλη που είναι συχνοί στόχοι MMTV. Το εύρημα αυτό υποστηρίζει την εγκυρότητα των άλλων σπάνια, αλλά σημαντική μυθιστόρημα CISs εντοπίσαμε στην οθόνη μας, όπως

Sfi1

,

Dock5

και

Fezf1

. Πράγματι, το ανθρώπινο ομόλογο του

Fezf1

(γνωστή ως

ZNF312B

) έχει περιγραφεί ως ένα ογκογονίδιο σε γαστρικό καρκίνο [32]. Επιπλέον, αρκετά γονίδια γνωστών και νέων στόχος βρέθηκε να ενισχύεται σε επαναλαμβανόμενη σε ένα πάνελ πάνω από 700 ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές (https://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/genetics/CGP/conan/search.cgi ) ή που αναφέρονται ως μεταλλάξεων στόχους στην κοσμική βάση δεδομένων (https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/). Αυτό δείχνει ότι τα γονίδια που σχετίζονται με CISs σε MMTV που προκαλείται από όγκους του μαστού μπορεί επίσης να είναι χρήσιμες για τον καρκίνο του ανθρώπου.

γονότυπου ειδικών CISs

Εκτός από την εύρεση νέων MMTV CISs ήμασταν ενδιαφέρονται για την εξεύρεση γονότυπο-ειδικό ενθέσεις. MMTV μολυνθεί

PTEN

+/- ποντίκια αναπτύσσουν μαστικούς όγκους ταχύτερα από τους ελέγχους άγριου τύπου τους, γεγονός που υποδηλώνει ότι ΜΜΤν παρεμβολές μπορεί να μεταλλαχθεί καρκίνο σχετικών γονιδίων που συνεργάζονται με PTEN απλοανεπάρκεια στο μαστικό ογκογένεση. Αν αυτή είναι η περίπτωση που θα περιμένατε να βρείτε τον εμπλουτισμό συγκεκριμένων CISs σε MMTV που προκαλείται

PTEN

+/-

όγκων του μαστού, σε σύγκριση με τον έλεγχο των όγκων. Ωστόσο, δεν μπορέσαμε να βρούμε κάποια σημαντική συσχέτιση είτε με υπόβαθρο στη μελέτη μας (Πίνακας 2). Αυτό υποδηλώνει ότι ΜΜΤν εντάξεις συμβαίνουν σε ή κοντά στο ίδιο γονίδια οδηγού του καρκίνου, ανεξάρτητα από το

Trp53

ή

ΡΤΕΝ

κατάστασης. Υπήρξε επίσης μια μεγάλη διαφορά στη διάρκεια ζωής μεταξύ του MMTV-μολυνθεί FVB και BALB /c ποντικούς άγριου τύπου (Σχήμα 1β). Επίσης εδώ, δεν μπορέσαμε να βρούμε κάποια σημαντική συσχέτιση μεταξύ CISs και το φόντο στέλεχος. Αν και παρατηρήσαμε ενθέσεις κοντά

HBEGF

μόνο στο FVB φόντο (Σχήμα 2), η διαφορά αυτή δεν ήταν στατιστικά σημαντική, πιθανώς λόγω της χαμηλής συχνότητας του ενθέσεις κοντά σε αυτό το γονίδιο. Πλην όμως υπαινιγμό προς την πιθανότητα ότι η ενεργοποίηση του

HBEGF

μπορεί να είναι ογκογόνο σε FVB ποντίκια αλλά όχι BALB /c ποντίκια.

Co-εμφάνιση και την αμοιβαία αποκλειστικότητα μεταξύ CISs

Η ανάλυσή μας των κοινών τόπων εισαγωγής απέδωσε αρκετά μυθιστόρημα, αλλά σπάνια ετικέτα τόπους. Αναλύσαμε τα πρότυπα εισαγωγής για όλα τα CISs σε όλους τους όγκους για τη δημιουργία σχέσεων μεταξύ των προτύπων εισαγωγής σε αυτά τα CISs. Παρεμβολές μπορεί να παρουσιάζουν μια αμοιβαία αποκλειστική σχέδιο ολοκλήρωσης, η οποία θα μπορούσε να σημαίνει λειτουργική εφεδρεία μεταξύ των γονιδίων-στόχων, όπως έχει αποδειχθεί για

Myc

και παράλογο του

N-myc

[33]. Αντιστρόφως, συνυπάρχουσες ενθέσεις μπορεί να παρατηρηθεί σε περιπτώσεις όπου η ογκογόνο δράση των δύο ενθέσεις είναι συνεργιστική. Για τον εντοπισμό αυτών των λειτουργικών σχέσεων, προσδιορίσαμε συνύπαρξη και την αμοιβαία αποκλειστικότητα μεταξύ της στατιστικά σημαντική CISs στη μελέτη μας, όπως περιγράφεται στο τμήμα των Μεθόδων (Σχήμα 3).

CISs υποδεικνύονται από το χέρι επιμέλεια του γονιδίου-στόχου τους. Κόκκινες άκρες δείχνουν μια σχέση συνύπαρξη, ενώ το πράσινο άκρες δείχνουν μια αμοιβαία αποκλειστική σχέση. Ο αριθμός στην παρένθεση και το μέγεθος των κόμβων να αναφέρει τον αριθμό των όγκων με μια ιογενή εισαγωγή στις σχετικές ΚΑΚ. Το πάχος των ακμών είναι ένα μέτρο της σημασίας της σχέσης μεταξύ των κόμβων.

Η

Αρκετές παρατηρήσεις μπορούν να γίνουν από αυτή την ανάλυση. Πρώτον, σημαντική συνύπαρξη συμβαίνει κυρίως μεταξύ σπάνιες προσθήκες και της αμοιβαίας αποκλειστικότητας κυρίως μεταξύ πολύ συχνές παρεμβολές. Αυτή η μεροληψία είναι πιθανότατα οφείλεται στον τρόπο της δοκιμής, η οποία είναι μικρής ισχύος για χαμηλές συχνότητες εισαγωγή. Σπάνια, αλληλοαναιρούνται ενθέσεις χρειαστεί ένα μεγαλύτερο μέγεθος δείγματος για να γίνει σημαντική, ενώ σπάνια, συνυπάρχουσες ενθέσεις μπορεί γρήγορα να γίνει σημαντική.

Δεύτερον, ενδιαφέρουσες σχέσεις βρέθηκαν μεταξύ των μελών του

Fgf

οικογένεια συνδετήρα και των υποδοχέων τους, οι

FGFR

γονίδια. Για παράδειγμα, η FGFR συνδετήρες FGF8 και FGF3 φαίνεται να έχουν μια αμοιβαία προτίμηση για τον υποδοχέα FGFR1, δεδομένου ότι

Fgf3

ενθέσεις αλληλοαναιρούνται με

FGFr1

παρεμβολές λαμβάνοντας υπόψη ότι η

FGF8

παρεμβολές σημαντικά συν-συμβαίνουν με το

FGFr1

παρεμβολές. Αυτό μπορεί να σημαίνει προνομιακή δέσμευση εταίρων για τα διάφορα προσδέματα και ένα εκλεκτικό πλεονέκτημα για αυξητική ρύθμιση τόσο του συνδετήρα και συμφωνημένα του υποδοχέα του.

Τέλος, παρατηρήσαμε αμοιβαία αποκλειστικότητα μεταξύ των μελών των μεμονωμένων οικογενειών γονιδίων (π.χ.

Wnt

γονίδια και

FGF-HBEGF

γονίδια). Αποτύπωση των σωρευτικών πρότυπα εισαγωγής για πέντε διακριτές οικογένειες γονιδίων CIS (

Wnt

,

Fgf /EGF

,

FGFR

,

RSPO

και

PDGFR

) αποκάλυψε ένα τυπικό πρότυπο αλληλοαποκλειόμενες ολοκλήρωσης για τα γονίδια μέσα σε κάθε οικογένεια (Σχήμα 4), δείχνοντας ότι ΜΜΤν μολυσμένα κύτταρα να αποκτήσουν λίγο έως καθόλου επιλεκτικό πλεονέκτημα από ΜΜΤν ενθέσεις κοντά πολλαπλά μέλη της ίδιας γονιδιακής οικογένειας. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, αποφασίσαμε να κοιτάξουμε για τις σχέσεις μεταξύ του γονιδίου της ΚΑΚ οικογένειες, αντί μόνο τα γονίδια της ΚΑΚ.

Για καθένα από τα πέντε οικογένειες οι στήλες αναφέρουν ποια όγκους περιείχε μια εισαγωγή για το συγκεκριμένο μέλος μιας οικογένειας. Σειρές υποδεικνύουν συγκεκριμένες όγκους.

Η

Μοντέλο για MMTV την εξέλιξη του όγκου

Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι ΜΜΤν στοχεύει κατά προτίμηση μια μάλλον περιορισμένη ομάδα των γονιδίων και των οικογενειών γονιδίων. Αν περιοριστούμε στα γονίδια της ΚΑΚ και τις οικογένειές ΚΑΚ που επηρεάζονται από ΜΜΤν παρεμβολές σε δέκα ή περισσότερους όγκους, έχουμε μείνει με μόνο 11 ομάδες γονιδίων ΚΑΚ (Πίνακας 2). Μας ενδιαφέρει να δούμε αν θα μπορούσαμε να βρούμε μια διαφορά στην κλωνικότητας μεταξύ αυτών των ομάδων γονιδίων. Κατά τη σύγκριση παρεμβολές κοντά σε δύο μέλη των ομάδων αυτών εντός ενός όγκου, το ένα με περισσότερες κλωνική ενθέσεις θα έχει επίσης μια υψηλότερη βαθμολογία κλωνικότητας με βάση τις μοναδικές μετράει δίσκους. Αυτό θα μπορούσε να δείξει μια προηγούμενη περίπτωση ή /και ένα πιο ισχυρό χτύπημα με αποτέλεσμα την ισχυρότερη θετική επιλογή. Δοκιμάσαμε για όλες τις 11 ομάδες της ΚΑΚ γονιδίων όλα τα ζεύγη των παρεμβολών που σημειώθηκε κατά την ίδια όγκου προκειμένου να ελεγχθεί αν τα μέλη μιας ομάδας έχουν ένα σταθερά υψηλότερες βαθμολογίες κλωνικότητας από τα μέλη της άλλης ομάδας, όταν συν-μεταλλαγμένο με τον ίδιο όγκο (βλέπε μέθοδοι για λεπτομέρειες).

το σχήμα 5α δείχνει ένα θερμικός χάρτης με τα ζεύγη του γονιδίου /οικογένεια της ΚΑΚ που είχε σημαντική σχέση κλωνικότητας σύμφωνα με το διωνυμικό τεστ. Αυτή η ανάλυση αποκαλύπτει σημαντικές σχέσεις μεταξύ του

Wnt /Fgf

γονίδιο οικογένειες (υψηλότερη κλωνικότητας) και

RSPO

,

Sfmbt2

,

ΡϋΘΡΡ

,

FGFR

,

Irs4

,

Εποχές

και

MAP3K8

(κάτω κλωνικότητας). Στο Σχήμα 5β έχουμε ορατά μόνο αυτές τις σημαντικές σχέσεις μαζί με την κατευθυντικότητα τους. Από αυτό το μοντέλο τα δεδομένα με γνώμονα μπορούμε να διατυπώσουμε ένα απλό μοντέλο εξέλιξης για μαστικό ογκογένεση MMTV που προκαλείται από το ποντίκι. Ογκογενή MMTV ολοκληρώσεις είναι πιο πιθανό να συμβεί κοντά σε ένα

Fgf

ή

Wnt

γονίδιο, ενώ παρεμβολές κοντά σε άλλα γονίδια CIS είναι δευτερεύοντα γεγονότα. Για δοκιμαστεί όλες οι άλλες σχέσεις υπάρχει είτε δεν υπάρχει σαφής σχέση κλωνικότητα ή δεν υπάρχουν όγκοι στο οποίο είναι συν-μεταλλαχθεί. Σε όλες τις 47 όγκους που έδειξε συν-μετάλλαξη του

Fgf

και του υποδοχέα της

FGFR

, η

Fgf

εισαγωγής ήταν πιο κλωνική, δείχνοντας ότι ο συνδετήρας FGF είναι πάντα ενεργοποιημένη νωρίτερα από τον υποδοχέα FGF κατά τη διάρκεια της εξέλιξης MMTV όγκου.

Α. Ένας θερμικός χάρτης όλων των συνδυασμών των οικογενειών γονιδίου και μόνο γονίδια δεν αποδίδεται σε μια οικογένεια. Σημαντικές διαφορές σε κλωνικότητα για κάθε οικογένεια υπολογίζονται χρησιμοποιώντας ένα διωνυμικό τεστ για όλα τα δείγματα που συν-εισαχθεί στο εν λόγω ζεύγος συγκεκριμένο γονίδιο (οικογένεια). Μπλε τετράγωνα υποδεικνύουν μια σημαντική κλωνική σχέση από την ομάδα που δεικνύεται επί του Υ-άξονα για την ομάδα που δεικνύεται επί του Χ-άξονα. Κίτρινο τετράγωνα υποδεικνύουν μία σημαντική κλωνική σχέση από τον άξονα Χ στο Υ-άξονα. Μαύρα τετράγωνα δείχνουν καμία σημαντική σχέση. B. Μια άποψη του δικτύου της heatmap στην Α δείχνει μόνο σημαντική (P & lt? 0.05) σχέσεις κλωνικότητας. Μια σημεία άκρη από το πιο κλωνική γονίδιο (οικογένεια) με το μικρότερο κλωνική γονίδιο (οικογένεια). Το πάχος του άκρου είναι ένα μέτρο της σημασίας της σχέσης κλωνικότητας. Για το κλάσμα που εμφανίζεται στις άκρες, ο αριθμητής αντιπροσωπεύει τον αριθμό των φορών που ο γονέας κόμβος είχαν υψηλότερο σκορ κλωνικότητα ενώ ο παρονομαστής αντιπροσωπεύει τον αριθμό των φορών που ο κόμβος παιδί είχε μια υψηλότερη βαθμολογία κλωνικότητα, σε έναν όγκο που περιείχε παρεμβολές στις δύο κόμβους.

η

Συζήτηση

Πρόσφατες μελέτες έχουν εμβαθύνει στην ετερογενή make-up των ανθρώπινων όγκων [2], [3] δείχνει ότι μια σταθερή συσσώρευση μεταλλάξεων στο φόντο καλύπτουν το γεγονός ότι μόνο ένα χούφτα των μεταλλάξεων οδήγηση προκαλεί ογκογόνο διαφοροποίηση. Χρησιμοποιώντας το σύστημα του ποντικιού, ήμασταν σε θέση να προσδιορίσει με σαφήνεια τα γονίδια του οδηγού για MMTV που προκαλείται από όγκους του μαστού και τη σειρά με την οποία παίρνουν απελευθερωθεί.

MMTV παρεμβατικής μεταλλαξογένεσης

Στην παρούσα μελέτη αναλύσαμε ένα μεγάλη ομάδα των ποντικών που ανέπτυξαν όγκους μέσω MMTV εισαγωγική μεταλλαξογένεση. Μέσα σε ένα σύνολο δεδομένων του 6600 μη φόντο MMTV ενθέσεις από 600 όγκους, εντοπίσαμε 30 κοινές θέσεις εισαγωγής περιλαμβάνει 1271 από τα 6600 παρεμβολές (19,3%). Χρησιμοποιήσαμε αυτό το σύνολο δεδομένων για την αντιμετώπιση διάφορα ερωτήματα σχετικά με MMTV που προκαλείται ογκογένεση μαστού ποντικού. Πρώτον, θέλαμε να δούμε αν θα μπορούσαμε να εντοπίσει τα νέα MMTV CISs σε αυτό το μεγάλο σύνολο δεδομένων με τη χρήση υψηλής απόδοσης προσέγγιση Shear-Splink μας. Βρήκαμε ότι το 30 ΜΜΤν CISs στοχεύουν σε ένα περιορισμένο αριθμό σαφώς καθορισμένων οικογένειες γονιδίων και πολύ λίγα άλλα γονίδια. Συνολικά, 53 ΜΜΤν CISs έχουν προηγουμένως ταυτοποιηθεί (Πίνακας S1). Η επικάλυψη μεταξύ αυτού του καταλόγου των γνωστών MMTV CISs και η λίστα μας είναι μόνο 18 CISs. Αυτό σημαίνει ότι το 66% του προηγουμένως βρεθεί CISs δεν μπορούσε να επιβεβαιωθεί σε αυτή τη μελέτη. Αν και είναι πιθανό ότι CISs με πολύ subclonal ενθέσεις δεν ανιχνεύονται από τη μέθοδο μας Shear-Splink, πιστεύουμε ότι η μελέτη μας είναι και λιγότερο προκατειλημμένη (μέσω της χρήσης του DNA διάτμηση αντί διάσπασης ενζύμου περιορισμού) και πιο ισχυρή (αφού μετράμε πολλά διαβάζει την ίδια εισαγωγής) από ό, τι παλαιότερα μελέτες που βασίζονται σε απομόνωση και αλληλούχιση Sanger των επιμέρους θέσεις εισαγωγής MMTV. Επίσης, η χρήση της βαθμολογίας LP για να φιλτράρει ενθέσεις φόντο από τα δεδομένα είναι μια ισχυρή μέθοδος για τον περιορισμό των εσφαλμένων θετικών ευρημάτων. Ενώ είναι δυνατόν ότι η μέθοδος μας παράγει ψευδώς αρνητικά, είναι ίσως πιθανότερο ότι κάποια από τα οποία έχουν αναγνωρισθεί προηγουμένως CISs είναι επιβάτες ή θέσεις τυχαίας ενσωμάτωσης. Τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι ΜΜΤν προκαλούμενη ογκογένεση μαστικού είναι μια πολύ συγκεκριμένη ασθένεια που περιλαμβάνει έναν περιορισμένο αριθμό κυτταρικών γονιδίων στόχων που μπορεί να προάγουν τον πολλαπλασιασμό, την επιβίωση και /ή αυτο-ανανέωση του MMTV μολυσμένα μαστικά επιθηλιακά κύτταρα. Ως τέτοια, ΜΜΤν δεν είναι ένα πολύ ευέλικτο σύστημα παρεμβολής μεταλλαξογένεσης και επομένως πιθανώς δεν είναι η καλύτερη προσέγγιση για τον εντοπισμό νέων γονιδίων του καρκίνου του μαστού υποψήφιος σε ποντίκια άγριου τύπου ή μοντέλα GEM όγκο προδιάθεση. Αυτή η έννοια ενισχύεται από το γεγονός ότι δεν μπορούμε να βρούμε συγκεκριμένες ενθέσεις ΜΜΤν σε μαστικούς όγκους ποντίκια επιρρεπή με ετερόζυγη

ΡΤΕΝ

διαγραφή ή ιστο-ειδική απώλεια του

Trp53

, παρόλο MMTV-μολυνθεί

ΡΤΕΝ

ετερόζυγα ποντίκια ανέπτυξαν όγκους μαστού ταχύτερα από ομολόγους άγριου τύπου τους. MMTV πρόκλησης ογκογένεσης κέρδη προφανώς από απλοανεπάρκεια για

PTEN

αλλά μετάλλαξη των ειδικών συνεργατών δεν απαιτείται για αυτόν τον όρο. Τα αποτελέσματά μας δεν αποκλείουν ότι ΜΜΤν θα μπορούσε να δείξει ένα διαφορετικό μοντέλο εισαγωγής σε ποντίκια με μαστικού αδένα-ειδικά υπερ-έκφραση μιας ισχυρής ογκογονιδίου.

Παρά την ισχυρή προκατάληψη των MMTV προς την ενεργοποίηση των μελών της οικογένειας Wnt /FGF, θα μπορούσαμε ακόμη εντοπίσει αρκετά νέα CISs για MMTV, λόγω του μεγάλου αριθμού των δειγμάτων που περιλαμβάνονται στην ανάλυση μας. Μερικά από τα νέα CISs εμπίπτουν εντός των καθορισμένων οικογένειες γονιδίων-στόχων, που δείχνει ότι η μέθοδος μας είναι σε θέση να προσδιορίσει αληθώς θετικά ακόμη και αν συμβαίνουν μόνο σε & lt? 1% των δειγμάτων, όπως είναι η περίπτωση με το

FGFR3

.