Αφηρημένο

Αυτή η μελέτη παρέχει μια μοναδική προσέγγιση για να ενεργοποιήσετε κλουβιά μικρών RNAs παρεμβολής (siRNAs) χρησιμοποιώντας έμμεση υπεριώδες φως που εκπέμπεται από το εγγύς υπέρυθρο (NIR) -να-UV διαδικασία upconversion για την επίτευξη υψηλών προτύπων χωρικής και χρονικής γονίδιο παρεμβολές. μόρια siRNA κατά της αντι-αποπτωτική γονίδιο

survivin

είχε εγκλωβισθεί από φωτοευαίσθητα μόρια (4,5-διμεθοξυ-2-νιτροακετοφαινόνη, ϋΜΝΡΕ), η οποία κατέστησε τους προσωρινά μη λειτουργικό. NIR-to-UV NaYF

4: Υο, Tm νανοσωματίδια upconversion (UCPs) υπηρέτησε ως οχήματα παράδοσης και ενεργοποιητές των εγκλωβίζονται μόρια siRNA στα καρκινικά κύτταρα ποντικού ουροδόχου κύστης (κυτταρική σειρά MB49). Αναβιβάζονται υπεριώδες φως στα 355 nm εκπέμφθηκε από το NIR-ακτινοβολημένα UCPs, η οποία συνέπεσε καλά με το μήκος κύματος που απαιτείται για την εκκλωβίζω ϋΜΝΡΕ. Κατά συνέπεια, το υπεριώδες φως έδρασε ως διακόπτης να εκκλωβίζω τη παραδοθεί μόριο siRNA, καθιστώντας έτσι πλήρως λειτουργικό για την άσκηση το θεραπευτικό του αποτέλεσμα στα καρκινικά κύτταρα κύστης. Για να επιτευχθεί η υψηλότερη απόδοση παρεμβολή RNA, βελτιστοποιημένες συνθήκες όπως είναι ο χρόνος μετά την κυτταρική πρόσληψη, ο χρόνος διέγερσης, η συγκέντρωση UCPs και ισχύος λέιζερ. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι /mL συγκέντρωση νανοσωματιδίων 200 μg σε συνδυασμό με 12 ώρες επώασης με MB49 κύτταρα και διέγερσης με λέιζερ NIR στα 100 mW ισχύος για 15 λεπτά έδωσε την ιδανική αποτελεσματικότητα παρεμβολή και ισχυρότερο επαγωγή κυτταρικού θανάτου MB49. Τα ευρήματά μας αποδεικνύουν την πιθανή βιολογική εφαρμογή των UCPs στη θεραπεία του καρκίνου της ουροδόχου κύστης με μια νέα θεραπευτική προσέγγιση

Παράθεση:. Guo Η, Γιαν D, Wei Υ, Han S, Qian Η, Yang Y, et al. (2014) Αναστολή του Ποντικού καρκίνο της ουροδόχου κύστης Η ανάπτυξη των κυττάρων

In Vitro από

Photocontrollable siRNA Βάσει Μετατροπή προς τα πάνω φθορισμού νανοσωματίδια. PLoS ONE 9 (11): e112713. doi: 10.1371 /journal.pone.0112713

Επιμέλεια: Yuan-Σύντομα Ho, Ταϊπέι Ιατρικό Πανεπιστήμιο, την Ταϊβάν

Ελήφθη: 8 Αύγ, 2014? Αποδεκτές: 14 Οκτωβρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 25 Νοέμβρη 2014

Copyright: © 2014 Guo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η έρευνα αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από τις επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 31100688, Αρ 21471043), Διεθνές Επιστημονικό & amp ? Πρόγραμμα τεχνολογικής συνεργασίας της Κίνας (Αρ 2014DFA31890), η επιστημονική Ίδρυμα Ερευνών για το επιστρεφόμενο Overseas κινέζικα Υποτρόφων, Υπουργείο Παιδείας κράτος, και το Χημείο του Κράτους Βασικά Κτηνιατρικής αιτιολογικός Βιολογίας, Lanzhou Ινστιτούτο Κτηνιατρικών Ερευνών, Κινεζική Ακαδημία Γεωργικών Επιστημών (SKLVEB2013KFKT010). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνου της ουροδόχου κύστης είναι η πιο συχνή κακοήθεια του ουροποιογεννητικού συστήματος σε όλο τον κόσμο. Σημαντική ερευνητική προσπάθεια έχει αφιερωθεί στην ανάπτυξη νέων και αποτελεσματικών θεραπειών για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Εκτός από τις συμβατικές μεθόδους θεραπείας όπως η χειρουργική επέμβαση, χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία, η γονιδιακή θεραπεία θεωρείται μια αποτελεσματική εναλλακτική λύση για τη θεραπεία της tumors.Hence, παρεμβολή RNA (RNAi), ένα φυσικό μηχανισμό σε κύτταρα για γονιδιακή σίγηση, δείχνει ισχυρό δυναμικό για την αγωγή της καρκίνο της ουροδόχου κύστης [1], [2], [3]. RNAi περιλαμβάνει τη σύνδεση του μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) για το RNA που προκαλείται από την αποσιώπηση σύμπλοκο (RISC), η οποία στη συνέχεια κατευθύνει την καταστροφή του αγγελιοφόρου RNA (mRNA) που είναι συμπληρωματικό προς τον κλώνο αντινοήματος του siRNA. Στόχου-ειδική RNAi μπορεί να γκρεμίσουμε ένα γονίδιο με υψηλή εξειδίκευση και επιλεκτικότητα, παρέχοντας έτσι ένα σημαντικό εργαλείο για την εξατομικευμένη θεραπεία του καρκίνου.

Ο μηχανισμός RNAi συνήθως ξεκινά μόλις τεθεί siRNA το κύτταρο, και οι επιπτώσεις στη γονιδιακή σίγηση μπορεί να παρατηρηθεί αμέσως μετά. Ωστόσο, η ταχεία και ανεξέλεγκτη RNAi περιορίζει τη χρησιμότητα της γονιδιακής θεραπείας. Ως εκ τούτου, έχουν γίνει προσπάθειες για την ανάπτυξη spatiotemporally επαγώγιμων RNAi. Μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση είναι «κλουβιά» RNAi, η οποία χρησιμοποιεί siRNA τροποποιηθεί με μια ομάδα προστασίας φωτοευκινήτου που μπλοκάρει τη δράση του. Καθώς η δράση της «κλουβιά» siRNA στηρίζεται σε μια βάση το φως σκανδάλη (όπως το υπεριώδες φως), η προσέγγιση αυτή επιτρέπει την απόσταση, το χρόνο και τον έλεγχο του βαθμού της γονιδιακής έκφρασης, περιγράφηκε για πρώτη φορά από τον Kaplan το 1978, έχει χρησιμοποιηθεί αυτή η μέθοδος σε μια ποικιλία εφαρμογών [4]. Σε αυτή τη μελέτη, εμείς επιλέξαμε 4,5-διμεθοξυ-2-νιτροακετοφαινόνη (ϋΜΝΡΕ), ένα 2-NB (2-νιτροβενζυλ) κατηγορία της ομάδας προστασίας φωτοασταθείς, να siRNAs κλουβί για την ελάχιστη διαρροή και μέγιστη uncaging αποδοτικότητα.

τα τελευταία χρόνια, τα νανοσωματίδια upconversion φθορισμού (UCPs) χρησιμοποιούνται ολοένα ως φθορίζοντες δείκτες και για απελευθέρωση γονιδίου. UCPs δείχνουν καλή βιοσυμβατότητα και δεν ανοσογονικότητα ως ένα σύστημα απελευθέρωσης γονιδίου, και μπορεί να αποβάλλεται με ασφάλεια χωρίς να αφήνει κατάλοιπα στο σώμα. UCPs μπορεί να παραδώσει αποτελεσματικά siRNA ή DNA σε κύτταρα-στόχους ή τους ιστούς, ενώ τα προστατεύει από την υποβάθμιση από νουκλεάσες στον ορό του αίματος. Επιπλέον, σε σύγκριση με τις παραδοσιακές δείκτες φθορισμού, όπως οργανικών βαφών και κβαντικές τελείες, UCPs εμφανίζουν χαμηλή τοξικότητα, καλή χημική σταθερότητα, υψηλή ένταση φθορισμού, υψηλή σταθερότητα, και μεγάλη μετατόπιση Stokes όταν χρησιμοποιούνται ως δείκτες φθορισμού. UCPs διεγείρονται από εγγύς υπέρυθρο (NIR) φως, το οποίο επηρεάζεται ελάχιστα από παρεμβολές και σκέδασης του αυτο-φθορισμού από τους ιστούς και τα κύτταρα, και έτσι θα προσφέρει χαμηλό υπόβαθρο και υψηλό λόγο σήματος προς θόρυβο [5].

NIR φως μπορεί να διαπεράσει τους ιστούς βαθύτερα από το ορατό φως, και ως τέτοια, UCPs μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως δείκτες φθορισμού ή στην οπτική θεραπεία της βαθιάς ιστών. Ως εκ τούτου, UCPs παρουσιάζουν καλή προοπτική ως φθορίζοντες δείκτες και οι φορείς απελευθέρωσης γονιδίου σε κλινικές ανίχνευση, θεραπεία, και την ανάλυση των βιολογικών μορίων [6], [7], [8], [9]. NaYF4: Yb, Er /Τ εμφανίζει την υψηλότερη απόδοση από την NIR στο ορατό /φθορισμού upconversion και μπορεί να προσφέρει μήκη κύματος από το υπεριώδες φως στο υπέρυθρο φως. Ως εκ τούτου, NaYF4: Yb, Tm χρησιμοποιήθηκε ως φορέας photocaged siRNA σε αυτή τη μελέτη

Survivin

είναι ένα από τα ισχυρότερα αναστολείς πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην απόπτωση.. Δεδομένης της μεγάλης διαφοράς στην έκφραση της μεταξύ κανονικών και κακοηθών ιστών και αιτιώδη ρόλο της στην εξέλιξη του καρκίνου, survivin έχει μελετηθεί σαν ένας στόχος για αντικαρκινική θεραπεία και ως δείκτης όγκου [10], [11], [12], [ ,,,0],13]. Εδώ, survivin επιλέχθηκε ως το γονίδιο-στόχο, προκειμένου να διερευνηθεί η αποτελεσματικότητα της γονιδιακής θεραπείας RNAi βασισμένη στη θεραπεία του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Συγκεκριμένα, Survivin siRNA κλουβί με ϋΜΝΡΕ συνδυάστηκε με UCPs ως φορέα. Η ενεργοποίηση του siRNA επιτεύχθηκε με ακτινοβολία με 980 nm NIR λέιζερ και αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων καρκίνου της ουροδόχου κύστης αξιολογήθηκε. Τα αποτελέσματά μας παρέχουν νέες πληροφορίες για την χρήση των UCPs στη γονιδιακή θεραπεία.

Υλικά και Μέθοδοι

1. Κυττάρων

κύτταρα MB49-PSA που παρασχέθηκαν από τον Δρ Ratha Mahendran από τη Σχολή Ιατρικής (NUS, Σιγκαπούρη) [7], [9], καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C κάτω από 5% CO

2 ατμόσφαιρα σε τροποποιημένο μέσο Eagle (ΜΕΜ, Gibco) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Gibco) που περιέχει 100 μονάδες /ml πενικιλλίνης G νατρίου (ΒΒΙ) και 100 μg /mL θειική στρεπτομυκίνη (ΒΒΙ).

2 . Αμινομάδα-τροποποιημένο σχηματισμό πολύπλοκων

UCPs και UCPs /siRNA-ϋΜΝΡΕ

NaYF

4: Υο, Tm νανοκρυστάλλων και μονοδιεσπαρμένων πυριτίου επικαλυμμένα NaYF

4: Υο, Tm (NaYF4: Yb, Tm @ διοξείδιο του πυριτίου, UCPs) συνετέθησαν και χαρακτηρίστηκαν σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται από τον Guo et al. (2010) [7] και Qian et al. (2009) [9]. Η UCPs τροποποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μία αμινομάδα σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται από τους Guo et al. (2011). ΫΜΝΡΕ (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε για να siRNAs κλουβί ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, και τα σύμπλοκα UCPs /siRNA-ϋΜΝΡΕ έγιναν όπως περιγράφηκε προηγουμένως από τον Guo et al. (2011) [14]. Η αναλογία UCPs να siRNA προσδιορίστηκε με μέτρηση του δυναμικού ζήτα χρησιμοποιώντας νανο-ZS ZEN 3600 (Malvern Instruments Ltd, UK) στους 25 ° C. Το φάσμα απορρόφησης υπεριώδους συγκεντρώθηκαν χρησιμοποιώντας BIOMATE 3S υν-ορατού φασματοφωτόμετρο (Thermo Scientific) στους 25 ° C.

3. Κυτταρική πρόσληψη UCPs σε διαφορετικά χρονικά σημεία

MB49 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων και καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες. Τα κύτταρα αμέσως σε επεξεργασία με νανοσωματίδια στα 100 μg /mL και συλλέχθηκε σε διάφορα χρονικά σημεία (15 λεπτά, 1 ώρα, 6 ώρες, και 24 ώρες). Κύτταρα φορτωμένα με νανοσωματίδια μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (RT) και στη συνέχεια πλύθηκε δύο φορές με 1 χ PBS για 5 λεπτά. Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με 0.1 μg /mL ϋΑΡΙ (Sigma) για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου που ακολουθείται από δύο πλύσεις με 1 χ PBS για 5 λεπτά η κάθε μία. Νανοσωματίδια φορτωμένο σε στερεωμένα κύτταρα στη συνέχεια κατέστησαν ορατές κάτω από ένα συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης με λέιζερ (Nikon C1 Ομοεστιακή) εφοδιασμένο με ένα συνεχές κύμα 980 nm πηγή διέγερσης λέιζερ.

4. Ποσοτικοποίηση των UCPs πρόσληψης

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 75 εκατοστά

2 φιάλες με 1 × 10

6 /mL μετά από καλλιέργεια για 24 ώρες. Τα κύτταρα αμέσως σε επεξεργασία με νανοσωματίδια στα 100 μg /mL και συλλέχθηκε σε διαφορετικούς χρόνους σημείο σε 0, 15 λεπτά, 1 ώρα, 3 ώρες, 6 ώρες, 24 ώρες, 48 ώρες, και 72 ώρες. Ενδοκυτταρική πρόσληψη των νανοσωματιδίων αξιολογήθηκε με μέτρηση συνολικού ποσού των νανοσωματιδίων σε κύτταρα χρησιμοποιώντας επαγωγικά συζευγμένου οπτικής εκπομπής Φασματόμετρο Πλάσματος (ICP-AES).

5. Επιμόλυνση των καλλιεργημένων κυττάρων

κύτταρα MB49-PSA επιμολύνθηκαν με το σύμπλοκο /siRNA-ϋΜΝΡΕ UCPs ακολουθώντας τη μέθοδο που περιγράφεται από τους Guo et al. (2011) [14]. Εν συντομία, UCPs σύμπλοκο /siRNA-ϋΜΝΡΕ επωάστηκε με κύτταρα για διαφορετικά χρονικό σημείο όπως υποδεικνύεται. στους 37 ° C υπό

2 ατμόσφαιρα 5% CO. Στο τέλος της περιόδου επώασης, τα κύτταρα ήταν ενθουσιασμένοι με ή χωρίς 980 nm λέιζερ χρησιμοποιώντας ένα 980 nm VA-II διόδων αντλείται στερεάς κατάστασης (DPSS) πηγή λέιζερ.

6.

In vitro

δοκιμές βιωσιμότητας /κυτταροτοξικότητας

Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας Κυττάρου Titer 96 υδατικό διάλυμα ενός ποσοτικού προσδιορισμού (Promega, Madison, WI). κύτταρα MB49 σπάρθηκαν επί πλάκας 96 φρεατίων σε πυκνότητα 5 χ 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο. Μετά από μία ημέρα σε καλλιέργεια, UCPs σύμπλοκο /siRNA-ϋΜΝΡΕ προστέθηκε στα φρεάτια. Τα κύτταρα επωάστηκαν για διαφορετικά χρονικό σημείο όπως υποδεικνύεται και στη συνέχεια διεγείρονται με λέιζερ 980 nm ή όχι. Μετά από επώαση για επιπλέον 24 ώρες στους 37 ° C, 20 μΐ του αντιδραστηρίου απευθείας προστέθηκαν στα φρεάτια και επωάστηκαν για άλλες 24 ώρες. Ποσότητα του προϊόντος φορμαζάνης που σχηματίζεται όπως υποδεικνύεται από 490 nm απορρόφηση είναι ευθέως ανάλογη με τον αριθμό των ζωντανών κυττάρων στην καλλιέργεια. Κάθε πείραμα έγινε εις τριπλούν. Κυτταρική βιωσιμότητα (%) σε σχέση με τα φρεάτια ελέγχου που περιείχαν μέσο καλλιέργειας κυττάρων χωρίς νανοκρυστάλλους υπολογίστηκε ως [

A

]

Πειρ /[

A

]

έλεγχος χ 100%, όπου [

A

]

Πείραμα είναι η απορρόφηση του δείγματος δοκιμής και [Ι]

έλεγχος είναι η απορρόφηση του δείγματος ελέγχου.

7. Ανίχνευση της έκφρασης σουρβιβίνης με ανάλυση ανοσοστυπώματος

MB49 κύτταρα σπάρθηκαν επάνω σε μια έξι-φρεατίων και καλλιεργήθηκαν μέχρι συμβολής ήταν 80% έως 90% (η οποία συνέβη μετά από περίπου 24 ώρες). Σε εκείνο το σημείο, UCPs σύμπλοκο /siRNA-ϋΜΝΡΕ προστέθηκε και τα κύτταρα επωάστηκαν για διαφορετικά χρονικό σημείο όπως υποδεικνύεται. Στη συνέχεια, τα κύτταρα ακτινοβολούνται με ή χωρίς 980 nm λέιζερ και επωάστηκαν στους 37 ° C για άλλες 24 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας κρύο αντιδραστηρίου λύσεως κυττάρων (Pierce) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Πρωτεΐνες σε κυτταρολύματα διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE σε 12% γέλες ακρυλαμιδίου χρησιμοποιώντας ένα ασυνεχές σύστημα ρυθμιστικού διαλύματος. Στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Pierce) σε ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς (20 mM Tris-HCl, 190 mM γλυκίνη, 20% μεθανόλη, ρΗ 8.3) χρησιμοποιώντας ένα σύστημα μεταφοράς Mini Trans-blot (Bio-Rad) στα 100 V για 1 h. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% άπαχο ξηρό γάλα σε ρυθμισμένο με Tris αλατούχο διάλυμα που περιέχει 0.05% Tween-20 (TBST) σε RT για 1 ώρα και στη συνέχεια επωάστηκαν με αντι-survivin αντίσωμα (Santa Cruz, 1:200 αραίωση) σε RT για 1 ώρα. Μετά από τρεις πλύσεις σε TBST, οι μεμβράνες επωάστηκαν με συζευγμένο με υπεροξειδάση αντι-ποντικού δευτερογενούς αντισώματος (Sigma, 1:8000 αραίωση) σε RT για άλλη 1 ώρα. Τρεις επιπλέον πλύσεις σε TBST διεξήχθησαν πριν η μεμβράνη NC έγιναν ορατές με διάλυμα ECL (Pierce).

8. Η στατιστική ανάλυση

Οι ταινίες σαρώθηκαν ως κλίμακα του γκρι εικόνες 8-bit και η πυκνότητα των ζωνών προσδιορίστηκαν από τα δεδομένα ImageJ software.The της σχετικής ποσότητας σε κηλίδα western παρουσιάζονται και η στατιστική ανάλυση της διακύμανσης μεταξύ των ομάδων ήταν εκτελούνται από SPSS Statistics 19.0 λογισμικού. Σημαντική διαφορά όλων των στατιστικών ελέγχων ορίσθηκε σε 0,05 (p & lt? 0,05)

Αποτελέσματα

Σε αυτή τη μελέτη, NaYF

4:. 25% Υο, 0,3% Tm NIR-to- UV UCPs χρησιμοποιήθηκε ως φορέας του κλουβιά siRNAs, τα οποία ενεργοποιούνται με τη χρήση NIR-to-UV αναβιβάζονται φωτός (Σχ. 1). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, οι συντίθενται νανοσωματίδια κατείχαν μία δομή πυρήνα-κελύφους που αποτελείται από ένα NaYF

4 πυρήνα νανοκρυστάλλου και ένα κέλυφος πυριτίας. Για να επισυνάψετε τα κλουβιά siRNAs, οι UCPs τροποποιήθηκαν με μια αμινο ομάδα η οποία κάνει την επιφάνειά του είναι θετικό φορτίο. Τα τροποποιημένα νανοσωματίδια που φαίνεται στο σχήμα 2C είναι πιο διασκορπισμένη από εκείνες στο Σχήμα 2Β, η οποία μπορεί να οφείλεται σε ηλεκτροστατική άπωση που προκαλείται από θετικά φορτία στην επιφάνεια των νανοσωματιδίων. Συνολικά, τα νανοσωματίδια βρέθηκαν να είναι καλά διεσπαρμένα σε νερό, σχηματίζοντας ένα διαυγές κολλοειδές διάλυμα και εμφανίζουν ισχυρό φθορισμό upconversion (Σχήμα 2Α).

Η

φθορισμού φάσματα του μη τροποποιημένου νανοσωματιδίων (Α).? μορφολογία του μη τροποποιημένου νανοσωματιδίων (Β) και αμινο-λειτουργοποιημένη νανοσωματιδίων (C) που παρατηρούνται με ΤΕΜ.

Η

Συγκρότημα σχηματισμό των αμινο-τροποποιημένων UCPs με siRNA εξετάστηκε με τη μέτρηση του δυναμικού nanozeta. UCPs και siRNA αναμίχθηκαν για 1 ώρα στους 4 ° C. Τα σύμπλοκα /siRNA UCPs πλύθηκαν αρκετές φορές με PBS και μετά επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα PBS. Μέτρηση του ζήτα δυναμικού έδειξε ότι το θετικό φορτίο επί UCPs σταδιακά εξουδετερώθηκε με αρνητικό φορτίο του siRNA με αύξηση νανοσωματιδίων /αναλογία siRNA (Σχ. 3Α). Ωστόσο, οι επιφάνειες των κυττάρων είναι αρνητικά φορτισμένα σε ουδέτερο κατάσταση (ρΗ 7.0). Ως εκ τούτου, για να μεγιστοποιηθεί η ικανότητα των UCPs να παραδώσει όσο siRNA το δυνατόν περισσότερο και να αποκτήσει τη βέλτιστη απόδοση κυτταρική πρόσληψη του συγκροτήματος /siRNA UCPs, χρησιμοποιήσαμε μια αναλογία nanoparticle:siRNA των 10:02 (mol:mol) σε όλες τις

in vitro

πειράματα. Προκειμένου να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα των siRNA uncaging από UCPs, η απορρόφηση τους μετρήθηκε. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β, ϋΜΝΡΕ-κλουβιά siRNA αποκάλυψε μια χαρακτηριστική σύνοδο κορυφής στα 355 nm ως ϋΜΝΡΕ και ως συνάντηση κορυφής στα 260 nm ως siRNA, η οποία κατέδειξε την προσάρτηση των ομάδων ϋΜΝΡΕ στα μόρια siRNA. Για ϋΜΝΡΕ-κλουβιά μόρια siRNA, χωρίς ακτινοβολία με 980 nm NIR laser, έδειξε μια σύγχυση φάσματα. Εκτιμάται ότι υπάρχει παρεμβολή μεταξύ της εκπομπής UCPs και της ϋΜΝΡΕ. Ωστόσο, UCPs /siRNA-ϋΜΝΡΕ, μια σημαντική πτώση στην κορυφή 355 nm παρατηρήθηκε κατά την ακτινοβόληση με NIR light.Hence, είναι πιστευτό ότι NIR-to-UV UCNs να απολύω μόρια siRNA υπό διέγερση των NIR φωτός.

(Α) Ομοεστιακή απεικόνιση upconversion φθορισμού που εκπέμπεται από MB49 κύτταρα φορτωμένα με 100 μg /mL των νανοσωματιδίων. Διέγερση με 980 nm NIR laser που εκπέμπεται πράσινο και κόκκινο ορατό φθορισμό. Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με DAPI (μπλε φθορισμό). Όλες οι εικόνες ελήφθησαν κάτω από τις ίδιες ρυθμίσεις, η οποία επέτρεψε τον υπολογισμό της σχετικής έντασης φθορισμού των διαφορικά φορτωμένα κύτταρα. (Β) ενδοκυτταρική πρόσληψη των νανοσωματιδίων στο φορτωμένο κύτταρα από ICP-AES για την περιεκτικότητα σε ύττριο.

Η

Για να καθοριστεί το επίπεδο της κυτταρικής πρόσληψης των UCPs, UCPs /siRNA ή UCPs παθητικά φορτώνονται σε MB49 κύτταρα με την επώαση τους με νανοσωματίδια 100 μg /mL για διαφορετικές διάρκειες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, δύο φίλτρα χρησιμοποιήθηκαν για να συλλάβει πράσινο και μπλε εκπομπών φθορισμού. Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με DAPI για να αποδείξει ότι σχεδόν όλα τα κύτταρα φορτώθηκαν. Μια προοδευτική αύξηση παρατηρήθηκε στο φθορισμό που εκπέμπεται από upconversion κύτταρα νανοσωματίδιο φορτωμένα με το χρόνο. Ωστόσο, η ένταση φθορισμού του συμπλόκου /siRNA UCPs σε κύτταρα MB49 ήταν ισχυρότερη από εκείνη του UCPs, μόνο μετά από 6 ώρες επώασης. Αυτό έδειξε ότι τα κύτταρα είχαν MB49 παραλαμβάνεται σύμπλοκα UCPs /siRNA πιο έντονα από UCPs με την αύξηση του χρόνου, η οποία μπορεί να οφείλεται στην επιφανειακό φορτίο των νανοσωματιδίων. Επιπλέον, μετρήσαμε την ενδοκυτταρική πρόσληψη των νανοσωματιδίων στη φορτωμένη κύτταρα με ICP-AES για συγκέντρωση ύττριο και παρατηρήθηκαν παρόμοια τάση αύξησης στην πρόσληψη των νανοσωματιδίων σε κύτταρα συναρτήσει του χρόνου (Σχ. 4Β). Ωστόσο, η ποσότητα των UCPs σε κύτταρα φθάσει στην κορυφή και, στη συνέχεια, παρέμεινε η ισορροπία.

(Α) Το ζήτα δυναμικό του συμπλόκου /siRNA-ϋΜΝΡΕ UCPs σε mol /mol αναλογίες 10:01, 10:02, 10 :3, 10:04 και 10:05? (Β) Απορρόφηση φασματοφωτομετρία του siRNA, ϋΜΝΡΕ-κλουβιά siRNA χωρίς ακτινοβολία, και UCPs /siRNA-ϋΜΝΡΕ ενεργοποιηθεί με ή χωρίς NIR ακτινοβολία.

Η

Για τον προσδιορισμό των βέλτιστων συνθηκών για την siRNA παρεμβάσεις μετά την διέγερση NIR-λέιζερ , πειράματα δημιουργήθηκε με διαφορετικές συνθήκες χρονικά σημεία μετά την επιμόλυνση, οι χρόνοι διέγερσης, η συγκέντρωση των συμπλοκών, και δύναμη λέιζερ. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5, η απόδοση αυξήθηκε παρεμβολή με τη διάρκεια της επώασης των νανοσωματιδίων με τα κύτταρα. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μειώθηκε σημαντικά στη θεραπεία /siRNA-ϋΜΝΡΕ UCPs μετά από διέγερση με NIR λίγη. Ωστόσο, δεν υπήρχε σχεδόν καμία αλλαγή στην βιωσιμότητα των κυττάρων χωρίς NIR διέγερσης (Σχ. 5Α) .Similarly, σε 12 ώρες μετά την αγωγή με ή χωρίς NIR διέγερσης, το επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης suvivin μειώθηκαν σημαντικά και σχεδόν παρέμειναν στο ίδιο επίπεδο σε 24 ώρες , η οποία προτείνεται αύξηση της αποτελεσματικότητας παρεμβολή (Εικ. 5Β) .Αυτό μπορεί να οφείλεται σε αύξηση της κυτταρικής πρόσληψης των νανοσωματιδίων με το χρόνο, και είναι σύμφωνο με τα αποτελέσματα που δείχνονται στο Σχήμα 4. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6, η αποδοτικότητα παρέμβαση αυξήθηκε με τον χρόνο της διέγερσης. Ειδικότερα, η έκφραση survivin μειώθηκε σημαντικά όταν τα κύτταρα διεγείρονται με NIR φως για περισσότερο από 15 λεπτά. Το Σχήμα 7 δείχνει ότι η αποτελεσματικότητα παρεμβολή αυξάνεται με την αύξηση της συγκέντρωσης των νανοσωματιδίων, και έτσι η αποτελεσματικότητα παρεμβολή αυξήθηκε επίσης με την ποσότητα του siRNA κατά survivin. Για να προσδιοριστεί η επίδραση της ισχύος του λέιζερ στην αποτελεσματικότητα παρεμβολή, τα κύτταρα επωάστηκαν με UCPs ή UCPs /siRNA-ϋΜΝΡΕ, η οποία είναι διαφορετική από εκείνες που χρησιμοποιούνται στο προηγούμενο πείραμα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 8, η αποτελεσματικότητα παρεμβολή αυξήθηκε επίσης με την αύξηση της ισχύος του λέιζερ, ιδιαίτερα στα 500 mW. Ωστόσο, η έκφραση survivin μειώθηκε επίσης στην ομάδα ελέγχου UCPs στα 500 mW, η οποία πρότεινε ότι UCPs μπορεί να προκαλέσει βλάβη των κυττάρων φορά ενθουσιασμένοι από NIR φως υψηλής ισχύος. Ως εκ τούτου, με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα, οι βέλτιστες συνθήκες (12 ώρες επώαση, 15 λεπτά διέγερσης, /mL συγκέντρωση νανοσωματιδίων 200 μg, και 100 mW ισχύς λέιζερ) χρησιμοποιήθηκαν για την επαλήθευση της μέγιστης αποτελεσματικότητας παρεμβολή.

UCPs /siRNA-ϋΜΝΡΕ προστέθηκε σε MB49 κύτταρα σε συγκέντρωση UCPs των 100 μg /mL. Τα κύτταρα διεγείρονται με χρήση φωτός λέιζερ NIR (100 mW) για 15 λεπτά σε διαφορετικά χρονικά σημεία. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν στις 24 ώρες μετά την θεραπεία φωτός. αποδοτικότητα παρεμβολή RNAi προσδιορίστηκε με ανοσοστύπωμα (Α) και δοκιμασία ΜΤΤ (Β). Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα και το αποτέλεσμα ενός αντιπροσωπευτικού πειράματος φαίνεται. Οι αστερίσκοι δεικνύουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των δειγμάτων με διαφορετικά θεραπεία στο ίδιο χρονικό σημείο. (* Ρ & lt? 0,05, ** Ρ & lt? 0,01).

Η

UCPs /siRNA-ϋΜΝΡΕ προστέθηκε σε MB49 κύτταρα σε συγκέντρωση UCPs των 100 μg /mL. Τα κύτταρα διεγείρονται με τη χρήση φωτός λέιζερ NIR (100 mW) με διαφορετικούς χρόνους διέγερσης. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν στις 24 ώρες μετά την θεραπεία φωτός. αποτελεσματικότητα RNAi προσδιορίστηκε με ανοσοστύπωμα (Α) και δοκιμασία ΜΤΤ (Β). Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα και το αποτέλεσμα ενός αντιπροσωπευτικού πειράματος φαίνεται. Οι αστερίσκοι δεικνύουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των δειγμάτων με παρόμοιους χρόνους διέγερσης (* Ρ & lt? 0,05, ** Ρ & lt? 0,01)

Η

Διαφορετικές συγκεντρώσεις UCPs /siRNA-ϋΜΝΡΕ προστέθηκαν σε MB49 κύτταρα για 12 h.. Τα κύτταρα διεγείρονται με φως λέιζερ NIR (100 MW) για 15 λεπτά. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν στις 24 ώρες μετά την θεραπεία φωτός. αποτελεσματικότητα RNAi προσδιορίστηκε με ανοσοστύπωμα (Α) και δοκιμασία ΜΤΤ (Β). Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα και το αποτέλεσμα ενός αντιπροσωπευτικού πειράματος φαίνεται. Οι αστερίσκοι δεικνύουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των δειγμάτων με παρόμοια συγκέντρωση (* Ρ & lt? 0,05, ** Ρ & lt? 0,01).

Η

UCPs /siRNA-ϋΜΝΡΕ προστέθηκε σε MB49 κύτταρα σε συγκέντρωση UCPs 100 μg /mL . Τα κύτταρα διεγείρονται χρησιμοποιώντας NIR φως λέιζερ με διαφορετική δύναμη για 15 λεπτά. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν στις 24 ώρες μετά την θεραπεία φωτός. αποτελεσματικότητα RNAi προσδιορίστηκε με ανοσοστύπωμα (Α) και δοκιμασία ΜΤΤ (Β). Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα και το αποτέλεσμα ενός αντιπροσωπευτικού πειράματος φαίνεται. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των δειγμάτων με παρόμοια ισχύ laser (* P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01).

Η

Για να επιβεβαιώσει εάν όλες οι συνθήκες είναι άριστες, το πείραμα siRNA επέμβαση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση UCPs και πολύπλοκο /siRNA-ϋΜΝΡΕ UCPs. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 9, σχεδόν καμία μείωση στη σουρβιβίνη πρωτεΐνη βρέθηκε στο κενό ομάδα ελέγχου μετά από διέγερση με ή χωρίς NIR light.Howeve, την αποτελεσματικότητα παρεμβολή του UCPs /siRNA-ϋΜΝΡΕ ήταν υψηλό μετά από διέγερση με φως NIR. Επιπλέον, η UCPs επηρεάζεται επίσης έκφραση της survivin σε κάποιο βαθμό, η οποία μπορεί να οφείλεται σε διάφορους παράγοντες που σχετίζονται με λέιζερ και νανοσωματίδια.

UCPs /siRNA-ϋΜΝΡΕ προστέθηκε σε MB49 κύτταρα σε συγκέντρωση UCPs των 100 μg /μL. Τα κύτταρα διεγέρθηκαν χρησιμοποιώντας φως λέιζερ NIR (100 mW) για 15 λεπτά σε 12 ώρες μετά την επώαση. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν στις 24 ώρες μετά την θεραπεία φωτός. αποτελεσματικότητα RNAi προσδιορίστηκε με ανοσοστύπωμα (Α). Τα επίπεδα της πρωτεΐνης survivin σε σχέση με εκείνες του ακτίνης με ή χωρίς NIR επαγόμενη διέγερση απεικονίζεται. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα και το αποτέλεσμα ενός αντιπροσωπευτικού πειράματος φαίνεται. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των υποδεικνύεται δείγματα (* P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01)

Η

Συζήτηση

Γονιδιακή ρύθμιση είναι σημαντική στα συστήματα διαβίωσης, επειδή τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων παίζουν σημαντικό. ρόλους σε λειτουργίες γονίδιο. Μέθοδοι για τον έλεγχο της γονιδιακής έκφρασης (άνω ή προς τα κάτω ρύθμιση) επανάσταση στο χώρο της αναπτυξιακής βιολογίας και της γονιδιακής θεραπείας. Η πρόσφατη ανάπτυξη της photocontrollable γονιδιακής έκφρασης και πολλά υποσχόμενο για αυξημένη χωροχρονικών έλεγχο διαμόρφωση της γονιδιακής έκφρασης. Στην τεχνική αυτή, μεταγραφικοί ενεργοποιητές /πλασμίδιο για την έκφραση του γονιδίου ή siRNAs για RNAi σε κλωβούς με φωτοευαίσθητα μόρια που τους καθιστούν προσωρινά μη λειτουργικό. Αυτή η διαδικασία, γνωστή ως photocaging, μπορεί να γίνει με διάφορους τρόπους, ο πιο κοινός των οποίων τροποποιεί επιλεγμένα ζεύγη βάσεων ή χημικών δεσμών στο μόριο εγκλωβισμού. Κατά την ακτινοβόληση με υπεριώδες φως, η τροποποίηση έχει καταστραφεί, με τον τρόπο αυτό εκ νέου ενεργοποίηση των νουκλεϊκών οξέων για να επανακτήσει τη λειτουργία τους [15], [16], [17]. Με τον τρόπο αυτό, μπορούν να επιτευχθούν πολύ υψηλές χωρικές και χρονικές έλεγχο μοτίβα γονιδιακής έκφρασης. Ωστόσο, οι περισσότερες από τις τρέχουσες φώτο-συστήματα είναι κατάλληλα μόνο για

in vitro

εφαρμογές επειδή το υπεριώδες φως, το οποίο είναι πολύ επιβλαβής, είναι απαραίτητη για τη διαδικασία uncaging. Υπεριώδες φως παρουσιάζει επίσης κακή βάθος διείσδυσης ιστού, γι ‘αυτό είναι απαράδεκτο για

in vivo

και κλινική χρήση. Επιπλέον, αν και η χρήση του siRNA για RNAi δείχνει μεγάλο δυναμικό για θεραπεία, siRNA εύκολα αποικοδομείται από RNase στον ορό του αίματος και ως εκ τούτου ακατάλληλες για

in vivo

χρήση. siRNA νουκλεοτίδια είναι σχετικά μικρή και σύντομη, ακόμη και μετά από χημική τροποποίηση να ενισχυθεί η σταθερότητα του siRNA. Αυτά τα νουκλεοτίδια μπορεί να αποβάλλεται μέσω του ουροποιητικού συστήματος μετά απορρόφηση στο αίμα. siRNA χρειάζεται επίσης να ξεπεραστούν εμπόδια ενδοθηλιακά να φθάσουν τα κύτταρα στόχους σε διαφορετικούς οργανισμούς. Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη ενός συστήματος για την αποτελεσματική και ασφαλή παράδοση των siRNA στα κύτταρα είναι εξαιρετικά σημαντικό. Μέχρι σήμερα, τα συστήματα διανομής για το siRNA έχουν συμπεριλάβει nonvirus- και βασίζεται σε ιό συστημάτων απελευθέρωσης? Το πρώτο περιλαμβάνει λιποσώματα, τα νανοσωματίδια, κατιονικά πολυμερή, μικκύλια και άλλα συστήματα που βασίζονται σε αυτές τις μορφές. Δεδομένου ότι τα συστήματα διανομής που βασίζεται σε ιό παρουσιάζουν κάποιες παρενέργειες, συμπεριλαμβανομένων πιθανών ανοσογονικότητα και ογκογένεσης με γονιδιακή θεραπεία, αυτά είναι ακατάλληλα για παράδοση siRNA. Ως εκ τούτου, προς το παρόν, τα συστήματα χορήγησης nonvirus-based για siRNA διερευνώνται. Σε αυτή τη μελέτη, NaYF

4: 25% Yb, 0,3% Tm NIR-to-UV UCPs χρησιμοποιήθηκαν ως φορείς του κλουβιά siRNA. NIR το φως, το οποίο χρησιμοποιήθηκε για να διεγείρει UCPs, μπορεί να διαπεράσει βιολογικούς ιστούς περισσότερο από το ορατό ή υπεριώδες φως, επιτρέποντας έτσι τη χρήση των UCPs ως φορείς σε βαθιά ιστούς

ομάδες προστασίας Φωτοασταθή μπορούν να χωριστούν σε δύο είδη:. Η μη ειδική ομάδα εγκλωβισμού περιλαμβάνει τυχαία εγκλωβισμού του φωσφορικού σκελετού siRNA [18], ενώ η άλλη ομάδα περιλαμβάνει ειδικές μπλοκάρισμα της 5′-φωσφορικής των siRNAs [19]. Οι μη ειδικές ομάδες είναι πιο σταθερές από τις συγκεκριμένες ομάδες. Επιπλέον, οι μη ειδικές ομάδες είναι εύκολο να συντεθούν με χημικές ή βιοχημικές μεθόδους, μειώνοντας έτσι το κόστος της παραγωγής σε κλουβιά siRNA. Σε αυτή τη μελέτη, siRNA ήταν σε κλουβιά χρησιμοποιώντας ϋΜΝΡΕ. ΫΜΝΡΕ ανήκει στην ομάδα εγκλωβισμού 2-NB και τα παράγωγά της είναι τα πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη και καλά χαρακτηρίζεται εγκλωβισμό των μορίων [20]. Το φάσμα NIR-to-UV UCPs δείχνει μία κορυφή εκπομπής στα 350 nm, η οποία συμπίπτει καλά με το μήκος κύματος που απαιτείται για την εκκλωβίζω ϋΜΝΡΕ. Επιπλέον, NIR φως απορροφάται μόνο ασθενώς από βιολογικούς ιστούς, η οποία εξασφαλίζει μέγιστη NIR απορρόφησης φωτός του UCPs και αυξάνει την ευαισθησία της μεθόδου.

Για να επαληθευτεί η βέλτιστη χρονικό σημείο της NIR διέγερσης στα κύτταρα, η κυτταρική πρόσληψη του UCPs ανιχνεύθηκε με μικροσκοπία φθορισμού και ICP-AES. Η ποσότητα UCPs στα κύτταρα αυξήθηκαν αρχικά με το χρόνο, αλλά μειώθηκε μετά από 24 ώρες μετά τον εμβολιασμό. Αυτό δείχνει ότι η πρώιμο στάδιο επώασης με UCPs είναι κρίσιμη. Λαμβάνοντας υπόψη τη βιωσιμότητα των κυττάρων, επιλέξαμε 12 ώρες μετά την επώαση των UCPs για NIR επαγόμενη διέγερση. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων μας τα επόμενα επιβεβαίωσαν ότι αυτή τη φορά το σημείο είναι ιδανικό για να επιτευχθεί υψηλή παρεμβολή RNA. Αν και NIR φως είναι λιγότερο κυτταροτοξική από το υπεριώδες φως, χρήση υψηλής ισχύος λέιζερ και για μεγάλο χρονικό διάστημα μπορεί να προκαλέσει διέγερση σημαντική κυτταροτοξικότητα και χαμηλότερη απόδοση RNAi. Ως εκ τούτου, μόνο 15 λεπτά χρόνου διέγερσης χρησιμοποιήθηκε και η ισχύς του λέιζερ ορίστηκε στα 100 mW. Επιπλέον, δεδομένου ότι UCPs επάγουν βλάβη στα κύτταρα σε υψηλές συγκεντρώσεις, η συγκέντρωση του UCPs ορίστηκε σε 200 μg /mL. Η υψηλή απόδοση RNAi που παρατηρήθηκαν στη μελέτη επικύρωσε την καταλληλότητα αυτών των παραμέτρων για τα πειράματά μας.

Συμπεράσματα

Εν κατακλείδι, η μελέτη αυτή αποδεικνύει ότι NIR-to-UV UCPs μπορεί να χρησιμεύσει ως οχήματα παράδοσης και ενεργοποιητές του κλουβί νουκλεϊκών οξέων. Η ακτινοβόληση του UCPs σε κύτταρα με αναβιβάζονται υπεριώδες φως που εκπέμπεται από NIR οδήγησε uncaging των φορτωμένων μόρια, καθιστώντας τα έτσι πλήρως λειτουργικά σε κύτταρα-ξενιστές. Εκτός εμφανίζουν καλή διείσδυση φωτός σε ιστούς για μια σε βάθος φωτοενεργοποίηση, NIR φως που προκαλείται από διέγερση που απαιτούνται για τη διαδικασία upconversion NIR-to-UV προκάλεσε ελάχιστη φωτογήρανσης να βιολογικά δείγματα. Οι εγγενείς ιδιότητες φθορισμού αυτών των νανοσωματιδίων να ενεργοποιήσετε την εκπομπή που οδήγησε στην απελευθέρωση των κλουβί siRNA και διευκόλυνση της γονιδιακής παρέμβασης. Έτσι, UCPs μπορεί να παρέχει μια πλατφόρμα για εφαρμογές που αφορούν το τηλεχειριστήριο της RNAi και γονιδιακή θεραπεία του καρκίνου. Επιπλέον, τα ευρήματά μας αποδεικνύουν τη χρησιμότητα της πολύχρωμα upconversion φωταύγεια UCPs ως ένα ευέλικτο και ισχυρό εργαλείο για προηγμένες εφαρμογές στην απεικόνιση, biodetection, και τη γονιδιακή θεραπεία.