Αφηρημένο

Το φάρμακο κατά του καρκίνου Ruxolitinib είναι ένας ισχυρός αναστολέας της κινάσης Janus εγκριθεί για τη θεραπεία των μυελοδιηθητικά νεοπλασμάτων. Επιπλέον, Ruxolitinib έχει ασθενή ανασταλτική δραστικότητα έναντι μιας ομάδας άλλων κινασών, συμπεριλαμβανομένων των Src κινάσης. Δεν υπάρχει καμία δομική πληροφορία της Ruxolitinib σύνδεση με οποιαδήποτε κινάση. Στο έγγραφο αυτό, προσδιορίσαμε την κρυσταλλική δομή της περιοχής της κινάσης c-Src σε συγκρότημα Ruxolitinib σε ανάλυση 2,26 Å. C-Src περιοχή κινάσης υιοθετεί η DFG-in δραστική διαμόρφωση κατά Ruxolitinib δέσμευσης, υποδεικνύοντας Ruxolitinib είναι ένας τύπος που αναστολέα για c-Src. Ruxolitinib σχηματίζει δύο δεσμούς υδρογόνου με Met341, ένα υδατο-μεσολάβηση δεσμό υδρογόνου με Thr338, και μια σειρά από van der Waals επαφές με c-Src. Ruxolitinib ακολούθως αγκυροβολημένο στην τσέπη σύνδεσης συνδετήρα μιας προηγουμένως λυθεί δομή JAK1. Από το αποτέλεσμα σύνδεσης, Ruxolitinib δεσμεύει επίσης JAK1 ως τύπος Ι αναστολέα, με περισσότερες αλληλεπιδράσεις και ένα υψηλότερο συμπληρωματικότητα σχήμα με το θύλακα δέσμευσης συνδέτη του JAK1 σε σύγκριση με εκείνη του c-Src. Από Ruxolitinib είναι μια σχετικά μικρή αναστολέας και υπάρχει σημαντική κοιλότητα μεταξύ Ruxolitinib και την τσέπη σύνδεσης συνδετήρα c-Src, προτείνουμε να τροποποιήσετε Ruxolitinib να αναπτύξουν πιο ισχυροί αναστολείς με c-Src

Παράθεση:. Duan Υ, Chen L, Chen Υ, Fan Xg (2014) c-Src Συνδέεται με το Cancer Drug Ruxolitinib με μια ενεργή διαμόρφωση. PLoS ONE 9 (9): e106225. doi: 10.1371 /journal.pone.0106225

Επιμέλεια: Wenqing Xu, του Πανεπιστημίου της Ουάσινγκτον, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 11, 2014? Αποδεκτές: 28 Ιούλ, 2014? Δημοσιεύθηκε: 8 του Σεπτέμβρη του 2014

Copyright: © 2014 Duan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Οι ατομικές συντεταγμένες και παράγοντες δομής έχουν κατατεθεί με την τράπεζα δεδομένων Πρωτεΐνη www.rcsb.org με αριθμούς προσχώρησης 4U5J

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίζεται από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (YC, οι αριθμοί του έργου 81272971 και 81372904) και το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (NIH) (LC, 5R01GM064642). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Οι κινάσες πρωτεΐνης καταλύουν τη μεταφορά μιας φωσφορικής ομάδας από την τριφωσφορική αδενοσίνη (ATP) προς σερίνη, θρεονίνη ή τυροσίνη υπολείμματα των πρωτεϊνών υποστρώματος της [1]. Τέτοιες μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις χρησιμεύσει ως μηχανισμός για να ρυθμίζει την ενζυματική δραστηριότητα ή μοριακές αλληλεπιδράσεις των πρωτεϊνών υποστρώματος σε απόκριση προς ενδογενή και εξωγενή σήματα [1]. Η φωσφορυλίωση παίζει ένα κρίσιμο ρόλο στη μεταγωγή σήματος και ρυθμίζει πολλές κυτταρικές διεργασίες συμπεριλαμβανομένης κυτταρικής προσκόλλησης, εισβολή, τον πολλαπλασιασμό, την επιβίωση και την αγγειογένεση [2]. Η υπερέκφραση ή μεταλλάξεις των πρωτεϊνικών κινασών μπορεί να οδηγήσει σε μία ποικιλία ανθρώπινων ασθενειών όπως ο καρκίνος και η αυτοανοσία. Οι πρωτεϊνικές κινάσες είναι θεραπευτικοί στόχοι για την θεραπευτική αγωγή ασθενειών του ανθρώπου [3]. Ένα πρωτότυπο παράδειγμα, Imatinib, στοχεύει BCR-Abl, μια συστατικώς δραστική μορφή της κινάσης Abl που οδηγεί σε χρόνια μυελοειδή λευχαιμία (CML), και είναι πολύ επιτυχής για τη θεραπεία αυτής της ασθένειας [4].

Επειδή του υψηλού βαθμού συντήρησης αλληλουχίας εντός του πεδίου κινάσης, δεν αποτελεί έκπληξη το ότι οι αναστολείς της κινάσης περισσότεροι τείνουν να έχουν περιορισμένη εξειδίκευση στόχου. Off-στόχος επιδράσεις μπορεί να είναι ευεργετική σε ορισμένες περιπτώσεις, αλλά μπορεί να οδηγήσει σε παρενέργειες σε άλλες περιπτώσεις. Κάθε αναστολέας της κινάσης έχει μοναδική και εξαιρετικά απρόβλεπτη φάσμα στόχων της [5]. Η κατανόηση του μηχανισμού πίσω από την ιδιαιτερότητα στόχος είναι ένας σημαντικός στόχος που θα μπορούσε να ενισχύσει τη χρήση των υφιστάμενων αναστολείς κινάσης και ωφελούν τη διαδικασία της ανάπτυξης αναστολέα. Για παράδειγμα, η δομική πληροφορία της κινάσης δέσμευσης Imatinib δεν ήταν μόνο μελετηθεί σε σύμπλεγμα με τον προορισμό της κινάσης στόχου του Abl [6], αλλά επίσης μελετηθεί σε σύμπλοκο με άλλες κινάσες, συμπεριλαμβανομένων των c-Src, Lck, p38 [7] – [9] . Οι μελέτες αυτές βοηθούν σημαντικά να κατανοήσουμε τη βάση της αναστολής της κινάσης, επιλεκτικότητα, και τις πιθανές επιπτώσεις εκτός στόχου. Επιπλέον, αυτές οι μελέτες παρέχουν μια δομική ικρίωμα για την ανάπτυξη νέων αναστολέων κινάσης των διαφόρων κινασών

Οι αναστολείς κινάσης πρωτεϊνών συνήθως διαιρείται σε τρεις υποτύπους:. Τύπου Ι, τύπου II και αναστολείς τύπου ΙΙΙ. Οι αναστολείς τύπου Ι καταλαμβάνουν την τσέπη πρωτίστως καλυφθεί από ΑΤΡ, και ένα καταλυτικά σημαντικό Asp-Phe-Gly (DFG) μοτίβο διατηρείται σε ενεργή διαμόρφωση (που αναφέρεται ως DFG-in διαμόρφωση). Ένα τυπικό παράδειγμα ενός αναστολέα κινάσης Ι τύπος είναι η δεύτερη γενιά αναστολέα BCR-Abl, Dasatinib. Οι αναστολείς τύπου II, όπως Imatinib, καταλαμβάνουν την ΑΤΡ-σύνδεσης τσέπη και μια πρόσθετη περιοχή, και το μοτίβο DFG περιστρέφεται από ~ 180 ° σε σχέση με τον ενεργό διαμόρφωση (που αναφέρεται ως DFG-out διαμόρφωση) [10] – [12 ]. Οι αναστολείς του τύπου III προσδένονται ρυθμιστικά πεδία εκτός του θύλακα σύνδεσης ΑΤΡ, και ρυθμίζουν τη δραστικότητα κινάσης σε μία αλλοστερική τρόπο. Επειδή τα αμινοξέα εκτός του θύλακα σύνδεσης ΑΤΡ είναι λιγότερο συντηρημένες σε σχέση με εκείνες στην τσέπη, έχει προταθεί ότι μπορεί να είναι ευκολότερο να επιτευχθεί κινάσης εκλεκτικότητα με αναστολείς τύπου II ή του τύπου III.

Ένα ενιαίο υπόλειμμα εντός της ΑΤΡ θέση των πρωτεϊνικών κινασών, που ονομάζεται ο φύλακας, παίζει σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση της τσέπη ειδικότητα, και ελέγχει την ευαισθησία σε μία ποικιλία αναστολέων μικρών μορίων. Το υπόλειμμα gatekeeper ποικίλλει μεταξύ των διαφόρων πρωτεϊνικών κινασών. Μερικές κινάσες έχουν ένα μικρό υπόλειμμα (π.χ. Thr, Ala, ή Gly) στη θέση αυτή, και εύκολα στοχεύονται από δομικά διαφορετικές κατηγορίες αναστολέων. Άλλες κινάσες διαθέτουν ένα μεγαλύτερο κατάλοιπο (π.χ. Phe) στη θέση αυτή, και είναι πιο ανθεκτικά [13]. Μετάλλαξη του υπολείμματος φύλακα είναι ένα κοινό μηχανισμό αντοχής στους αναστολείς κινάσης. Για παράδειγμα, η υποκατάσταση του BCR-Abl φύλακα Thr-315 σε Ile έχει οδηγήσει σε αντίσταση στην ιματινίμπη [14] – [16].

Ruxolitinib είναι ένας ισχυρός αναστολέας της κινάσης Janus για τη θεραπεία των νεοπλασμάτων μυελοϋπερπλαστικές (MPNs ) [17]. Έχει ισχυρή ανασταλτική δραστικότητα έναντι JAK1 (IC

50 = 3.3 ηΜ) και JAK2 (IC

50 = 2.8 ηΜ), μέτρια δραστικότητα έναντι ΤΥΚ2 (IC

50 = 19 ηΜ) και ασθενή δραστηριότητα ενάντια JAK3 ( IC

50 = 428 ηΜ) και ένα πάνελ άλλων κινασών, περιλαμβανομένης της Src κινάσης [18], [19]. μεταλλάξεις JAK2 και ενεργοποίηση διαδραματίζουν θεμελιώδη ρόλο στην αιτιολογία της ανθρώπινης MPNs. Για παράδειγμα, περίπου το ήμισυ των ασθενών με MPNs φέρουν μια μετάλλαξη κέρδος-of-λειτουργία στο γονίδιο JAK2 (JAK2 V617F) [17], [18]. Ruxolitinib αναστέλλει την απορυθμισμένη JAK2 οδό σηματοδότησης, και έδειξε σημαντικά οφέλη σε κλινικές δοκιμές. Το 2011, Ruxolitinib είχε εγκριθεί για τη θεραπεία του ενδιάμεσου ή υψηλού κινδύνου μυελοΐνωση [20].

Δεν υπάρχει δομικές πληροφορίες του Ruxolitinib σύνδεση με οποιαδήποτε κινάση. Σε αυτή την εργασία, θα διερευνήσει τη δομική βάση για τη δέσμευση Ruxolitinib σε κινάσης, χρησιμοποιώντας c-Src περιοχή κινάσης ως πρωτότυπο σύστημα. Με τον προσδιορισμό της δομής ενός σύνθετου Ruxolitinib σε 2,26 το ψήφισμα A, δείξαμε ότι η περιοχή της κινάσης c-Src υιοθετεί την ενεργή διαμόρφωση DFG-in. Ruxolitinib σχηματίζει δύο δεσμούς υδρογόνου με Met341, ένα υδατο-μεσολάβηση δεσμό υδρογόνου με Thr338, και μια σειρά από van der Waals επαφές με c-Src. Στη συνέχεια αγκυροβολημένο Ruxolitinib εντός του θύλακα σύνδεσης συνδετήρα μιας προηγουμένως λυθεί δομή JAK1. Από αποτέλεσμα σύνδεσης μας, Ruxolitinib δεσμεύει επίσης JAK1 ως τύπος Ι αναστολέα, με περισσότερες αλληλεπιδράσεις και υψηλότερες συμπληρωματικότητα σχήμα με το θύλακα δέσμευσης συνδέτη του JAK1 από εκείνη του c-Src. Δεδομένου ότι υπάρχει σημαντική κοιλότητα μεταξύ Ruxolitinib και του θύλακα σύνδεσης συνδετήρα c-Src, είναι πολύ πιθανό να τροποποιήσουν Ruxolitinib να αναπτύξουν πιο ισχυροί αναστολείς με c-Src.

Μέθοδοι

Έκφραση πρωτεϊνών και Καθαρισμός

Chicken c-Src (κατάλοιπα 251-533) παρασκευάστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]. Εν συντομία, η πρωτεΐνη εκφράστηκε με ένα 6 × His-tagged σε κύτταρα Escherichia coli BL21DE3, παρουσία της φωσφατάσης YopH. Η πρωτεΐνη καθαρίστηκε πρώτα με σφαιρίδια Νί-ΝΤΑ. Το 6 × His-tag στη συνέχεια απομακρύνθηκε με διάσπαση ΤΕν. Μετά τη διάσπαση, χρωματογραφία ανταλλαγής ανιόντων και χρωματογραφία αποκλεισμού μεγεθών χρησιμοποιήθηκαν για τον περαιτέρω καθαρισμό της πρωτεΐνης. Πρωτεΐνη σε 50 mM Tris (ρΗ 8.0), 100 mM NaCl, 5% γλυκερίνη, 1 mM DTT συμπυκνώθηκε στα 10 mg /ml και καταψύχθηκαν flash για αποθήκευση στους -80 ° C.

Κρυστάλλωση

το c-Src κρύσταλλοι /ruxolitinib ελήφθησαν στους 18 ° C χρησιμοποιώντας τη μέθοδο διάχυσης ατμού κρέμονται σταγόνα. Το c-Src σύμπλοκο /ruxolitinib αναμίχθηκε σε ένα διάλυμα 170 μΜ c-SRC, 2000 ruxolitinib μΜ, 10% DMSO, 50 mM Tris (ρΗ 8.0), 100 mM NaCl, 5% γλυκερίνη, 1 mM DTT. Το διάλυμα δεξαμενή περιείχε 0,1 Μ MES (ρΗ 6.4), 2% γλυκερόλη, 8% PEG 4000, 50 mM οξικό νάτριο, 10 mM MgCl2. Κρύσταλλοι κρυοπροστατεύθηκε στη δεξαμενή για το διάλυμα συν 20% γλυκερόλη και 2000 ruxolitinib μΜ. Κρύσταλλο ανήκει στην ομάδα χώρου Ρ1 με διαστάσεις των κυττάρων του

μια

= 42,107 Α,

β

= 63,228 Α,

γ

= 73.989 Α, α = 79,27 °, β = 89.27 °, γ = 90,29 °.

Συλλογή δεδομένων και δομή Προσδιορισμός

Τα δεδομένα συλλέχθηκαν με τη διευκόλυνση της Σαγκάης Synchrotron Radiation (SSRF), beamline BL17U, και το Advanced Light Source (Lawrence Berkeley National Laboratory) beamlines 5.0.2 και 8.2.1. Δεδομένα υπέστη αναγωγή χρησιμοποιώντας HKL2000 [22]. Προσδιορισμός της δομής διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23], [24]. προσδιορισμός Αρχική φάση διεξήχθη με μοριακή αντικατάσταση με Phaser από το πακέτο CCP4 [25], με τη χρήση της αλυσίδας Α ενός προηγουμένως λυθεί δομή c-Src (ΠΣΠ κωδικός 2SRC) [26] ως το πρότυπο αναζήτησης. Η δομή εξευγενισμένα χρησιμοποιώντας Phenix.refine και Αστράγαλο από το πακέτο Phenix [27]. Τα στατιστικά στοιχεία της κρυσταλλογραφική ανάλυση παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Οι γραφικές αναπαραστάσεις της δομής παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας PyMol (Delano Scientific, San Francisco, CA). Οι συντεταγμένες και διαρθρωτικοί παράγοντες έχουν κατατεθεί στην Τράπεζα Δεδομένων Πρωτεΐνης με κωδικό ένταξη 4U5J.

Η

Μοριακής σύνδεσης και δομική ανάλυση

Μοριακή βάση σύνδεσης διεξήχθη χρησιμοποιώντας Molsoft ΜΠΕ-Pro [28 ]. Ruxolitinib ήταν αγκυροβολημένο στην τσέπη δέσμευσης συνδέτη του JAK1 (pdb κωδικός: 3EYG) [29]. Όγκος του θύλακα δέσμευσης συνδέτη υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας POCASA [30]. Διαγράμματα των αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-συνδετήρα παρήχθη χρησιμοποιώντας LIGPLOT [31].

Κινάσης Δοκιμασίες

c-Src (αραιωμένα σε 50 mM Tris ρΗ 7,5, 0,1 mM EGTA, 0,1% β-μερκαπτοαιθανόλη, 1 mg /ml BSA) προσδιορίστηκε έναντι KVEKIGEGTYGVVYK σε ένα τελικό όγκο 25,5 μΙ που περιείχε 50 mM Tris ρΗ 7,5, 0,1 mM EGTA, 0,3 mM KVEKIGEGTYGVVYK, 10 mM οξικό μαγνήσιο και 0.05 mM [33Ρ-γ-ΑΤΡ] (50-1000 cpm /pmole) και επωάστηκαν για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι δοκιμασίες τερματίστηκαν με την προσθήκη 5 μΐ 0,5 Μ (3%) ορθοφωσφορικού οξέως, συλλέχθηκαν επί πλακών Unifilter Ρ81 με ένα ρυθμιστικό διάλυμα έκπλυσης 50 mM ορθοφωσφορικό οξύ, και ξηραίνεται στον αέρα. Τα ξηρά πλακίδια Unifilter στη συνέχεια σφραγίστηκαν για την προσθήκη MicroScint Ο και μετρήθηκαν σε μετρητές σπινθηρισμών Packard Topcount ΝΧΤ.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Ruxolitinib δέσμευση στην ΑΤΡ-δέσμευσης τσέπη του c-Src

για να δείτε πώς ο καρκίνος του φαρμάκου Ruxolitinib αλληλεπιδρά με την κινάση, προσδιορίσαμε τη δομή ακτίνων Χ του c-Src σε συγκρότημα με Ruxolitinib σε ένα ψήφισμα του 2,26 Å. Τα στατιστικά της συλλογής δεδομένων και τελειοποίηση του μοντέλου που παρατίθενται στον Πίνακα 1. Κάθε ασύμμετρη μονάδα περιέχει δύο μόρια του c-Src. Υπάρχει σαφώς καθορισμένες πυκνότητα ηλεκτρονίων για Ruxolitinib σε αμφότερα τα μόρια c-Src, η οποία φαίνεται να δεσμεύονται με πλήρη χωρητικότητα (Σχήμα S1). Η δομή του c-Src αποτελείται από ένα δι-λοβούς αρχιτεκτονική (Ν-λοβού και C-λοβός) που είναι τυπικό για κινάσες τυροσίνης πρωτεΐνης. Η θέση δέσμευσης ΑΤΡ του c-Src κινάση βρίσκεται στην αναδίπλωση σχισμή μεταξύ των Ν- και C-τερματικών λοβούς, που περιβάλλεται από την περιοχή άρθρωσης, Ρ-βρόχος, Helix μ.Χ., και βρόχο ενεργοποίησης (Σχήμα 1Α). Μέρος του βρόχου ενεργοποίησης (αμινοξέα 412-423) παρουσιάζει καμία πυκνότητα ηλεκτρονίων, υποδεικνύοντας η περιοχή αυτή είναι ευέλικτη. Ως εκ τούτου, η περιοχή αυτή δεν περιλαμβάνεται στο ΠΣΠ.

(Α) Γενική δομή των σύνθετων c-Src /Ruxolitinib. (Β) Οι δακτύλιοι πυρρολοπυριμιδίνη σχηματίζουν δύο δεσμούς υδρογόνου με τα κύρια άτομα της αλυσίδας του Met341. (Γ) σχηματίζει ένα Ruxolitinib αλληλεπίδραση νερό μεσολάβηση με υπόλειμμα Src gatekeeper Thr338.

Η

Ruxolitinib προσδένεται στο ΑΤΡ-δέσμευσης κοιλότητα του c-Src, με σαφή πυκνότητα ηλεκτρονίων που παρατηρήθηκαν για τον αναστολέα (Εικόνα S1) . Είναι προσανατολίζεται έτσι ώστε οι δακτύλιοι πυρρολοπυριμιδίνη δείχνει προς την περιοχή άρθρωσης, τα σημεία δακτύλιο κυκλοπεντανίου προς το Ο-λοβού, ενώ τα σημεία ομάδα προπανονιτρίλιο προς το Ρ-βρόχος (Σχήμα 1Α). Οι δακτύλιοι πυρρολοπυριμιδίνη σχηματίζουν δύο δεσμούς υδρογόνου με τα κύρια άτομα της αλυσίδας του Met341 (Σχήμα 1Β), καθώς και μια αλληλεπίδραση με μεσολάβηση νερό με Src υπόλειμμα ελεγκτή πύλης Thr338 (Σχήμα 1 C). Εκτός από τα δεσμούς υδρογόνου, Ruxolitinib σχηματίζει επίσης έναν αριθμό van der Waals επαφές με c-Src (Εικόνα S2).

DFG μοτίβο τοποθετεί στο Ν-τερματικό άκρο του βρόχου ενεργοποίησης και διαμόρφωση του παίζει κεντρικό ρόλο στην ενεργότητα κινάσης [32]. DFG-in και DFG-out διαμορφώσεις αντιπροσωπεύουν δύο ακραίες καταστάσεις ενός συνεχούς δυνατότητες [32]. Οι ενδιάμεσες καταστάσεις που παρατηρούνται σε ορισμένες περιπτώσεις [26]. Τρεις διακριτές διαμορφώσεις των περιοχών κινάσης των κινασών Src οικογένειας: μια DFG-in δραστική διαμόρφωση, ένα DFG-ενδιάμεσο ανενεργό διαμόρφωση, και ένα DFG-out ανενεργή διαμόρφωση [32]. Στην DFG-in διαμόρφωση (Σχήμα 2Α και 2Β, PDBS 3LCK και 3DQW), οι Ασπαρτική πλευρική αλυσίδα όψεις μέσα στην θέση δέσμευσης ΑΤΡ και οι όψεις της αλυσίδας πλευρά φαινυλαλανίνης στην πρωτεΐνη. Στο DFG-out διάπλασης (Σχήμα 2Ε, ΠΣΠ 2OIQ), η ραχοκοκαλιά του μοτίβου DFG γυρνάει, η αλυσίδα sdie ασπαρτικό αντιμετωπίζει μακριά από το σημείο της ΑΤΡ-δέσμευσης, ενώ η πλευρά φαινυλαλανίνης αλυσίδα καταλαμβάνει τη θέση σύνδεσης ΑΤΡ. Για παράδειγμα, η περιοχή της κινάσης του c-Src υιοθετεί DFG-out διαμόρφωση κατά την σύνδεση προς Imatinib [33]. Στο DFG-ενδιάμεσο διάπλασης (Σχήμα 2D, ΠΣΠ 2SRC), η DFG-μοτίβο υιοθετεί μια διαμόρφωση μεταξύ των δύο παραπάνω διαμορφώσεις. Συγκρίναμε τη διαμόρφωση DFG-μοτίβο σε Src /Ruxolitinib συγκρότημα με αυτές τις τρεις διαμορφώσεις. Προφανώς, κατά την πρόσδεση Ruxolitinib, πεδίο κινάσης c-Src διατηρείται σε DFG-in διαμόρφωση (Σχήμα 2C)

(Α) ενεργός Lck DFG-in διαμόρφωση. (ΠΠ: 3LCK)? (Β) που δραστηριοποιούνται c-Src T338I DFG-in διάπλαση (ΠΣΠ: 3DQW)? (C) που δραστηριοποιούνται c-Src DFG-in διαμόρφωση σε σύνθετα Src /Ruxolitinib (το έργο αυτό)? (D) ανενεργό c-Src στην διαμόρφωση Src /CDK, DFG-ενδιάμεσο (pdb: 2SRC)? (Ε) ανενεργό c-Src DFG-out διαμόρφωση σε Src /Imatinib σύμπλοκο (pdb: 2OIQ).

Η

Ο τομέας κινάσης του c-Src υιοθετεί διαφορετικές διαμορφώσεις κατά την πρόσδεση διαφόρων αναστολέων. Στο c-Src συγκρότημα /Imatinib, Imatinib καταλαμβάνει όχι μόνο την περιοχή δέσμευσης ΑΤΡ, αλλά και εκτείνεται πέρα ​​από το μοτίβο DFG και καταλαμβάνει μια πρόσθετη περιοχή. Το μοτίβο DFG είναι στη DFG-out διαμόρφωση (Σχήμα 3Α). Στο συγκρότημα c-Src /Ruxolitinib, Ruxolitinib καταλαμβάνει μόνο την περιοχή συνδέσεως ΑΤΡ και c-Src υιοθετεί μια DFG-in διάπλαση. Η Ρ-βρόχος κινείται πιο κοντά στο Ο-λοβού, που οδηγεί σε αυστηρότερο θέση ΑΤΡ-δέσμευσης. Αυτό θα μπορούσε να οφείλεται σε μια επαγόμενη-fit μηχανισμός (Σχήμα 3Β). Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, imatinib είναι ένας αναστολέας τύπου ΙΙ για c-Src, ενώ Ruxolitinib είναι ένας τύπος που αναστολέα για c-Src.

(Α) Pocket χωρητικότητα του Imatinib στο c-Src /Imatinib συγκρότημα (ΠΣΠ : 2OIQ). δομή C-Src δείχνεται στο κινουμένων σχεδίων, χρωματισμένο με ματζέντα. Imatinib φαίνεται στην σφαίρα. (Β) Pocket χωρητικότητα του Ruxolitinib στο συγκρότημα c-Src /Ruxolitinib (αυτό το έργο). δομή C-Src δείχνεται στο κινουμένων σχεδίων, χρωματισμένο με κίτρινο. Ruxolitinib φαίνεται στην σφαίρα.

Η

Οι περισσότεροι αναστολείς κινάσης είναι ΑΤΡ-ανταγωνιστική και ανήκουν τύπου Ι αναστολείς. Ο θύλακας σύνδεσης ΑΤΡ διατηρείται μεταξύ των μελών της οικογένειας κινασών. Εκτός από το θύλακα σύνδεσης ΑΤΡ, αναστολέας τύπου II δεσμεύει ένα λιγότερο συντηρημένη πρόσθετη τσέπη. Τύπου ΙΙ αναστολέας δρα προκαλώντας μια αλλαγή διαμόρφωσης, έτσι ώστε η κινάση δεν είναι πλέον σε θέση να λειτουργήσει. Προτείνεται ότι ο αναστολέας τύπου II θα μπορούσε να επιτύχει καλύτερη επιλεκτικότητα. Παρ ‘όλα αυτά, βιολογική αποτελεσματικότητα, ειδικά κλινική αποτελεσματικότητα, θα είναι ο τελικός κριτής.

Σύγκριση των δεσμευτικών τσέπες Src και JAK

Ruxolitinib είναι ένας αναστολέας της κινάσης Janus, με αναφερόμενη IC

50 τιμές 2,8 ηΜ για JAK2, 3.3 ηΜ για JAK1, 19 ηΜ για ΤΥΚ2, και 428 ηΜ για JAK3 [18]. Lck, Src μια κινάση της οικογένειας, αναστέλλεται από Ruxolitinib με μια αναφερόμενη IC

50 τιμή 3,6 μΜ [19]. Χρησιμοποιώντας κινάσης δοκιμασίες, βρήκαμε ότι Ruxolitinib ανέστειλε c-Src με IC

50 2,92 μΜ (Πίνακας S1). Ως εκ τούτου, οι κινάσες Src αναστέλλεται από Ruxolitinib σε πολύ μικρότερο βαθμό από ό, JAK κινασών. Η ταυτότητα αλληλουχίας μεταξύ Src και JAK κινάσες της οικογένειας είναι ~34% στην περιοχή κινάσης (Σχήμα 4Α & amp? 4Β). Εκτός από το γεγονός ότι JAK κινάσες έχουν πολλά επιπλέον τμήματα των αμινοξέων (Εικόνα 4Α, τονίζεται στο πράσινο κουτί), εντοπίσαμε αρκετές άλλες βασικές διαφορές μεταξύ των Src κινάση της οικογένειας και της οικογένειας κινάσης JAK. Thr338, το υπόλειμμα φύλακα στο c-Src, αντικαθίσταται με Met στην οικογένεια JAK? Συναντήθηκε 341 του c-Src, το υπόλειμμα σχηματίζει δύο δεσμούς υδρογόνου με Ruxolitinib, αντικαθίσταται με λευκίνη στην οικογένεια JAK (Εικόνα 4Α)

Η συντηρημένη DFG μοτίβο τονίζεται σε μπλε κουτί.? το υπόλειμμα gatekeeper επισημαίνεται με κόκκινο κουτί? κατάλοιπο που αντιστοιχεί στη Met341 σε c-Src επισημαίνεται με μωβ κουτί? Οι πολλές επιπλέον τμήματα των αμινοξέων επισημαίνονται με πράσινο κουτί

Η

Στη συνέχεια επικαλύπτεται δομή μας με μια δομή JAK1 (ΠΣΠ: 3EYG). [29]. Και τα δύο πεδία κινάσης μοιράζονται μια παρόμοια συνολική δομή με RMSD 2,92 Å. Η Ρ-βρόχος του JAK1 είναι πιο κοντά στο C-λοβού, που οδηγεί σε αυστηρότερο τσέπη, σε σύγκριση με εκείνη του c-Src (Σχήμα 5Α). Στη συνέχεια χρησιμοποιήσαμε POCASA [30] για την ανάλυση των θυλάκων δέσμευσης συνδέτη του c-Src (δομή μας) και JAK1 (pdb κωδικός: 3EYG). JAK1 έχει μια μικρότερη τσέπη με όγκο 311 Α

3, ενώ η c-Src έχει ένα μεγαλύτερο τσέπη με ένα προβλεπόμενο όγκο 450 Α

3 (Εικόνα 5Β & amp? 5C).

( Α) c-Src περιοχή κινάσης (η εργασία αυτή) είναι επάλληλα με τον τομέα JAK1 κινάσης (ΠΣΠ: 3EYG) χρησιμοποιώντας τα άτομα Ca του τομέα κινάσης ως αναφορά. c-Src δείχνεται κίτρινο, ενώ JAK1 παρουσιάζεται στο ματζέντα. (Β) Προβλεπόμενα θύλακα δέσμευσης συνδέτη c-Src εμφανίζεται με γκρι τελείες. (Γ) Προβλεπόμενη θύλακα δέσμευσης συνδέτη JAK1 εμφανίζεται με γκρι τελείες. τσέπη σύνδεσης συνδετήρα προβλέπεται χρησιμοποιώντας POCASA [30]

Η

Για να κατανοήσουμε καλύτερα πώς Ruxolitinib διαφοροποιεί αυτές τις οικογένειες κινασών, που ελλιμενίζεται Ruxolitinib σε μια προηγουμένως λυθεί δομή JAK1 (ΠΣΠ: 3EYG). [29]. Το αποτέλεσμα σύνδεσης δείχνει ότι Ruxolitinib καταλαμβάνει μόνο την περιοχή συνδέσεως ΑΤΡ, και το μοτίβο DFG διατηρείται σε DFG-in δραστική διαμόρφωση (Σχήμα 6Α), προτείνοντας ότι Ruxolitinib είναι επίσης ένα είδος Ι αναστολέα για JAK1. Αυτό είναι συνεπές με προηγούμενο εύρημα χρησιμοποιώντας ανταγωνισμού δοκιμασίες σύνδεσης [5]. Ruxolitinib προσανατολίζεται έτσι ώστε οι δακτύλιοι πυρρολοπυριμιδίνη δείχνει προς την περιοχή άρθρωσης. Αντί σχηματίζουν δύο δεσμούς υδρογόνου με Met341 σε c-Src, οι δακτύλιοι πυρρολοπυριμιδίνη σχηματίζουν δύο δεσμούς υδρογόνου με τα κύρια άτομα της αλυσίδας των Glu957 και Leu959 (Σχήμα 6Β). Μια σημαντική διαφορά μεταξύ της πρόσδεσης Ruxolitinib με c-Src και JAK1 έγκειται στον προσανατολισμό του δακτυλίου κυκλοπεντανίου. Είναι στραμμένο προς την C-λοβού στο σύμπλοκο c-Src /Ruxolitinib, ενώ τα σημεία προς Ν-λοβού όταν πρόσδεση σε JAK1 (Σχήμα 6Β). Μια άλλη αξιοσημείωτη διαφορά είναι ότι η ομάδα προπανονιτρίλιο του Ruxolitinib κάνει επαφές με JAK1, ενώ δεν αλληλεπιδρά με c-Src (Σχήμα S3).

(Α) Ruxolitinib ήταν αγκυροβολημένο στην τσέπη δέσμευσης συνδέτη του JAK1 ( ΠΣΠ: 3EYG). JAK1 τομέα κινάσης φαίνεται στο κινούμενο σχέδιο, και χρωματισμένο με ματζέντα. Ruxilitinib παρουσιάζεται στο σφαίρα. (Β) Προβλεπόμενη δεσμούς υδρογόνου μεταξύ Ruxolitinib και JAK1 περιοχή άρθρωσης. Βασισμένο σε αποτέλεσμα σύνδεσης, οι πυρρολοπυριμιδίνης δαχτυλίδια Ruxolitinib σχηματίζουν δύο δεσμούς υδρογόνου με JAK1 Glu957 και Leu959. (C) Shape συμπληρωματικότητα μεταξύ Ruxolitinib και την τσέπη σύνδεσης συνδετήρα JAK1. (D) Shape συμπληρωματικότητα μεταξύ Ruxolitinib και την τσέπη σύνδεσης συνδετήρα c-Src. Η προβλεπόμενη τσέπη σύνδεσης συνδετήρα εμφανίζεται με γκρι χρώμα των ματιών.

Η

Υπάρχει μια συμπληρωματικότητα υψηλό σχήμα μεταξύ Ruxolitinib και την τσέπη JAK1 ΑΤΡ-δέσμευσης (Σχήμα 6C), οδηγώντας σε περισσότερες επαφές με τα κατάλοιπα που περιβάλλουν το τσέπη από εκείνη του c-Src (Σχήμα S3). Στο συγκρότημα c-Src /Ruxolitinib, υπάρχει μια αρκετά μεγάλη κοιλότητα δίπλα Ruxolitinib στην τσέπη δέσμευσης συνδέτη, ειδικά μεταξύ Ruxolitinib και της έλικας αΟ του c-Src (Σχήμα 6D). Πιο αλληλεπιδράσεις και υψηλότερες συμπληρωματικότητα σχήμα θα μπορούσε να είναι ο λόγος για τον οποίο Ruxolitinib είναι ένας πιο ισχυρός αναστολέας για κινάσες JAK ό, τι για Src κινασών.

Ruxolitiib είναι ένας σχετικά μικρός αναστολέας με μοριακό βάρος 306,37 g /mol. Προσθέτοντας κάποια επιπλέον ομάδες για να Ruxolitinib μπορούσε να οδηγήσει στην ανακάλυψη νέων ενώσεων οι οποίες είναι πιο ισχυροί αναστολείς για c-Src. Για παράδειγμα, προσθέτοντας μερικές χημικές ομάδες για να γεμίσει την κοιλότητα μεταξύ Ruxolitinib και Helix αΟ του c-Src θα μπορούσε να βελτιώσει σε μεγάλο βαθμό συγγένεια νέα ένωση με Src κινασών. Ωστόσο, λόγω της αύξησης του όγκου συνδετήρα, η νέα ένωση θα ήταν πιθανόν να είναι πολύ μεγάλο για να γεμίσει το θύλακα δέσμευσης συνδέτη JAK, ως εκ τούτου θα μπορούσε να είναι ένας κακός αναστολέας για JAK κινασών.

Συμπεράσματα

σε αυτή την εργασία, παρουσιάζουμε μια κρυσταλλική δομή του Ruxolitinib δεσμεύεται στην περιοχή της κινάσης του c-Src. Παρά το γεγονός ότι δεν Ruxolitinib είναι ένας ισχυρός αναστολέας της c-Src, η κρυσταλλική δομή δείχνει ότι η περιοχή της κινάσης c-Src διατηρείται στην ενεργή διαμόρφωση DFG-in που είναι χαρακτηριστική του τύπου Ι αναστολέα. Επιπλέον, έχουμε ελλιμενίζεται Ruxolitinib εντός του θύλακα σύνδεσης συνδετήρα μιας προηγουμένως λυθεί δομή JAK1. Από αποτέλεσμα σύνδεσης μας, Ruxolitinib δεσμεύει επίσης JAK1 ως τύπου Ι αναστολέα. Σε σύγκριση με την πρόσδεση του με c-Src, Ruxolitinib έχει περισσότερες αλληλεπιδράσεις και υψηλότερο συμπληρωματικότητα σχήμα με τσέπη δέσμευσης συνδέτη JAK1, η οποία θα μπορούσε να είναι ο κύριος λόγος για τον οποίο Ruxolitinib είναι ένα πολύ πιο ισχυρός αναστολέας ενάντια κινασών JAK από Src κινασών. Στην δομική ανάλυση μας, παρατηρήσαμε ότι υπάρχει σημαντική κοιλότητα μεταξύ Ruxolitinib και c-Src σύνδεσης συνδετήρα τσέπης, γεγονός που υποδηλώνει ότι τροποποιώντας Ruxolitinib θα μπορούσε να οδηγήσει στην ανάπτυξη ισχυρών αναστολέων c-Src.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Fo-Ρο παραλείψετε χάρτη της Ruxolitinib στο συγκρότημα c-Src /Ruxolitinib. Η πυκνότητα των ηλεκτρονίων έχει περίγραμμα σε 2σ και επάλληλα με το τελικό μοντέλο

doi:. 10.1371 /journal.pone.0106225.s001

(TIFF)

Εικόνα S2.

Σχηματικό διάγραμμα της ptotein-συνδέτη αλληλεπιδράσεις στο συγκρότημα c-Src /Ruxolitinib. Οι δεσμοί υδρογόνου υποδεικνύονται με διακεκομμένες γραμμές μεταξύ των ατόμων που εμπλέκονται, ενώ οι υδρόφοβες επαφές αντιπροσωπεύονται από ένα τόξο με ακτίνες. Το διάγραμμα δημιουργήθηκε από LIGPLOT [31] (Συμπληρωματική αναφοράς)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0106225.s002

(TIFF)

Εικόνα S3.

Σχηματικό διάγραμμα της ptotein-συνδέτη αλληλεπιδράσεις με αποτέλεσμα σύνδεσης JAK1 /Ruxolitinib. Οι δεσμοί υδρογόνου υποδεικνύονται με διακεκομμένες γραμμές μεταξύ των ατόμων που εμπλέκονται, ενώ οι υδρόφοβες επαφές αντιπροσωπεύονται από ένα τόξο με ακτίνες. Το διάγραμμα δημιουργήθηκε από LIGPLOT [31] (Συμπληρωματική αναφοράς)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0106225.s003

(TIFF)

Πίνακα S1. αναλύσεις

κινάσης δείχνουν ότι Ruxolitinib ανέστειλε c-Src με IC50 2,93 μΜ

doi:. 10.1371 /journal.pone.0106225.s004

(DOCX)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Xiao Lei, Kaori Noridomi, και Shuxing Li για την πειραματική βοήθεια και συζήτηση. Ευχαριστούμε Chao Zhang για την παροχή του φορέα έκφρασης c-Src. Ευχαριστούμε Meng Xia και Stephanie Chu για βοήθεια σχετικά με την επεξεργασία. Θέλουμε να ευχαριστήσουμε τα μέλη του προσωπικού ALS BCSB Corie Ralston και Kevin Royal για βοήθεια σχετικά με τη συλλογή δεδομένων. Θέλουμε να ευχαριστήσουμε τα μέλη του προσωπικού SSRF BL17U για βοήθεια σχετικά με τη συλλογή δεδομένων. Ευχαριστούμε Διεθνές Κέντρο για την κινάσης προφίλ για βοήθεια σχετικά με δοκιμασία κινάσης.