Αφηρημένο

Πρόσφατα διαπιστώσαμε ότι

ATP5J

ήταν υπερ-εκφράζεται σε δείγματα ιστών από ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου. Ωστόσο, η κλινική σημασία και η λειτουργία της υπερ-έκφραση του

ATP5J

σε αυτούς τους ασθενείς παραμένει ασαφής. Ερευνήσαμε τα θέματα αυτά στην παρούσα μελέτη. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η έκφραση του

ATP5J

ήταν σημαντικά υψηλότερη σε ορθοκολικό καρκινικό ιστό από ότι σε γειτονικό ιστό, και ήταν επίσης σημαντικά υψηλότερη σε μεταστατικούς λεμφαδένες σε σχέση με το πρωτογενές καρκινικό ιστό (

P

& lt? 0.05). Παρατηρήθηκε μία συσχέτιση μεταξύ του

εντοπίστηκε ATP5J

έκφρασης και του όγκου της διαφοροποίησης, αλλά καμία συσχέτιση με το φύλο, την ηλικία, το στάδιο Τ, μετάσταση στους λεμφαδένες, ή την κατάσταση επιβίωσης. Κάτω ρύθμιση του

ATP5J

έκφραση εξασθένησε την ικανότητα της κυτταρικής μετανάστευσης και αύξησε την ευαισθησία σε 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) σε κύτταρα της κυτταρικής γραμμής DLD1. Αντίστροφα, πάνω ρύθμιση του

ATP5J

έκφραση ενισχυμένη κυτταρική μετανάστευση και μειώθηκαν 5-Fu ευαισθησία, γεγονός που υποδηλώνει ότι η λειτουργία του ATP5J σε καρκίνο του παχέος εντέρου μπορεί να περιλαμβάνει μετανάστευση των κυττάρων και την ευαισθησία 5-FU.

Citation : Zhu Η, Chen L, Zhou W, Huang Ζ, Χου J, Dai S, et al. (2013) υπερέκφραση του

ATP5J

Γονίδιο σχετίζεται με την κυτταρική μετανάστευση και 5-φθοριοουρακίλη ευαισθησία στον καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 8 (10): e76846. doi: 10.1371 /journal.pone.0076846

Επιμέλεια: Jun Li, η Sun Yat-sen University Medical School, Κίνα

Ελήφθη: 18 Φεβρουαρίου, 2013? Αποδεκτές: 31 Αυγούστου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 4 Οκτωβρίου 2013

Copyright: © 2013 Zhu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (30700970 και 81272681), τα Θεμελιώδη Κονδυλίων Έρευνας για τις Κεντρικές πανεπιστήμια και πρόγραμμα για τις καινοτόμες Research Team στην επαρχία Zhejiang (2010R50046). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι η δεύτερη πιο κοινή μορφή καρκίνου στις Ηνωμένες Πολιτείες και άλλες ανεπτυγμένες χώρες [1,2], και η συχνότητα του αυξάνεται χρόνο με το χρόνο στις αναπτυσσόμενες χώρες [3,4]. Όπως γνωρίζουμε, καρκινογένεση και την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου περιλαμβάνει μία σειρά από πολύπλοκες διαδικασίες εκείνες περιλαμβάνουν πολλαπλά γονίδια και τα βήματα. Παρά το γεγονός ότι ένα αυξανόμενο σώμα γονιδίων έχουν αναφερθεί στην βιβλιογραφία [5-7], η έρευνα για νέα γονίδια που θα μπορούσαν να σχετίζονται με την καρκινογένεση, την ανάπτυξη, τη διάγνωση ή τη θεραπεία του ορθοκολικού καρκίνου συνεχίζεται. Ως εκ τούτου, ψάξαμε τη βάση δεδομένων Sage και επιβεβαίωσε τους υποψηφίους ενδιαφέρον γονίδιο με αντίστροφη αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης μεταγραφής (RT-PCR). Τελικά, εντοπίσαμε ένα γονίδιο,

ATP5J

, που ήταν υπερ-εκφράζεται στο ορθοκολικού καρκίνου.

Ένα συστατικό του F

0, ATP5J είναι μια πρωτεΐνη που βρίσκεται στα μιτοχόνδρια που είναι ένα λιπίδιο-διαλυτά μέρος της συνθετάσης ΑΤΡ [8]. Ο πρόδρομος του ATP5J αποτελείται από 108 αμινοξέα και θα απογυμνωμένη από 32 αμινοξέα [9]. Το προϊόν που περιέχει τα υπολειμματικά 76 αμινοξέα διατηρείται στα μιτοχόνδρια για την μεταφορά ενέργειας [9]. Παραδοσιακά, ATP5J έχει σκεφτεί να ανακτήσει την ανταλλαγή μεταξύ ανόργανου φωσφόρου και ΑΤΡ, καθώς και τη δραστηριότητα της ΑΤΡάσης που αναστέλλεται από ολιγομυκίνη [10]. Πρόσφατες έρευνες, όμως, έχει δείξει ότι ATP5J εκτενώς κατανεμημένα στην επιφάνεια των αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων [11,12]. Ως εκ τούτου, μπορεί επίσης να εκκρίνεται εντός του αίματος και διανεμηθεί σε συνδυασμό με την β υπομονάδα της συνθετάσης ΑΤΡ που βρίσκεται στην επιφάνεια των αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων. Στη συνέχεια, η δραστηριότητα της φωσφολιπάσης Α2 μπορεί να ανασταλεί από την ενεργοποίηση του σχετικού μονοπατιού σηματοδότησης, η οποία θα ακολουθείται από την αναστολή της σύνθεσης της προσταγλανδίνης που προάγει αγγειοσυστολή [12]. Recenetly, ορισμένες λογοτεχνίες έχουν δείξει ότι

ATP5J

γονίδιο υπερεκφράζεται σε μια σειρά από καρκίνους συμπεριλαμβανομένου του καρκινώματος νεφρικών κυττάρων και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [13,14]. Ωστόσο, η λειτουργία του υπερ-εκφράζεται

ATP5J

σε καρκίνους ακόμα δεν έχει τεκμηριωθεί.

Σύμφωνα με την εισαγωγή του ATLAS ανθρώπινη πρωτεΐνη (https://www.proteinatlas.org/ENSG00000154723 /κανονικό), ATP5J πρωτεΐνη μπορεί να εκφράζεται σε πολλούς κανονικούς ιστούς ή όργανα, συμπεριλαμβανομένων του παχέος εντέρου και του ορθού. προκαταρκτικά στοιχεία μας επιβεβαίωσε επίσης το φαινόμενο αυτό. Το πιο σημαντικό, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι το

ATP5J

ήταν υπερ-εκφράζεται στο καρκίνο του παχέος εντέρου σε σύγκριση με το φυσιολογικό ιστό. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθεί η κλινική σημασία και η λειτουργία του υπερ-έκφραση του

ATP5J

σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το

ATP5J

ήταν υπερ-εκφράζεται σε δείγματα ιστών από ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου και ότι υπήρχε ένας συσχετισμός μεταξύ

ATP5J

έκφρασης και του όγκου διαφοροποίηση. Επιπλέον, η υπερέκφραση του

ATP5J

ενισχυμένη κυτταρική μετανάστευση και επαγόμενη αντίσταση σε 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) στις ορθοκολικό καρκίνο κύτταρα.

Υλικά και Μέθοδοι

Συλλογή των δειγμάτων φρέσκου ιστού

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από το νοσοκομείο Sir Run Run Shaw και το Πανεπιστήμιο της Επιτροπής Δεοντολογίας Zhejiang (NO.20100823). Φρέσκα δείγματα καρκινικού ιστού ελήφθησαν απευθείας από τα δείγματα της λειτουργίας των 72 διαδοχικών ασθενών που είχαν υποβληθεί σε χειρουργική εκτομές για την πρωτοβάθμια σποραδικές παχέος αδενοκαρκινώματα στο Τμήμα παχέος Χειρουργικής, Sir Run Run Shaw Νοσοκομείο, Hangzhou, Zhejiang, Κίνα, από τον Σεπτέμβριο του 2010 και Μάρτιος 2011 . Γραπτή συγκατάθεση για τη συλλογή ιστού λήφθηκε από όλους τους ασθενείς πριν από χειρουργικές επεμβάσεις τους. Κανένας από αυτούς τους ασθενείς είχε οποιοδήποτε προεγχειρητική χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία. Οι παρακείμενους ιστούς συλλέχθηκαν από περισσότερα από 5 εκατοστά μακριά από το καρκινικό ιστό.

Ασθενείς και κλινικά δεδομένα συλλογής

παραφίνη τομές των δειγμάτων από συνολικά 79 ασθενείς με ανέπαφο κλινικά δεδομένα που είχαν διαγνωστεί με καρκίνο του παχέος εντέρου μεταξύ Ιουλίου 2006 και Ιουνίου 2007 και ώρα νοσοκομείο μας συλλέχθηκαν για ανοσοϊστοχημική χρώση. Ο μέσος χρόνος παρακολούθησης των ασθενών αυτών ήταν 52,6 μήνες και το συνολικό ποσοστό επιβίωσης ήταν 73,4% κατά την τελευταία παρακολούθηση. Μεταξύ αυτών των 79 περιπτώσεων, καρκινικό ιστό και τη σχετική κανονικά γειτονικά ζεύγη ιστού μελετήθηκαν σε 51 περιπτώσεις, και δείγματα ιστού από μεταστατικούς λεμφαδένες μελετήθηκαν σε 26 περιπτώσεις. Όλα τα τμήματα ήταν προετοιμασμένοι για ανοσοϊστοχημεία σε διαφάνειες που χρησιμοποιήθηκαν για τη σύγκριση

ATP5J

έκφρασης μεταξύ των διαφορετικών ιστών.

Κύτταρα και κυτταρική καλλιέργεια

Ανθρώπινο παχύ έντερο καρκινικές κυτταρικές σειρές DLD1, RKO, SW620, SW480, και Colo320 αγοράστηκαν από το Ινστιτούτο Cell Research στη Σαγκάη της Κίνας. Η κανονική ανθρώπινη κυτταρική σειρά ινοβλαστών (NHFB) ελήφθη από το Παγκόσμιο Bioresource Κέντρο-American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ) συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) θερμο-απενεργοποιημένο βόειο εμβρυϊκό ορό (FBS), 1% γλουταμίνη, και 1 χ αντιβιοτικό-αντιμυκητιασικό μίγμα (Invitrogen, Beijing Office, Beijing , Κίνα). Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή που περιέχει 5% CO

2 και θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την ανάλυση RT-PCR. Επιπλέον, DLD1 καθώς και κύτταρα SW620 θα χρησιμοποιηθεί στη συνέχεια για μια σειρά άλλων πειραμάτων.

Αντίστροφη μεταγραφή PCR

Τα φρέσκα δείγματα ιστού των 100 μg ομογενοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μύλο με υγρό άζωτο που ακολουθείται από λύση με αντιδραστήριο ΤΡΙΖΟΙ (Invitrogen Γραφείο Πεκίνο, Πεκίνο, Κίνα). Καλλιεργημένα κύτταρα που αναφέρθηκαν ως ανωτέρω ήταν άμεσα λύθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο TRIZOL μετά τη θεραπεία. RNA εκχυλίστηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ένα μικρογραμμάριο RNA από κάθε δείγμα μεταγραφεί αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας τυχαία εξαμερή ως εκκινητές ανάστροφης μεταγραφής (Applied Biosystems Shanghai Office, Σαγκάη, Κίνα). Στη συνέχεια, η χαρακτηριστική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) για την

ATP5J

γονίδιο διεξήχθη. Το ανθρώπινο

GAPDH

γονίδιο χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος για ομαλοποίηση της ποσότητας mRNA. Οι αλληλουχίες των εκκινητών ήταν ως εξής: 5′-TCAGCCGTCTCAGTCCATTT-3 ‘και 5′-CCAAACATTTGCTTGAGCTT-3’ για το

ATP5J

? 5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ‘και 5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 »για

GAPDH

.

Η ανοσοϊστοχημική χρώση

Η ανοσοχρώση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ MaxVision (Maixin Βίοι, Fuzhou , Κίνα). Εν συντομία, 4-μm πάχους τομές κόπηκαν από, τμήματα ιστού ενσωματωμένα σε παραφίνη σταθεροποιημένα με φορμαλίνη, τοποθετημένα σε πολυλυσίνη επικαλυμμένα διαφάνειες, αποκηρωμένα σε ξυλόλιο, επανυδατώθηκαν και μέσω διαβαθμισμένης σειράς διαλυμάτων αιθανόλης. Μετά αποπαραφίνωση οι καλυπτρίδες σε επεξεργασία με υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% σε διάλυμα μεθανόλης για 10 λεπτά για την απόσβεση της ενδογενούς ενεργότητας υπεροξειδάσης, θεραπεία τότε αντιγόνου ανάκτηση διεξήχθη στους 121 ° C (αυτόκλειστο) για 5 λεπτά σε 10 mM ρυθμιστικό κιτρικού νατρίου (ρΗ 7.4) . Η μη ειδική δέστρες μπλοκαρίστηκαν με κατεργασία διαφάνειες με 10% φυσιολογικό ορό κατσίκας για 10 λεπτά. Στη συνέχεια, τα πλακίδια επωάστηκαν με το αντίσωμα ATP5J (Cell Applications, San Diego, CA, αραίωση 1: 8000) επί μία νύκτα στους 4 ° C. Στη συνέχεια, τα πλακίδια επωάστηκαν με μία σταγόνα αντιδραστηρίου MaxVision για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η ανάπτυξη χρώματος πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας 0,05% διαμινοβενζιδίνη και 0,03% υπεροξείδιο του υδρογόνου σε 50 mM Tris-HCl, ρΗ 7,6, επί 5 λεπτά. Τέλος, τα πλακίδια με αιματοξυλίνη 1% Meyer. Ως αρνητικός έλεγχος, τομές ιστού υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με φυσιολογικό ορό αντί για ATP5J αντισώματος.

Αξιολόγηση της χρώσης

Όλες οι τομές βαθμολογήθηκαν τυφλά υπό μικροσκόπιο φωτός. Κυττάρων με σαφή δομή και καφέ-κίτρινους κόκκους που ήταν υψηλότερο από το φόντο θεωρήθηκαν θετικά? Αλλιώς, τα κύτταρα θεωρείται αρνητική. Για κάθε διαφάνεια, εξετάστηκαν 5-10 πεδία υψηλής μεγέθυνσης (× 400). Στη συνέχεια, τα πλακίδια βαθμολογήθηκαν σύμφωνα με το ποσοστό των θετικών κυττάρων: 0 (& lt? 5%), 1 (5-25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%), ή 4 (76- 100%). Ταυτόχρονα, τα πλακίδια βαθμολογήθηκαν σύμφωνα με την ένταση χρώσης: 1 (yellowy), 2 (καφέ-κίτρινο), ή 3 (καφέ) [15]. Το τελικό αποτέλεσμα υπολογίστηκε ως το άθροισμα αυτών των δύο βαθμολογιών.

Western ανάλυση κηλίδος

Τα κύτταρα πλύθηκαν με ψυχρό PBS και υποβλήθηκαν σε λύση σε ρυθμιστικό λύσης Laemmli του. Ίσες ποσότητες υλικού λύσεως διαχωρίστηκαν με χρήση ηλεκτροφόρησης 10% δωδεκυλοθειϊκού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) και μετά μεταφέρθηκαν σε Hybond ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL) μεμβράνες (Amersham Bioscience, England). Οι μεμβράνες στη συνέχεια δεσμεύτηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα PBS που περιείχε 5% γάλα χαμηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά και 0,05% Tween-20 για 1 ώρα ή όλη τη νύκτα στους 4 ° C, πλύθηκαν τρεις φορές με PBS που περιέχει 0.05% Tween-20 (PBST), και επωάστηκαν με αντίσωμα ATP5J για τουλάχιστον 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από πλύση με PBST και πάλι, οι μεμβράνες επωάστηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση και εμφανίσθηκε με ένα κιτ ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (ECL κιτ, Amersham Bioscience, England). Κουνελιού αντίσωμα αντι-ανθρώπινο ATP5J αγοράστηκε από την Cell Applications. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Κατασκευή του πλασμιδίου που εκφράζει

ATP5J

Η

Ένα πλασμίδιο pOTB7 που περιέχει το

ATP5J

σειρά αγοράστηκε από Invitrogen (κλώνος ID 3357779). Η

ATP5J

αλληλουχία κλωνοποιήθηκε σε ρ △ E1sp1A πλασμίδιο χρησιμοποιώντας EcoRI /XhoI ένζυμα. Στη συνέχεια υποβλήθηκε σε περαιτέρω πέψη και κλωνοποιήθηκε σε ένα πλασμίδιο pcDNA3.1 (+) χρησιμοποιώντας ένζυμα BamHI /HindⅢ για να ληφθεί ένα νέο πλασμίδιο ονομάζεται pcDNA3.1 (+) /ATP5J. Μετά την έκφραση

ATP5J

επιβεβαιώθηκε, το νέο αυτό πλασμίδιο χρησιμοποιήθηκε για το επόμενο μέρος της μελέτης.

τηλέφωνα επιμόλυνση και σταθερή αποικία επιλογή

Για την επιμόλυνση, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων σε πυκνότητα 1×10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο και αφέθηκαν να αναπτυχθούν όλη τη νύκτα σε 90-95% συρροή. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα μορφομετατράπηκαν με το μίγμα του 0,8 μg ATP5J shRNA πλασμίδιο (ΟηΟεηε, USA), pcDNA3.1 (+) /ATP5J πλασμίδιο, ή αρνητικό πλασμίδιο ελέγχου (ΟηΟεηε, USA) συν 2 μΙ Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) σε 100 μΙ μέσου χωρίς ορό σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για την παραγωγή σταθερώς επιμολυσμένων κυττάρων μετά από επιμόλυνση με το αντίστοιχο πλασμίδιο, 10 μg /ml πουρομυκίνης (Roche, Mannheim, Germany) προστέθηκε σε 48 ώρες στο μέσο (DMEM + 15% FBS). Τα κύτταρα αφέθηκαν σε επιλεκτικό μέσο για 2 εβδομάδες? μετά από αυτό το χρονικό διάστημα που τρυψινοποιήθηκαν και επανακαλλιεργήθηκαν σε επιλεκτικό μέσο για πολλαπλασιασμό.

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

Κυτταρική βιωσιμότητα προσδιορίσθηκε με τη χρήση μίας ανιχνεύσεως ΜΤΤ (3- (4,5 διμεθυλθειαζολ-2-υλο) -2 , 5 διφαινυλοτετραζολίου? Sangon, Σαγκάη, Κίνα). Εν συντομία, τα κύτταρα (5×10

3 ανά φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων για παρατήρηση σε μια σειρά από χρονικά σημεία. Στη συνέχεια, 100 μΙ του διαλύματος ΜΤΤ (10 mg /ml) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο, και η επώαση συνεχίστηκε για 4 ώρες πριν απομακρύνθηκε το μέσο. Στη συνέχεια, 100 μΐ διμεθυλοσουλφοξειδίου (DMSO) εφαρμόστηκε σε κάθε φρεάτιο για άλλα 10 λεπτά. Τέλος, η αξία των OD

570nm προσδιορίστηκε? Αυτή η τιμή αντιπροσωπεύει τη βιωσιμότητα των κυττάρων. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τετραπλούν και επαναλήφθηκε τουλάχιστον δύο φορές.

Κυττάρων κλωνογονική δοκιμασία

1.000 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 10 cm με κανονικό μέσο καλλιέργειας σε έναν επωαστήρα που περιέχει 5% CO

2 στους 37 ° C για 14 ημέρες. Μεμονωμένες αποικίες (& gt? 50 κύτταρα ανά αποικία) σταθεροποιήθηκαν και βάφτηκαν με ένα διάλυμα που περιέχει 0,25% χρωστική κρυσταλλικού ιώδους και 20% αιθανόλη για 20 λεπτά. Οι αποικίες μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας Optimas λογισμικό (Media Cybernetics LP, Silver Spring, MD, USA). Κάθε πείραμα έγινε εις τριπλούν και επαναλήφθηκε δύο φορές.

Η κυτταρομετρία ροής

δοκιμασία

Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και πλύθηκαν μία φορά με ψυχρό PBS. Στη συνέχεια, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με ψυχρή 70% όλη τη νύκτα αιθανόλη στους 4 ° C. Τριάντα λεπτά πριν δοκιμάστηκαν, ιωδιούχο προπίδιο χρώση (ΡΙ) πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16-18]. Η κυτταρομετρία ροής αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν στο Εργαστήριο πυρήνα στο Sir Run Run Shaw νοσοκομείο.

επούλωση της πληγής δοκιμασία

Η μετανάστευση των κυττάρων μελετήθηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία επούλωση της πληγής μηδέν. Τα κύτταρα (5×10

5 ανά φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν για 24 ώρες. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μg /ml μιτομυκίνη C (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) για 3 ώρες, πλύθηκαν με PBS, μετά απλά τραυματίες με ένα ρύγχος πιπέτας. Φρέσκο ​​πλήρες μέσο προστέθηκε και τα κύτταρα αφέθηκαν να κλείσει το τραύμα για 48 ώρες ή λιγότερο. Οι φωτογραφίες του στην ίδια θέση του τραύματος ελήφθησαν σε αντίστοιχα χρονικά σημεία. Το πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν.

Η μετανάστευση των κυττάρων δοκιμασία

Τα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν και επανεναιωρήθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιέχει 1% FBS σε πυκνότητα 1×10

6 κύτταρα /ml. Συνολικά, 100 μΙ του κυτταρικού εναιωρήματος επιστρώθηκαν σε 24 φρεατίων Transwell (Costar, Corning, ΝΥ). ΫΜΕΜ (600 μλ) που περιέχει 10% FBS τοποθετήθηκε στον κάτω θάλαμο. Μετά από επώαση για 24 ώρες, τα κύτταρα που παραμένουν στον ανώτερο θάλαμο απομακρύνθηκαν προσεκτικά χρησιμοποιώντας ένα μάκτρο βάμβακος, και η μεμβράνη αποκόπηκε χρησιμοποιώντας ένα μαχαίρι λειτουργίας. Η πλευρά που βλέπει προς το κατώτερο θάλαμο χρωματίστηκε με 0,05% χρωστική κρυσταλλικού ιώδους, και τα συνδεδεμένα κύτταρα μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές.

Στατιστική ανάλυση

Συσχέτιση μεταξύ

ATP5J

έκφρασης και κλινικά χαρακτηριστικά αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας την ανάλυση συσχέτισης, και οι διαφορές μεταξύ των ομάδων εκτιμήθηκαν χρησιμοποιώντας το Wilcoxon ταιριάζουν ζεύγη δοκιμή ή με ANOVA χρησιμοποιώντας το λογισμικό SPSS15.0 (SPSS Inc., Chicago, USA).

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

ATP5J

ήταν υπερ-εκφράζεται σε κλινική του παχέος καρκινικούς ιστούς

Στη βάση δεδομένων Sage (http:. //cgap.nci.nih.gov/SAGE/AnatomicViewer), ψάξαμε για μια σειρά υποψηφίων γονιδίων αυτών είχαν εκφράζονται διαφορικά σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Αρκετά ενδιαφέροντα γονίδια εντοπίστηκαν, συμπεριλαμβανομένων τετρασπανίνη ΤΜ4-C, oligophrenin 1, ATP5J, διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη Α33 πρόδρομος, DHRS9, απαμινάση κυτιδίνης, ουρογουανυλίνη, και φωσφατάση διπλής ειδικότητας 1. Ωστόσο, πρωταρχικός μας τα αποτελέσματα από την RT-PCR έδειξε ότι μόνο ουρογουανυλίνη ήταν μειωθούν και ότι

ATP5J

ήταν υπερ-εκφράζεται σε καρκίνο του παχέως εντέρου (Σχήμα 1Α). Τα άλλα γονίδια ήταν αμετάβλητα ή μη ανιχνεύσιμα στο πείραμά μας (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επειδή η έκφραση της ουρογουανυλίνης και τη λειτουργία του στον καρκίνο του παχέος εντέρου έχει αποσαφηνιστεί σε προηγούμενη έκθεση [19], αλλά όχι για το

ATP5J

γονίδιο, ο τελευταίος επιλέχθηκε ως το μοναδικό στόχο στη μελέτη μας.

(Α) αποτελέσματα RT-PCR για την em> ATP5J

και

ουρογουανυλίνη

γονίδια. (Β) Ανοσοϊστοχημική χρώση για τα αποτελέσματα παρακείμενο ιστό και καρκινικό ιστό. (C) Ανοσοϊστοχημική χρώση για τα αποτελέσματα παρακείμενο ιστό, καρκινικό ιστό, και μεταστατικό λεμφαδένα ιστού.

Η

Για να επιβεβαιωθεί η έκφραση

ATP5J

σε καρκίνο του παχέος εντέρου, αναλύσαμε περαιτέρω την έκφραση της

ATP5J

mRNA με RT-PCR σε φρέσκο ​​καρκινικούς ιστούς και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών από τους 72 διαδοχικούς ασθενείς (Πίνακας 1). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι θετικές ποσοστά των RT-PCR για

ATP5J

σε ιστούς από ασθενείς με καρκίνο του παχέος έφθασε περίπου 54,17%, η οποία ήταν παρόμοια μεταξύ καρκίνου του παχέος εντέρου και του καρκίνου του ορθού. Ωστόσο, η έκφραση του

ATP5J

ήταν σημαντικά υψηλότερη σε ορθοκολικό καρκινικό ιστό σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό μεταξύ των PCR-θετικούς ασθενείς (Πίνακας 1,

P

& lt? 0,01). ανοσοϊστοχημική χρώση μας αποτελέσματα από τις τομές παραφίνης από άλλους 51 ασθενείς που αναφέρονται στο

Ασθενείς και κλινικά δεδομένα συλλογή

τμήμα έδειξε ένα παρόμοιο αποτέλεσμα, αλλά με υψηλότερη θετική αναλογία (Σχήμα 1 Β και Πίνακας 1,

P

& lt? 0,05). Περαιτέρω ανοσοχρώσης αποτελέσματα έδειξαν επίσης ότι το

ATP5J

έκφραση ήταν σημαντικά υψηλότερη σε μεταστατικούς λεμφαδένες σε σχέση με το πρωτογενές καρκινικό ιστό (Σχήμα 1 C και Πίνακα 2,

P

& lt? 0,05).

Κατάσταση ATP5J

υπόθεση αριθ.

Θετικές περιπτώσεις

διανομής Θετική περιπτώσεις »από την έκφραση ATP5J στον όγκο εναντίον παρακείμενο ιστό

P

αξία

Απλή αναζήτηση Τ

* & gt? Ένα

*

T = A

Τ & lt? Μια

Η mRNA από PCR7239 (54,2%) 32 (82,1%) 6 (15,4%) 1 (2,6%) & lt? 0.01Protein από τον IM

* 5149 (96,1%) 32 (65,3%) 15 (30,6%) 2 (4,1%) & lt? 0.05Table 1. Κατάσταση της έκφρασης ATP5J στην παχέος όγκου και των παρακείμενων ιστών

* Τ:. όγκου? Α: δίπλα? . IM: ανοσοϊστοχημική χρώση CSV CSV Κατεβάστε ATP5J στο ΕΚΑΤ

*

Υπόθεση

ΕΚΑΤ & gt? T

ΕΚΑΤ = T

ΕΚΑΤ & lt? T

P

αξίας

Positive25 (96,2%) 12 (46,2%) 8 (30,8%) 5 (19,2%) & lt? 0.05Negative1 (3,8%) – 1 (3,8%) Πίνακας 2. Κατάσταση της έκφρασης ATP5J σε όγκο παχέος εντέρου και μεταστατικό λέμφου κόμβοι

* ΕΚΑΤ:. μεταστατικούς λεμφαδένες CSV Λήψη CSV

Συσχέτιση μεταξύ υπερέκφραση του

ATP5J

και κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου

Για να αναλύσει τη σχέση μεταξύ της πάνω -έκφραση ATP5J και κλινικών παθολογικών χαρακτηριστικών των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου, τομές παραφίνης από 79 ασθενείς, όπως αναφέρεται στο τμήμα του

ασθενείς και κλινικών συλλογή δεδομένων

, συλλέχθηκαν. Η ανοσοϊστοχημική χρώση πραγματοποιήθηκε σε αυτές τις διαφάνειες και οι βαθμολογίες υπολογίστηκαν όπως αναφέρεται ανωτέρω. Σύμφωνα με αυτά τα αποτελέσματα,

ATP5J

έκφραση θα μπορούσε να διαιρεθεί περαιτέρω σε δύο τάξεις: αδύναμο (≤4) και ισχυρής (& gt? 4). Στη συνέχεια, η ανάλυση συσχέτισης έγινε με τη χρήση του λογισμικού SPSS? Τα αποτελέσματα φαίνονται στον Πίνακα 3. Μεταξύ των εισηγμένων κλινικά χαρακτηριστικά, μόνο βαθμό διαφοροποίησης είχε μια συσχέτιση με

ATP5J

έκφρασης. Το φύλο, την ηλικία, το Τ στάδιο, μετάσταση στους λεμφαδένες, καθώς και κατάσταση επιβίωσης δεν έδειξε συσχέτιση με το

ATP5J

έκφρασης. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το

ATP5J

έκφραση σε καλά διαφοροποιημένοι όγκοι ήταν ασθενέστερη από ότι σε ελάχιστα ή μετρίως διαφοροποιημένων όγκων (

P

& lt? 0,05).

Μεταβλητό

Υπόθεση

Ασθενής

Ισχυρή

P Vaule

GenderFemale358270.281Male441529Age & gt? 65 yr286220.271≤65511734T stageT1,2196130.789T3,4601743DifferentiationWell4116250.045Poor /moderate38731Histologic LNM

* Absent3612240.408Present431132Survival statusSurvival5818400.538Died21516Table 3. Συσχέτιση έκφραση ATP5J και patients’clinical χαρακτηριστικά

* LNM:. λεμφαδενικές μεταστάσεις CSV Λήψη CSV

Ανίχνευση

ATP5J

έκφραση σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου

ήταν δύσκολο να διευκρινιστεί η υποκείμενη λειτουργία της ATP5J στον καρκίνο του παχέος εντέρου εξαρτάται μόνο από τις κλινικές αναλύσεις. Πιο μοριακές βιολογικές μελέτες που απαιτούνται για το σκοπό αυτό. Ως εκ τούτου, η προσοχή μας μετατοπίστηκε από ασθενείς με καρκίνο του παχέος σε κυτταρικές γραμμές. Για να κατανοήσουμε την έκφραση του

ATP5J

σε καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές, πέντε ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές συλλέχθηκαν (DLD1, RKO, SW620, SW480, και Colo320), και η κανονική ανθρώπινων ινοβλαστών (NHFB) χρησιμοποιήθηκε ως κανονική ελέγχου των κυττάρων. Πρώτον, συλλέξαμε το προϊόν mRNA από αυτές τις κυτταρικές σειρές και εκτελέστηκε RT-PCR όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το mRNA ATP5J υπερ-εκφράζεται σε όλα κυτταρικών σειρών καρκίνου του παχέος εντέρου, αλλά όχι σε NHFB (Σχήμα 2Α). Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε κηλίδωση Western επί των δειγμάτων πρωτεΐνης αυτών των κυτταρικών σειρών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ένα παρόμοιο φαινόμενο. ATP5J πρωτεΐνη υπερ-εκφράζεται σε καρκίνο του παχέος εντέρου τέσσερα κυτταρικές γραμμές (εκτός RKO) σε σύγκριση με NHFB (Σχήμα 2Β). Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, επιλέξαμε κυρίως κύτταρα DLD1 για το επόμενο μέρος της μελέτης μας? DLD1 έδειξε μέτριο βαθμό

ATP5J

έκφρασης, που ήταν βολικό για την παρατήρηση της κάτω ρύθμιση, καθώς και η προς τα πάνω ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης στην ίδια κυτταρική σειρά χρησιμοποιώντας μοριακές τεχνικές.

(Α) RT-PCR αποτέλεσμα για ATP5J mRNA. (Β) κηλίδωση Western αποτελέσματα για ATP5J πρωτεΐνης.

Η

κάτω ρύθμιση του

ATP5J

έκφραση εξασθενημένο μετανάστευση των κυττάρων και την αύξηση της 5-FU ευαισθησία στα κύτταρα DLD1

Πρώτα , είμαστε κάτω-ρυθμίζονται

ATP5J

έκφραση στα κύτταρα DLD1 μέσω σταθερής επιμόλυνσης με ένα πλασμίδιο που εκφράζει shRNA ATP5J στόχευση. Μετά την επιλογή αποικιών, κηλίδωση Western Διεξήχθη (Σχήμα 3Α). Η έκφραση του ATP5J ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω δραματικά στον κλώνο 4 και οριακά στον κλώνο 9. Επιλέξαμε κλώνο 4 για περαιτέρω μελέτη και ορίζονται ως ATP5J shRNA /4. Εν τω μεταξύ, ο κλώνος 2 από τον έλεγχο shRNA χρησιμοποιήθηκε ως φορέα ελέγχου (φορέα), και άγριου τύπου DLD1 (WT) χρησιμοποιήθηκε σαν μια παρωδία του ελέγχου.

(Α) αποτέλεσμα κηλίδα Western για ATP5J πρωτεΐνης σε διαφορετικούς κλώνους της DLD1 κύτταρο μετά από σταθερή επιμόλυνση με το ίδιο πλασμίδιο ATP5J shRNA. (Β) δοκιμασία επούλωση της πληγής για WT, διάνυσμα, και ATP5J shRNA /4 κύτταρα DLD1. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν ένα από τα τρία παρόμοια πειράματα (αρχική μεγέθυνση: x100). (Γ) Η μετανάστευση των WT, Vector, και ATP5J shRNA /4 DLD1 κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα 24-Transwell. Οι εικόνες του μετανάστευσαν κύτταρα πάρθηκαν 24 ώρες μετά την σπορά (αρχική μεγέθυνση: x100). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν ένα από τα τρία παρόμοια πειράματα. (D) Ποσοτικός αναλύσεις τριών προσδιορισμών κυτταρικής μετανάστευσης. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέσες τιμές ± SD. *

P

& lt? 0,05? αναλογίες (Ε) Τα αποπτωτικά του WT, Vector, και ATP5J shRNA /4 κύτταρα DLD1 μετά από θεραπεία με 50 μmol /L 5-FU για 3 ημέρες. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν ένα από τα δύο παρόμοια πειράματα. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέσες τιμές ± SD. *

P

& lt?. 0.05

Η

Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας ΜΤΤ, κυτταρικό κύκλο με κυτταρομετρία ροής, ή το σχηματισμό του κλώνου με κλωνογόνο προσδιορισμό δεν αποκάλυψε διαφορές στην επιβίωση των κυττάρων μεταξύ των WT, Vector , και ATP5J shRNA /4 ομάδες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, τα δεδομένα από την ανάλυση επούλωση της πληγής έδειξαν ότι κύτταρα στην /4 ομάδα ATP5J shRNA πήρε & gt? 48 ώρες για να κλείσει μια πληγή μηδέν, ενώ τα κύτταρα στις ομάδες WT και Vector πήρε & lt? 48 ώρες για να θεραπεύσει μια πληγή παρόμοιου μεγέθους (Σχήμα 3Β). Αυτό το αποτέλεσμα προτείνει ότι κάτω ρύθμιση

ATP5J

εξασθενημένο η ικανότητα της κυτταρικής μετανάστευσης σε κύτταρα DLD1. Για να ποσοτικοποιηθεί η επίδραση του

ATP5J

κάτω ρύθμιση για τη μετανάστευση των κυττάρων, μια περαιτέρω δοκιμασία μετανάστευσης εκτελέστηκε. Τα αποτελέσματα αυτής της δοκιμασίας επιπλέον έδειξε ότι ο αριθμός των μετανάστευσαν κυττάρων στην /4 ομάδα ATP5J shRNA ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση τόσο με τις ομάδες WT και Vector (Σχήμα 3C και 3D,

P

& lt? 0,05).

Επιπλέον, θέλαμε να αξιολογηθεί η απόκριση των καρκινικών κυττάρων στη θεραπεία κατά του καρκίνου μετά άλλαξε η έκφραση ATP5J. Για το σκοπό αυτό, επιλέξαμε 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) για την επόμενη μελέτη, επειδή είναι ένα συχνά χρησιμοποιούμενο αντι-μεταβολίτης χημειοθεραπευτικό φάρμακο σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η αποπτωτική αναλογία ATP5J shRNA /4 ομάδα ήταν υψηλότερη από εκείνη των δύο ομάδων WT και Vector μετά από θεραπεία με 50 μmol /L 5-FU για 3 ημέρες (Σχήμα 3Ε, Ρ & lt? 0,05). Αυτό το αποτέλεσμα πρότεινε ότι κάτω ρύθμιση του

ATP5J

αύξησε την ευαισθησία των κυττάρων DLD1 με 5-FU.

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η λειτουργία της ATP5J στην άλλη κυτταρική γραμμή, γκρέμισε το

ATP5J

έκφραση στα κύτταρα SW620 χρησιμοποιώντας την ίδια πλασμίδιο όπως αναφέρθηκε παραπάνω. Μετά την επιλογή αποικιών, εντοπίσαμε ένα κλώνο με τον οποίο

ATP5J

έκφραση δραματικά κάτω-ρυθμίζονται? εμείς το ονόμασε ATP5J shRNA /3 (Εικόνα 4Α). Τα αποτελέσματα τόσο από την ανίχνευση της απόπτωσης και προσδιορισμούς κυτταρικής βιωσιμότητας πρότεινε ότι η ATP5J shRNA /3 ομάδα που προέρχεται από κύτταρα SW620 ήταν περισσότερο ευαίσθητα σε 5-FU σε σύγκριση με τις ομάδες WT και Vector μετά από θεραπεία με 50 μmol /L 5-FU για 3 ημέρες (Σχήμα 4Β και 4C,

P

& lt? 0,05). Αυτό το αποτέλεσμα είναι συνεπές με τα προηγούμενα δεδομένα μας από κύτταρα DLD1 και περαιτέρω επικυρώνει τη λειτουργία του ATP5J σε καρκινικά κύτταρα κόλον.

(Α) αποτέλεσμα κηλίδα Western για ATP5J πρωτεΐνης σε διαφορετικούς κλώνους SW620 κυττάρων μετά σταθερή επιμόλυνση με το ίδιο ATP5J shRNA πλασμίδιο. (Β) αναλογία αποπτωτικά του WT, Vector, και ATP5J shRNA /3 SW620 κυττάρων μετά την κατεργασία με 50 μmol /L 5-FU για 3 ημέρες. δοκιμασίες (C) Cell βιωσιμότητα του WT, Vector, και ATP5J shRNA /3 SW620 κυττάρων μετά την κατεργασία με 50 μmol /L 5-FU για 3 ημέρες. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν ένα από τα δύο παρόμοια πειράματα. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέσες τιμές ± SD. *

P

& lt?. 0.05

Η

Up-ρύθμιση του

ATP5J

έκφραση ενισχυμένη μετανάστευση των κυττάρων και μειωμένη 5-Fu ευαισθησία στα κύτταρα DLD1

στη συνέχεια, θελήσαμε να επιβεβαιώσει αποτέλεσμα μας χρησιμοποιώντας μια αντίθετη κατάσταση στην οποία em

ATP5J

έκφρασης περαιτέρω up-ρυθμίζεται. Για την επίτευξη αυτού του στόχου, η pcDNA3.1 (+) /πλασμιδίου ATP5J ήταν σταθερά επιμολυσμένα σε κύτταρα DLD1. Μετά την επιλογή αποικιών, κηλίδωση Western Διεξήχθη (Σχήμα 5Α). Η έκφραση ATP5J ήταν ρυθμισμένη δραματικά στους κλώνους 2, 3, και 4. Εμείς επιλέξαμε τυχαία κλώνοι 2 και 4 για περαιτέρω μελέτη και τους ορίζονται ως ATP5J /Α2 και ATP5J /Α4, αντίστοιχα. Εν τω μεταξύ, ο κλώνος 7 από το πλασμίδιο ελέγχου χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φορέα (Vector) και τα κύτταρα άγριου τύπου DLD1 (WT) χρησιμοποιήθηκαν ως εικονικές ελέγχου.

(Α) αποτέλεσμα κηλίδα Western για ATP5J πρωτεΐνης σε DLD1 κύτταρα μετά από σταθερή επιμόλυνση με pcDNA3.1 (+) /ATP5J πλασμίδιο. (Β) δοκιμασία επούλωση της πληγής για WT, διάνυσμα, ATP5J /Α2, και τα κύτταρα ATP5J /A4. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν ένα από τα τρία παρόμοια πειράματα (αρχική μεγέθυνση: x100). (Γ) Μεταναστεύσεις του WT, Vector, ATP5J /Α2, και τα κύτταρα ATP5J /A4 προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα 24-Transwell. Οι εικόνες του μετανάστευσαν κύτταρα πάρθηκαν 24 ώρες μετά την σπορά (αρχική μεγέθυνση: x100). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν ένα από τα τρία παρόμοια πειράματα. (Δ) Ποσοτική ανάλυση τριών προσδιορισμών κυτταρικής μετανάστευσης. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέσες τιμές ± SD. *

P

& lt? 0,05. αναλογίες (Ε) Τα αποπτωτικά κύτταρα WT, Vector, ATP5J /Α2, και ATP5J /A4 μετά από θεραπεία με 50 μmol /L 5-FU για 3 ημέρες. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν ένα από τα δύο παρόμοια πειράματα. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέσο ± SD και *

P

& lt?. 0.05

Η

Τα στοιχεία που αφορούν την επιβίωση των κυττάρων, του κυτταρικού κύκλου, και το σχηματισμό του κλώνου απέδωσε αποτελέσματα παρόμοια με αυτά που παρουσιάζονται παραπάνω. Δεν παρατηρήθηκε διαφορά μεταξύ των ομάδων WT, Vector, ATP5J /Α2, και ATP5J /A4 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ο προσδιορισμός επούλωση της πληγής έδειξαν ότι τα κύτταρα στα ATP5J /Α2 και ATP5J /A4 ομάδες πήραν & lt? 44 ώρες για να κλείσει μια πληγή μηδέν, ενώ τα κύτταρα στις ομάδες WT και Vector πήρε & gt? 44 ώρες για να θεραπεύσει μια πληγή παρόμοιου μεγέθους ( Σχήμα 5Β). Αυτό το αποτέλεσμα πρότεινε ότι πάνω ρύθμιση του

ATP5J

ενισχυμένη κυτταρική μετανάστευση σε κύτταρα DLD1. Μία περαιτέρω δοκιμασία κυτταρικής-μετανάστευσης έδειξε ότι ο αριθμός των κυττάρων που μετανάστευσαν στις ομάδες ATP5J /Α2 και ATP5J /Α4 ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με εκείνες τις ομάδες WT και Vector (Σχήμα 5C και 5D,

P

& lt? 0.05). Εν τω μεταξύ, μετά από θεραπεία με 50 μmol /L 5-FU για 3 ημέρες, τα αποπτωτικά αναλογίες των ομάδων ATP5J /Α2 και ATP5J /A4 ήταν σημαντικά χαμηλότερες από εκείνες των ομάδων WT και Vector (Σχήμα 5Ε, Ρ & lt? 0,05), υποδεικνύοντας ότι πάνω ρύθμιση του

ATP5J

που προκαλείται από κύτταρα DLD1 να αντισταθεί σε 5-FU.

Συζήτηση

η μελέτη μας ερεύνησε την κατάσταση του

ATP5J

έκφρασης ασθενείς με ορθοκολικό καρκίνο, και τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το

ATP5J

ήταν υπερ-εκφράζεται σε αυτούς τους ασθενείς. Το αποτέλεσμα αυτό ήταν αντίθετη προς αυτήν στη βάση δεδομένων Sage. Θα μπορούσε να οφείλεται στη διαφορά του μεγέθους του δείγματος, καθώς και προκατάληψη επιλογή του δείγματος. Σύμφωνα με τα στοιχεία μας, υπήρξαν αρκετές διαφορετικές συνθήκες έκφρασης ATP5J σε καρκίνο του παχέος εντέρου, ένας από αυτούς ήταν μειωμένη. Επιπλέον, το μέγεθος του δείγματος που χρησιμοποιείται από βάση δεδομένων ήταν πολύ μικρή. Έτσι θα μπορούσε να γίνει κατανοητό ότι είχαμε ένα διαφορετικό συμπέρασμα σχετικά με την έκφραση ATP5J σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας ελήφθησαν τόσο σε mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης και θα πρέπει, ως εκ τούτου, να είναι πειστική.

Περαιτέρω αποτελέσματα έδειξαν ότι ο βαθμός διαφοροποίησης συσχετίστηκε με

ATP5J

έκφρασης. Σύμφωνα με τις δημοσιευμένες λογοτεχνίες, η διαφοροποίηση του όγκου ήταν ένας παράγοντας πρόγνωση για τους ασθενείς με καρκίνους του παχέος [20,21]. Με βάση αυτό,

ATP5J

έκφραση θα μπορούσε να συσχετιστεί με την κατάσταση επιβίωσης, ωστόσο τα δεδομένα μας δεν έδειξαν αυτή την συσχέτιση. Πρόσθετες, τα αποτελέσματά μας έδειξαν επίσης ότι

ATP5J

έκφραση ήταν υψηλότερη σε μεταστατικούς λεμφαδένες σε σύγκριση με τα αντίστοιχα πρωτογενή καρκινικό ιστό, αλλά δεν είχε καμία συσχέτιση με μετάσταση στους λεμφαδένες. Η διαφορά θα μπορούσε να προκληθεί από πάρα πολλά ανεξέλεγκτους παράγοντες κλινικώς, και όχι από τις συνθήκες στις μοριακές βιολογικές μελέτες, οι οποίες ελέγχονται ακριβώς. Θα μπορούσε να προκληθεί και από το μικρό μέγεθος των περιελάμβανε ασθενείς και χρειάζονται μια έρευνα με μεγάλα δείγματα. Ανεξάρτητα από αυτή τη διαφωνία, την περαιτέρω τα αποτελέσματά μας perspicuously έδειξαν ότι κάτω ρύθμιση του

ATP5J

έκφραση εξασθενημένο μετανάστευση των κυττάρων και την αύξηση της 5-FU ευαισθησία στα κύτταρα DLD1.