Αφηρημένο

RNU2 υπάρχει σε δύο λειτουργικές μορφές (RNU2 -1 και RNU2-2) διακρίνονται από την παρουσία ενός μοναδικού 4-βάσεις μοτίβο. Λεπτομερή διερεύνηση των συνόλων δεδομένων που λαμβάνονται από το βαθύ αλληλουχίας των πέντε ανθρώπινου πνεύμονα πρωτοπαθών όγκων αποκάλυψε ότι οι δύο μορφές εκφράζουν με υψηλό ρυθμό ένα 19-22nt θραύσματος (miR-U2-1 και -2) από την «περιοχή του 3 και περιέχει τα 4-βάσεις μοτίβο . Βαθιά αλληλουχίας των ανεξάρτητων δεξαμενών δειγμάτων ορού από υγιείς δότες και ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα αποκάλυψε ότι το miR-U2-1 και -2 είναι διάχυτα σε επεξεργασία σε πνευμονικό ιστό μέσω ενδονουκλεολυτική διασπάσεις και σταθερά εξάγονται στο αίμα. Στη συνέχεια, τα πειράματα μικροσυστοιχιών υβριδοποίηση αντίστοιχα δείγματα κανονικής /όγκου αποκάλυψε μια σημαντική υπερ-έκφραση του miR-U2-1 σε 14 από 18 πνευμόνων πρωτοπαθών όγκων. Στη συνέχεια, qRT-PCR του miR-U2-1 χρησιμοποιώντας ορό από 62 ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα και 96 διαφόρων ελέγχων έδειξαν ότι τα επίπεδα έκφρασης του εντοπισμό ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα με 79% ευαισθησία και 80% ειδικότητα. έκφραση miR-U2-1 συσχετίζεται με την παρουσία ή απουσία καρκίνου του πνεύμονα σε ασθενείς με χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια (ΧΑΠ), άλλες ασθένειες του πνεύμονα – μη καρκίνος, και σε υγιείς μάρτυρες. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι RNU2-1 είναι μια νέα διλειτουργικά ncRNA που παράγει μια 19-22nt θραύσμα το οποίο μπορεί να είναι χρήσιμα στην ανίχνευση του καρκίνου του πνεύμονα με μη επεμβατικό σε ασθενείς υψηλού κινδύνου

Παράθεση:. Mazières J, Catherinne C , Delfour O, Gouin S, Rouquette Ι, Delisle MB, et al. (2013) Εναλλακτική επεξεργασία του U2 μικρού πυρηνικού RNA Παράγει ένα 19-22nt Θραύσμα που παρουσιάζει ενδιαφέρον για τον εντοπισμό των μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα σε ανθρώπινο ορό. PLoS ONE 8 (3): e60134. doi: 10.1371 /journal.pone.0060134

Επιμέλεια: Liang-Hu Qu, η Sun Yat-sen University, η Κίνα

Ελήφθη: 23 του Νοεμβρίου του 2012? Αποδεκτές: 21 Φεβρουαρίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 20 Μάρτη 2013

Copyright: © 2013 Mazières et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το πρόγραμμα , ειδικότερα τη συλλογή του αίματος, υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από το Περιφερειακό Συμβούλιο Midi-Pyrénées. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, η ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν έχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα. Η υπαγωγή των πολλών συγγραφέων να Cepheid Company δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις πολιτικές PLoS ONE.

Εισαγωγή

Η εξερεύνηση του RNA μη-κωδικοποίησης πρωτεΐνης (ncRNA) μεταγραφικό σε ανθρώπινα κύτταρα και ιστούς έχει από καιρό επικεντρώθηκε σε προφίλ microRNAs. Η εμφάνιση της υψηλής απόδοσης τεχνολογίες αλληλουχίας Next Generation (NGS) επέτρεψε την ταυτοποίηση νέων τύπων ncRNAs και άνοιξε το δρόμο για τη μελέτη των λειτουργικών ενώσεις τους [1]. Τα περισσότερα νέα είδη ncRNA έχουν τώρα ανακαλύψει χρησιμοποιώντας NGS προσεγγίσεις [2] – [5]. Δεδομένου ότι τα λειτουργικά ncRNAs πιστεύεται να προστατεύονται από την αποδόμηση λόγω της σύνδεσής τους με πρωτεΐνες και τη συσκευασία σε σωματίδια, και ως εκ τούτου είναι σταθερά, NGS προσφέρει το μοναδικό πλεονέκτημα ότι είναι σε θέση να ανιχνεύσει την ταυτόχρονη έκφραση χιλιάδων λειτουργικών μικρών RNA μεταγραφές σε μια ενιαία τύπο ιστού, αποκαλύπτοντας ένα νέο επίπεδο πολυπλοκότητας στην παραγωγή μικρών ncRNAs σε ανθρώπινα κύτταρα, ιστούς και όργανα κάτω από διάφορες φυσιολογικές συνθήκες [2], [4], [8]. Η πολύ υψηλή ευαισθησία των μεθόδων NGS επέτρεψε επίσης την ανακάλυψη προηγουμένως απαρατήρητα »isomirs« παράγεται από μηχανισμούς μετα-μεταγραφικής επεξεργασίας, single-νουκλεοτίδιο μη-πρότυπο 3 ‘αδενοσίνη ή προσθήκες ουρακίλη που χρησιμεύει ως ένα παράδειγμα [6], [7]. Επιπλέον, αποδείχθηκε πρόσφατα ότι μία μόνο ncRNA μπορεί να παραγάγει διαφορετικά προϊόντα όχι απλά μέσω τυχαίας αποικοδόμησης αλλά μέσω ειδικών ρύθμιση των πολλαπλών σταδίων επεξεργασίας που περιλαμβάνουν Dicer [9] ή άλλα ένζυμα [10], [11]. Τέτοια εναλλακτική επεξεργασία ncRNA θα μπορούσε να εξηγήσει πώς μια ενιαία πρωταρχική μεταγραφή ncRNA μπορεί να υποβοηθούν περισσότερες από μία λειτουργία, ανάλογη με το εναλλακτικό μάτισμα του pre-mRNA μεταγραφές. Έτσι, η αυξανόμενη συλλογή των δι-λειτουργικών ncRNAs προσφέρει μια νέα άποψη της ανθρώπινης βιολογίας, όπως φαίνεται μέσα από το φακό της NGS.

Αυτά τα πρόσφατα ανακαλύφθηκαν τάξεις των μικρών RNA που παράγεται από ncRNAs με ένα άλλο μερίδιο λειτουργία κάποια κοινά χαρακτηριστικά με microRNA. Υπάρχει τώρα εκτεταμένες ενδείξεις ότι πολλές tRNAs παράγουν tRNA-παράγωγων κανονιστικών μικρά RNAs (smRNAs) [9], [11] – [13]. Άφθονα μικρά RNAs 18-22 nt σε μήκος, επεξεργάζονται ταυτόχρονα από το 5 ‘και 3’ άκρα των ώριμων tRNAs, καθώς και από το 3 ‘περιοχές τρέιλερ της προ-tRNAs. Το ώριμο 3 ‘πληθυσμού (που ονομάζεται επίσης τύπου Ι) βρέθηκε να είναι Dicer εξαρτώμενα και συμπλοκοποιημένη με Αργοναύτες 1-4. Σε αντίθεση, η προ-tRNA 3 ‘πληθυσμού ρυμουλκούμενου (τύπου II) είναι Dicer ανεξάρτητη και φαινομενικά περιλαμβάνει τη δράση ΚΝάσης Ζ Επιπλέον, τα RNAs τύπου II βρέθηκαν να συμπλοκοποιηθεί με Αργοναύτες 3 και 4 και σε πολύ μικρότερο βαθμό, να Αργοναύτες 1 και 2 [13]. Συγκεντρώνεται στην πυρηνίσκους, αρκετές snoRNAs λειτουργία στην επεξεργασία των ριβοσωματικών RNA (rRNA) κατά τη διάρκεια της βιοσύνθεσης του ριβοσώματος υπομονάδας και του συνέρχεσθαι. Ωστόσο, οι περισσότεροι από αυτούς χρησιμεύει ως οδηγός για την ενζυματική τροποποίηση της rRNAs στόχου και snRNAs συρραφής U6 σε νουκλεοτίδια που επιλέγονται από την RNA: αντιπληροφοριακό RNA αλληλεπιδράσεις [14], [15]. SnoRNAs κατατάσσονται σε δύο ομάδες, οι C /D κουτί snoRNAs που καταλύουν 2 ‘O ριβόζη μεθυλίωση [16], και οι snoRNAs κουτί Η /ACA που εισάγουν τροποποιήσεις ψευδουριδίνης [17]. Πρόσφατες βιοπληροφορικής αναλύσει μικρών βιβλιοθηκών RNA έχουν προτείνει την ύπαρξη smRNAs που προέρχονται από ορισμένα από τα snoRNAs μετά από επεξεργασία [18] – [21]. H /ACA και C /D που προέρχεται κουτί ncRNAs χρησιμοποιούν αποκλίνουσες πορείες βιογένεση ανάλογα με τον τύπο του προδρόμου υφίσταται επεξεργασία snoRNA [21] – [23]. H /ACA προερχόμενα ncRNAs είναι κυρίως 20-24 nt σε μήκος και προέρχονται από το άκρο 3 ‘. Η παραγωγή τους είναι ανεξάρτητη από Drosha, αλλά απαιτεί τη δράση του Dicer [18]. Αντίθετα, η C /D που προέρχεται ncRNAs είναι είτε 17-19 nt ή & gt? 27 nt σε μήκος και κατά κύριο λόγο προέρχονται από το 5 ‘άκρο [21]. Η μεγάλη ποικιλία των δευτερογενών δομών τους, προτείνει Dicer ανεξάρτητη επεξεργασία με βάση ago2 δραστηριότητα ενδονουκλεάση παρόμοια επεξεργασία με προ-miR-451 [24]. Αρκετά παραδείγματα smRNAs που προέρχονται από προδρόμους tRNA ή snoRNA έχουν ήδη αποδειχθεί ότι έχουν πιθανές βιολογικές λειτουργίες [9], [11], [27], [28].

Σύντομη διαβάζει επίσης παράγονται από μια ευρεία ποικιλία από άλλους τύπους δομημένων ncRNAs όπως 7SL, 5S, Υ1 και Υ3 [25]. Τα RNA θόλο που εμπλέκονται στην πολυφαρμάκου αντίσταση και ενδοκυτταρική μεταφορά σε ανθρώπους έχουν πρόσφατα δειχθεί να παράγει μια ομάδα από ~ 23-nt RNAs σε ένα Drosha ανεξάρτητη αλλά Dicer μεσολάβηση βήμα επεξεργασίας [26]. Ένα από τα θόλο που προέρχονται ncRNAs συνδέεται με τις πρωτεΐνες Argonaute και μεσολαβεί διάσπαση mRNA, μιμούνται το κλειδί μικρο-RNA-όπως χαρακτηριστικά.

Όλα αυτά τα παραδείγματα δείχνουν ότι η εναλλακτική επεξεργασία ncRNAs μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα σημαντικό μηχανισμό με τον οποίο λειτουργική ποικιλομορφία για ncRNAs επιτυγχάνεται, και επιπλέον σημαίνει ότι το νέο στρώμα της ρυθμιστικής επιρροής και ελέγχου που επιβάλλονται από ncRNAs στη γονιδιακή έκφραση μπορεί να είναι θεμελιώδους σημασίας για την βιολογία. Κάποιος μπορεί να φανταστεί κανείς μόνο τον πιθανό αντίκτυπο της smRNAs προέρχεται από ncRNAs με άλλη λειτουργία στην έκφραση των μεταβολικών ενδιαμέσων σε διάφορες φυσιολογικές καταστάσεις, καθώς και η επίδραση σε βασικά διαμεσολαβητές της μεταγωγής σήματος σε διαφορετική παθοφυσιολογική καταστάσεις, όπως ο καρκίνος.

σε αντίθεση με snoRNAs και tRNAs, λίγα είναι γνωστά για snRNAs που είναι συστατικά του συμπλόκου σωμάτια συναρμογής, κατευθύνοντας την ακριβή αφαίρεση του ιντρονικές αλληλουχίες από την προ-mRNAs [29]. Ωστόσο, πρόσφατα πειράματα NGS πρότεινε ότι snRNAs συρραφής U1, U2, U6 και U12 συσσωρεύονται μικρές αλληλουχίες RNA [25], ενώ ανοσοκατακρήμνισης με πρωτεΐνες Argonaute επέτρεψε την ταυτοποίηση πριν δεσμεύεται θραύσματα RNA από U1, U2 και U12 [30]. Πιο πρόσφατα, ένα θραύσμα του RNU2-1 δείχθηκε υπερεκφράζεται σε παγκρεατικά και του παχέος εντέρου σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό από εκείνα τα όργανα [31]. Για την καλύτερη κατανόηση αν η έκφραση μικρών θραυσμάτων ncRNA προκύπτουν από εναλλακτικό επεξεργασίας σχετίζονται με την ύπαρξη της νόσου, μετρήσαμε τα επίπεδα των θραυσμάτων που παράγονται από την U2 snRNA από διάφορες μεθοδολογίες στον πνευμονικό ιστό και ορό ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα, και τους σε σύγκριση με τα επίπεδα RNU2 στον ορό των ασθενών σε κίνδυνο για καρκίνο του πνεύμονα (ασθενείς με COPD), καθώς και τους φυσιολογικούς υγιείς μάρτυρες. RNU2 είναι ένα από τα πιο υψηλής έκφρασης ncRNAs και εκφράζεται κατά προτίμηση σε πνευμονικό ιστό [32]. Συνδυάζοντας NGS, πειράματα υβριδισμού μικροσυστοιχιών και qRT-PCR, πραγματοποιήσαμε μια λεπτομερή ανάλυση των RNU2 προερχόμενων smRNAs στον πνεύμονα πρωτογενείς όγκους, σε συνδυασμό παρακείμενο φυσιολογικό πνευμονικό ιστό από τους ίδιους ασθενείς, καθώς και δείγματα ορού από ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα και υγιείς μάρτυρες, καθώς και ως μάρτυρες με άλλες ασθένειες των πνευμόνων – όχι καρκίνο. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι miR-U2, ένα 19-22nt προϊόν του RNU2 εναλλακτικής επεξεργασίας, επιτρέπει την διάκριση των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα από εκείνους με ΧΑΠ, αλλά χωρίς καρκίνο και εγείρει την πιθανότητα ότι οι μετρήσεις των επιπέδων miR-U2 ορό βάση θα μπορούσε να είναι χρησιμοποιείται ως μη επεμβατική, χαμηλού κόστους, νωρίς εργαλείο διαλογής για την επιλογή των ασθενών για περαιτέρω αξιολόγηση με προηγμένα διαγνωστικά απεικόνισης, όπως σπιράλ σάρωση CT.

Υλικά και Μέθοδοι

δείγματα Συλλογή

δείγματα ιστού και δείγματα ορού συλλέχθηκαν σε Νοσοκομείο Rangueil και το Νοσοκομείο Larrey, Τουλούζη, Γαλλία. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλα τα άτομα πριν από την εγγραφή τους σε αυτή τη μελέτη και η μελέτη εγκρίθηκε από κατάλληλα διοικητικά συμβούλια θεσμική αναθεώρηση. Όλα τα αρχεία ήταν ανώνυμα για την προστασία του απορρήτου των ατόμων. Τα κλινικά δεδομένα συλλέχθηκαν για κάθε άτομο κατά τη στιγμή του ιστού ή τη συλλογή του αίματος. Κλινικό στάδιο προσδιορίστηκε σύμφωνα με την 7

ου Διεθνούς Ένωσης για τη Μελέτη του Καρκίνου του Πνεύμονα συστήματος [33] στάσης. Για οκτώ ασθενείς από τους δεκαοκτώ ετών που χειρουργήθηκαν για καρκίνο του πνεύμονα, σε συνδυασμό πρωτογενούς όγκου και περιφερικό φυσιολογικό δείγματα ιστών συλλέχθηκαν. Το αίμα των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα συλλέχθηκε κατά το χρόνο της διάγνωσης, αλλά πριν από την εκτομή του όγκου ή σε οποιαδήποτε ειδική θεραπεία. Πέντε ml αίματος συλλέχθηκαν από κάθε άτομο σε SST σωλήνες και αμέσως επεξεργασία. Οι σωλήνες αναμίχθηκαν με λίγες αναστροφές, και στη συνέχεια να θέσει σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά για την πήξη του. Οι σωλήνες στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν (1000 g στους 4 ° C) για 10 λεπτά. Τέλος, το κλάσμα ορού δειγματίστηκε σε 1 ml σωλήνες και αποθηκεύονται αμέσως στους -80 ° C μέχρι τη στιγμή της χρήσης. 45 υγιή δείγματα ελέγχου ήταν επίσης αγοράστηκαν από Asterand και επεξεργάζονται με τον ίδιο τρόπο. Οργανώσαμε αυτή την ομάδα σε πέντε ομάδες. Τρεις ομάδες ελέγχου περιέχουν άτομα χωρίς καρκίνο του πνεύμονα: 1) μόνο άτομα χωρίς συμπτώματα της νόσου κατά τη στιγμή της κλήρωσης αίματος. Μπορούν να θεωρηθούν «υγιή» άτομα. 2) ασθενείς με πνευμονική νόσο η οποία δεν είναι COPD. Αυτή η ομάδα αποτελείται κυρίως από άτομα που πάσχουν από άσθμα, βρογχίτιδα, και πνευμονικές λοιμώξεις. 3) ασθενείς με ΧΑΠ χωρίς οποιαδήποτε ένδειξη του καρκίνου του πνεύμονα κατά το χρόνο της κλήρωσης αίμα. Οι ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα χωρίστηκαν σε δύο ομάδες: 1) όλοι οι ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα χωρίς συμπτώματα COPD, και 2) ασθενείς που υποφέρουν τόσο από καρκίνο του πνεύμονα και η ΧΑΠ

Εκχύλιση-Καθαρισμός του RNA

.

RNA εξήχθη από 0,5 ml ορού χρησιμοποιώντας το κιτ Qiagen mini miRNeasy, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μια ακίδα-in ελέγχου (Cel-miR-39) προστέθηκε μετά το πρώτο βήμα μετουσίωσης.

Αρχείο ή πρόσφατα snap-κατεψυγμένα δείγματα ιστού ομογενοποιούνται με γουδί και γουδοχέρι σε TRIzol® αντιδραστηρίου Τεχνολογίες Ζωής (Carlsbad, CA ) και το RNA εκχυλίστηκε περαιτέρω σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το μικρό κλάσμα RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το Flash ΣΕΛΙΔΑ κλασμάτωσης (Ambion). Όλα τα δείγματα microRNA αραιώθηκαν σε RNase-free νερό και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C.

Deep αλληλουχίας και θεραπεία δεδομένα

πειράματα Βιβλιοθήκη προετοιμασία και ανάλυση αλληλουχίας χρησιμοποιώντας RNA που καθαρίστηκε από δείγματα ιστών ή ορού πραγματοποιήθηκαν από Fasteris (Ελβετία). Εν συντομία, τα θραύσματα RNA (16-30 nt ή 25-50 nt) καθαρίστηκαν με πηκτή που ακολουθείται από σύνδεση του μονόκλωνου RNA 3 ‘και 5’ προσαρμογείς. Ένα στάδιο καθαρισμού σε πήκτωμα ακρυλαμιδίου έγινε πριν από την αντίστροφη μεταγραφή και ενίσχυση PCR για να δημιουργηθεί η βιβλιοθήκη DNA εκμαγείο αποικία. Τα cDNA καθαρίστηκαν με γέλη και η βιβλιοθήκη ποσοτικοποιήθηκε πριν την αραίωση έως 10 ηΜ. Τα αραιωμένα βιβλιοθήκες cDNA στη συνέχεια αλληλουχήθηκαν χρησιμοποιώντας την τεχνολογία Illumina HiSeq. Η ακολουθία διαβάζει υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένα συνδυασμό των αλγορίθμων βιοπληροφορικής και χειροκίνητη επιμέλεια για την απομάκρυνση των 5 ‘και 3’ άκρο προσαρμογείς (Πίνακας S7). Μόνο το διαβάζει από 19nt καιρό ή και περισσότερο μετά την αφαίρεση του προσαρμογέα κρατήθηκαν για ανάλυση. Η 5 ‘και 3’ άκρα αναντιστοιχίες κόπηκαν μέχρι διαβάζει τέλειο αγώνα. Διαβάζει από τις διάφορες βιβλιοθήκες ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τον συνολικό αριθμό των διαβάζει κάθε βιβλιοθήκη και εκφράζονται ως διαβάζει ανά εκατομμύριο (RPM) για τον σκοπό της σύγκρισης των σχετικών επιπέδων έκφρασης. Μόνο διαβάζει με ένα μοναδικό αγώνα για το ανθρώπινο γονιδίωμα χρησιμοποιήθηκαν (NCBI χτίσει 37). Έτσι, διαβάζει χαρτογράφησης για λειτουργικά γονίδια RNU2 χάρτη σε κανένα άλλο γονιδιωματική θέση. Δεν επετράπη εσωτερικές αναντιστοιχίες. Για μεγαλύτερη εμπιστοσύνη, μόνο RNA με τουλάχιστον πέντε RPM θεωρήθηκαν για περαιτέρω ανάλυση.

μικροσυστοιχίες υβριδισμός Πειράματα

Nexterion (Schott) γυάλινα πλακίδια μικροσυστοιχιών χρησιμοποιήθηκαν ως στερεό υπόστρωμα για την μικροσυστοιχιών. Προσαρμοσμένη στο σπίτι σχεδιασμένο ολιγονουκλεοτίδια εντοπίστηκαν στην επιφάνειά τους. Η επισήμανση του microRNA προσαρμόστηκε από Castoldi et al. 2006 [34]. Το σημασμένο κλάσμα microRNA υβριδοποιήθηκε στους στίγματα συστοιχίες χρησιμοποιώντας το σταθμό υβριδοποίησης Discovery (Ventana, Tucson, ΑΖ). Οι συστοιχίες σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας το σαρωτή Αχοη (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) και τα δεδομένα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό GenePix. Έξι σε σπίτι σχεδιασμένο ακίδα-in εσωτερικοί έλεγχοι χρησιμοποιήθηκαν για την κανονικοποίηση των δεδομένων. Αυτά τα συνθετικά στοιχεία ελέγχου RNA προστέθηκαν στο συνολικό κλάσμα RNA πριν την υβριδοποίηση. Όλες οι σειρές για τις οποίες η ένταση του τόπου ήταν υψηλότερη από τη μέση τοπική ένταση φόντο συν 1,5 φορές την τυπική απόκλιση της κατηγοριοποιήθηκαν όπως εκφράζεται microRNAs. Στατιστική κανονικοποίηση των δεδομένων έγινε με τον υπολογισμό του Log

2 αναλογία όπου η Σύνδεση

2 αναλογία = μέση ένταση σήματος του διπλές κηλίδες /διάμεση ένταση όλων των εσωτερικών ελέγχων για το μπλοκ. Η κανονικοποίηση έγινε ανά μπλοκ για την αποφυγή μη ομοιογενή σήμανση (Πίνακας S4). δεδομένα μικροσυστοιχιών αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το πακέτο R βιομεταβιβαστή [35]. Η σχετική έκφραση του κάθε microRNA υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την 2

-ΔΔCT μέθοδο [36]. Η «MeV 4.8.1» (MultiExperimentViewer) [37] χρησιμοποιήθηκε για την ιεραρχική ανάλυση ομαδοποίησης, όπου επιλεγμένα miRNAs ήταν συγκεντρωμένα χρησιμοποιώντας Ευκλείδεια απόσταση.

qRT-PCR του miR-U2 έκφραση

Έκφραση επίπεδα miR-U2-1 αξιολογήθηκαν από qRT-PCR χρησιμοποιώντας το Exiqon έθιμο LNA

TM εκκινητές (Exiqon, Vedbaek, Denmark) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Παρά το γεγονός ότι οι εναρκτήρες ήταν σχεδιασμού για την ανίχνευση της ισομορφή UGGAUUUUUGGAGCAGGGAG οι εκκινητές Exiqon επιτρέπουν την ανίχνευση των άλλων ισομορφών (Πίνακες S5 και S6). Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Λόγω της έλλειψης housekeeping ορού μικρών ncRNAs, εμείς κανονικοποιούνται συγκέντρωση microRNA με τον αρχικό όγκο του ορού (500 μl). Ένα εξωγενές ακίδα-in ελέγχου (Cel-miR-39) χρησιμοποιήθηκε επίσης προκειμένου να ελεγχθεί η ορθότητα των αποτελεσμάτων. Υπολογίσαμε τη μήτρα τιμή ΔCt για κάθε δείγμα αφαιρώντας την τιμή αριθμού κύκλο κατωφλίου (Ct) για miR-U2 από την τιμή Ct της Cel-miR-39. Μία μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA) χρησιμοποιήθηκε για στατιστική ανάλυση σύγκριση των δειγμάτων πληθυσμών και τις ομάδες ελέγχου. Η περιοχή κάτω από την καμπύλη (AUC) υπολογίστηκε για τις καμπύλες δέκτη χειριστή (ROC). Αποτελέσματα προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας την ομαλοποίηση στην Cel-miR-39 ακίδα-in και εξομάλυνση με τον όγκο του ορού συγκρίθηκαν.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

πνευμόνων πρωτοπαθών όγκων εξαιρετικά εκφράζουν μια 19-22nt ncRNA μεταποιημένα RNU2

Το ανθρώπινο γονιδίωμα κωδικοποιεί δύο λειτουργικά γονίδια snRNA U2, RNU2-1 και RNU2-2 που βρίσκονται σε 17q21.31 και 11q12.3 αντίστοιχα. Η γονιδιωματική οργάνωση των δύο γονιδίων RNU2 διαφέρει ριζικά. RNU2-2 είναι παρούσα σε ένα μόνο αντίγραφο, ενώ RNU2-1 είναι οργανωμένη σε ένα σύμπλεγμα από 6 έως -30 σειρά επαναλαμβανόμενα αντίγραφα που εκτείνονται σε 30 έως 150 kb. Κάθε επαναλαμβανόμενη μονάδα είναι 6.1 kb μακρύ, περιέχει ένα μόνο γονίδιο RNU2-1 και είναι εξαιρετικά διατηρημένη με άλλες μονάδες επανάληψης. Αν και RNU2-1 διαφέρει σε αριθμό αντιγράφων του γονιδίου από άτομο σε άτομο, οι συστοιχίες είναι σταθερά κληρονομείται, υπόκεινται σε αποζημίωση δοσολογίας και μεταγράφεται σε ασυνήθιστα υψηλό ποσοστό. Για να ανακαλύψετε εάν οι μικρές ncRNAs θα μπορούσε να επεξεργαστεί αποτελεσματικά από τα δύο λειτουργικά γονίδια RNU2 και να οριοθετηθούν με ακρίβεια τα εν λόγω προϊόντα, που αποκωδικοποίησε το μικρό RNA μεταγραφικό πέντε ανθρώπινου καρκίνου του πνεύμονα πρωτοπαθείς όγκους, καθώς και τρεις πισίνες των δειγμάτων ορού, ένα από υγιείς δότες και δύο από ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα (Πίνακας 1). Προσδιορισμό της αλληλουχίας των σχετικών δειγμάτων παράλληλα ελαχιστοποιεί το ποσοστό των εσφαλμένων ανακάλυψη ncRNAs. ncRNAs που είναι πραγματικά υπερεκφράζεται θα αναμενόταν να βρεθεί σε πολλαπλά ανεξάρτητα δείγματα. Σε ένα πρώτο βήμα, έχουμε χαρτογραφηθεί ο διαβάζει ακολουθία από επτά βιβλιοθήκες που παρασκευάζονται από πρωτογενείς όγκους, πέντε μικρού μεγέθους (16-30nt) και δύο μακριά μεγέθους (25-50nt) απευθείας επάνω στην RNA αλληλουχία των λειτουργικών γονιδίων RNU2. Ο τόπος RNU2-1 στο χρωμόσωμα 17 ήταν στην πραγματικότητα απομακρύνεται από το συγκρότημα του ανθρώπινου γονιδιώματος από την έκδοση Build 37 (NCBI Σχολιασμός Πληροφορίες Gene ID: 6066, ενημερώθηκε στις 20-Απρ-2012). Η μεγάλη πλειοψηφία των διαβάζει από τις πέντε μικρές μεγέθους βιβλιοθήκες χαρτογραφεί σε μια μοναδική τοποθεσία ανάμεσα στις θέσεις 93 και 114 του RNU2-1 (Σχ. 1α-β). Οι πιο υψηλή έκφραση διαβάζει κυμαίνεται από 19 έως 22nt σε μήκος. Αυτό το θραύσμα RNA ονομάζεται miR-U2-1. Αξιοσημείωτα, μικρά RNA αλληλούχιση από τις τρεις πισίνες του δείγματα ορού έδειξαν ότι miR-U2-1 είναι παρούσα στην κυκλοφορία του αίματος και στα δύο ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα και σε υγιή άτομα, αποκαλύπτοντας διάχυτη έκφραση του (Εικ. 1c-d). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι το miR-U2-1 ενεργά εξάγονται παρά παθητικά απελευθερώνεται στην κυκλοφορία. Μόνο ένα υποσύνολο των miRNAs έχει πράγματι ανιχνευθεί έξω από τα κύτταρα [38] -. [41], έτσι miR-U2-1 μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα επιπλέον μέλος αυτής της κατηγορίας

Μικρές διαβάζει ανιχνεύεται στο Δημοτικό όγκους (α) και δείγματα ορού (γ). Long-διαβάζει ανιχνεύονται στο Δημοτικό όγκους (ε). Ο κωδικός χρώματος δείχνει τον αριθμό των φυσιολογικών διαβάζει ανιχνεύονται σε κάθε βιβλιοθήκη. Η κόκκινη γραμμή τοποθετεί miR-U2. Ο αριθμός των διαβάζει ανάλογα με το μέγεθός τους δίνεται στο (β) για τις πρωτογενείς όγκους, το (δ) για τα δείγματα ορού.

Η

Μεταξύ του πληθυσμού των διαβάζει παρούσα σε πρωτοπαθείς όγκους όπως καθώς και στον ορό, παρατηρήσαμε μια συσσώρευση θραυσμάτων RNA αρχίζοντας από τη θέση «Α-94» ή «Α-95» και καταλήγει στην θέση «G-113» ή «Α-114» (Εικ. 2). Αυτό περιορισμένο αριθμό 5 ‘και 3’ άκρο διαβάζει αντιστοιχεί σε μια συγκεκριμένη και μικρός πληθυσμός των παραλλαγών ή isomirs, μια συνήθως χαρακτηριστικό των microRNAs. Μαζί, αυτές οι isomirs miR-U2-1 αντιπροσωπεύουν περισσότερο από το 75% των διαβάζει ταιριάζουν αποκλειστικά σε αυτή την περιοχή της RNU2-1. επίπεδα έκφρασης τους είναι της τάξης των κανονικών microRNAs όπως mir16, miR-17, miR-200A ή miR-451 (Πίνακας S1). Αυτή η σημαντική συσσώρευση ενός μοναδικού και με ακρίβεια διασπασμένο θραύσμα RNA από RNU2-1 αποτελεί σαφή στοιχεία που ευνοούν την υπόθεση ότι τα συγκεκριμένα γεγονότα επεξεργασία παράγει ένα νέο λειτουργικό ncRNA, miR-U2-1, παρά την εναλλακτική εξήγηση, ότι αυτοί είναι οι τυχαίες προϊόντα αποδόμηση του RNA. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν περαιτέρω ότι miR-U2-1 προστατεύεται κατά των ενδο- και εξω-νουκλεολυτικήν πέψη ΚΝάσης δυνάμει της συσκευασίας σε πολύπλοκες νουκλεοπρωτεΐνη σωματίδια. miR-U2-1 μπορούν επίσης να συσκευάζονται σε μικρές μεμβρανώδη σωματίδια (εξωσώματα, μικροκυστίδια, αποπτωτικά σώματα) πριν από την εξαγωγή στην κυκλοφορία. Η πλειοψηφία των microRNAs ανιχνεύσιμη στον ορό είναι πράγματι συμπυκνώθηκε σε εξωσώματα [42], αν και ορισμένοι μπορεί απλά να συνδέονται με πρωτεΐνες [43]. Στο σύνολό τους, το γεγονός αυτό δείχνει ότι τα γεγονότα επεξεργασίας που παράγουν miR-U2-1 αντιπροσωπεύουν ουσιώδη βιολογικές διεργασίες στον άνθρωπο.

(α) δείχνει την ακολουθία του καθενός διαβάστε ανιχνεύεται και το κανονικοποιημένο αριθμό κάθε ανάγνωσης δίνεται για κάθε όγκου δείγμα. (Β) Ο συνολικός αριθμός κάθε τύπου αναγνώσεως εμφανίζεται ως ιστόγραμμα. Ιστογράμματα (γ) και (δ) εμφανίζει τον αριθμό των διαβάζει τις διαφορετικές 5 ‘αρχίζει και 3’ άκρα του miR-U2, αντίστοιχα.

Η

Οι αλληλουχίες των γονιδίων RNU2-1 και RNU2-2 (187 nt) είναι εξαιρετικά διατηρημένη. Οι διαφορές μεταξύ τους περιορίζεται σε δύο σημειακές μεταλλάξεις που βρίσκονται στο άκρο 3 ‘(θέσεις 170 και 187) και σε μία μετάλλαξη 4 βάσεων που βρίσκονται στις θέσεις 108-111 (Εικ. S1). Αξίζει να σημειωθεί ότι, RNU2-2 εκφράζει επίσης την ίδια περιοχή με το ίδιο μέγεθος (Εικ. S2). Ο μεγαλύτερος αριθμός των διαβάζει ανιχνευθεί για miR-U2-1 σε σύγκριση με το miR-U2-2 είναι σύμφωνη με τις υψηλότερες γονιδιωματική αριθμός αντιγράφων του RNU2-1 του. Ευτυχώς, η διαφορά 4-βάσης (GCAG και AAUA στην RNU2-1 και RNU2-2 αντίστοιχα) διακρίνουν τα δύο γονίδια U2 βρίσκεται εντός των ακολουθιών miR-U2, που επιτρέπει τις διακρίσεις των δύο προϊόντων. Αυτός ο πολυμορφισμός δεν φαίνεται να έχει κάποια αισθητή επίπτωση στην επεξεργασία, γεγονός που υποδηλώνει παρόμοιους μηχανισμούς βιογένεση για miR-U2-1 και miR-U2-2. Ωστόσο, οι διαφορές στην αλληλουχία μεταξύ των miR-U2-1 και miR-U2-2 μπορεί να αντανακλά την περαιτέρω λειτουργική διαφοροποίηση, ίσως διευκόλυνση μικρορύθμιση της ρυθμιστικής λειτουργίας μέσω παράγοντες επιλογής απόκλιση στόχος ή πρωτεΐνη δέσμευσης.

Η χρήση των τεχνολογία NGS δεν είναι χωρίς τις παγίδες της. Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι οι μικρές RNAs μπορεί να είναι λάθος cross-χαρτογραφήθηκαν σε λάθος γονιδιωματική περιοχή. RNU2 γονίδια είναι ένα οικογενειακό συγκρότημα που περιλαμβάνει περισσότερες από 50 ψευδογονίδια που κάνει λάθη cross-χαρτογράφηση ευδιάκριτα δυνατό. Έχει πρόσφατα αναφερθεί ότι δύο ανοσοκαταβυθίστηκε Argonaute σχετιζόμενη μικρό RNAs από 23nt και 30nt χαρτογραφήθηκαν σε δύο διαφορετικές ψευδογονίδια U2 [30], σε θέσεις 168 έως 187 του ψευδογονιδίου U2 που κωδικοποιείται από χρωμόσωμα 6 και στις θέσεις 95-125 του U2 ψευδογονίδιο κωδικοποιείται από το χρωμόσωμα 10, αντίστοιχα. Αυτά τα δύο θραύσματα χαρτογράφηση της λειτουργικής U2-1 RNA με 100% ταυτότητα. Είχαμε νωρίτερα σημειωθεί ότι ο τόπος RNU2-1 στο χρωμόσωμα 17 ήταν στην πραγματικότητα απομακρύνεται από την ακολουθία Συνέλευση Ανθρώπινου Γονιδιώματος Build 37 (NCBI Σχολιασμός Πληροφορίες Gene ID: 6066, ενημέρωση 20-Απρίλιος-2012), και αυτή είναι η πιο πιθανή εξήγηση ως προς γιατί αυτά τα θραύσματα RNA χαρτογραφηθεί σε αυτές ψευδογονίδια και όχι το λειτουργικό RNU2 ίδια γονίδιο. Ομοίως, δύο σύντομες microRNAs (19 nt), miR-1246 και miR-1290, αγώνα miR-U2-1 με 100% ταυτότητα και μία αναντιστοιχία αντίστοιχα [44]. Χαρτογράφηση διαβάζει από πέντε μικρές βιβλιοθήκες μας με τις αντίστοιχες πρόδρομες ενώσεις αυτών των δύο microRNAs [45] έδειξε σαφώς ότι οι δύο υποθετικές πρόδρομοι των miR-1246 και miR-1290 είναι το αποτέλεσμα ψευδών χαρτογράφησης. Οι δύο προτεινόμενες ώριμη microRNAs είναι στην πραγματικότητα περικοπεί εκδόσεις του miR-U2-1. Αυτό επιβεβαιώθηκε έμμεσα για miR-1246, όταν οι προσπάθειες για την προδρομική αλληλουχία του με τον ίδιο ιστό όπου miR-1246 είχε αποτύχει εντοπιστεί, γεγονός που υποδηλώνει ότι η υποτιθέμενη πρόδρομος δεν υπάρχει [46]. Αυτό το αποτέλεσμα πρόσφατα ανεξάρτητα επιβεβαιώθηκε [31]. Όσον αφορά miR-1290 υπάρχουν δύο πιθανές γονιδιωματικές θέσεις που θα μπορούσε να (Εικ. S3) κωδικοποιούν, ωστόσο, στα πειράματά μας ανιχνευθεί στο ίδιο επίπεδο με το θόρυβο που σχετίζεται με σφάλματα προσδιορισμού αλληλουχίας (Πίνακας S2). Καταλήγουμε στο συμπέρασμα από αυτά τα δεδομένα ότι όλα τα αποτελέσματα που σχετίζονται με miR-1246 και miR-1290 μπορεί να αποδοθεί σε miR-U2.

Μια διπλή λειτουργία για τα γονίδια RNU2

Τα πειραματικά αποτελέσματα που συζητήθηκαν μέχρι τώρα προτείνουν μια διπλή λειτουργία για την RNU2-1 και RNU2-2 snRNAs. 5 ‘περιοχή περιέχει την θέση διακλάδωσης mRNA που εμπλέκονται στην ματίσματος mRNA, ενώ 3 τους πεδίο κωδικοποιεί miR-U2 που περιέχει τη θέση πρόσδεσης Sm και θα μπορούσε να εμπλέκεται στην ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Αυτό το λειτουργικό διαμέρισμα του RNU2 συσχετίζεται με τις παρατηρούμενες διαφορές στα δομικά χαρακτηριστικά που υπάρχουν στο μόριο (Εικ. 3). Το τμήμα 5 ‘περιέχει έναν εντυπωσιακό αριθμό μετα-μεταγραφική τροποποίηση, συμπεριλαμβανομένων 14 pseudouridylations και 10 μεθυλιωμένα νουκλεοτίδια [47] – [49]. Σε αντίθεση, δεν γίνονται τροποποιήσεις εντοπίζονται κατάντη της θέσης 90 του RNU2, και αυτή η περιοχή περιέχει πιο εκτεταμένη δευτεροταγή δομή, ιδιαίτερα όταν ο πρόδρομος αλληλουχία συμπεριλαμβάνεται. Αυτές οι εντυπωσιακές διαρθρωτικές διαφορές που πιθανόν σχετίζονται με τις αντίστοιχες διαφορική λειτουργίες των δύο μισά του RNU2. Αν και η 5 ‘περιοχή είναι επαρκής για να επάγει ματίσματος mRNA in vitro [50] – [52], δεν υπάρχει καμία απόδειξη είτε από τη βιβλιογραφία ή από NGS πειράματα μας ότι οποιοδήποτε τμήμα της περιοχής 5’ του RNU2 συσσωρεύονται στα κύτταρα. Αυτό υποδηλώνει έναν εναλλακτικό μηχανισμό επεξεργασίας που παράγει το RNU2 πλήρους μεγέθους, αφενός, και miR-U2 στην άλλη.

Η δευτεροταγής δομή αναδίπλωση του προδρόμου RNU2 δείχνεται. τοποθεσίες Ψ είναι από [49]. Τα μεθυλιωμένα νουκλεοτίδια με το σύμβολο «

m». Νουκλεοτίδια σε μπλε και πράσινο αντιστοιχούν σε ακολουθία miR-U2-1. Τα πράσινα γράμματα εντοπισμό των τεσσάρων νουκλεοτιδίων μετάλλαξης μεταξύ miR-U2-1 και miR-U2-2. Μαύρο και κόκκινο γράμματα δείχνουν RNU2 και ακολουθίες RNU2 πρόδρομος-ειδικά αντίστοιχα. Μπλε βέλη δείχνουν στο 5 ‘και 3’ άκρα του miR-U2 isomirs. Το κόκκινο βέλος δείχνει το 3 ‘άκρο του RNU2. Τα δύο μαύρα βέλη δείχνουν τις δύο εσωτερικές θέσεις διάσπασης που προσδιορίζονται στην παρούσα εργασία.

Η

Για να κατανοήσουμε καλύτερα το μηχανισμό του miR-U2 μάτισμα, εμείς αλληλουχία δύο βιβλιοθήκες cDNA για ncRNAs περισσότερο από miR-U2 (25-50nt μακρύ), προκειμένου για τον προσδιορισμό δυνητικών ενδιαμέσων (Πίνακας 1). Ο αριθμός των μακράς διαβάζει χαρτογράφηση να RNU2 είναι σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη που παρατηρήθηκε στις βιβλιοθήκες cDNA μικρού μεγέθους, γεγονός που υποδηλώνει ότι το ενδιάμεσο της ωρίμανσης είναι ταχέως αποικοδομείται ή κομμένα για να παραχθεί το τελικό ώριμο microRNA. Εξετάζοντας την κατανομή των διαβάζει (μετρούμενη σε RPM) κατά μήκος της αλληλουχίας προ-RNU2, παρατηρούμε δύο κορυφές που αντιστοιχούν σε δύο μικρότερα θραύσματα τα οποία συσσωρεύονται (Εικ. 1ε). Όπως ήταν αναμενόμενο, μία κορυφή χάρτες στο ώριμο miR-U2, ενώ απροσδοκήτως η δεύτερη χάρτες προς το 3 ‘άκρο του ώριμου RNU2, μια περιοχή η οποία δεν παράγει ένα σταθερό ncRNA αφού δεν το παρατηρούμε στα αποτελέσματα αλληλούχισης μας από τη σύντομη -sized βιβλιοθήκες. Αυτό το τμήμα RNU2 αντιστοιχεί ακριβώς στο 30nt βίου θραύσμα σύνδεσης ago1 [30]. Αυτό υποδηλώνει ότι η αποικοδόμηση του 3 ‘άκρου του RNU2 παρεμποδίζεται από τη δέσμευση της πριν παροδικά, αλλά επειδή η προστασία που παρέχεται από πριν 1 είναι προσωρινή, δεν οδηγούν σε ένα σταθερό προϊόν ncRNA. Εναλλακτικώς, αυτό το προϊόν θα μπορούσε να υποβαθμιστεί σε ιστούς των πνευμόνων λόγω της απουσίας πρόσθετων παραγόντων, αλλά θα μπορούσε να εκφραστεί σε άλλους τύπους κυττάρων ή ιστών. Η ελάττωση του αριθμού των διαβάζει και των δύο πλευρών των δύο κορυφών αντανακλά μια υποβάθμιση των ενδιαμέσων ωρίμανσης με κόψιμο μηχανισμών από τα δύο άκρα, ενώ η κοιλάδα μεταξύ τους εντοπίζει τη θέση μιας ενδονουκλεολυτική θέση διάσπασης (ενδο 3 ‘) στην περιοχή της θέσης 145 εντός στέλεχος IV (Εικ. 1e και το Σχ. 3). Σε αντίθεση, το 5 ‘ήμισυ δεν περιέχει κανένα θραύσμα προστατεύεται από αποικοδόμηση. Παρ ‘όλα αυτά, μια δεύτερη endonucleolitic θέση αποκοπής (ενδο 5’) φαίνεται να βρίσκεται μεταξύ των θέσεων 70 και 80 μέσα σε βλαστικά ΙΙβ.

Λαμβάνοντας υπόψη τις διαφορετικές δυνητικές οδούς επεξεργασίας για RNU2, το πιο πιθανό πρώτο βήμα περιλαμβάνει το 3 ‘άκρο διάσπαση στη θέση 187. Μπορούμε να βρούμε καμία ανάγνωσης ταιριάζει με το αναμενόμενο ειδικό πρόδρομο, υποδεικνύοντας μια πρόωρη και γρήγορη εκδήλωση. Αυτό το πρώτο βήμα περιλαμβάνει μια βάση-φλούδι μεταξύ της συγκεκριμένης αλληλουχίας προδρόμου (θέσεις 190-200) και τις θέσεις 100-110 της RNU2 η οποία αποτελεί βασικό δομικό χαρακτηριστικό που απαιτείται για την καθοδήγηση του 3 ‘άκρου επεξεργασίας [53]. Είναι αξιοσημείωτο ότι, αυτό το ζευγάρωμα βάσεων λαμβάνει χώρα με την περιοχή miR-U2 και σκιαγραφεί με ακρίβεια τα δύο δομικά και λειτουργικά διακριτές μισά του RNU2 (Εικ. 3). Στη συνέχεια, κατά την απουσία του ago1 δέσμευσης, η σύνδεση του Sm πρωτεΐνης, πιθανόν σε συνδυασμό με άλλους παράγοντες, όπως U2A »και ΙΙ2Β», θα μπορούσε να σταθεροποιήσει το πλήρες μήκος RNU2. Αντίθετα, η ago1 σύνδεση προς αλληλουχίες miR-U2 θα μπορούσε να προκαλέσει μια μετατόπιση προς την οδό ενδονουκλεολυτική σχάσεις που διασπά στις θέσεις 70-80 και 145 αντίστοιχα. Πολλαπλές και παρακείμενα μικρές περιοχές RNA δέσμευσης για ago1 είναι γνωστό ότι διευκολύνει συνεργατική αλληλεπιδράσεις που σταθεροποιούν δεσμευτικός Argonaute [54]. Από ago1 δεν έχει ενζυμική δραστηριότητα, η RNase πρέπει να προσλαμβάνονται για miR-U2 ωρίμανση, παρόμοια με miR-όπως ncRNAs παράγεται από snoRNAs και τα tRNA. Τέλος, αυτή η παροδική πρόδρομος ταχέως κομμένα από τα δύο άκρα για να δώσει το ώριμο miR-U2.

Η αποκλειστική σύνδεση του miR-U2 να ago1 [30], σε αντίθεση με τα περισσότερα από κανονική microRNAs τα οποία δεσμεύονται επίσης ago2 [ ,,,0],55], προτείνει ένα διαφορετικό ρόλο για miR-U2. Αν και η υπεροχή των δεδομένων δείχνει ότι microRNAs ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση στο κυτταρόπλασμα και Ρ-φορείς, οι τέσσερις Argonaute πρωτεΐνες και μια σειρά από microRNAs έχουν ανακαλυφθεί πρόσφατα στον πυρήνα των ανθρώπινων κυττάρων. Η μεταφορά μικρών RNAs σε συγκρότημα με πριν πρωτεϊνών στον πυρήνα εξαρτάται από Importin-8 [56]. Αυτός ο μηχανισμός υποδηλώνει πιθανή αλληλεπίδραση τους με την χρωματίνη και ανοίγει τη συναρπαστική εναλλακτική λύση της άμεσης συμμετοχής τους σε επηρεάζουν πυρηνικών διαδικασιών όπως ματίσματος ή μεταγραφής στοχεύοντας περιοχές του γονιδίου υποκινητή. Είναι ενδιαφέρον, αρκετές πρόσφατες μελέτες αποκάλυψαν λειτουργική διαχωρισμό μεταξύ ago1 και ago2 [57], καθώς και μια διαφορική κατανομή στον πυρήνα σε απόκριση προαγωγού-στοχευμένες siRNA κατά τη διάρκεια της μεταγραφικής γονιδιακής σίγησης [58] υποδηλώνοντας ότι πριν από πρωτεΐνες μεσολαβούν την πυρηνική εντόπιση των μικρών RNAs . Εκτός από τον ορισμό της βιολογικής δραστηριότητας των μικρών RNAs, πριν πρωτεΐνες μπορεί επίσης να καθορίσει το μήκος του ώριμου microRNAs [59].

Αυτό μας επιτρέπει να εξετάσουμε την πιθανότητα ότι το miR-U2 θα μπορούσε να διαδραματίσει επιγενετικές ρόλους στο επίπεδο του DNA όπου θα μπορούσε να λειτουργήσει ως ρυθμιστής της έκφρασης των μεγάλων χρωμοσωμικών περιοχών. Είναι πράγματι γνωστό ότι πολλοί υποκινητές των γονιδίων καταστολής όγκων εμφανίζουν υψηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης, γεγονός που υποδηλώνει μια πιθανή σύνδεση με τον κίνδυνο καρκίνου. miR-U2 θα μπορούσε για παράδειγμα να συμμετέχουν στην καθοδήγηση μεθυλίωση κυτοσίνης, μια διαδικασία που είναι γνωστό ότι είναι αποκρίνεται σε περιβαλλοντικά ερεθίσματα.