Abstract

Εισαγωγή

Γενετικές aberrancies εντός του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) μονοπάτι σχετίζονται με θεραπευτικά αποτελέσματα των αναστολέων κινάσης EGFR-τυροσίνη (ΤΚΙδ) σε προχωρημένο καρκίνο μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). Ωστόσο, η επίδραση της χημειοθεραπείας σε EGFR που σχετίζονται με γονίδια μεταβολές δεν έχει οριστεί σε NSCLC. Η μελέτη μας έχει ως στόχο να διερευνήσει τις επιπτώσεις της εισαγωγική χημειοθεραπεία (Neoadj-χημειοθεραπείες) σε μεταλλάξεις ενεργοποίηση του EGFR και των συναφών γονιδίων αντοχής που σχετίζονται με EGFR-TKIs.

Ασθενείς και Μέθοδοι

Συμφωνήθηκε δείγματα όγκου λήφθηκαν αναδρομικά από 66 ασθενείς με ΜΜΚΠ (στάδια IIb-IIIb) που αντιστοιχεί σε προ και μετά Neoadj-χημειοθεραπείες. μεταλλάξεις του EGFR ανιχνεύτηκαν με μετουσίωση υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (DHPLC) και επιβεβαιώνεται από τεχνολογία Amplification Refractory Mutation Σύστημα (ARMS), οι μεταλλάξεις KRAS, η μετάλλαξη Τ790Μ και ενίσχυση c-ΜΕΤ ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης-περιορισμός Θραύσμα πολυμορφισμού μήκους (PCR-RFLP ), τα χέρια, και σε πραγματικό χρόνο PCR, αντίστοιχα.

Αποτελέσματα

Πριν Neoadj-χημειοθεραπείες, οι μεταλλάξεις του EGFR ταυτοποιήθηκαν σε 33,3% (22/66) των ασθενών με NSCLC. Μόνο 18,2% (12/66) των ασθενών που μεταφέρονται μεταλλάξεις του EGFR μετά Neoadj-χημειοθεραπείες (p = 0,013). Η μέση μέγιστη τιμή του EGFR 19 μεταλλάξεις εξόνιο μειώθηκε μη σημαντικά μετά Neoadj-χημειοθεραπείες. KRAS ρυθμός μετάλλαξης μειώθηκε από 4,6% (3/66) έως 3,0% (2/66) με Neoadj-χημειοθεραπείες. Παρά το γεγονός ότι το συνολικό ποσοστό των ασθενών που εμφανίζουν c-MET ενισχύσεις (6,1% [4/66]) δεν άλλαξε με Neoadj-χημειοθεραπείες, δύο ασθενείς μεταπηδά από αρνητική σε θετική ενίσχυση γ-ΜΕΤ, και δύο ασθενείς αντιστρέφονται αυτές τις αλλαγές μετά Neoadj- χημειοθεραπείες. T790M μεταλλάξεις ήταν απούσα από όλα τα δείγματα.

Συμπέρασμα

εισαγωγική χημειοθεραπεία τείνει να μειώσει τη συχνότητα μετάλλαξης της μετάλλαξης του EGFR και κατάντη γονίδια, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ανάλυση δειγμάτων σε πραγματικό χρόνο για την γενετική aberrancies μέσα σε μονοπάτια EGFR έχουν σημαντική αξία για να οριοθετηθούν ειδικές ομάδες ασθενών και να διευκολυνθεί η εξατομικευμένη θεραπεία

Παράθεση:. Wang S, ένα Τ, Duan J, Zhang L, Wu M, Zhou Q, et al. (2013) Μεταβολές στο EGFR και σχετιζόμενα γονίδια παρακάτω Νεο-επικουρική χημειοθεραπεία σε Κινέζους ασθενείς με μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 8 (3): e51021. doi: 10.1371 /journal.pone.0051021

Συντάκτης: John D. Minna, Πολυτεχνείου της Texas Southwestern Medical Center στο Ντάλας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 11, Αύγ 2012? Αποδεκτές: 29 Οκτωβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 8 Μαρτίου 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Υποστηρίζεται από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών Διακεκριμένος νέους επιστήμονες (81025012), Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών Γενική Πρόγραμμα (81172235), το Ίδρυμα Capital Ανάπτυξης (2007-1023), το Πεκίνο Συστήματα Υγείας Ακαδημαϊκό Leader (22/2/2011) και το Project Επιστήμη και Τεχνολογία του Πεκίνου (Z090507017709015), Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών Ίδρυμα China Youth Science (81101726). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

επιδερμικού αυξητικού παράγοντα αναστολείς κινάσης υποδοχέα τυροσίνης (EGFR-ΤΚΙδ) αντιπροσωπεύουν επαναστατική εξατομικευμένες θεραπείες για NSCLC ασθενή, ένα υποσύνολο που φέρουν συγκεκριμένες μεταλλάξεις του EGFR που είναι προγνωστικά της ευνοϊκή κλινική απόκριση σε EGFR-TKIs [1] – [3]. Σωματικές μεταλλάξεις στα εξώνια 19 ή 21 αποτελούν περίπου το 90% όλων των μεταλλάξεων του EGFR ενεργοποίησης, και ο προσδιορισμός αυτών των μεταλλάξεων μπορεί να εφαρμοστεί για την επιλογή της θεραπείας του καρκίνου του πνεύμονα. Αρκετές κλινικές μελέτες φάσης ΙΙΙ έχουν επιβεβαιώσει ότι η παρουσία των μεταλλάξεων του EGFR-ενεργοποίηση είναι προγνωστική του ευνοϊκού αποτελέσματος με EGFR-TKIs (δηλαδή, gefitinib και erlotinib), σε σύγκριση με διπλή χημειοθεραπεία, ως θεραπεία πρώτης γραμμής για NSCLC, και στις δύο ασιατικές και του Καυκάσου ασθενών με προχωρημένο NSCLC [4] – [7]. Όλα τα παραπάνω δείχνουν ότι η κατάσταση μετάλλαξης του EGFR διέπει την έκβαση EGFR-TKIs, ανεξάρτητα από την εθνικότητα [8].

Το αποτέλεσμα της θεραπείας με EGFR-ΤΚΙ καθορίζεται όχι μόνο από την παρουσία του EGFR ευαισθητοποίηση μεταλλάξεων, αλλά και από ανθεκτικά EGFR ή παράκαμψης της ή προς τα κάτω που σχετίζονται με γονίδια aberrances. Συγκεκριμένα, EGFR Τ790Μ μετάλλαξη, ταυτοποιήθηκε μηχανισμός τόσο αποκτήθηκαν και αντίσταση πρωτογενούς EGFR-ΤΚΙ [9], και ενίσχυση του ογκογονιδίου c-ΜΕΤ [10] περιγράφονται ως επίκτητη αντοχή, ενώ KRAS μετάλλαξη σχετίζεται με την πρωτογενή αντοχή [11] . Αυτά τα ευρήματα έχουν οδηγήσει σε κλινικές δοκιμές εφαρμόζοντας νέες θεραπείες που στοχεύουν σε μηχανισμούς ανθεκτικότητας καθώς και ελπιδοφόρα προκαταρκτικά αποτελέσματα σε εργαστηριακές και κλινικές μελέτες.

Η ανίχνευση μεταλλάξεων EGFR σήμερα συνιστάται για την επιλογή των ασθενών που θα μπορούσαν να ωφεληθούν από πρώτης γραμμής θεραπεία με EGFR-ΤΚΙ. Ωστόσο, είναι άγνωστο εάν η κατάσταση της μετάλλαξης του EGFR και κατάντη αντίσταση που σχετίζονται με γονίδια aberrances (

δηλ.

, Μεταλλάξεις KRAS, Τ790Μ, ή ενίσχυση γ-ΜΕΤ) είναι συνεπείς στις προ και μετά τη χημειοθεραπεία δείγματα. Ως εκ τούτου, είναι απαραίτητο να αξιολογηθούν οι επιπτώσεις της χημειοθεραπείας σε μοριακό προφίλ του όγκου. Chin et al ανέφεραν ότι πριν από την έκθεση σε παράγοντες πλατίνας μπορεί να μειώσει το όφελος από μετέπειτα επεξεργασία με EGFR-ΤΚΙ για erlotinib ευαίσθητο κύτταρο NSCLC EGFR-μεταλλαγμένο μέσω της οδού επιβίωση φωσφατιδυλινοσιτόλης 3-κινάση /ΑΚΤ [12]. πρόσφατη μελέτη μας διερευνώνται επίδραση της χημειοθεραπείας σε EGFR μεταλλαχθεί συχνότητες με τη χρήση δύο ομάδες συμπεριλαμβανομένου του DNA στο πλάσμα σε προχωρημένο NSCLC και τα δείγματα πριν και μετά την εγχείρηση ιστού σε ασθενείς με τοπικά προχωρημένο NSCLC, και να διερευνηθεί ο πιθανός μηχανισμός της που σχετίζονται με τη χημειοθεραπεία αλλοίωση της μετάλλαξης του EGFR. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η χημειοθεραπεία μπορεί να μειώσει E

συχνότητες GFR

μετάλλαξη σε ασθενείς με NSCLC, ένα πιθανό αποτέλεσμα μιας προνομιακής απόκρισης υπο-κλώνων με μεταλλάξεις του EGFR σε όγκους με πληθυσμούς ετερογενείς κυττάρου όγκου [13]. Για τις γνώσεις μας, λίγες μελέτες έχουν αξιολογήσει κλινικών δειγμάτων για την επίδραση της χημειοθεραπείας επί των σχετικών αντίσταση EGFR-ΤΚΙ γονιδίων.

Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι η χημειοθεραπεία μπορεί να επηρεάσει την συχνότητα μετάλλαξης του EGFR μετάλλαξης και κατάντη γονιδίων, έτσι θα μπορούσε επίσης να προκαλέσει επιπτώσεις σχετικά με το ρόλο των γονιδίων αυτών που εργάζονται ως εκλεκτικοί δείκτες σε εξατομικευμένη θεραπεία του EGFR-ΤΚΙ. Ως συνέχεια των πρόφαση μελέτη μας, η παρούσα μελέτη διερεύνησε την επίδραση της χημειοθεραπείας τόσο EGFR μεταλλάξεις ενεργοποίησης, ιδιαίτερα, αξιολόγησε μεταβολές στην ποσότητα μετάλλαξη στο εξόνιο EGFR 19 και κλινική σημασία, και διερευνήθηκε περαιτέρω πιθανών μεταβολών των γονιδίων ανθεκτικότητας που σχετίζονται με EGFR-ΤΚΙ , όπως Τ790Μ, KRAS και γ-ΜΕΤ aberrances χρησιμοποιώντας την ίδια ομάδα αντίστοιχα δείγματα καρκινικών ιστών του πριν και μετά την Neoadj-χημειοθεραπείες από το στάδιο ασθενείς IIb-IIIb NSCLC.

ασθενείς και Μέθοδοι

ασθενής

οι ασθενείς που συμμετείχαν σε αυτή την αναδρομική μελέτη ήταν ηλικίας άνω των 18 ετών και παρουσίασαν στάδιο ΙΙΒ-ΙΙΙΒ NSCLC με διαστάσεις μετρήσιμη νόσο πριν από την επέμβαση. Επιλέξιμες ασθενείς είχαν επίσης μια κατάσταση ECOG απόδοσης (Eastern Cooperative Oncology Group) του 0-2 και είχε λάβει 2-4 κύκλους Neoadj-χημειοθεραπείες χωρίς προηγούμενη χημειοθεραπεία ή βιολογική /ανοσολογική θεραπεία. Όλοι οι ασθενείς με την προϋπόθεση αντίστοιχα δείγματα ιστών από βιοψίες πραγματοποιήθηκε προ Neoadj-χημειοθεραπείες και από εκτομές μετά Neoadj-χημειοθεραπείες.

Εξήντα έξι ασθενείς που είχαν προβληθεί από την βάση δεδομένων μας ιδρύθηκε το 1999, συμπεριλαμβανομένων περισσότερων από 1.900 ασθενών με κλινικά δεδομένα πληρούνται τα παραπάνω κριτήρια και υποβλήθηκαν σε θεραπεία στο Πεκίνο Αντικαρκινικό Νοσοκομείο από Σεπτέμβριος 2001 – Ιούνιος 2010 (σύμφωνα με την προϋπόθεση της εγγραφής αυτή είναι μια έκταση 9 χρόνια, αλλά τα περισσότερα από τα δείγματα που συλλέχθηκαν 2005-2010). Τα διαθέσιμα σχήματα χημειοθεραπείας εμπλέκονται φάρμακα με βάση την πλατίνα (

π.χ.

, Σισπλατίνη ή η καρβοπλατίνη σε συνδυασμό με γεμσιταβίνη ή ταξάνες). Η ακτινολογική ανταπόκριση Neoadj-χημειοθεραπείες προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το RECIST (Κριτήρια Αξιολόγησης απόκρισης σε συμπαγείς όγκους) τις κατευθυντήριες γραμμές [14]. Όλοι οι ασθενείς με την προϋπόθεση γραπτή συγκατάθεση για την ανάλυση των βιοδεικτών στην πρώτη φορά νοσηλείας τους. Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικών Δεοντολογίας του Πεκίνου Αντικαρκινικό Νοσοκομείο.

Ηθική Δήλωση

Όλοι οι ασθενείς με την προϋπόθεση γραπτή συγκατάθεση για ανάλυση βιοδείκτη. Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικών Ηθικής στο Πεκίνο Αντικαρκινικού Νοσοκομείου. Εμείς δεν διεξάγει έρευνα εκτός της χώρας διαμονής μας. Όλοι οι συμμετέχοντες παρέχουν γραπτή συγκατάθεση τους να συμμετάσχουν σε αυτή τη μελέτη. επιτροπές δεοντολογίας μας ενέκρινε την εν λόγω διαδικασία συναίνεσης. Το άτομο σε αυτό το χειρόγραφο έχει δώσει γραπτή συγκατάθεση για τη δημοσίευση αυτών των στοιχείων υπόθεση.

ΣΥΛΛΟΓΗ ΚΑΙ DNA εξόρυξη

ιστούς όγκων ελήφθησαν πριν και μετά τις θεραπείες Neoadj-χημειοθεραπείες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για γενωμική απομόνωση DNA χρησιμοποιώντας EZNA FFPE DNA κιτ (Omega Biotek, USA). Για να αποφύγετε την επιρροή του Neoadj-χημειο-επαγόμενη νέκρωση των ιστών στο EGFR και σχετίζονται με τα γονίδια της Εκτροπής ανιχνεύσεις, μετεγχειρητική δείγματα μακρο-αποκόπηκαν από τομές χειρουργική ιστού εγκλεισμένα σε παραφίνη για να εξασφαλιστεί ότι ελήφθησαν μόνο ιστούς όγκων. περιεχόμενα του όγκου καταγράφηκαν για κάθε δείγμα, χρησιμοποιώντας αμέσως γειτονικά τμήματα ιστού.

EGFR ανίχνευση μεταλλάξεων από τη μετουσίωση υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (DHPLC) και Amplification Refractory Mutation System (ΟΠΛΑ)

Έχουμε αναλύσει όλα τα αντίστοιχα δείγματα στην ίδια κατάσταση, ώστε να εξισωθούν οι συνθήκες ανίχνευσης. Του EGFR εξόνιο 19 διαγραφή ή εξόνιο 21 υποκατασταθεί μεταλλάξεις εντοπίστηκαν σύμφωνα με τη μέθοδο που αναφέρεται από εμάς στο παρελθόν [15].

ΟΠΛΑ, μια πιο ευαίσθητη μέθοδος, χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει εκ νέου τις υποθέσεις με αποκλίσεις μετάλλαξη του EGFR προ -. και μετά την εισαγωγική χημειοθεραπεία [13]

Μια ημι-ποσοτική ανάλυση του εξονίου 19 αφθονίας μετάλλαξη διεξήχθη με τον υπολογισμό της αναλογίας μεταξύ των υψών των κορυφών των μεταλλαγμένων (Μ) και άγριου τύπου /φυσιολογικό (W) προϊόντα (δηλαδή, Μ /W). Αυτή η ανάλυση δεν επεκτάθηκε στο εξώνιο 21, διότι η Μ και W κορυφές επικαλύπτονται σε αυτό το εξώνιο.

PCR-RFLP για μεταλλάξεις KRAS

PCR-RFLP διεξήχθη για να αναλύσει την κατάσταση μετάλλαξης του KRAS σύμφωνα με το πρότυπο πρωτόκολλα [16]. PCR εκκινητές σχεδιάστηκαν για να ενισχύσουν αλληλουχίες που περιβάλλουν τα κωδικόνια 12 και 13 στο εξόνιο 1 του KRAS? αυτά τα κωδικόνια που εμπλέκονται σε περίπου 85% των ενεργοποίησης KRAS μεταλλάξεων.

Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου για c-ΜΕΤ

ζεύγη δείγματα όγκων αναλύθηκαν για c-ΜΕΤ αριθμού αντιγράφων γονιδίου με χρήση πραγματικού χρόνου ανίχνευση PCR σύμφωνα με πρότυπα πρωτόκολλα. Ένα δείγμα του όγκου ορίστηκε ως ενίσχυση θετικά εάν αναλογία αξία της ξεπερνούσε τα εξής: μέση τιμή (Μ) + 2 × τυπική απόκλιση (SD) [17]. HCC827 (Homo sapiens (άνθρωπος) αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα, τον αριθμό ATCC CRL-2868) χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας.

Amplification Refractory Mutation Σύστημα ανίχνευσης του EGFR Τ790Μ

Amplification Refractory Mutation System (ΟΠΛΑ) τεχνολογία χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της μετάλλαξης Τ790Μ. Τα κριτήρια μέθοδο ανίχνευσης και των διακρίσεων ήταν σύμφωνα με το εργοστάσιο (Amoy Diagnostics Co., LTD).

Η στατιστική ανάλυση

Συχνότητα πινακοποίηση και συνοπτικά στατιστικά στοιχεία δόθηκαν για να χαρακτηρίσει την κατανομή των δεδομένων. δοκιμασία του McNemar εφαρμόστηκε για να συγκρίνει την αλλαγή της κατάστασης μετάλλαξης (

δηλ.

, EGFR [συμπεριλαμβανομένων T790M] μεταλλάξεις, η μετάλλαξη KRAS, και ενίσχυση γ-ΜΕΤ) πριν και μετά τη θεραπεία. δοκιμή τάση Cochran-Armitage χρησιμοποιήθηκε για να ελεγχθεί κατά πόσον η αλλαγή του καθεστώτος μετάλλαξη που σχετίζεται με την κλινική έκβαση όσον αφορά την μερική ανταπόκριση, σταθερή νόσο. Οι ενώσεις αταίριαστο κατηγορικές μεταβλητές αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το τεστ chi-square, εκτός από την ακριβή τεστ που Fisher χρησιμοποιήθηκε για μικρά μεγέθη δειγμάτων (n & lt? 5 σε κάθε κελί του πίνακα έκτακτης ανάγκης). Wilcoxon τεστ rank ποσό αυτό εφαρμόζεται σε σύγκριση το μεταλλαγμένο αφθονία του EGFR 19 εξόνιο μεταξύ πριν και μετά Neoadj-chem. Η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε στο επίπεδο του 0,05. Δύο όψεων δοκιμές πραγματοποιήθηκαν σε όλες τις ρυθμίσεις. Όλοι οι υπολογισμοί πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SAS Έκδοση 10.0 (SAS Institute, Inc., Cary, NC).

Αποτελέσματα

Τα χαρακτηριστικά των ασθενών και η μετάλλαξη του EGFR κατάσταση

Τα χαρακτηριστικά κατά την έναρξη της πληθυσμού της μελέτης παρουσιάζονται στον πίνακα 1. Οι 66 ασθενείς που συμπεριλήφθηκαν 50 άνδρες και 16 γυναίκες, με εύρος ηλικίας από 35 έως 78 ετών (μέσος όρος 60 έτη). Οι ασθενείς που συμπεριλήφθηκαν 35 (53,0%) περιπτώσεις ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα, 27 (40,9%) περιπτώσεις αδενοκαρκινώματος, και 4 περιπτώσεις αδενοχοληδωτό καρκινώματος. Όλοι οι ασθενείς έλαβαν Neoadj-χημειοθεραπείες? 63 (95,5%) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με λευκόχρυσο συν πακλιταξέλη (διάμεσος 2 κύκλοι? Εύρος 2-4 κύκλους). Με βάση το 2009 αμερικανική μεικτής επιτροπής για το σύστημα καρκίνο του πνεύμονα όγκου-node-μετάσταση σταδιοποίηση του καρκίνου, το 9 ασθενείς διαγνώσθηκαν ως στάδιο IIb, 35 ως Stage IIIA, και 22 ως Σταδίου ΙΙΙ πριν από την επέμβαση? και μετά την επέμβαση, 11 ως

pstage ΙΙα, 27 ως

pstageIIb, 23 ως

pstage IIIa, 5 ως

pstage IIIb. Με τη θεραπεία Neoadj-χημειοθεραπείες, 39, 66 ασθενείς πέτυχαν μερική ανταπόκριση (PR), 27 ασθενείς ταξινομήθηκαν ως σταθερή νόσο (SD), και κανένας δεν εμφάνισε προοδευτική ασθένεια (PD).

Η

παραλλαγή μετάλλαξης του EGFR πριν και μετά Neoadj-χημειοθεραπείες

Μεταξύ των 66 ασθενών με NSCLC, η EGFR ρυθμός μετάλλαξης προ-Neoadj-χημειοθεραπείες ήταν 33,3% (22/66), συμπεριλαμβανομένων 12 ασθενών που φέρουν μεταλλάξεις στο εξόνιο 19, 9 ασθενείς με μεταλλάξεις στο εξόνιο 21, και 1 ασθενής με μεταλλάξεις σε αμφότερες τις εξόνια. Μετα-Neoadj-Chemo, ο ρυθμός μετάλλαξης EGFR μειώθηκε σε 18,2% (12/66), συμπεριλαμβανομένων των 7 ασθενείς με μεταλλάξεις σε 19 εξόνιο και 5 με μεταλλάξεις στο εξόνιο 21 (του McNemar δοκιμή Ρ = 0,013? Σχήμα 1). Η συνοχή των μεταλλάξεων EGFR σε προ- και μετα-χημειοθεραπεία δείγματα ήταν 78,8% (52/66). Με τη θεραπεία Neoadj-χημειοθεραπείες, η κατάσταση EGFR μεταπηδά από μεταλλαγμένο σε άγριου τύπου σε 12 ασθενείς? το αντίθετο συνέβη σε 2 ασθενείς

Neoadj-χημειοθεραπείες:. Νεοεπικουρική χημειοθεραπεία? EGFR: EGFR μετάλλαξη? KRAS: KRAS μετάλλαξη? C-MET: C-MET ενίσχυση

Η

Στην προ-Neoadj-χημειοθεραπείες δείγματα, ο ρυθμός μετάλλαξης του EGFR ήταν 55,6% (15/27) στο αδενοκαρκίνωμα, το οποίο είναι υψηλότερο από ό, τι μετριέται σε ασθενείς με πλακώδες επιθήλιο καρκίνωμα (17.1% [6/35]). Ωστόσο, τα ποσοστά μετάλλαξης του EGFR σε ασθενείς που υποβλήθηκαν σε Neoadj-χημειοθεραπείες μειώθηκε στο 33,3% (9/27) στο αδενοκαρκίνωμα και το 8,57% (3/35) σε καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων, με μια μη σημαντική διαφορά (P & gt? 0,05). Οι τέσσερις ασθενείς με αδενοχοληδωτό καρκίνωμα αποτελείται πάρα πολύ μικρό από μια ομάδα για στατιστική ανάλυση (Πίνακας 1).

Αναλογία των υψών των κορυφών DHPLC σχετίζεται με μετάλλαξη του EGFR στο εξόνιο 19

Για την εκτίμηση διακυμάνσεις στην ποσότητα μετάλλαξη , οι μεταλλάξεις του EGFR στο εξόνιο 19 ήταν ημι-ποσοτικά ανιχνεύονται από 13 ασθενείς που φέρουν μεταλλάξεις σε αυτό το εξώνιο (Σχήμα 2). Η αναλογία των υψών κορυφής μεταξύ προ- και μετα-Neoadj-Chemo άλλαξε σε όλους τους ασθενείς. Μετά Neoadj-χημειοθεραπείες, εξόνιο 19 μεταλλάξεις μεταπηδά από θετικό σε αρνητικό σε 7 ασθενείς. Τα ύψη των κορυφών παρουσίασαν απότομη μείωση σε τρεις ασθενείς, ενώ αυξήθηκαν σε τρεις άλλους ασθενείς. Η μέση αναλογία Μ /W προ-Neoadj-χημειοθεραπείες ήταν 0,50? ο δείκτης υποχώρησε στο 0,24 μετά Neoadj-χημειοθεραπείες, μη σημαντική διαφορά (P = 0,078).

Η

παραλλαγή μετάλλαξης του EGFR και την αποτελεσματικότητα των Neoadj-χημειοθεραπείες

Όλοι οι ασθενείς αξιολογήθηκαν για την ανταπόκρισή τους μετά Neoadj-χημειοθεραπείες. 39 ασθενείς (59,1%) επιτεύχθηκε PR, 27 ασθενείς (40,9%) έφθασε SD, και κανένας δεν εμφάνισε PD (Πίνακας 1). Μεταξύ των 66 ασθενών, την κατάσταση EGFR 12 ασθενών άλλαξε από μετάλλαξη προς άγριου τύπου μετά την αγωγή, 2 περιπτώσεις είχε αντίστροφη μετατόπιση, 52 παρέμειναν άγριου τύπου (n = 42) ή μετάλλαξης (n = 10) προ και μετά την κατάσταση neoadj- χημειοθεραπείες. Τα ποσοστά PR σε αυτές τις υποομάδες ήταν 58,33% (7/12), 50% (1/2), και 59,6% (31/52), αντίστοιχα. Η κλινική ανταπόκριση δεν συσχετίστηκε σημαντικά με την αλλαγή της κατάστασης μετάλλαξης του EGFR (P = 0,13, Cochran-Armitage τεστ τάσης).

KRAS παραλλαγή μετάλλαξης πριν και μετά Neoadj-χημειοθεραπείες

Η KRAS ρυθμός μετάλλαξης κυμαινόταν από 4,5% (3/66) προ-Neoadj-Chemo έως 3,0% (2/66) μετά τη θεραπεία (Πίνακας 2). Η συνέπεια των μεταλλάξεων KRAS πριν και μετά τη χημειοθεραπεία ήταν 95,5% (63/66). Δύο ασθενείς διατηρούνται καταστάσεις τους μετάλλαξη KRAS μετά τη θεραπεία, ενώ ένας ασθενής με μετάλλαξη KRAS μεταβεί στα άγρια ​​κατάσταση μετά από μετα-Neoadj-χημειοθεραπείες.

Η

c-MET προ ενίσχυσης και μετά Neoadj-χημειοθεραπείες

Το συνολικό ποσοστό ενίσχυσης γ-ΜΕΤ δεν άλλαξε με τη θεραπεία Neoadj-χημειοθεραπείες (6,0% [4/66]) (Πίνακας 2). Ωστόσο, 4 από 66 ασθενείς παρουσίασαν μια αλλαγή στο καθεστώς ενίσχυσης γ-ΜΕΤ. Συγκεκριμένα, δύο περιπτώσεις μεταπηδά από την ενίσχυση αρνητικά σε -θετικό, και δύο παρουσίασαν την αντίστροφη μετάβαση. Δύο ασθενείς που εμφανίζουν c-MET ενίσχυση προεπεξεργασίας διατήρησε το καθεστώς ενίσχυσης τους μετά τη θεραπεία. Η συνοχή των προ ενίσχυσης γ-ΜΕΤ και μετα-Neoadj-χημειοθεραπείες ήταν 93,9% (62/66). Είναι ενδιαφέρον ότι, δύο ασθενείς των οποίων ο-ΜΕΤ καθεστώς ενίσχυσης αλλάξει από θετικό σε αρνητικό λαμβάνονται PR με Neoadj-χημειοθεραπείες. Οι δύο ασθενείς με γ-ΜΕΤ αλλάζει από αρνητικό σε θετικό εμφάνισε SD με Neoadj-χημειοθεραπείες.

προ κατάστασης μετάλλαξης Τ790Μ και μετα-Neoadj-χημειοθεραπείες

μεταλλάξεις Τ790Μ ήταν απούσα από όλα τα δείγματα, όπως προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας την τεχνολογία ARMS.

Συζήτηση

Προηγούμενες μελέτες δεν έχουν αξιολογηθεί κατά πόσον τα μοριακά χαρακτηριστικά των καρκινικών ιστών αλλάξετε μεταξύ της αρχικής διάγνωσης και μετά τη χημειοθεραπεία. Με βάση την πρόφαση τα αποτελέσματα της μελέτης μας [13], αποδείξαμε επίσης ότι Neoadj-χημειοθεραπείες δεν επηρεάζει μόνο την κατάσταση μετάλλαξης του EGFR, αλλά και την παρεκκλίνουσα κατάσταση μετάλλαξης του EGFR σχετίζονται κατάντη ή παράκαμψης των γονιδίων σε ασθενείς με NSCLC. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν τη χημειοθεραπεία που σχετίζονται με μοριακή ετερογένεια

μεταλλάξεις του EGFR είναι καθιερωμένη δείκτες πρόβλεψης της έκβασης στην πρώτη γραμμή θεραπείας του EGFR ΤΚΙ [4] -. [7]. Ωστόσο, έχει γίνει σαφές εάν ανιχνευθεί κατάσταση μετάλλαξης του EGFR χρησιμοποιώντας αρχικά διαγνωστικά δείγματα, επίσης, προβλέπει με ακρίβεια δεύτερης ή τρίτης γραμμής του EGFR ΤΚΙ θεραπείες. Προς το παρόν, η πλειοψηφία των Κινέζων ασθενών με προχωρημένο NSCLC υποβάλλονται σε EGFR-ΤΚΙ μόνο ως δεύτερης ή τρίτης γραμμής θεραπεία, πιθανώς λόγω της ιατρικής ασφαλιστήρια συμβόλαια. Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό να γνωρίζουμε τις επιπτώσεις της χημειοθεραπεία πρώτης γραμμής για την κατάσταση της μετάλλαξης του EGFR για να καθοδηγήσει την επιλογή της θεραπείας δεύτερης γραμμής EGFR-ΤΚΙ. Μια υψηλή επίπτωση των μεταβολών στην κατάσταση μετάλλαξης του EGFR με χημειοθεραπεία θα δικαιολογούσε μια δεύτερη βιοψία πριν την έναρξη της θεραπείας δεύτερης ή τρίτης γραμμής του EGFR ΤΚΙ.

Στη μελέτη μας, το συνολικό ποσοστό μετάλλαξης του EGFR μειώθηκε σημαντικά το μετά δείγματα ιστού Neoadj-χημειοθεραπείες σε σύγκριση με τα προ-Neoadj-χημειοθεραπείες αυτά σε ασθενείς με πρώιμο στάδιο NSCLC. Διαπιστώσαμε μια ασύμφωνα ποσοστό 18,2% (12/66), η οποία περιελάμβανε ασθενείς που μεταπηδά από EGFR με θετικό στη μετάλλαξη σε αρνητικό ως (n = 10) και το αντίστροφο (n = 2). Δεν σημαντικές διαφορές έχουν εντοπιστεί σχετικά με τη συχνότητα των μεταλλάξεων του EGFR με πρώιμη έως προχωρημένου επιπέδου σταδιοποίηση του ΜΜΚΠ [18]. Ως εκ τούτου, θεωρείται ότι Neoadj-χημειοθεραπείες που σχετίζονται με αλλαγές στη μετάλλαξη του EGFR που παρατηρήθηκε στις αρχές του σταδίου NSCLC μπορεί να είναι ανάλογη με τις αλλαγές που προκαλούνται από χημειοθεραπεία πρώτης γραμμής σε προχωρημένες περιπτώσεις NSCLC. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η κατάσταση μετάλλαξης του EGFR αξιολογήθηκε πριν από τη χημειοθεραπεία μπορεί να μην αντικατοπτρίζουν με ακρίβεια την κατάσταση της μετάλλαξης μετά τη χημειοθεραπεία, η οποία υποστηρίζει ένα «πραγματικό χρόνο» προφίλ όγκου στην εξατομικευμένη θεραπεία του NSCLC.

Οι μηχανισμοί που συμβάλλουν στην χημειοθεραπεία που σχετίζονται με αλλαγές στην κατάσταση μετάλλαξης του EGFR παραμένουν ασαφείς. Ετερογενής ενδονεοπλαστική μεταλλάξεις του EGFR και διαφορετικές ευαισθησίες των μεταλλαγμένων EGFR και κύτταρα όγκου φυσικού τύπου σε χημειοθεραπεία μπορεί να σχετίζεται με μεταβολές στην συνολική κατάσταση μετάλλαξης του EGFR μετά από χημειοθεραπεία [4], [19]. Yatabe et al [20] πρότεινε ότι, σε αδενοκαρκινώματα πνεύμονα, ετερογενείς κατανομές των μεταλλάξεων του EGFR σε όλη κύτταρα είναι εξαιρετικά σπάνιες. Ωστόσο, αρκετές άλλες μελέτες έχουν παρατηρηθεί ετερογένεια στην γονιδιακή έκφραση EGFR, ή μετάλλαξη ενίσχυση μεταξύ πρωτογενών και μεταστατικών όγκων ή μεταξύ ενδονεοπλαστική εστίες, με διαφορετικό ρυθμό ασυμφωνία [21] – [23]. Okami et al [24] ανέφεραν ότι οι ασθενείς των οποίων οι όγκοι συμπεριλαμβανομένων και των δύο EGFR-μεταλλαχθεί και -wild κύτταρα είχαν σημαντικά μικρότερη επιβίωση χωρίς εξέλιξη μήκη μετά από θεραπεία gefitinib σε σύγκριση με τους ασθενείς των οποίων οι όγκοι αποτελούνταν από μόνο EGFR-μεταλλαγμένα κύτταρα. Zhou et al [25] έδειξε ασθενείς με υψηλό introtumoral αφθονία μεταλλάξεων EGFR μπορεί να ωφεληθούν περισσότερο από αυτούς με χαμηλή αφθονία μετάλλαξης EGFR. Όλα αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η εντός του όγκου ετερογένεια του EGFR μεταλλάξεων κατάσταση μπορεί να επηρεάσει την έκβαση της θεραπείας EGFR-ΤΚΙ.

προηγούμενη μελέτη μας εντόπισε διακυμάνσεις της κατάστασης μετάλλαξης του EGFR μέσω μικροδιατομής διαφορετικές εστίες από 85 ασθενών με προχωρημένο NSCLC μετά από παρηγορητική χειρουργική επέμβαση εκτομή. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι περίπου το 30% των δειγμάτων περιείχαν κύτταρα τόσο EGFR μεταλλάξεως και αγρίου-τύπου με την αναλογία των μεταλλαγμένων κυττάρων EGFR που κυμαίνεται από 1% έως 90% [13]. Πολλαπλές προκλινικές και κλινικές δοκιμές έδειξαν ότι μεταλλάξεις του EGFR ήταν πιο ευαίσθητοι όχι μόνο για να EGFR-TKIs αλλά και σε χημειοθεραπεία, σε σύγκριση με εκείνα που φέρουν EGFR φυσικού τύπου [4], [21], [26]. Είμαστε εικάζουν ότι η χημειοθεραπεία μπορεί επιλεκτικά να σκοτώσει και να αναστέλλουν κλώνων μεταλλαγμένων εντός του όγκου, ενώ οι κλώνοι που παρουσιάζουν άγριου τύπου EGFR μπορεί να πολλαπλασιαστούν σε αφθονία μετά τη χημειοθεραπεία. Ένα τέτοιο φαινόμενο θα μπορούσε να εξηγήσει γιατί EGFR κατάσταση μετάλλαξης μετατοπίζεται από EGFR-μεταλλαγμένο προς άγριου-τύπου μετά τη χημειοθεραπεία. Ενώ πολύ χαμηλή συχνή κύτταρα μετάλλαξη (1% -5%) βρέθηκαν μόνο στα μικροδιατομή δείγματα [13], η οποία μπορεί να σχετίζεται με παραλλαγή του EGFR από τον άγριο τύπο μετάλλαξης μετά τη χημειοθεραπεία. Αυτές οι μικρές κλώνοι της μετάλλαξης του EGFR μπορεί να επιλεγεί και να πολλαπλασιαστεί μετά εκτέθηκαν σε χημειοθεραπεία.

Η ασυμφωνία της κατάστασης μετάλλαξης του EGFR μεταξύ βιοψίας και χειρουργικά δείγματα πριν και μετά Neoadj-χημειοθεραπείες, αντίστοιχα, επίσης, μπορεί να αποδοθεί σε διαφορές που προκύπτουν από τη δειγματοληψία ενδονεοπλαστική ετερογένεια. Συγκεκριμένα, τα μικρά δείγματα βιοψίας με περιορισμένη υλικά που δεν θα μπορούσαν να αντιπροσωπεύουν τα πλήρη βιολογικά χαρακτηριστικά του όγκου, και πάρα πολύ μικρό μέγεθος των μεταλλαγμένων κυττάρων μπορεί να αγνοηθεί. Ωστόσο, η παρούσα μελέτη παρατηρήθηκε υψηλότερη συχνότητα εμφάνισης aberrances γονιδίου EGFR που σχετίζονται με δείγματα βιοψίας προ-Neoadj-χημειοθεραπείες σε σύγκριση με χειρουργική εκτομή δείγματα μετα-Neoadj-χημειοθεραπείες. Αυτό υποδηλώνει ότι η ασυμφωνία της κατάστασης μετάλλαξης του EGFR που παρατηρήθηκε στα δείγματα πριν και μετά Neoadj-χημειοθεραπείες δεν προέρχονται από δειγματοληψία προκατάληψη.

Σας έδειξαν ότι η θεραπεία Neoadj-χημειοθεραπείες των ασθενών με NSCLC επηρέασε όχι μόνο EGFR κατάσταση μετάλλαξης αλλά aberrancies και σε συναφείς προς τα κάτω γονίδια, συμπεριλαμβανομένων KRAS και γ-ΜΕΤ. Ο ρυθμός μετάλλαξης του KRAS ήταν 4,6% (3/66) προ-Neoadj-χημειοθεραπείες και μειώθηκε σε 3,0% (2/66) μετά τη θεραπεία. Αν και η αναλογία ενίσχυσης ο-ΜΕΤ πριν και μετά τη Neoadj-χημειοθεραπείες δεν άλλαξε (6,1% [4/66]), 4 ασθενείς παρουσίασαν βάρδιες. Συγκεκριμένα, δύο περιπτώσεις μεταπηδά από την ενίσχυση αρνητικά σε -θετικό με Neoadj-χημειοθεραπείες, και δύο ασθενείς παρουσίασαν την αντίστροφη αλλαγή. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι υπάρχουν aberrancies γονιδίου c-MET και KRAS σε δείγματα χωρίς θεραπεία ιστό σε χαμηλές συχνότητες? Αυτό είναι συνεπές με μελέτες από Turke et al [27] και Maheswaran et al [28]. Μαζί με την παρατηρούμενη αλλαγές μετάλλαξη του EGFR, τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι η επανάληψη βιοψίες των όγκων κατά τη διάρκεια της ασθένειας του ασθενούς μπορεί να κατευθύνει καλύτερα την επιλογή του θεραπευτικού σχήματος.

Δεν μπορούμε να εξηγήσουμε πλήρως τους πιθανούς μηχανισμούς που συμβάλλουν σε αλλαγές σε αυτά με αντοχή σχετιζόμενα γονίδια κατά τη διάρκεια της χημειοθεραπείας. Αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει πρόσφατα παρόμοιες μεταβολές σε EGFR ανθεκτικά γονίδια [27] – [30]. Sequist et al [29] πραγματοποιείται μια διαμήκης ανάλυση της γενετικής και φαινοτυπικές αλλαγές σε 37 ασθενείς με erlotinib ανθεκτικά NSCLCs που φέρουν μεταλλάξεις του EGFR. Χρησιμοποιώντας σειριακή βιοψίες, οι συγγραφείς ανέφεραν ότι Τ790Μ και PIK3CA (καταλυτική, πολυπεπτίδιο άλφα φωσφοϊνοσιτιδίου-3-κινάση) μετάλλαξη χάθηκαν σε απουσία επιλεκτικής πιέσεως συνεχίζεται από αναστολείς EGFR. Αυτοί οι καρκίνοι μπορούν να γίνουν ευαίσθητα σε ένα δεύτερο γύρο της θεραπείας με αναστολείς του EGFR. Απ ‘όσο γνωρίζουμε, αυτή η μελέτη χρησιμοποίησε πρώτη επαναληπτική βιοψίες να εξεταστεί δυναμικά την αλλαγή στην γονότυπο και φαινότυπο με EGFR-ΤΚΙ και χημειοθεραπεία. Chin et al ανέφεραν ότι πριν από την έκθεση σε παράγοντες πλατίνας θα μπορούσαν να επηρεάσουν την επακόλουθη αντίδραση με την erlotinib σε ένα μοντέλο καλλιέργειας κυττάρων ενός NSCLC κυτταρική σειρά EGFR-μεταλλαγμένο erlotinib ευαίσθητη [12]. Αυτό συμβαίνει μέσω ενός επίμονα ενεργοποιημένου ΡΙ3Κ /ΑΚΤ οδού και διευκολύνεται από σισπλατίνη που προκαλείται μείωση της ΡΤΕΝ (φωσφατάση και ομόλογο tensin) λειτουργία. Οι μηχανισμοί που εμπλέκονται σε αυτή την αλλαγή χημειοθεραπεία που σχετίζονται μπορεί να είναι βαθιά, και επιγενετική μπορεί να παίζει ένα σημαντικό ρόλο. Αυτό δικαιολογεί περαιτέρω έρευνα.

Βρήκαμε ότι EGFR Τ790Μ μετάλλαξη ήταν απούσα στα δύο πριν και μετά Neoadj-χημειοθεραπείες δείγματα. Είναι σε αντίθεση με τα ευρήματα της Maheswaran et al [28] και Rosell et al [31], ο οποίος ανέφερε ότι η μετάλλαξη T790M θα μπορούσε να ανιχνευθεί σε προ-επεξεργασμένα δείγματα όγκων-βιοψία. υπάρχουν σήμερα δύο υποθέσεις για να εξηγήσουν το μηχανισμό της μετάλλαξης Τ790Μ. Η επίκτητη αντοχή υπόθεση ισχυρίζεται ότι η έκθεση σε EGFR-TKIs επάγει μία δεύτερη μετάλλαξη σημείο, με αποτέλεσμα την αλλαγή θρεονίνης-to-μεθειονίνης στη θέση 790 του EGFR. Εναλλακτικά, ο επιλεκτικός αντίσταση υπόθεση προτείνει ότι η μετάλλαξη Τ790Μ μπορεί να υπάρχουν σε ασθενείς ως μικρά κλώνους πριν από τη θεραπεία? Αυτές οι ανθεκτικοί κλώνοι μπορούν να πολλαπλασιάζονται μετά εκτίθεται στο gefitinib ή erlotinib. Ωστόσο, στη μελέτη μας, η απουσία των Τ790Μ μετάλλαξης σε τόσο πριν όσο και μετά την δείγματα Neoadj-χημειοθεραπείες έχει επιβεβαιωθεί ανεξάρτητα από Amoy Diagnostics Co., LTD. Πιθανή αιτία για την ασυνέπεια της κατάστασης Τ790Μ αναφερθεί από εμάς και Maheswaran et al [28] μπορεί να σχετίζονται με την εθνοτική διαφορά σε ορισμένα μοριακά προφίλ, τα οποία πρέπει να επικυρωθεί σε περαιτέρω μελέτες

Περιορισμοί ήταν ότι:. Τη μελέτη αυτή είναι ένα μικρό δείγματα και αναδρομική μελέτη και οι ασθενείς με ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (SQC) σε αυτή τη μελέτη αντιπροσώπευαν το 53%. Πρώην μελέτη έδειξε ο ρυθμός μετάλλαξης του SQC σε Καυκάσιους είναι όχι περισσότερο από 3,6% [32]. Ωστόσο, στην κινεζική προχωρημένο πληθυσμό NSCLC, ρυθμός μετάλλαξης SQC ασθενών ήταν πολύ υψηλότερο από εκείνο των Καυκάσιων ασθενών (12-20%) [33] – [34], η οποία ήταν σύμφωνη με τα αποτελέσματα στο κέντρο μας (17,8%) [35]. Στην παρούσα μελέτη, ο ρυθμός μετάλλαξης του πλακώδους καρκινώματος 23,5%, αυτό είναι σωστό γύρω από το επίπεδο του κινεζικού πληθυσμού.

Συμπέρασμα

Εμείς αξιολογούνται διακυμάνσεις μεταλλάξεις του EGFR (συμπεριλαμβανομένων των Τ790Μ), KRAS μεταλλάξεις και γ-ΜΕΤ ενίσχυση τόσο πριν όσο και μετά τη θεραπεία Neoadj-χημειοθεραπείες. Τα ευρήματά μας υποστήριξε ότι η χημειοθεραπεία μπορεί να επηρεάσει τα προφίλ μοριακών βιοδεικτών και έμμεσα υποδεικνύει την παρουσία της ετερογένειας των όγκων. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματα των θεραπειών για προφίλ του όγκου θα πρέπει να αξιολογούνται πριν από τη λήψη αποφάσεων σχετικά με δεύτερης ή τρίτης γραμμής θεραπεία του EGFR ΤΚΙ για τους ασθενείς με NSCLC. Η προετοιμασία του πραγματικού χρόνου προφίλ μοριακών βιοδεικτών για EGFR-TKIs προτείνεται να οριοθετηθούν ειδικές ομάδες ασθενών και να διευκολυνθεί η εξατομικευμένη θεραπεία.

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Δρ Keneng Chen και η ομάδα του, οι χειρουργοί από Τμήμα της χειρουργικής θώρακος Πεκίνου Αντικαρκινικό Νοσοκομείο & amp? Ινστιτούτο, για την παροχή μέρους των δειγμάτων για την έρευνα μας? Ο Δρ Ning Wang, ακτινολόγος από Ακτινολογικό Τμήμα του Πεκίνου Αντικαρκινικό Νοσοκομείο & amp? Ινστιτούτο, για τη συμβολή του στην αξιολόγηση απάντηση? και ο κ Guoshuang Feng, στατιστικολόγος από Κινεζικό Κέντρο Ελέγχου και Πρόληψης Νοσημάτων, για τη συμβολή του στη Στατιστική ανάλυση.