Αφηρημένο

Ρόη, ένα νέο μέλος της οικογένειας πρωτεϊνών Rho, είναι ένας βασικός ρυθμιστής του κυτταρικού σκελετού και των κυττάρων της μετανάστευσης. Η ομάδα μας έχει δείξει στο παρελθόν ότι Ρόη ως άμεσο στόχο για HIF-1α και μεσολαβεί υποξία προκαλούμενη επιθηλιακά μεσεγχυματικά να μετάβαση στο γαστρικό καρκινικά κύτταρα. Ως εκ τούτου, υποθέτουμε ότι Ρόη θα μπορούσε να διαδραματίσει ένα σημαντικό ρόλο στην μετάσταση καρκίνου γαστρικό. Στην παρούσα μελέτη, έχουμε διερευνήσει τον ρόλο της έκφρασης Ρόη στο γαστρικό καρκίνο, κυτταρική εισβολή και τη μετάσταση, και την επιρροή του Ρόη στη ρύθμιση του δυναμικού έκφραση των γονιδίων κατάντη. έκφραση Ρόη ανυψώθηκε σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με την κανονική γαστρικό ιστούς. Βρήκαμε επίσης μια στενή συσχέτιση μεταξύ του ιστολογικού βαθμού και τη διάγνωση του ασθενούς. Up-ρύθμιση του Ρόη ενισχυθεί σημαντικά τα μεταναστευτικά και επεμβατικές δυνατότητες των γαστρικών καρκινικών κυττάρων τόσο

in vitro

και

in vivo

. Επιπλέον, προς τα κάτω ρύθμιση του Ρόη μείωσε τη μεταστατικό δυναμικό των καρκινικών κυττάρων. σειρά PCR και μετέπειτα δοκιμασία φρεατίων έδειξαν ότι η ρύθμιση της γαστρικής μετάστασης του καρκίνου από Ρόη εν μέρει διαμεσολαβείται από CXCR4. Αυτή η παρατήρηση προτείνει ότι CXCR4 μπορεί να είναι ένας καθοδικός τελεστής για Ρόη. Εν ολίγοις, η μελέτη μας προσδιορίζονται Ρόη ως νέο προγνωστικό βιοδείκτη και το γονίδιο μεταστατικού-προώθηση του γαστρικού καρκίνου

Παράθεση:. Feng B, Li K, Zhong Η Ρεν G, Wang Η, Shang Y, et al. (2013) Ρόη Προωθεί μετάσταση στο γαστρικό καρκίνο μέσω ενός μηχανισμού που εξαρτάται σε αυξημένη έκφραση του CXCR4. PLoS ONE 8 (11): e81709. doi: 10.1371 /journal.pone.0081709

Επιμέλεια: Sharmila Shankar, Πανεπιστήμιο του Κάνσας Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 11 Ιανουαρίου του 2013? Αποδεκτές: 24 Οκτ 2013? Δημοσιεύθηκε: 29 Νοεμβρίου, 2013

Copyright: © 2013 Feng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Πρόγραμμα βασικής Έρευνας της Κίνας (No: 2009CB521700), το Εθνικό υψηλής Τεχνολογίας Πρόγραμμα Έρευνας και Ανάπτυξης της Κίνας (No: 2006AA02A253) και το Εθνικό Επιστήμης και Τεχνολογίας Υποστηρικτικό Πρόγραμμα κατά τη διάρκεια της ενδέκατη πενταετές σχέδιο Περίοδος (No: 2006BAI02A14). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

γαστρικός καρκίνος είναι η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο που σχετίζονται με τον κόσμο και μετάσταση όγκου είναι το μεγαλύτερο εμπόδιο για την επιτυχή θεραπεία της και την κύρια αιτία θνησιμότητας των ασθενών [1,2]. Για δεκαετίες, πολυάριθμες μελέτες έχουν προσπαθήσει να κατανοήσουν τις διαδικασίες και τους μηχανισμούς της μετάστασης του καρκίνου του στομάχου. Τα τελευταία χρόνια, έχει βρεθεί ότι τα επιθηλιακά μεσεγχυματικά μετάβασης (ΕΜΤ) είναι ζωτικής σημασίας σε αυτή τη διαδικασία και σε μεγάλο βαθμό συμβάλλει στην καρκινικών κυττάρων εισβολή και μετάσταση. Ένας πιθανός λόγος είναι ότι κατά τη διάρκεια της EMT, η κυτταροσκελετού είναι ριζικά διαμορφωμένο, που οδηγεί στη διασπορά των καρκινικών κυττάρων [3].

Ρόη ανήκει σε μια υπο-ομάδα των πρωτεϊνών Rho, τα οποία παίζουν σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση του κυτταροσκελετού , κυτταρική κινητικότητα, τον κυτταρικό κύκλο και την απόπτωση [4,5]. Σε αντίθεση με τις τυπικές πρωτεΐνες Rho, η οποία κύκλου μεταξύ ενός ενεργού GTP-δεσμευμένη κατάσταση και κατάσταση ηρεμίας ΑΕΠ-δεσμεύεται, Ρόη δεν έχει εγγενή δραστικότητα ΟΤΡάσης και πάντα παρουσιάζεται ως το ενεργό GTP-δεσμευμένη μορφή [6]. Αυτό το μοναδικό χαρακτηριστικό δείχνει ότι η λειτουργία του Ρόη ρυθμίζεται κυρίως μέσω της έκφρασης του και όχι από τη δραστηριότητά της.

Πρόσφατα, αρκετές μελέτες διαπιστώθηκε ότι η μη φυσιολογική έκφραση του Ρόη συσχετίστηκε με καρκινογένεση και ότι Ρόη μπορεί να δράσει είτε ως ογκοκατασταλτικό γονίδιο ή ένα ογκογονίδιο, ανάλογα με την προέλευση του καρκίνου [7-9]. Ομοίως, Ρόη έχει ποικίλες επιρροές σε μετάσταση σε διαφορετικές μορφές καρκίνου. Στο μελάνωμα, Ρόη υποστηρίζει την μετανάστευση και διεισδυτικότητα των καρκινικών κυττάρων με τη ρύθμιση της ακτίνης του κυτταροσκελετού [10]. Ωστόσο, το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, Ρόη αντιπροσωπεύει ο ίδιος ως καταστολέας πρωτεΐνη μετάσταση όγκου [11,12].

Προηγουμένως, η ομάδα μας έχει βρει ότι η Ρόη ενισχύθηκε στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα με επαγωγή της έκφρασης του HIF-1α στο πλαίσιο υποξικές συνθήκες και να προωθηθεί ΕΜΤ του γαστρικού καρκίνου κυττάρων [13]. Έτσι, υποθέσαμε ότι η Ρόη μπορεί να έχει θετική συμβολή στην μετάσταση του καρκίνου του στομάχου. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε η επίδραση του Ρόη για την μετάσταση του καρκίνου του στομάχου κυττάρων και των υποκείμενων μηχανισμών.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

Το ανθρώπινο γαστρικό αδενοκαρκίνωμα κυτταρικές γραμμές SGC7901, ΜΚΝ-45, ΜΚΝ-28, ΚΑΤΩ-ΙΙΙ και οι συνήθεις γαστρικού βλεννογόνου GES κυτταρική σειρά διασώθηκαν στο ινστιτούτο μας [14-16]. Επιπλέον, το γαστρικό καρκίνο σε κύτταρα γραμμή SGC7901-M, το οποίο έχει υψηλό μεταστατικό δυναμικό, και SGC7901-NM, η οποία έχει μια κακή μεταστατική ικανότητα, καθιερώθηκαν και διατηρήθηκαν σε ινστιτούτο μας [17]. Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 μέσο συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (GIBCO, Carlsbad, CA, USA) και καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε ένα πλήρως υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO2.

Ιστός Array

Για εφαρμογές ανοσοχρώση, δύο συστοιχίες των ιστών του ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου ήταν εμπορικά αγοράστηκαν από ξεπεράσει Biotech Co. Ltd (Σαγκάη, Κίνα). Μια συστοιχία ιστού που περιέχονται 90 σημεία του ιστού του όγκου και συμφωνημένα παρακείμενα σημεία μη καρκινικό ιστό που ελήφθησαν από 90 ασθενείς (με 5.3 – 6.1 ετών παρακολούθησης). Ο κατασκευαστής παρέχεται το φύλο, την ηλικία, και κλινικοπαθολογικών παραμέτρων των ασθενών. Η άλλη σειρά περιείχε 120 σημεία με 40 πρωτογενείς κηλίδες ιστό του όγκου, 40 συμφωνημένα παρακείμενο κηλίδες μη καρκινικό ιστό, και 40 συμφωνημένα μεταστάσεις κηλίδες λεμφαδένα.

Ανοσοϊστοχημεία

Η ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας Histostain ™ Plus kits (Zhongshan Goldenbridge Biotech, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το αντι-Ρόη αντίσωμα ποντικού (αραιωμένο 1: 100? Upstate, MA, USA) ή αντίσωμα αντι-CXCR4 (αραιωμένο 1: 200? Sigma-Aldrich, ΜΟ, USA) χρησιμοποιήθηκαν στον προσδιορισμό IHC ως πρώτο αντίσωμα. Mouse IgG χρησιμοποιήθηκε αντί του πρώτου αντισώματος ως αρνητικός έλεγχος σε αυτές τις μελέτες. Το ληφθέν αποτέλεσμα ημι-ποσοτικά αξιολογούνται αναθέτοντας βαθμολογίες για την ένταση της ανοσοαντιδραστικότητας και για το ποσοστό των κυττάρων που χρωματίζονται θετικά, όπως περιγράφεται από τους άλλους. Η ένταση της ανοσοδραστικότητας χωρίστηκε σε τέσσερις κατηγορίες και βαθμολογείται ως απούσα (-? Βαθμολογία: 0), αδύναμο (+? Βαθμολογία: 1), μέτρια (++? Βαθμολογίας: 2), ή ισχυρά (+++? Βαθμολογία: 3 ) σύμφωνα με την ένταση χρώσης που παρατηρήθηκε στην πλειονότητα των γαστρικών επιθηλιακών κυττάρων. Η αναλογία των θετικών κυττάρων κατατάσσονται σε τέσσερις ομάδες: (1), 0-25% των καρκινικών κυττάρων που παρουσιάζουν ανοσοαντιδραστικότητα? (2), 25-50% των κυττάρων? (3), 50-75 ποσοστιαίες μονάδες των κυττάρων? και (4), 75-100% των κυττάρων. Η συνολική βαθμολογία ήταν το προϊόν των δύο [18].

Ανάλυση Western Blot

Τα δείγματα πρωτεΐνης που εξάγεται από κύτταρα ή ιστούς με υπερήχους σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (150 mM NaCl, 50 mM Tris -ΗΟΙ (ρΗ 8.8), 0.1% SDS, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1% ΝΡ40, 5 μg /ml απροτινίνης, 1 μg /ml λευπεπτίνη) επί πάγου, κατόπιν φυγοκεντρήθηκε στις 12.000 rpm για 10 λεπτά. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και ηλεκτρομεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Bio-Rad, CA, USA). Μη ειδική σύνδεση μπλοκαρίστηκε με 5% χωρίς λιπαρά γάλα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Η μεμβράνη στη συνέχεια χωριστά επωάστηκε με αντίσωμα αντι-Ρόη (αραιωμένο 1: 400? Upstate, ΜΑ, USA), αντι-CXCR4 αντίσωμα (αραιωμένο 1: 1000? Sigma-Aldrich, ΜΟ, USA), αντι-VEGFA αντίσωμα (αραιωμένο 1 : 500? Abcam, MA, USA), αντίσωμα αντι-CD82 (αραίωση 1: 1000? Abcam, MA, USA), αντίσωμα αντι-CTSK (αραιωμένο 1: 1000? Santa Cruz, Texas, USA) ή αντίσωμα β-ακτίνης ( αραιωμένο 1: 10.000? Sigma-Aldrich, ΜΟ, USA) για όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Μετά από τέσσερις εκπλύσεις με ρυθμιστικό ΤΒδ-Τ, οι μεμβράνες επωάστηκαν με το δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας (αραιωμένο 1: 2000? Santa Cruz, Texas, USA) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από 4 πλύσεις με ρυθμιστικό TBS-T, οι ζώνες αναπτύχθηκαν με SuperSignal Χημειοφωταυγές υπόστρωμα (Thermo Scientific, ΜΑ, USA) για την οπτικοποίηση των πρωτεϊνών. Οι κηλίδες στη συνέχεια αναλύθηκαν με Ποσότητα One® λογισμικού (έκδοση 4.2. Bio-Rad, CA, USA) ακολουθώντας τον Οδηγό χρήσης. κηλίδα Western για έκφραση β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος.

έκτοπη έκφραση και siRNA-Mediated κατασιγάσει

Για έκτοπη έκφραση των γονιδίων στόχων, γαστρικά καρκινικά κύτταρα υπέστησαν μεταγωγή με φορέα που εκφράζει φακοϊό Ρόη ή CXCR4 (παρέχεται από GeneChem, Σαγκάη, Κίνα). Εν συντομία, τα κύτταρα επιστρώθηκαν και αναπτύχθηκαν σε 75 έως 80% συρροή χωρίς αντιβιοτικά, μετά την οποία οι φορείς λεντοϊών προστέθηκαν στα κύτταρα σε μέσο ανάπτυξης που περιέχει πολυβρένιο (2 μg /ml) σε ΜΟΙ 50. Ακολούθως, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για μια άλλη 72 ώρες και η αποτελεσματικότητα μόλυνση ελέγχθηκε με μικροσκοπία φθορισμού και ανάλυση κηλίδας Western. Παρέμβαση της ανθρώπινης έκφρασης Ρόη ή CXCR4 επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας μια τεχνική παρεμβολής RNA. siRNA διπόλων συντέθηκαν από την Takara Βιοτεχνολογίας (Liaoning, Κίνα) και οι στοχευμένες αλληλουχίες του Ρόη ή CXCR4 ορίστηκαν ως εξής:

Ρόη, 5′-GAACGUGAAAUGCAAGAUAUU-3 ‘?

CXCR4, 5′-UAAAAUCUUCCUGCCCACC-3 ‘.

Η

Έλεγχος siRNA διπόλων σχεδιάστηκαν μετά την υποβολή ερωτημάτων στη βάση δεδομένων BLAST με μη-ειδικές αλληλουχίες στόχευσης. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με ολιγονουκλεοτιδικά διπλά χρησιμοποιώντας LipofectamineTM 2000 (Invitrogen, ΝΥ, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, μετά την οποία υποβλήθηκαν σε περαιτέρω αναλύσεις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση.

επούλωση πληγών Δοκιμασία

Για την ανίχνευση κυτταρικής κινητικότητας, εκθετικής φάσης κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων. Αφού τα κύτταρα έφθασαν σε συρροή σαν μονοστιβάδα κυττάρων επί του υποστρώματος πλάκα, ένα πλαστικό ρύγχος πιπέτας συντάχθηκε σε ολόκληρο το κέντρο της πλάκας για να παραχθεί ένα καθαρό ευρεία περιοχή του τραύματος 1 mm και το μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​ΚΡΜΙ1640 που περιείχε 1% ορό εμβρύου μόσχου . Μετά από 48 ώρες, η κίνηση των κυττάρων στην περιοχή του τραύματος εκτιμήθηκε με τη χρήση μικροσκοπίου αντίθεσης φάσης, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19,20].

Εισβολή Δοκιμασία

προσδιορισμοί κυττάρων εισβολής διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας μια πλάκα transwell (Corning, ΝΥ, USA) επικαλύφθηκαν με Matrigel (Becton Dickinson, NJ, USA). Εν συντομία, Matrigel αραιώθηκε σε μία συγκέντρωση 2 mg /ml, και 50 μΐ αυτού του διαλύματος τοποθετήθηκε σε ένα φίλτρο από πολυανθρακικό και ξηραίνεται στον αέρα. Μετά την έκπλυση με PBS, τα φίλτρα τοποθετήθηκαν σε φρεάτια και 700 μΐ RPMI-1640 μέσο καλλιέργειας συμπληρωμένο με 10% FBS προστέθηκε στο κατώτερο θάλαμο. Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε RPMI-1640 που περιείχε 1% FBS και 1 χ 105 κύτταρα σε 0,2 ml καθορισμένου μέσου απλώθηκαν εντός του άνω θαλάμου. Τα κύτταρα στους θαλάμους εισβολή επωάστηκαν σε υγροποιημένο επωαστή για 12-48 ώρες. Μετά από μία επιπλέον επώαση, τα κύτταρα που διείσδυσαν τους πόρους της μεμβράνης και διασπείρεται στην κάτω επιφάνεια των φίλτρων βάφτηκαν με διάλυμα 5% κρυσταλλικού ιώδους για την οπτικοποίηση. Ακολούθως, τα εισέβαλαν κύτταρα σε κάθε φρεάτιο μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός (Olympus, Tokyo, Japan) και ποσοτικοποιούνται από την οπτικοποίηση πέντε τυχαία πεδία με μεγέθυνση χ 200 και κατά μέσο όρο, όπως περιγράφεται από τον Albini [21]. Η δοκιμασία εισβολή επαναλήφθηκε 3 φορές. Η αξία του γραφήματος μπάρα αντιπροσωπεύει το μέσο αριθμό εισέβαλαν κυττάρων από 3 ξεχωριστά πειράματα.

ουραία φλέβα Μεταστατικό Δοκιμασία

Η ουρά φλέβα μεταστατικό δοκιμασίας προσδιορίστηκε όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [22]. Τριάντα ανδρικό γυμνό ποντίκια αντιμετωπίζονται σύμφωνα με τις καλύτερες ανθρώπινες πρακτικές και οι φροντίδες σύμφωνα με τις οδηγίες του ΝΙΗ Animal Care και την Επιτροπή Χρήσης. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας τρυψίνη και πλύθηκαν τρεις φορές με PBS. Οι ποντικοί στη συνέχεια εγχύθηκαν με 1 χ 106 κύτταρα σε 0.1 mL PBS μέσω ένεσης φλέβας της ουράς. Οι ποντικοί στη συνέχεια παρακολουθούνται για τη γενική υγεία και το συνολικό σωματικό βάρος. Την 28η ημέρα μετά την ένεση, τα ποντίκια θυσιάστηκαν. Lung και το ήπαρ ιστούς παρατηρήθηκαν με γυμνό μάτι και τον αριθμό των ορατών όγκων στην επιφάνεια των πνευμόνων και ήπατος μετρήθηκαν ποσοτικά. Lung και το ήπαρ ιστούς κόπηκαν σε σειριακές τομές, χρωματίζονται με αιματοξυλίνη και ηωσίνη, κατόπιν παρατηρείται κάτω από ένα μικροσκόπιο φωτός. Πειραματικές και ελέγχου ομάδες το καθένα περιείχε 6 ποντικούς. Όλες οι πειραματικές διαδικασίες εγκρίθηκαν από το Πρόνοιας επιτροπή δεοντολογίας και Πειραματική των ζώων, την τέταρτη Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο. πειράματα σε ζώα πραγματοποιήθηκαν με την έγκριση της Επιτροπής Θεσμικών για την έρευνα των ζώων, σύμφωνα με τις εθνικές κατευθυντήριες γραμμές για τη φροντίδα και τη χρήση των πειραματόζωων.

μετάσταση όγκου PCR Array

Η έκφραση της metastasis- συνδεδεμένων γονιδίων προσδιορίστηκαν με τη Human μετάσταση όγκου PCR Array (PAHs-028A? SuperArray Biosciences, Maryland, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Πρώτον, το συνολικό RNA εκχυλίστηκε από Ρόη-lentviral μολυσμένα SGC7901 κύτταρα και κύτταρα ελέγχου με τη χρήση τυποποιημένων πρωτοκόλλων, το οποίο στη συνέχεια μετατρέπεται σε cDNA πρώτου κλώνου. Το πρότυπο cDNA συνενώθηκε με 2 × SuperArray PCR μάστερ μιξ, προστέθηκαν στα φρεάτια μιας πλάκας Array PCR (384-φρεατίων) που περιέχουν τα σύνολα εκκινητών γονιδίου-ειδική, και υποβλήθηκαν σε πραγματικό χρόνο PCR. Οι συνθήκες των κύκλων της PCR ήταν ως ακολούθως: 40 κύκλοι στους 95 ° C για 15 s, 60 ° C για 1 λεπτό, και 72 ° C για 30 s. Πέντε γονίδια καθαριότητας χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικοί έλεγχοι. Η πολλαπλή μεταβολή στην έκφραση των γονιδίων μετάστασης που σχετίζονται προσδιορίστηκε με τη μέθοδο ΔΔCt.

Στατιστική Ανάλυση

Η ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού στατιστικής ανάλυσης SPSS 17.0 (Chicago, IL, ΗΠΑ). Το Mann-Whitney U χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η σημασία των διαφορών στη συχνότητα έκφρασης του Ρόη μεταξύ γαστρικού καρκινικούς ιστούς και μεταστάσεις λεμφαδένων. Η δοκιμή Kruskal-Wallis H για multi-ομάδες, και το Mann-Whitney U για δύο συγκρίσεις ομάδα χρησιμοποιήθηκαν για να αναλυθεί η σχέση μεταξύ των δύο επίπεδα έκφρασης Ρόη και διάφορα κλινικο-παθολογική παράγοντες γαστρικών δειγμάτων καρκίνου. Αθροιστική χρόνος επιβίωσης υπολογίστηκε με τη μέθοδο της επιβίωσης Kaplan-Meier και αναλύθηκαν από την δοκιμασία log-rank. Μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική αναλύσεις με βάση το μοντέλο παλινδρόμησης αναλογικού κινδύνου του Cox. Συγκρίσεις των ποσοτικών δεδομένων αναλύθηκαν με Τ-τεστ του Student μεταξύ δύο ομάδων. ανάλυση συσχέτισης μεταξύ της έκφρασης του Ρόη και CXCR4 εκτιμήθηκε με τη μέθοδο βαθμό συσχέτισης Spearman του. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές όταν Ρ 6049818149Gender0.742Male679232213Female2355103Differentiation0.005

aWell52120Moderately471215146Poorly380121610TNM stageT 0.001

aT194320T2175840T347414209T4171367N0.001

bN031111073N1-N3593182513M0.003

bM08014272811M1100145Table 1. Στατιστική Ανάλυση Δοκιμασία Ανοσοϊστοχημική

α, Kruskal-Wallis H δοκιμή.?

b, Mann-Whitney U Test CSV Λήψη CSV

Στη συνέχεια, μελετήσαμε τα επίπεδα έκφρασης του Ρόη στην πρωτοβάθμια γαστρικό καρκινικούς ιστούς και να συνδυαστούν οι ιστοί τους κόμβο μεταστατικό λέμφου. Τα επίπεδα έκφρασης του Ρόη απουσίαζαν σε 7 γαστρικό καρκινικούς ιστούς, εκφράζεται ασθενώς σε 16 ασθενείς με γαστρικό καρκίνο, μέτριας εκφράσεως σε 11, και εκφράζεται έντονα σε 6 καρκινικούς ιστούς, αντίστοιχα. Αντίθετα, σε λεμφαδένα μεταστάσεων ο αντίστοιχος αριθμός ήταν 3, 12, 14 και 11. Επιπλέον, η έκφραση του Ρόη ήταν σημαντικά υψηλότερη σε μεταστατικούς ιστούς λεμφαδένα από αυτή που βρέθηκε σε πρωτογενείς ιστούς του καρκίνου. Αυτές οι παρατηρήσεις έδειξαν ότι η έκφραση Ρόη συσχετίστηκε με μετάσταση στον καρκίνο του στομάχου (Πίνακας 2, Ρ 0.001 0.0010.80++11730+++0270Negative2008Table 4. Συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του Ρόη και CXCR4 σε 60 ζεύγη γαστρικός καρκίνος των ιστών.

CSV Λήψη CSV

CXCR4 είναι απαραίτητη για την επαγωγή εισβολή Ρόη στο γαστρικό καρκίνο κύτταρα

Για να διερευνηθεί η επίδραση της CXCR4 σχετικά με την ικανότητα του να λειτουργεί Ρόη στην μετάσταση του καρκίνου του στομάχου, ενισχύσαμε την έκφραση της σε κύτταρα CRCR4 SGC7901-M-siRhoE με βραδέος tranduction και ρυθμισμένα προς τα κάτω την έκφρασή του σε κύτταρα SGC7901-NM-Ρόη με siRNA παρεμβολή. Το επίπεδο της πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με ανάλυση κηλίδας Western (Εικόνα S2). Στην ακόλουθη δοκιμασία transwell, διαπιστώσαμε ότι η ενισχυμένη έκφραση του CXCR4 θα μπορούσε να αποκαταστήσει την επεμβατική ικανότητα των κυττάρων SGC7901-M-siRhoE, ενώ αντίθετα φίμωση ενδογενή CXCR4 καταπιεσμένη την εισβολή των κυττάρων SGC7901-NM-Ρόη (Σχήμα 5). Αυτές οι παρατηρήσεις έδειξαν ότι Ρόη επάγεται γαστρικού εισβολή των καρκινικών κυττάρων, η οποία εν μέρει μεσολαβείται από CXCR4. Αυτές οι παρατηρήσεις επίσης κατέδειξαν περαιτέρω ότι CXCR4 ήταν ένας στόχος κάτω-ροή του Ρόη.

Η επίδραση της CXCR4 στην Ρόη επαγόμενη μετάσταση μετρήθηκε με μία δοκιμασία transwell. Σε κύτταρα SGC7901-M-siRhoE, CXCR4 ενισχύθηκε ακόλουθη λοίμωξη οφειλόμενη σε φακοϊό. Στα κύτταρα SGC7901-NM-Ρόη, CXCR4 χτυπήθηκε έξω από τη θεραπεία με παρεμβολή siRNA. Ο αριθμός των εισβάλλοντας κυττάρων προσδιορίστηκε και παρουσιάζονται ως ιστογράμματα. * Ρ & lt? 0,05, σε συγκρίσεις μεταξύ των κυτταρικών σειρών που παρουσιάζουν διαφορετικά επίπεδα έκφρασης του Ρόη. ** Ρ & lt?. 0.05, σε συγκρίσεις μεταξύ κυτταρικές σειρές που εμφανίζουν διαφορική επίπεδα έκφρασης του CXCR4

Η

Συζήτηση

παρεκκλίνοντα-εκφράζεται Ρόη συχνά συνδέεται με την εξέλιξη του όγκου. Ωστόσο, ο ρόλος o Ρόη μπορεί να μετατοπιστεί μεταξύ ογκοκατασταλτικό και ογκογονιδίου ανάλογα με την προέλευση του όγκου [7-9]. Όπως αναφέρθηκε, γαστρικό καρκίνος παραμένει μια από τις πιο κοινούς καρκίνους παγκοσμίως, ειδικά στην Ανατολική Ασία. Προηγουμένως, έχει δειχθεί ότι ανώμαλη έκφραση Ρόη είναι καλά συσχετισμένη με την εξέλιξη του καρκίνου του στομάχου. Όπως περιγράφεται Zhou και Li, η έκφραση του Ρόη αυξάνεται σε καρκίνο του στομάχου με την επαγωγή του HIF-1α, και του οποίου η έκφραση θα μπορούσε να πάει επαυξημένης ακόμη περισσότερο, όταν τα καρκινικά κύτταρα παράγουν αντίσταση στα φάρμακα κατά του όγκου. Επιπλέον, η ενισχυμένη έκφραση του Ρόη προωθεί αντοχής φαρμάκου με την καταστολή της έκφρασης Bax [13,24].

Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι η έκφραση Ρόη ανυψώθηκε σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς, ενώ ήταν απούσα ή ασθενώς εκφράζεται σε παρακείμενες μη ογκογόνους ιστούς. Επιπλέον, κλινικά στοιχεία έδειξαν ότι Ρόη υπερ-έκφραση συσχετίστηκε σημαντικά με τις μοίρες της διαφοροποίησης των καρκινικών κυττάρων και ΤΝΜ σταδιοποίηση, η οποία αποτελείται από το μέγεθος του όγκου (Τ), λεμφαδένα εισβολή (Ν) και μετάσταση (Μ). Το πιο σημαντικό, τα επίπεδα έκφρασης ήταν Ρόη ένα ανεξάρτητο και σημαντικό παράγοντα κινδύνου για την επιβίωση σε γαστρικό καρκίνο. Επιπλέον, up-ρυθμισμένη έκφραση του Ρόη θα μπορούσε να προβλέψει μια κακή έκβαση σε ασθενείς με καρκίνο του στομάχου. Στο σύνολό τους, τα δεδομένα μας υποδηλώνουν έντονα ότι η Ρόη θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως ένα ογκογονίδιο σε καρκίνο του στομάχου και έπαιξε θετικό ρόλο στη γαστρική εξέλιξης του καρκίνου, ειδικά στη μετάσταση του καρκίνου. Είναι τυπικά δυνατόν ότι Ρόη θα μπορούσε να είναι ένα νέο προγνωστικός παράγοντας σε ασθενείς με καρκίνο του στομάχου. Έτσι, θεωρώντας ότι η μετάσταση είναι ένας από τους βασικούς λόγους για γαστρικό θνησιμότητα από καρκίνο, τα ευρήματά μας θα μπορούσε να παράσχει μία νέα ένδειξη ή νέο στόχο για την αναστολή της μετάστασης όγκου σε γαστρικό καρκίνο και ενδέχεται τελικά να βοηθήσει στην ανάπτυξη θεραπευτικών στρατηγικών για την παράταση της επιβίωσης των ασθενών.

Παρ ‘όλα αυτά, ο ρόλος του Ρόη στη μετάσταση του καρκίνου παραμένει μερικώς απροσδιόριστο. Σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα κυττάρων και μεσεγχυματικών όγκων, αυξημένη έκφραση Ρόη συσχετίζεται με μειωμένη μεταστατική ικανότητα, ενώ στα κύτταρα του μελανώματος, Ρόη προάγει τη μετανάστευση κυττάρων και εισβολή [10,12,25]. Για να διερευνηθεί ο ρόλος του Ρόη στη μετάσταση του καρκίνου του στομάχου, εμείς γκρέμισε Ρόη στην κυτταρική γραμμή SGC7901-M, το οποίο έχει ένα υψηλό μεταστατικό δυναμικό και επαγόμενη έκφραση της στην SGC7901-NM κυτταρική γραμμή, η οποία είναι φτωχή σε μετάσταση . Στη συνέχεια,

in vitro

προσδιορισμοί έδειξαν ότι η αυξημένη Ρόη προωθείται κυτταρική κινητικότητα και διεισδυτικότητα, ενώ μειώθηκε Ρόη οδήγησε σε μια μη επεμβατική χαρακτήρας του γαστρικού καρκίνου κύτταρα. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω από το

in vivo

δοκιμασία. Είναι γνωστό ότι η ενισχυμένη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή είναι απαραίτητα βήματα για την τελική διαμόρφωση των μεταστάσεων. Ως εκ τούτου, σε γαστρικό καρκινικά κύτταρα, Ρόη μπορούσε να είναι ένα λειτουργικό γονίδιο μετάστασης προαγωγής. Παρ ‘όλα αυτά, έχουμε παρατηρήσει επίσης ότι η μορφολογία των κυττάρων άλλαξε πολύ μετά την αλλαγή της έκφρασης Ρόη. Περαιτέρω έρευνες διαπιστώθηκε ότι αυτή η μορφολογική αλλαγή θα μπορούσε να προκληθεί από την εξαφάνιση του ίνας στρες (Σχήμα S3b), παρά την αλλαγή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού.

Όπως έχει ήδη αναφερθεί, η Ρόη ρυθμίζει τη μετάσταση του καρκίνου, και το κάνει κυρίως με την αναστολή της ROCK /MYPT μονοπατιού [26].