Αφηρημένο

Ιστορικό

Ο καρκίνος του προστάτη εξαρτάται αρχικά σε ανδρογόνα για την επιβίωση και την ανάπτυξη, καθιστώντας ορμονοθεραπεία ο ακρογωνιαίος λίθος της θεραπείας για τους όγκους προχωρημένου σταδίου. Ωστόσο, παρά την αρχική ύφεση, ο καρκίνος αναπόφευκτα θα επαναληφθεί. Η παρούσα μελέτη σχεδιάστηκε για να διερευνήσει τον τρόπο τελικά εξαρτώμενων από ανδρογόνα καρκίνου του προστάτη κύτταρα επιβιώνουν και να επαναλάβουν την ανάπτυξη υπό ανδρογόνου στερούνται και αντιανδρογόνο συμπληρωμένο συνθήκες. Ως πρότυπο σύστημα, που χρησιμοποιείται για την PC346C κυτταρική σειρά ανδρογόνο-απόκρισης και η θεραπεία-ανθεκτική sublines του:. PC346DCC, PC346Flu1 και PC346Flu2

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

τεχνολογία μικροσυστοιχιών χρησιμοποιήθηκε για να αναλύσει τις διαφορές στην γονιδιακή έκφραση μεταξύ των PC346 κυτταρικών σειρών που αποκρίνονται στο ανδρογόνο και θεραπεία ανθεκτικών. ανάλυση μικροσυστοιχιών αποκάλυψε 487 μεταγραφές διαφορικά εκφρασμένο μεταξύ των ανδρογόνων-απόκρισης και η θεραπεία-ανθεκτική κυτταρικές σειρές. Τα περισσότερα από αυτά τα γονίδια ήταν κοινή σε όλες τις τρεις sublines θεραπεία-ανθεκτική και μόνο μια μειοψηφία (~ 5%) ήταν ανδρογόνων-ρυθμίζεται. ανάλυση Pathway αποκάλυψε εμπλουτισμό σε λειτουργίες που αφορούν την κυτταρική κίνηση, την ανάπτυξη των κυττάρων και θάνατο των κυττάρων, καθώς και συσχέτιση με τον καρκίνο και τη νόσο του αναπαραγωγικού συστήματος. PC346DCC εξέφρασαν επίπεδα εναπομείναντος του υποδοχέα ανδρογόνων (AR) και έδειξαν σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω των γονιδίων ανδρογόνο ρυθμιζόμενη (p-value = 10

-7). Παρατηρήθηκε up-ρύθμιση του VAV3 και TWIST1 ογκογονίδια και την καταστολή της DKK3 ογκο-κατασταλτικά στην PC346DCC, γεγονός που υποδηλώνει μια πιθανή μηχανισμό AR παράκαμψης. Μεταγενέστερες επικύρωση αυτών των τριών γονιδίων σε δείγματα ασθενών επιβεβαίωσε ότι η έκφραση απελευθερωθεί κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη.

Συμπεράσματα /Σημασία

Η θεραπεία-ανθεκτική ανάπτυξη μπορεί να προκύψει από προσαρμογές στην οδό AR, αλλά ανδρογόνα ανεξαρτησία μπορεί επίσης να επιτευχθεί με εναλλακτικούς μηχανισμούς επιβίωσης. Εδώ εντοπίσαμε TWIST1, VAV3 και DKK3 ως πιθανούς παίκτες στην παράκαμψη της οδού AR, καθιστώντας τους καλούς υποψηφίους ως βιοδείκτες και τα νέα θεραπευτικά στόχους

Παράθεση:. Marques RB, Dits NF, Erkens-Schulze S, van Weerden WM, Jenster G (2010) παράκαμψη Μηχανισμοί υποδοχέα ανδρογόνων Pathway σε θεραπεία-ανθεκτική Καρκίνος του προστάτη Μοντέλα Cell. PLoS ONE 5 (10): e13500. doi: 10.1371 /journal.pone.0013500

Συντάκτης: Τσαντ Creighton, Baylor College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 1 Ιουλίου 2010? Αποδεκτές: 29 Σεπτέμβρη 2010? Δημοσιεύθηκε: 19 του Οκτώβρη 2010

Copyright: © 2010 Marques et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο που παρουσιάζονται σε αυτό το χειρόγραφο υποστηρίζεται οικονομικά από την ολλανδική Οργάνωση Επιστημονικής Έρευνας (NWO), μέσω ZonMW επιχορήγηση 903-46-187, και από την ολλανδική Εταιρεία Καρκίνου (KWF), μέσω επιχορηγήσεων NKB97-1479 και DDHK 2001-2455. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η δεύτερη κύρια αιτία της ανδρικής θανάτων από καρκίνο στις δυτικές χώρες και ένα αυξανόμενο πρόβλημα σε αυτούς υιοθέτηση δυτικό τρόπο ζωής και τη διατροφή. Οι πρόοδοι στην διαλογή και τη διάγνωση επέτρεψαν την ανίχνευση όγκων σε προηγούμενα στάδια, όταν θεραπευτική αγωγή εξακολουθεί να είναι εφικτή. Για προχωρημένο στάδιο Διάχυτη όμως, οι τρέχουσες θεραπείες είναι απλώς καταπραϋντική και δεν υπάρχει θεραπευτική αγωγή. Δεδομένου ότι η ανάπτυξη των όγκων του προστάτη αρχικά ανδρογόνο-εξαρτώμενοι, μεταστατικούς καρκίνους γενικά αντιμετωπίζονται με θεραπεία απόσπασης ανδρογόνων, με ή χωρίς συμπλήρωση αντιανδρογόνο [1], [2]. Η συντριπτική πλειονότητα αυτών των ασθενών εμφανίζουν σημαντική κλινική παλινδρόμησης, αλλά ο καρκίνος τελικά επανέρχεται εντός 12-18 μηνών. Αυτές οι επαναλαμβανόμενες όγκοι έχουν διαφύγει ανδρογόνων καταστολή και έγινε ανθεκτικά σε ορμονική θεραπεία, αναφέρεται ως ορμόνη-ανθεκτική ή ευνουχισμός ανθεκτικά ΣΕΣΣ. Για να επιβιώσουν και να συνεχίσετε την ανάπτυξη σε μια ανδρογόνο στερηθεί περιβάλλον κύτταρα του προστάτη πρέπει είτε να προσαρμόσει την πορεία του υποδοχέα ανδρογόνων (AR), με τους όρους των ανδρογόνων-εξαντλημένο ή να επικαλεσθεί εναλλακτικές οδούς επιβίωση και ανάπτυξη [3]. υπάρχει πολύ πειραματικές αποδείξεις για να υποστηρίξει και τις δύο μηχανισμούς, που δεν είναι απαραίτητα αλληλοαποκλειόμενες. έκφραση AR δείχθηκε να διατηρηθεί στην πλειοψηφία των ασθενών που υποβλήθηκαν σε ορμονική θεραπεία και έδειξε υποτροπή της νόσου, γεγονός που υποδηλώνει ένα ρόλο του AR επίσης στη νόσο όψιμου σταδίου [4], [5]. Επιπλέον, το γονίδιο AR ενισχύεται και /ή υπερεκφράζεται σε περίπου 30% των πυρίμαχων όγκων ορμόνη-θεραπεία, και έχει προταθεί αυτό θα μπορούσε να ευαισθητοποιήσει τον υποδοχέα για τις υπολειμματικές συγκεντρώσεις ανδρογόνων και αντι-ανδρογόνα παρόν υπό ορμονικές θεραπείες [6], [7 ], [8]. Επιπλέον, αρκετοί AR μεταλλάξεις, με αποτέλεσμα αυξημένη δραστικότητα ή να διευρυνθεί συνδετήρα-εξειδίκευση σε εναλλακτικές στεροειδή και αντιανδρογόνα, έχουν συσχετιστεί με την εξέλιξη της νόσου [9], [10]. Άλλες τροποποιήσεις του μονοπατιού AR που μπορεί να προκαλέσει ορμονοάντοχου ανάπτυξης περιλαμβάνουν ενδοογκική στεροειδογένεση, ενεργοποίηση ανεξάρτητη συνδεσμικού με cross-talk με άλλες οδούς σηματοδότησης, οι μεταβολές στην ισορροπία του AR συν-ρυθμιστές ή έκφραση μόνιμα ενεργών κόλουρου AR ισομορφών [3] , [11], [12]. Είναι ενδιαφέρον ότι, πρόσφατες εργασίες από τους άλλους και μας αποκάλυψε ότι η οδός AR μπορεί να εξασθενεί επιλεκτικά σε προχωρημένο /μεταστατική νόσο [13], [14], [15]. Δεδομένου ότι η οδός AR συμμετέχει επίσης σε διαδικασίες κυτταρικής διαφοροποίησης και ωρίμανσης του προστάτη, είναι δελεαστικό να δείχνουν ότι τα κύτταρα του προστάτη μπορεί τελικά να αποκτήσουν πλεονέκτημα ανάπτυξης μέσω της αναστολής της AR που επάγεται διαφοροποίηση. Παρακινούμενος από αυτά τα αποτελέσματα, εστιάσαμε την παρούσα μελέτη για τις εναλλακτικές οδούς επιβίωση και την ανάπτυξη, η οποία είναι ανεξάρτητη από την ενεργοποίηση AR. Να παρακάμψει ουσιαστικά το μονοπάτι AR, καρκίνο επιθηλιακών κυττάρων πρέπει να είναι σε θέση να επιβιώσουν τα αποπτωτικά σήματα που προκαλούνται από ορμονικές θεραπείες και επικαλούνται εναλλακτικές οδούς ανάπτυξης. Αυτοκρινές παραγωγή των αυξητικών παραγόντων ή των υποδοχέων του, η ενεργοποίηση των ογκογονιδίων και αναστολή των γονιδίων καταστολής όγκων είναι όλοι οι πιθανοί μηχανισμοί για την παράκαμψη της οδού AR. Συνεπής με αυτή την υπόθεση, παρακρινείς αυξητικοί παράγοντες που κανονικά εκκρίνονται από κύτταρα στρώματος του προστάτη, όπως του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF), ινσουλινοειδής αυξητικός παράγοντας 1 (IGF1), αυξητικός παράγοντας ηπατοκυττάρων (HGF), αυξητικός παράγοντας κερατινοκυττάρων (KGF) ή ιντερλευκίνη 6 (IL-6), έχουν βρεθεί να είναι υπερέκφραση σε ορμονοάντοχου καρκίνο σε συνδυασμό με έναν διακόπτη για να αυτοκρινή παραγωγή από τα επιθηλιακά κύτταρα του καρκίνου [16]. Εκτός του ότι είναι εν δυνάμει μιτογόνα τοποθέτησης στοιχεία δείχνουν ότι αυτές οι ορμόνες ανάπτυξης είναι επίσης σε θέση να cross-talk με το σηματοδοτικό μονοπάτι AR, οδηγώντας σε έκφραση γονιδίων στόχων AR απουσία ανδρογόνων [17]. Ως εκ τούτου, εξακολουθεί να πρέπει να καθοριστεί αν η αυτοκρινή παραγωγή αυτών των αυξητικών παραγόντων αντιπροσωπεύει μια προσαρμογή ή μια πραγματική παράκαμψη του μονοπατιού σηματοδότησης AR. Μεταβολές στην αντι-αποπτωτική

BCL2

ογκογονίδιο και στην προ-αποπτωτική

Ρ53

και

ΡΤΕΝ

ογκοκατασταλτικών γονιδίων έχουν βρεθεί επίσης σε καρκίνο προστάτη [18], [19]. Ωστόσο, αυτά τα γεγονότα συμβαίνουν κυρίως πριν από την εξέλιξη προχωρημένο στάδιο, που τους καθιστά λιγότερο πιθανό υποψήφιοι για το διακόπτη για να ορμονοάντοχου ανάπτυξης στη νόσο προχωρημένο στάδιο. Παρ ‘όλα αυτά, αναστέλλοντας τον θάνατο των κυττάρων του προστάτη και η μετατόπιση της ισορροπίας προς τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, γονίδια που εμπλέκονται στη ρύθμιση της απόπτωσης μπορεί επίσης να παίζουν ρόλο στην ορμονοάντοχου ανάπτυξης.

Για να διερευνήσουν τον μηχανισμό (ες) με την οποία ανδρογόνα εξαρτάται από τα κύτταρα του προστάτη γίνει ανθεκτικά σε ορμονική θεραπεία, θα χρησιμοποιηθεί η τεχνολογία των μικροσυστοιχιών για να ανακρίνουν τις διαφορές στη γονιδιακή έκφραση μεταξύ ανδρογόνων-απόκρισης και η θεραπεία-ανθεκτική κυτταρικές σειρές. Ως σύστημα μοντέλο που χρησιμοποιείται για την PC346C κυτταρική σειρά ανδρογόνο-απόκρισης και η θεραπεία-ανθεκτική υποσειρές της PC346DCC, PC346Flu1 και PC346Flu2. Αυτά sublines προήλθαν από τη γονική PC346C από μακροχρόνια αφαίρεσης ανδρογόνων (PC346DCC), όπως συμπληρώθηκε με το υδροξυφλουταμίδιο αντιανδρογόνο (PC346Flu1 και PC346Flu2) [20], [21]. Προηγούμενες μελέτες αποκάλυψαν διακριτές τροποποιήσεις AR σε όλες τις τρεις sublines θεραπεία-ανθεκτική, τα οποία αντιστοιχούσαν σε διαφορετικές μηχανισμό ορμονικά ανθεκτικών ανάπτυξης. Εκτιμώντας PC346DCC, εκφράζοντας την πολύ χαμηλά επίπεδα AR και PSA, παρουσίασαν στοιχεία της παράκαμψη της οδού AR, PC346Flu1 εκτίθενται 4 φορές AR up-ρύθμιση και PC346Flu2 φάνηκε να φέρουν τη μετάλλαξη T877A AR. Και οι δύο PC346Flu1 και PC346Flu2 sublines αναπαράγουν την εξέλιξη σε ορμόνες θεραπεία ανθεκτική νόσο μέσω της προσαρμογής της οδού AR. Ως εκ τούτου, εστιάσαμε στην υπογραμμή PC346DCC να επιλέξετε για τα γονίδια που εμπλέκονται ιδιαίτερα στην παράκαμψη της οδού AR. Εκτός από την παροχή νέων γνώσεις για τους μηχανισμούς της εξέλιξης προστάτη, τα γονίδια που ταυτοποιούνται εδώ μπορούν να αποδειχθούν χρήσιμοι ως προγνωστικοί δείκτες και πιθανοί στόχοι για νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις.

Μέθοδοι

Αντιδραστήρια και κυτταρικές σειρές

Ο PC346C κυτταρική γραμμή προήλθε από τον όγκο του προστάτη ενός ασθενούς με αδενοκαρκίνωμα μη προοδευτική προστάτη (T4N0M0) [20], [21]. Η PC346DCC, PC346Flu1 και PC346Flu2 sublines προήλθαν από PC346C κατόπιν μακροχρόνια καλλιέργεια σε ξυλάνθρακα-απογυμνωμένο μέσο, ​​χωρίς ή με συμπλήρωση αντιανδρογόνο υδροξυφλουταμιδίου, αντιστοίχως. Η ανάπτυξη και ο χαρακτηρισμός αυτών των κυτταρικών σειρών έχει δημοσιευτεί προηγουμένως [20], [21]. Το βασικό μέσο καλλιέργειας που χρησιμοποιείται για τη διατήρηση των κυτταρικών σειρών PC346 αποτελείτο από μέσο DMEM-F12 (Cambrex BioWhitaker, Belgium) συμπληρωμένο με 2% ορό εμβρύου μόσχου (FCS? PAN Biotech GmbH, Aidenbach, Γερμανία), 1% ινσουλίνη-τρανσφερίνης-σελήνιο (Gibco BRL), 0,01% λευκωματίνη βόειου ορού (Boehringer Mannheim, Γερμανία), 10 ng /ml επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (Sigma-Aldrich), πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη αντιβιοτικά (100 U /ml πενικιλλίνη, 100 mg /ml στρεπτομυκίνη? BioWhitaker, Βέλγιο )? συν τις ακόλουθες προσθήκες: 100 ng /ml ινονεκτίνης (Harbor Bio-Products, Tebu-bio, Ολλανδία), 20 mg /ml fetuine (ICN Biomedicals, Ολλανδία), 50 ng /ml τοξίνης χολέρας, 0,1 mM φωσφοαιθανολαμίνη, 0,6 ng /ml τριιωδοθυρονίνη και 500 ng /ml δεξαμετασόνη (όλα από την Sigma). κύτταρα PC346C διατηρήθηκαν σε καλλιέργεια σε πλήρες μέσο που περιγράφηκε παραπάνω, συμπληρωμένο με 0,1 ηΜ 17-μεθυλοτριενολόνη (R1881? ΝΕΝ, Boston ΜΑ, USA). PC346DCC μέσο επιλογής συμπληρώθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω, αλλά εξαντλημένο από ανδρογόνα χρησιμοποιώντας ξυλάνθρακα επικαλυμμένο με δεξτράνη (DCC) κατεργάζεται FCS. PC346Flu1 και μεσαίου PC346Flu2 καλλιέργειας επίσης ανδρογόνων εξαντλημένο χρησιμοποιώντας 2% DCC-FCS, και συμπληρωμένο με 1 μΜ υδροξυφλουταμιδίου (ΟΗ-φλουταμίδιο, Schering-Plough Research Institute, New Jersey, USA).

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε φιάλες καλλιέργειας ιστών Τ25 Primaria ™ (BD Biosciences Benelux NV, Ολλανδία) στους 37 ° C υπό 5% CO

2 υγρή ατμόσφαιρα.

Έκφραση μικροσυστοιχιών ανάλυση

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε αντίστοιχους μέσο επιλογής τους να φθάσει -50% συρροή και αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 2 ημέρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα ξεπλύθηκαν δύο φορές με PBS και αποθηκεύτηκαν στους -20 ° C μέχρι την απομόνωση του RNA. Ολικό RNA απομονώθηκε με το αντιδραστήριο ΚΝΑζοΙ Β (Campro Scientific, Veenendaal, Ολλανδία) και καθαρίστηκε περαιτέρω μέσω στηλών RNeasy (Qiagen) με on-στήλη πέψη DNA, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. ποιότητα του RNA ελέγχθηκε σε πήκτωμα 1% αγαρόζης.

Cy3- ή Cy5-σημασμένους ανιχνευτές RNA παρήχθησαν με την ενσωμάτωση αμινο-αλλυλ UTP κατά την διάρκεια ενίσχυσης RNA, που ακολουθείται από σύζευξη προς Ν-υδροξυηλεκτριμίδιο τροποποιημένη χρωστική. Εν συντομία, 3 μα RNA χρησιμοποιήθηκε για ένα πρωτόκολλο γραμμικής ενίσχυσης mRNA Τ7-based, που περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Αμινο-αλλυλο UTP, συν ίση ποσότητα μη τροποποιημένου rUTP, ενσωματώθηκε στο aRNA με Τ7 MEGAscript Kit (όλα από Ambion), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα ενισχυμένα RNA καθαρίστηκε και συμπυκνώθηκε με χρήση Microcon-ΥΜ 30 στήλες (Amicon®) για την έκπλυση τρεις φορές με 300 μΙ RNAse χωρίς νερό. Τέλος, 2 μg αμινοαλλυλ-τροποποιημένο RNA, σε ένα μέγιστο 3,33 μΙ RNAse ελεύθερο νερό, επωάζεται με 1.66 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος διττανθρακικού νατρίου (0,3 Μ, ρΗ 9) και 5 μΐ Cy3- ή Cy5- χρωστική (CyScribe Μετα-Labeling Kit, Amersham, NJ, USA), για 1 ώρα στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου. Η αντίδραση σταμάτησε με 5 μΐ 4 Μ υδροξυλαμίνη HCl (Sigma), αντενδείξεις ιχνηθετημένων ανιχνευτών ενώθηκαν και καθαρίστηκαν /συμπυκνώθηκαν χρησιμοποιώντας Microcon-ΥΜ 30. Probe συλλέχθηκε σε 5-15 μΙ τελικό όγκο και επαναιωρήθηκε σε 80 μΙ αριθμός Ambion ρυθμιστικού διαλύματος υβριδισμού 1 .

για την μικροσυστοιχιών χρησιμοποιήσαμε oligoarrays διπλό βαφής που εκπροσωπούν περίπου 15.000 ανθρώπινα γονίδια, στην οποία επισημαίνονται RNA από το κάθε θεραπεία-ανθεκτική υπογραμμή ήταν cohybridized με contra-επισημασμένο PC346C. Τέσσερις μικροσυστοιχίες πραγματοποιήθηκαν ανά συνθήκη, χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικές διόδους κυττάρων σε dye-swap. Αυτό έγινε για να εξηγήσει την βιολογική μεταβλητότητα και να αποκλείσει με βαφή κατά προτίμηση σύνδεση με ολιγονουκλεοτίδια στη μικροσυστοιχία. Οι oligoarrays χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη παρήχθησαν στο Κέντρο Erasmus για Biomics. Εν συντομία, ένα ανθρώπινο 18.584 ολιγονουκλεοτίδια βιβλιοθήκης (Compugen, Sigma-Genosys) εθεάθη σε αμινοσιλανίου διαφάνειες χρησιμοποιώντας ένα Virtek Chipwriter Professional arrayer (Virtek Vision International, Waterloo, Καναδάς). σημεία ελέγχου που περιλαμβάνονται ορόσημα, ρυθμιστικό κηλίδες αίματος, αλλοδαπός ολιγονουκλεοτίδια (SpotReport Alien Oligo Array, La Jolla, Stratagene), πολυ d [Α] 40-60, DNA σπέρματος σολομού, και την ανθρώπινη COT-1 DNA. Πριν από την υβριδοποίηση, τα πλακίδια μικροσυστοιχιών προϋβριδοποιήθηκαν σε 5 χ SSC, 0,05% SDS, 4% διάλυμα BSA για 30 λεπτά στους 45 ° C, πλύθηκαν δύο φορές με RNAse χωρίς νερό για 2 λεπτά, ξεπλύθηκε με ισοπροπανόλη και spin-ξηραίνεται επί 3 λεπτά σε 1500 g. υβριδοποιήσεις μικροσυστοιχιών διεξήχθησαν όλη τη νύχτα στους 45 ° C, με συνεχή ανάδευση, σε ένα σταθμό HS4800 Hybridization (Tecan Benelux BV). Τέλος, οι συστοιχίες εκπλύθηκαν αυτόματα στο Σταθμό υβριδοποίηση με τη χρήση:. 2χ SSC /0.05% SDS (στους 45 ° C), 1 χ SSC και 0.2 Χ SSC (σε θερμοκρασία δωματίου), και ξηραίνεται υπό ρεύμα Ν2, πριν από τη σάρωση

εξόρυξη δεδομένων και η ανάλυση

Πίνακες σαρώθηκαν σε ένα ΗΤ σαρωτή ScanArray Express (Perkin Elmer, Nederland BV) και σημείο εντάσεις ποσοτικά με τη χρήση του λογισμικού ImaGene (Bio Discovery Inc, El Sequndo, CA, USA ). Για την εξισορρόπηση Cy3 και Cy5 σημείο εντάσεις, Loewess ομαλοποίηση ανά υπο-συστοιχίας πραγματοποιήθηκε με τη χρήση limma-πακέτο (https://bioinf.wehi.edu.au/limma/) από Bioconductor (https://www.bioconductor.org) [23] , [24]. Σε κλίμακα μεταξύ συστοιχιών, η παγκόσμια μέση ένταση ανά συστοιχία ορίστηκε στο 1000. εντάσεις χρωστικής κάτω από 200 στη συνέχεια κατώφλι στα 200, για την ελαχιστοποίηση του θορύβου και να κάνετε πολλαπλή μεταβολή στο φάσμα χαμηλής έντασης πιο ισχυρή από ακραίες τιμές. Κηλίδες με εντάσεις κάτω από το όριο (200) και για τα δύο κανάλια Cy3 και Cy5 σε περισσότερες από 2 από τις 4 συστοιχίες που εκτελούνται ανά υπογραμμή εξαιρέθηκαν από την ανάλυση. Δείγμα με αναλογίες αναφοράς υπολογίζεται στη συνέχεια και 2log μεταμορφωθεί. Σημεία που έδειξαν αντίθετα αποτελέσματα για την βαφή-ανταλλαγής /βιολογική αντίγραφα αποκλείστηκαν από την περαιτέρω ανάλυση? επιδράσεις που ονομάζεται αντίθετο, αν η μέση αναλογία 2log για την ανά δευτερεύουσα γρα ήταν ≥0.5 για μία χρωστική και κάτω ≤-0,5 για τη βαφή-swap. Μετά την κανονικοποίηση και όλες τις προαναφερθείσες ποιοτικούς ελέγχους, οι 2log αναλογίες ένταση ελήφθη ο μέσος όρος για τις επαναλήψεις της κάθε υποσειρά. Τα στοιχεία αυτά αποθηκεύονται σε SRS7 (έκδοση Ακολουθία Σύστημα Ανάκτησης 7, Lion Bioscience AG, Heidenberg, Γερμανία), η οποία χρησιμοποιείται επίσης για τις συγκρίσεις με άλλα προηγουμένως δημοσιευθεί /δημοσίως διαθέσιμες βάσεις δεδομένων [25]. Τα δεδομένα μικροσυστοιχιών κατατέθηκε στην έκφραση του γονιδίου Omnibus αποθετήριο (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/υπό τον αριθμό GEO GSE21596). Ιεραρχική ομαδοποίηση και οπτικοποίηση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση προγραμμάτων Cluster και TreeView (Eisen Labs: https://rama.lbl.gov). Σημασία Ανάλυση των μικροσυστοιχιών (SAM? https://www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM) χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί ποια γονίδια ήταν στατιστικά διαφορετικές μεταξύ διεγερμένα δείγματα και μη διεγερμένα αναφορές. Γονιδιακή οντολογία ομαδοποίηση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση βάσεων δεδομένων για το σχολιασμό, την απεικόνιση και την Ολοκληρωμένη Discovery (DAVID: https://david.abcc.ncifcrf.gov) [26], [27]. Το μονοπάτι και λειτουργικές αναλύσεις που δημιουργούνται μέσω της χρήσης των Ingenuity Pathways Ανάλυση (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com).

σύνθεση του cDNA και ανάλυση RT- PCR

Κανονική και όγκου δείγματα από ασθενείς που χρησιμοποιείται για την ποσοτική σε πραγματικό χρόνο ανάλυση RT-PCR ελήφθησαν από την παγωμένη τράπεζα ιστών του Ιατρικού Κέντρου Erasmus (Rotterdam, Κάτω Χώρες). Τα δείγματα συλλέχθηκαν μεταξύ 1984 και 2001. Τα πειραματικά πρωτόκολλα εγκρίθηκαν από την ιατρική επιτροπή Δεοντολογίας Erasmus MC, σύμφωνα με την ιατρική έρευνα σε ανθρώπους νόμου. Πρόσθετες πληροφορίες σχετικά με αυτά τα δείγματα παρασχέθηκαν προηγουμένως. [28] Το συνολικό RNA απομονώθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω και cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας MMLV-ανάστροφης μεταγραφάσης kit και ολίγο (dT)

12-18 εκκινητή (Invitrogen), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Δείγματα cDNA φυλάχθηκαν στους -20 ° C. TaqMan πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση διεξήχθη σε ΑΒΙ Prism 7700 Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας (Applied Biosystems, Foster City, CA), χρησιμοποιώντας AmpliTaq Gold ϋΝΑ πολυμεράση (Applied Biosystems), σύμφωνα με τις προδιαγραφές του κατασκευαστή. Επικυρωμένες εκκινητές και ανιχνευτές από TaqMan Gene Expression δοκιμασίες (Applied Biosystems) χρησιμοποιήθηκαν για την ποσοτικοποίηση του VAV3 (Hs00916821_m1), TWIST1 (Hs00361186_m1), DKK3 (Hs00951307_m1) και GAPDH (Hs99999905_m1), σύμφωνα με τις ρυθμίσεις της PCR που παρέχονται από την Applied Biosystems. PBGD ήταν ποσοτικά με τη χρήση 0,33 μΜ εκκινητών προς τα εμπρός: CATGTCTGGTAACGGCAATG και να αντιστραφεί: εκκινητών GTACGAGGCTTTCAATGTTG, στην εξουσία SybrGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems), σύμφωνα με το πρωτόκολλο θερμικού κύκλου συνιστάται από τον κατασκευαστή. ποσότητες μεταγραφής για κάθε δείγμα κανονικοποιήθηκαν έναντι του μέσου όρου των δύο ενδογενών παραπομπές και σε σχέση με ένα βαθμονομητή. Τα δύο γονίδια καθαριότητας χρησιμοποιηθεί ως ενδογενής αναφορές ήταν

PBGD

και

GAPDH

? ένα μείγμα των cDNAs από ξενομοσχεύματα καρκίνου του προστάτη χρησιμοποιήθηκε σαν τον βαθμονομητή. Γραφήματα και στατιστικά στοιχεία έγιναν με GraphPad Prism (έκδοση 3.0). P-τιμές & lt? 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές

Αποτελέσματα

προφίλ διαφορική γονιδιακή έκφραση μεταξύ των ανδρογόνων-απόκρισης PC346C και η θεραπεία-ανθεκτική sublines της

ανάλυση της σειράς έκφρασης εκτελέστηκε. να διερευνήσει κατά πόσον η οδός AR είναι ακόμα ενεργή στα πυρίμαχα κύτταρα ορμόνες θεραπεία υπό συνθήκες ανδρογόνων-στέρησε και τον εντοπισμό υποθετικών εναλλακτικών δρόμων ανάπτυξης /επιβίωσης. Κάθε μία από τις θεραπεία ανθεκτικών sublines καλλιεργήθηκαν σε αντίστοιχες μέσο επιλογής τους (στεροειδές απογυμνωμένο μέσο για PC346DCC, συμπληρωμένο με 1 μΜ ΟΗ-φλουταμίδιο για PC346Flu1 και Flu2) και υβριδοποιήθηκαν επί των μικροσυστοιχιών, μαζί με τον γονικό αποκρίνονται στο ανδρογόνο PC346C (καλλιεργημένα σε πλήρες μέσο συμπληρωμένο με 0,1 ηΜ R1881). Για να ληφθεί υπόψη για τη βιολογική ποικιλότητα και βαφής προτιμησιακή δέσμευση με ολιγονουκλεοτίδια στη μικροσυστοιχία, τέσσερις συστοιχίες πραγματοποιήθηκαν ανά συνθήκη, με τη χρήση δύο ανεξάρτητων περάσματα των κυττάρων σε dye-swap. Διακύμανση σε πρότυπο έκφρασης αναλύθηκε ανά θεραπεία ανθεκτική υπογραμμή, και κηλίδες θεωρήθηκαν να εκφράζονται διαφορικά εάν η απόλυτη αναλογία 2log ≥ 0,5 (αναλογία ≥ 1.42 ή ≤0.71) για τουλάχιστον τρεις από τις 4 συστοιχίες και για το μέσο του συνόλου 4 συστοιχίες. Σύμφωνα με τα κριτήρια αυτά, υπήρχαν συνολικά 487 διαφορικά ρυθμίζονται μεταγραφές στην θεραπεία ανθεκτικών υποσειρές σύγκριση με ανδρογόνο ευαίσθητα PC346C, οι περισσότερες από τις οποίες επικαλύπτει τις τρεις πυρίμαχα sublines (Εικ. 1). Με 276 διαφορετικά ρυθμίζονται μεταγραφές, PC346DCC έδειξε την ισχυρότερη απόκλιση από τη γονική γραμμή, ενώ PC346Flu2 αποκάλυψε τις λιγότερες αλλαγές (127 μεταγραφές). Σημασία Ανάλυση των μικροσυστοιχιών (SAM) χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η στατιστική σημαντικότητα των επιλεγμένων γονιδίων και, σε μια ψευδή ρυθμό ανακάλυψης 5%, 392 της 487 (80%) που επιλέγεται πέτυχε στατιστική σημαντικότητα. Οι 100 κορυφαίες διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων μεταξύ των αποκρίνονται στο ανδρογόνο κυτταρικές σειρές θεραπεία-ανθεκτική και τις αντίστοιχες αναλογίες έκφρασης και στατιστική ανάλυση παρουσιάζονται στους Πίνακες 1 και 2. Ο πλήρης κατάλογος όλων των ρυθμιζόμενων γονιδίων ανά υποσειρά παρέχεται στους Πίνακες S1 έως S3 . Είναι ενδιαφέρον ότι, ένα σημαντικό ποσοστό (64/487) των διαφορικά ρυθμιζόμενα γονίδια συγκεντρωμένα σε διακριτές θέσεις γονιδιωματική στα χρωμοσώματα 4, 5, 6, 8, 11 και 18 (τιμή-ρ & lt? 0,05? Πίνακας 3).

PC346C καλλιεργήθηκε σε πλήρες θρεπτικό μέσο με 0,1 nM R1881, ενώ οι ορμόνες πυρίμαχα sublines ήταν ο πολιτισμός σε ξυλάνθρακα επικαλυμμένο με δεξτράνη απογυμνωμένο μέσο (PC346DCC), συμπληρωμένο με 1 μΜ του υδροξυφλουταμιδίου αντιανδρογόνο (PC346Flu1 και PC346Flu2). Α) Heat-χάρτη εκπροσώπηση: κόκκινο και πράσινο χρώμα αντιπροσωπεύουν πάνω ρύθμιση και ρύθμιση προς τα κάτω, αντίστοιχα, ενώ το μαύρο υποδηλώνει καμία διαφορά μεταξύ sublines και γονικών κυττάρων PC234C. Γκρι τετράγωνα υποδεικνύουν τα ελλείποντα στοιχεία, είτε λόγω των χαμηλών επιπέδων έκφρασης, η κακή ποιότητα των δεδομένων ή την απουσία των ανιχνευτών για το αντίστοιχο προϊόν μετεγγραφής στην πλατφόρμα συστοιχία χρησιμοποιείται για τη μελέτη. Β) Βεν-διάγραμμα του αριθμού των ρυθμιζόμενων γονιδίων στα διάφορα sublines.

Η

Η

οδός AR ρυθμίζεται προς τα κάτω σε PC346DCC

Για να διερευνήσουν την κατάσταση ενεργοποίησης του μονοπατιού AR στην PC346DCC, PC346Flu1 και PC346Flu2, η βάση δεδομένων SRS χρησιμοποιήθηκε για να συνδέσει και να συγκρίνουν τα σημερινά δεδομένα μας με ένα προηγουμένως καθοριστεί γονίδιο ανδρογόνα απόκριση υπογραφής (Σχ. 2Α). Αυτή η υπογραφή ανδρογόνο-απόκρισης προσδιορίστηκε με ανάλυση μικροσυστοιχιών έκφρασης, μετά από διέγερση των διαφορετικών PC346 κυτταρικές γραμμές με το συνθετικό ανδρογόνο R1881 ή την υδροξυφλουταμιδίου αντιανδρογόνο (Πίνακας S4). Από τους 487 διαφορικά ρυθμιζόμενες μεταγραφές στην θεραπεία ανθεκτικών υποσειρές, μόνο 27 ήταν γονιδίων στόχων AR (& lt? 6%), υποδεικνύοντας ότι άλλα γονίδια και μονοπάτια εμπλέκονται επίσης στην ορμόνη θεραπεία πυρίμαχα πολλαπλασιασμό αυτών υποσειρές. Επιπλέον, AR γονίδια-στόχοι προς τα κάτω-ρυθμίζονται σε PC346DCC (p-value = 10

-7), ενώ η έκφραση τους σε PC346Flu1 και PC346Flu2 δεν επηρεάστηκε σημαντικά (Εικ. 2Β). Ωστόσο, αν και όχι στατιστικά σημαντική για το AR οδό ως σύνολο, PC346Flu1 και PC346Flu2 έδειξε χαμηλότερη επαγωγή ορισμένων αποκρίνονται στο ανδρογόνο γονιδίων όπως KLK2, STEAP1, STEAP2 και EHF.

διαφορικά-εκφρασμένα γονίδια σε PC346 ορμόνη -refractory sublines έναντι γονική PC346C συνδέθηκαν με ένα προηγουμένως καθοριστεί γονιδίου των ανδρογόνων-απόκρισης υπογραφής (βλέπε τμήμα Υλικά και Μέθοδοι). (Α) Heat-map αναπαράσταση των γονιδίων που αποκρίνονται στο ανδρογόνο απορρυθμισμένη σε οποιοδήποτε από τα ορμονικά ανθεκτικών υποσειρές PC346. Χρώμα καθεστώτος, όπως περιγράφεται στο Σχ. 1. (Β) Venn διάγραμμα και τα αντίστοιχα στατιστικά στοιχεία.

Η

Γονιδιακή οντολογία και την ανάλυση οδό εντοπίζει τον καρκίνο υπογραφή

Η επιλεγμένη 487-γονιδίου υπογραφή ταξινομήθηκε σύμφωνα με Gene Ontology (GO) βιολογικών διεργασιών με τη χρήση της βάσης δεδομένων για το σχολιασμό, την απεικόνιση και την Ολοκληρωμένη Discovery (David) [26], [27]. ανάλυση σχολιασμού ομαδοποίηση έδειξε εμπλουτισμό των κατηγοριών που εμπλέκονται στην ανάπτυξη των οργάνων, διαφοροποίηση αναπαραγωγικό σύστημα, κυτταρική ανάπτυξη, τη διαφοροποίηση και την απόπτωση (Πίνακας 4). Εφευρετικότητα Διαδρομή Η ανάλυση χρησιμοποιείται για να προσδιορίσει τον εμπλουτισμό σε «ασθένειες και διαταραχές», «μοριακών και κυτταρικών λειτουργιών», και για να ψάξετε εγγενή μονοπάτια /δικτύων εντός των επιλεγμένων σετ γονιδίων (www.ingenuity.com). Του καρκίνου και του αναπαραγωγικού συστήματος της νόσου ήταν κατατάσσονται στην κορυφή 3 του «ασθενειών και διαταραχών», η οποία επιβεβαίωσε λογικά τον εμπλουτισμό των γονιδίων που σχετίζονται με προστάτη, όπως εψίνη, clusterin, του υποδοχέα της βιταμίνης D, σε σχήμα τριφυλλιού συντελεστής 3, πρωτεΐνη όγκου D52, το ίδιο το AR και αρκετών γονιδίων στόχων του (Εικ. 3Α και 3Β, αντιστοίχως). Επιπλέον, θα χρησιμοποιηθούν για την ανάλυση του Δικτύου για τη διαλογή της 276-γονίδιο υπογραφή PC346DCC για τις πιθανές εναλλακτικές οδούς ανάπτυξης που θα μπορούσαν να εμπλέκονται στην παρακάμπτοντας τη σηματοδότηση AR. Είναι ενδιαφέρον, σηματοδότηση μέσω του υποδοχέα αυξητικής ορμόνης (GHR), υποδοχέα ινσουλίνης (INSR) και του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα ήταν μεταξύ των κορυφαίων 10 Δίκτυα (βαθμολογία = 20) που δείχνει την απορρύθμιση στην PC346DCC (Σχ. 3C).

Top 5 βιολογικές λειτουργίες εμπλουτισμένο σε θεραπεία ανθεκτικών υποσειρές: (Α) ασθένειες και διαταραχές, (Β) και μοριακών κυτταρικές λειτουργίες. (C) Παράδειγμα ανάλυσης Δικτύου για PC346DCC δείχνει την απορρύθμιση της σηματοδότησης ορμονών και αυξητικού παράγοντα του υποδοχέα: up-ρυθμιζόμενα γονίδια εκπροσωπούνται σε κόκκινο και καταπιεσμένη γονίδια στο πράσινο. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού Ingenuity Διαδρομή ανάλυση (www.ingenuity.com).

Η

Ολοκληρωμένη ανάλυση αποκαλύπτει γονίδια απελευθερωθεί στον προστάτη εξέλιξης του καρκίνου

Για την ταυτοποίηση των γονιδίων διαμορφώνονται σε προστάτη ότι θα μπορούσε να εξηγήσει ορμόνη θεραπεία πυρίμαχα ανάπτυξη μέσω παράκαμψης της οδού AR, έχουμε συνδέσει το 276 γονίδιο υπογραφή από PC346DCC με δεδομένα από επτά μελέτες μικροσυστοιχιών προστάτη δημοσιευθεί προηγουμένως (Πίνακας 5) [14], [29], [30], [31 ], [32], [33], [34]. Μόνο γονίδια που υπάρχουν σε τουλάχιστον 5/7 βάσεων δεδομένων (209 γονίδια) και απορρυθμισμένη σε τουλάχιστον 3/7 (111 γονίδια) συμπεριλήφθηκαν για περαιτέρω ανάλυση. Ιεραρχική συσταδοποίηση εκτελούνται στα γονίδια υπογραφή (πρώτη στήλη), δίπλα στην πρωτογενή καρκίνο εναντίον κανονικό προστάτη (δεύτερη στήλη), μεταστατικό καρκίνο έναντι πρωτογενούς καρκίνου (τρίτη στήλη) και τελικά ορμονοάντοχου vs. ορμόνη-αφελή νόσο (τέταρτη στήλη ), φαίνεται στο Σχ. 4. Περίπου το 30% των γονιδίων που εκφράζονται διαφορικά σε PC346DCC βρέθηκαν να απελευθερωθεί με συνέπεια σε μεταστατικό προστάτη σε σύγκριση με τη νόσο όργανο-περιορισμένο.

Το 276-γονίδιο υπογραφή από PC346DCC συνδέθηκε με τα δεδομένα από τις 7 προστάτη μικροσυστοιχιών καρκίνο βάσεις δεδομένων των πρωτογενών (Lapointe, Varambally, Tomlins, Yu), μεταστατικό (Chandran, Lapointe, Varambally, Tomlins, Yu) και ορμόνες θεραπεία πυρίμαχα όγκους (Tamura, Tomlins και καλύτερο). Μόνο γονίδια που υπάρχουν σε τουλάχιστον 5/7 βάσεων δεδομένων (209 γονίδια) και απορρυθμισμένη σε τουλάχιστον 3/7 (111 γονίδια) συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση. Heat-map αναπαράσταση (Α) 72 υπερεκφράζεται και (Β) 39 καταστέλλεται γονιδίων σε PC346DCC. (Γ) Η απορρύθμιση γονιδίων που επιλέγονται για περαιτέρω ανάλυση qPCR. Χρώμα καθεστώτος, όπως περιγράφεται στο Σχ. 1. γκρι τετράγωνα υποδεικνύουν τα ελλείποντα στοιχεία, είτε λόγω των χαμηλών επιπέδων έκφρασης, η κακή ποιότητα των δεδομένων ή την απουσία των ανιχνευτών για το αντίστοιχο προϊόν μετεγγραφής στην πλατφόρμα συστοιχία χρησιμοποιείται για τη μελέτη. PC-ΝΑΡ: ο καρκίνος του προστάτη μείον κανονική δίπλα του προστάτη? MET-PC: μετάσταση μείον πρωτοβάθμια προστάτη όγκοι? HR-HN:. Ορμονικής θεραπείας πυρίμαχα μείον ορμόνη αφελείς όγκων

Η

TWIST1, DKK3 και VAV3 ως δείκτες για τη διάγνωση της νόσου και την πρόγνωση

Με βάση τις αναγνωρισμένες παθολογικές λειτουργίες τους και συνεπής απορρύθμιση σε πολλαπλές βάσεις δεδομένων ΣΕΣ, στρίψιμο ομόλογο 1, επιλέχθηκαν vav συντελεστής 3 γουανίνης ανταλλαγής νουκλεοτιδίων (VAV3) και dickkopf ομόλογο 3 (DKK3) (TWIST1) για τον πιθανό ρόλο τους στην παράκαμψη της οδού AR. Με αυτόν τον τρόπο, TWIST1 και VAV3 είναι υποθετική ογκογονίδια που εμπλέκονται στην σηματοδότηση της αυξητικής ορμόνης, όπως αποκαλύπτεται από Ingenuity Ανάλυση Pathway (Σχ. 3C). Από την άλλη πλευρά, DKK3 είναι ένα ογκοκατασταλτικό, δείχνοντας ισχυρή ρύθμιση προς τα κάτω στα σύνολα δεδομένων από Chandran

et al.

, Lapointe

et al.

Και Varambally

et al.

(Εικ. 4C). Λαμβάνοντας υπόψη ότι η TWIST1 έδειξε σταθερή ρύθμιση προς τα πάνω στην πρωτοβάθμια και μεταστατικό σύνολα δεδομένων προστάτη από Varambally

et al.

, Yu

et al.

, Lapointe

et al.

Και Chandran

et al.

, VAV3 ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω σε πρωτογενείς όγκους που ακολουθείται από ρύθμιση προς τα πάνω στη μετάσταση (Εικ. 4C).

Ποσοτική RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα ανεξάρτητο σύνολο δειγμάτων του προστάτη, που λαμβάνεται από ριζική προστατεκτομή ή διουρηθρική εκτομή του προστάτη των ασθενών που λειτουργεί στο Erasmus MC κλινική. Αυτός ο πίνακας περιείχε 21 δείγματα ιστού καλοήθους προστάτη και 74 αδενοκαρκινώματα σε διαφορετικά στάδια της νόσου. Ποσοτική ανάλυση PCR έδειξε up-ρύθμιση του TWIST1 στην πρωτοβάθμια δείγματα προστάτη και λεμφαδένα μετάσταση (P-value = 0,0001 και 0,002, αντίστοιχα). Καμία διαφορά δεν παρατηρήθηκε μεταξύ των ορμονοάντοχου (HRPC) και ορμόνη-αφελή όγκων (HNPC) (εικ. 5Α). έκφραση DKK3 ήταν σημαντικά μειωμένη σε PCa και λεμφαδένα μετάσταση (Ρ-τιμή ≤0.0001), αν και δεν παρατηρήθηκε διαφορά στη διάρκεια της εξέλιξης από όργανο-περιορίζεται σε μεταστατικό ή ορμόνες πυρίμαχα νόσο (Εικ. 5Β). έκφραση VAV3 μειώθηκε σταδιακά κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του προστάτη, με τα χαμηλότερα επίπεδα που παρατηρούνται σε μεταστατικούς όγκους του προστάτη (P-value = 0,0001 για μετά τη δοκιμή γραμμικής τάσης) και τα δείγματα ορμονοάντοχου (P-value = 0,005 για HNPC εναντίον HRPC? Σχ. 5C ). δείγματα λεμφαδένων απομακρύνθηκαν από την ανάλυση VAV3 στο Σχ. 5C, επειδή VAV3 ήταν ιδιαίτερα εκφράζεται σε φυσιολογικό λεμφαδένα σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς προστάτη (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε αυτές τις ρυθμίσεις, η παρουσία των υπολειμμάτων του κανονικού λεμφαδένα ιστού μπορεί να οδηγήσει σε υπερεκτίμηση της πραγματικής ποσότητας VAV3 στη μετάσταση στους λεμφαδένες. Kaplan-Meier ανάλυση έδειξε μια άμεση συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης VAV3 και μετάσταση επιβίωση χωρίς (P-value = 0,004 για τη δοκιμή τάση Logrank? Εικ. 5D).

δείγματα όγκων του προστάτη ελήφθησαν από ριζική προστατεκτομή ή διουρηθρική ο προστάτης των ασθενών που λειτουργεί στο Erasmus MC κλινική. Αυτός ο πίνακας περιέχει 21 δείγματα καλοήθη ιστό του προστάτη και 74 αδενοκαρκινώματα σε διαφορετικά στάδια της νόσου. (Α) TWIST1? (Β) DKK3? (Γ) VAV3 έκφραση σε δείγματα προστάτη? (D) VAV3 ανάλυση επιβίωσης μετάσταση-free. ΕΣΚ: κανονικό γειτονικό προστάτη? PC: πρωτοπαθή καρκίνο του προστάτη? LNmet: λεμφαδένα μετάσταση? PC-Met: μη-προοδευτική όργανο-Confine καρκίνο του προστάτη? PC + Met: πρωτοπαθούς όγκου από την προοδευτική καρκίνο του προστάτη που είτε είχαν είτε αναπτύξει μετάσταση κατά τη διάρκεια της μετέπειτα παρακολούθησης? HN: ορμόνη αφελής? HR: ορμόνη θεραπεία πυρίμαχο? (*) P-value ≤0.0001 και (**) τιμή p ≤0.005 χρησιμοποιώντας Mann-Whitney δίπλευρη δοκιμή. (***) P-value ≤0.0001 με Δημοσίευση δοκιμή γραμμική-τάση.

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήσαμε την ανάλυση μικροσυστοιχιών για να εντοπιστούν διαφορές στο πρότυπο έκφρασης του γονιδίου της η PC346C κυτταρική σειρά ανδρογόνο-απόκρισης και η θεραπεία-ανθεκτική sublines του: PC346DCC, PC346Flu1 και PC346Flu2. Αυτή η ανάλυση ανιχνεύθηκε 487 μεταγραφές διαφορικά ρυθμίζονται στα ορμόνη θεραπεία πυρίμαχο κυττάρων έναντι του πατρικού PC346C. Πολλά από αυτά ήταν κοινά σε όλες τις υποσειρές θεραπεία ανθεκτικών, παρά τις διαφορετικές τροποποιήσεις AR οδού υποδεικνύοντας παρόμοιες προσαρμογές ενίσχυση της ανάπτυξης (Εικ. 1).