Αφηρημένο

Στόχος

Χρόνια τραυματισμό ίνωση του ήπατος είναι ένας σημαντικός παράγοντας κινδύνου για ηπατοκαρκινογένεσης στον άνθρωπο. Τα ποντίκια με στοχευμένες διαγραφή Mdr2 (το μυϊκό ορθόλογο της Mdr3) να αναπτύξουν χρόνιο τραυματισμό ίνωση του ήπατος. Το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) αναδύεται αυθόρμητα σε τέτοιους ποντικούς με 50-60 εβδομάδες ηλικίας, παρέχοντας ένα μοντέλο της ίνωσης που σχετίζεται με ηπατοκαρκινογένεσης. Χρησιμοποιήσαμε Mdr2

– /- ποντίκια για να ερευνηθεί η υπόθεση ότι η ενεργοποίηση του hedgehog (Hh) μονοπατιού σηματοδότησης προωθεί την ανάπτυξη τόσο της ηπατικής ίνωσης και HCC

Μέθοδοι

Ηπατική βλάβη και ίνωση. , ενεργοποίηση μονοπατιού Hh, και οι πληθυσμοί του ήπατος προγονικών συγκρίθηκαν σε Mdr2

– /- ποντίκια και χειριστήρια άγριου τύπου της ίδιας ηλικίας. Ένα πείραμα εύρεσης δόσης με την Hh ανταγωνιστή σηματοδότησης GDC-0449 διεξήχθη για να βελτιστοποιήσει Hh αναστολή οδού. Οι ποντικοί στη συνέχεια κατεργάζεται με GDC-0449 ή όχημα επί 9 ημέρες, και οι επιπτώσεις στην ηπατική ίνωση και το φορτίο του όγκου αξιολογήθηκαν με ανοσοϊστοχημεία, qRT-PCR, στύπωμα Western, και απεικόνιση μαγνητικού συντονισμού.

Αποτελέσματα

Σε αντίθεση με τους ελέγχους, Mdr2

– /- ποντίκια που εκφράζεται με συνέπεια συνδέτες HH και σταδιακά συσσωρευμένη HH-απόκρισης μυοϊνοβλάστες ήπατος και των προγονικών κυττάρων με την ηλικία. Θεραπεία της ηλικίας Mdr2-ανεπαρκή ποντίκια με GDC-0449 ανέστειλε σημαντικά την ηπατική δραστικότητα Hh, μειωμένη μυοϊνοβλάστες ήπατος και προγονικών κυττάρων, μειωμένη ηπατική ίνωση, προωθείται παλινδρόμηση της ενδο-ηπατικής HCCs, και μείωσε τον αριθμό των μεταστατικών HCC χωρίς αύξηση της θνησιμότητας.

Συμπεράσματα

ενεργοποίηση μονοπατιού Hh προάγει την ηπατική ίνωση και ηπατοκαρκινογένεσης, και αναστέλλοντας την σηματοδότηση Hh ασφάλεια αντιστρέφει τις δύο διαδικασίες, ακόμη και όταν ίνωση και HCC οι προηγμένες

Παράθεση:. Philips GM, Chan είναι, Swiderska Μ , Schroder VT, Guy C, Karaca GF, et al. (2011) σκαντζόχοιρος Σηματοδοσίας Ανταγωνιστή Προωθεί Παλινδρόμηση των δύο ίνωση του ήπατος και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα σε ένα μοντέλο ποντικού πρωτοπαθή καρκίνο του ήπατος. PLoS ONE 6 (9): e23943. doi: 10.1371 /journal.pone.0023943

Επιμέλεια: Pranela Rameshwar, Πανεπιστήμιο Ιατρικής και Οδοντιατρικής του Νιου Τζέρσεϊ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13 Ιούνη 2011? Αποδεκτές: 27 Ιούλη του 2011? Δημοσιεύθηκε: 2 Σεπτέμβρη του 2011

Copyright: © 2011 Philips et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε, εν μέρει, από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (NIH) RO1 DK077794, ΝΙΗ RO1 AA010154, ΝΙΗ Τ32 DK007568, και ΝΙΗ Τ32 CA071341. Ένα τμήμα της απεικόνισης πραγματοποιήθηκε στο Duke Κέντρο για την in vivo Μικροσκοπίας, υποστήριξε, εν μέρει, από το Εθνικό Κέντρο Έρευνας Πόρων Εθνικό Βιοϊατρικής Τεχνολογίας Research Center (Ρ41 RR005959) και το Πρόγραμμα του Εθνικού Ινστιτούτου Καρκίνου Μικρών Ζώων Imaging Resource (U24 CA092656). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) είναι μια ύπουλη καρκίνου που αναλογεί σε ποσοστό έως 1 εκατομμύριο θανάτους ετησίως και είναι η τρίτη κυριότερη αιτία θανάτου από καρκίνο σε όλο τον κόσμο [1]. Κίρρωση, μια συνέπεια της προοδευτικής ηπατικής βλάβης και ίνωση, είναι η μεγαλύτερη ενιαία παράγοντα κινδύνου για ΗΚΚ [2]. Μια τροποποιημένη επούλωσης πληγών απόκριση σε χρόνια ηπατική βλάβη, με αποτέλεσμα την απορρυθμισμένη ενεργοποίηση των μυοϊνοβλαστών και των πληθυσμών προγονικών κυττάρων, έχει εμπλακεί στην παθογένεση κίρρωση και ενδεχόμενη καρκινογένεση [3].

απώλειας λειτουργίας μεταλλάξεις στο καναλιοειδές ηπατοκυττάρων φωσφολιπιδίων φλιπάση mdr3 (ABCB4) έχουν συσχετιστεί με ένα ευρύ φάσμα της ανθρώπινης χοληφόρων ασθένειες συμπεριλαμβανομένων των προοδευτικών οικογενής ενδοηπατική χολόσταση τύπου 3 (PFIC3), χολόσταση της κύησης, που προκαλείται από τα ναρκωτικά χολόσταση και έναν ενήλικα χολική κίρρωση με χαρακτηριστικά παρόμοια με πρωτογενή σκληρυντική χολαγγειίτιδα (PSC) [4], [5], [6], [7]. Ποντίκια με μια στοχευμένη διαγραφή του Mdr2 (το μυϊκό ορθόλογο του Mdr3) στερούνται του ήπατος-ειδική Ρ-γλυκοπρωτεΐνης που μεταφέρει φωσφατιδυλοχολίνη (PC) σε όλη την καναλιοειδές μεμβράνης. Η απουσία των φωσφολιπιδίων στη χολή αποτελέσματα στην προοδευτική σκληρωτική χολαγγειίτιδα με συνοδευτικά πύλης φλεγμονή, σωληνίσκων πολλαπλασιασμό και την πύλη ίνωση. Η ηπατική βλάβη εκδηλώνεται αμέσως μετά τη γέννηση και του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος προκύψουν αυθόρμητα μεταξύ 50 και 60 εβδομάδων [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14]. Σε αντίθεση με τα μοντέλα ξένου μοσχεύματος που χρησιμοποιείται ευρέως για να εξετάσουν μηχανισμούς ως επί- και θεραπείες διατυ HCC, Mdr2

– /- ποντίκια παρέχουν ένα μοντέλο που είναι παράλληλη με τη φυσική εξέλιξη του HCC σε φόντο της χρόνιας φλεγμονής, ηπατική βλάβη και ίνωση [15] .

αναλύσεις της γονιδιακής έκφρασης σε Mdr2-ανεπαρκή ποντίκια και τους ελέγχους ετεροζυγώτες έχουν επιδείξει ισχυρή και σταθερή επαγωγή πολλαπλών προσαρμοστικών μηχανισμών που ελέγχουν κυτταρικές αποκρίσεις που σχετίζονται με το οξειδωτικό στρες, φλεγμονή, το μεταβολισμό των λιπιδίων, και τον πολλαπλασιασμό, προκαλώντας εικασίες ότι αυτές οι διαδικασίες συμβάλλουν στην ηπατοκαρκινογένεσης [16]. Αν και δεν αξιολογήθηκαν τυπικά από προηγούμενες μελέτες του Mdr2-ανεπαρκή ποντίκια, ένα άλλο μονοπάτι που θα μπορούσαν να διαδραματίσουν ένα ρόλο στην ίνωση που σχετίζεται ηπατοκαρκινογένεσης είναι Hedgehog (Hh), επειδή σηματοδότηση Hh έχει ενοχοποιηθεί τόσο ινογόνων επισκευή ηπατικής βλάβης και HCC.

το μονοπάτι Hh είναι μια εξελικτικά συντηρημένη μονοπατιού σηματοδότησης που ενεργοποιείται όταν προσδέματα Hh (Sonic hedgehog και ινδική hedgehog) συνδέονται με Patched (PTC), ένας διαμεμβρανικός υποδοχέας που εκφράζεται επί της επιφανείας του Hh κύτταρα που αποκρίνονται. Μετά τη σύνδεση συνδετήρα, Ptc αδρανοποιείται, απαλλάσσοντας καταστολή της smoothened (SMO), μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη η οποία μεσολαβεί σηματοδότηση Hh στο εσωτερικό του κυττάρου. ενεργοποίηση ΠΕΑ κορυφώνεται με την πυρηνική εντόπιση των παραγόντων μεταγραφής Gli-οικογένεια, Gli1, Gli2, και Gli3, η οποία, με τη σειρά του, ρυθμίζει προς τα κάτω την έκφραση του γονιδίου. Η οδός είναι αδρανή σε φυσιολογικό ήπαρ [17], [18], αλλά γίνεται επανενεργοποιηθεί ως μηχανισμός επισκευής σε χρόνιο τραυματισμό ήπαρ [19], [20], [21], [22], [23]. συνδετήρες Hh προάγει την ανάπτυξη και τη βιωσιμότητα των μυοϊνοβλαστών, η συσσώρευση του οποίου οδηγεί σε μη φυσιολογική επισκευή του ήπατος, ίνωση και η ενδεχόμενη κίρρωση [24], [25]. συνδετήρες Hh χρησιμεύουν επίσης ως βιωσιμότητα και πολλαπλασιαστικών παραγόντων για προγόνους συκώτι επιθηλιακά, και την επέκταση αυτού του διαμερίσματος έχει συνδεθεί με το σχηματισμό και τη συντήρηση των ηπατοκυτταρικών καρκινωμάτων [26]. Η πιθανότητα ότι η ενεργοποίηση Hh μονοπάτι συμβάλλει στην ηπατοκαρκινογένεσης υποστηρίζεται από το γεγονός ότι Sonic hedgehog (Shh) έκφραση συνδέτη σημειώνεται σε περίπου 60% των ανθρώπινων HCCs, και έκφραση των Hh-ρυθμιζόμενα γονίδια, Gli1 και Ptc, συμβαίνει στο 50% των ανθρώπινους όγκους [27], [28], [29], [30].

Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, θα υποτεθεί ότι η ενεργοποίηση μονοπατιού Hh συμβάλλει στην παθογένεση τόσο της ηπατικής ίνωσης και της ίνωσης που σχετίζεται με HCC. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, υποβάλλαμε σε αγωγή ηλικιωμένα ποντίκια με ανεπάρκεια Mdr2 με τον αναστολέα οδού Hh, GDC-0449, ενός αναστολέα μικρού μορίου το οποίο συνδέεται με smoothened (SMO). Αυτός ο παράγοντας επελέγη λόγω της ανθρώπινης προφίλ ασφαλείας του σε δοκιμές φάσης 1, καθώς και την αποτελεσματικότητα του σε όγκους συμπαγών οργάνων, όπως καρκίνωμα βασικών κυττάρων (BCC) και μυελοβλάστωμα [31], [32], [33]. Οι στόχοι μας ήταν να καθοριστεί εάν ή όχι ποντίκια με προχωρημένη ηπατική νόσο και ΕΑΣ θα ανεχθεί Hh οδού αναστολή και την εμπειρία βελτιώσεις στην ίνωση του ήπατος ή /και το φορτίο του όγκου.

Μέθοδοι

Ποντίκια

Mdr2

– /- ποντίκια ήταν ένα δώρο από τον Δρ Detlef Schuppan (Beth Israel Deaconess Medical Center, Boston, MA). Ηλικία συμφωνημένα FVB /NJ ποντικούς άγριου τύπου ελήφθησαν από Jackson Laboratory (Bar Harbor, ΜΕ). Όλα τα ποντίκια στεγάστηκαν με ένα κύκλο φωτός-σκότους 12 h και με δεδομένο το νερό και τυπική τροφή

κατά βούληση

. Σε ηλικίες, 2, 4, 12, 36 52 και 62 εβδομάδων, τα ποντίκια θυσιάστηκαν υπό γενική αναισθησία. βάρος ήπατος και το σωματικό βάρος καταγράφηκε, συλλέχθηκαν ορό και ιστό του ήπατος. Οι μελέτες σε ζώα έχουν εγκριθεί από την Επιτροπή Φροντίδας και Χρήσης Θεσμικών ζώων, όπως διέπεται από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας «Οδηγός για τη Φροντίδα και Χρήση Εργαστηριακών Ζώων», του Πανεπιστημίου Duke Animal Welfare Διασφάλισης Αριθμός A3195-01.

ορού AST /ALT αποφασιστικότητα

Ορός ασπαρτική αμινοτρανσφεράση (AST) και της αμινοτρανσφεράσης της αλανίνης (ALT) μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ που διατίθεται στο εμπόριο από Biotron Diagnostics (66-D και 68-D αντίστοιχα? Hemet, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών .

Western Blot

η ολική πρωτεΐνη εξάγεται από θραύση παγώσει ολόκληρο το ηπατικού ιστού σε ρυθμιστικό RIPA. Τα δείγματα συλλέχθηκαν από την ηλικία (2-4 δείγματα ανά ηλικιακή ομάδα), εκτός όπως σημειώνεται. Η ανάλυση στυπώματος Western έγινε όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα: Sonic hedgehog (SC-9024? Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), ινδική σκαντζόχοιρος (ab39634? Abcam), β-ακτίνη (SC-47778, Santa Cruz Biotechnology), Gli2 (18 -732 – 292.462, Genway, San Diego, CA). Όλα τα αντισώματα αραιώθηκαν 1:1000 και επωάστηκαν στους 4 ° C όλη τη νύκτα. εικόνες κηλίδα Western αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ψηφιακό σύστημα FluorChem HD2 σκοτεινού θαλάμου (Βιοεπιστημών κυττάρων, Santa Clara, Καλιφόρνια).

Η ανοσοϊστοχημεία

4 μm φορμόλη-σταθερό, δείγματα παραφίνη-ενσωματωμένες αποκηρώθηκαν και επανυδατώθηκαν. Για την αξιολόγηση της αρχιτεκτονικής των ιστών, τα πλακίδια χρωματίσθηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε) και Sirius red το σύνηθες πρωτόκολλο. Για ανοσοϊστοχημεία, τα πλακίδια επωάστηκαν σε 3% υπεροξείδιο του υδρογόνου /μεθανόλης. Το αντιγόνο ανάκτηση πραγματοποιήθηκε με θέρμανση σε 10 mM ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικού νατρίου ή 0,25% πεψίνη (Κ19? Invitrogen, Carlsbad, CA) για 10 λεπτά. Οι τομές μπλοκαριστεί (Dako Envision, Carpinteria, CA) και επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 ° C: γλοιοβλαστώματος-2 (Gli-2? 18-732-292462? 1:2000? Genway, San Diego, CA)? κυτοκερατίνη 19 (Troma-III? Hybridoma Bank, Iowa City, IA? 1:500)? α-εμβρυϊκή πρωτεΐνη (AFP) (Dako, 1:1000)? Ινδικό σκαντζόχοιρος (Abcam? 1:750, Cambridge, ΜΑ)? Polymer-HRP αντι-κουνελιού (K4003? Dako) ή αντι-ποντικού (K40011? Dako) ή κιτ πολυμερές MACH3 ποντικού ΑΡ (MP530, Biocare Medical, Concord, California, USA) χρησιμοποιήθηκαν ως δεύτερα αντισώματα. 3,3′-διαμινοβενζιδίνη (DAB) υποστρώματος χρωμογόνου συστήματος (K3466? Dako) και /ή Ferangi Μπλε (Biocare) χρησιμοποιήθηκε στη διαδικασία ανίχνευσης. Παραλείποντας πρωτογενή αντισώματα από τις αντιδράσεις εξαλειφθεί χρώσης η οποία κατέδειξε χρώση εξειδίκευση. Εικόνες αποκτήθηκαν σε Όλυμπο IX71 (Τόκιο, Ιαπωνία) ανεστραμμένο μικροσκόπιο χρησιμοποιώντας το DP2-BSW σύστημα λογισμικού λήψης εικόνας (Όλυμπος).

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR αντίστροφης μεταγραφής

RNA απομονώθηκε από ολόκληρο συκώτι, καθώς και από εκτομή δείγματα όγκων είχαν τυπική εκχύλιση ΤπζοΙ όπως έχει περιγραφεί προηγουμένως [24]. Ένας πίνακας εκκινητών έχει συμπεριληφθεί στα συμπληρωματικά υλικά.

Μορφομετρία

φορμαλίνη σταθερό ήπαρ και όγκου τομές χρωματίστηκαν για CD44 και οστεοποντίνη, όπως περιγράφεται παραπάνω, και ποσοτικοποιήθηκαν με μορφομετρική ανάλυση με MetaView λογισμικού (Universal Imaging, Downington, PA). Ένα ελάχιστο 5 επιλέγονται τυχαία 10 × 20 × ή πεδία /τμήμα αξιολογήθηκαν για κάθε ποντίκι.

Ποσοτική ανοσοϊστοχημική ανάλυση

φορμόλη-σταθερές του ήπατος και του όγκου τομές costained για Gli2 και CK19. Ένα ελάχιστο 5 σωληνίσκων περιφερειών, 20 × πεδία ανά τμήμα, αξιολογήθηκαν για κάθε ποντικό μετρώντας τον αριθμό των κυττάρων που συν-σημασμένα.

Ηπατική υδροξυπρολίνη δοκιμασία

Η περιεκτικότητα σε υδροξυπρολίνη σε ολόκληρο δείγματα ήπατος προσδιορίστηκε χρωματομετρικώς όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [34]

GDC-0449 θεραπείας

στην αρχική, εύρεσης δόσης ομάδα των ζώων, 16 Mdr2

-. /- ποντίκια (ηλικίας 57- 68 εβδομάδων) χωρίστηκαν σε θεραπεία με έλεγχο οχήματος (DMSO, η = 5), 20 mg /kg GDC-0449 (n = 5), ή 40 mg /kg GDC-0449 (n = 6). Αρσενικό-θηλυκό αναλογίες ήταν ισορροπημένα μεταξύ των ομάδων. GDC-0449 (Σέλεκ Chemicals, Houston, TX) ήταν πρόσφατα αποτελούσε καθημερινά σε DMSO. Όλοι οι ποντικοί έλαβαν μια ημερήσια ενδοπεριτοναϊκή ένεση επί 9 ημέρες. Την ημέρα 10, τα ζώα θανατώθηκαν. Τα δείγματα συλλέχθηκαν όπως παραπάνω. Μία δεύτερη ομάδα των 20 Mdr2

– /- ποντίκια (ηλικίας 51-59 εβδομάδων) υποβλήθηκαν σε ολόκληρο το σώμα απεικόνιση μαγνητικού συντονισμού για την αξιολόγηση του φορτίου του όγκου και στη συνέχεια ζεύγη ποντικών με συγκρίσιμα φορτία όγκου αποδόθηκαν σε θεραπεία είτε με DMSO (έλεγχος, η = 10) ή 40 mg /kg GDC-0449 (n = 10). Φάρμακα παραδόθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω? Μαγνητική τομογραφία σάρωσης επαναλήφθηκε μετά την 9

ης ημέρας της θεραπείας? ποντίκια θυσιάστηκαν για νεκροψία και ιστών συγκομιδή

Παθολογία

H & amp?. Ε και Sirius red χρώση των τομών ήπατος αξιολογήθηκε από έναν παθολόγο πίνακας-επικυρωμένο. Εξετάστηκαν Αντιπροσωπευτικά τμήματα του όγκου και μη καρκινικό ιστό. Όγκου ιστού ορίστηκε ως κατάφωρα ορατό οζίδια που ήταν τουλάχιστον 10 mm σε μέγεθος και χειρουργικά εξαιρέσιμων.

Κοιλιακή μαγνητική τομογραφία

Τα ζώα είχαν ανατεθεί έναν κωδικό εκτυφλωτική, η οποία διατηρήθηκε κατά τη διάρκεια του μαγνητικού συντονισμού (MR ) την απόκτηση και ανάλυση δεδομένων. απεικόνιση ήπατος MR ποντικού διεξήχθη σε 7Τ Bruker Biospec 70/30 οριζόντιο σύστημα οπή (Billerica, ΜΑ). Τα ζώα αναισθητοποιήθηκαν ελαφρώς κάτω από ισοφλουράνιο με συνεχή παρακολούθηση και συντήρηση των φυσιολογικών παραμέτρων σε όλη τη διάρκεια απεικόνισης (~ 60 min για κάθε ζώο). Αξονικές και στεφανιαίες 2D Τ2 γρήγορο γύρισμα echo εικόνες (TURBO-RARE, ΤΕ /TR = 11/4200 ms με 1 χιλιοστό πάχος φέτα, μήτρα = 256 × 256 και FOV 2,4 cm × 2,4 εκατοστά, 5 μέσους όρους, 0,0 χιλιοστά μεταξύ των τομών κενό) εικόνες ελήφθησαν πρώτα για σκοπούς ελέγχου και συμπληρωματικές ανατομικές πληροφορίες. Για κατευθύνεται ανάλυση ογκομετρική όγκου, 64 συνεχόμενων 500 μm πάχους εικόνες πυκνότητας πρωτονίων 3D FSE προκατειλημμένη απέναντι στάθμιση Τ1 (TURBO-RARE, ΤΕ /TR = 9/1500 ms, μήτρα = 256 × 256 × 64 και FOV 2,2 cm × 2,2 cm × 2,2 cm, 25 λεπτά διάρκεια) αποκτήθηκαν. Όλες οι αλληλουχίες απεικόνισης πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση αναπνευστικών περίφραξη.

Ογκομετρική ανάλυση από σύνολα δεδομένων MR έγινε στο λογισμικό Osirix, ένα open source εφαρμογή επεξεργασίας εικόνας που αναπτύχθηκε και συντηρείται από Pixmeo (Γενεύη, SUI). όγκοι ήπατος χειροκίνητα κατά διαστήματα σε κάθε ζώο από έναν ακτινολόγο πίνακας-επικυρωμένο (τυφλωμένος από τη θεραπεία) μετά τη θεραπεία. Επιλεγμένες περιοχές εξετάστηκαν για συνέπεια στις στεφανιαίες και οβελιαίο αναπαραστάσεις, και cross-συσχετίζονται με αξονική εικόνες 2D FSE. Για ογκομετρία, δύο ξεχωριστές μετρήσεις όγκου ελήφθησαν για κάθε βλάβη, με το μέσο όγκο, τότε λαμβάνονται. Interrater αξιοπιστία (τιμή κάππα) ήταν = 0,97. Τ1 και ακολουθίες σαρώσεως Τ2 διεξήχθησαν.

Στατιστικές αναλύσεις

αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση ± SD. Σημασία καθορίζονται με t-test του Student. Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές όταν ρ & lt? 0,05

Αποτελέσματα

προοδευτική συσσώρευση HH-κύτταρα που αποκρίνονται σε Mdr2

– /- ποντίκια

Διάφορες μορφές της οξείας και χρόνιας. ηπατική βλάβη προκληθεί ηπατική έκφραση συνδέτες HH και ενεργοποίηση των ανταποκρινόμενων κυττάρων HH. Τα επίπεδα ορού του AST και ALT ήταν σταθερά υψηλότερα σε Mdr2

– /- ποντίκια από την ηλικία μάρτυρες (Σχήμα S1), επιβεβαιώνοντας ότι τα ποντίκια knockout είχαν χρόνια ηπατική βλάβη. Έτσι, ρωτήθηκαν συκώτια από Mdr2

– /- ποντίκια για την ενεργοποίηση μονοπατιού Hh. Σε σύγκριση με προϊόντα λύσης πρωτεΐνης ήπατος από άγρια ​​ελέγχους τύπου, προϊόντα λύσης από Mdr2

– /- ποντίκια έδειξε αύξηση της Sonic hedgehog (Shh) και Indian hedgehog (Ihh) με ανάλυση κηλίδας Western. Αυτό ήταν εμφανές κατά το πρώτο χρονικό σημείο που εξετάστηκαν (2 εβδομάδες μετά τη γέννηση) και διατηρήθηκε καθ ‘όλη τη διάρκεια της ζωής των ζώων (έως 64 εβδομάδες ηλικίας) (Σχήμα 1Α). Ανοσοϊστοχημεία για την Hh ρυθμίζεται παράγοντα μεταγραφής, Gli2, κατέδειξε προοδευτική, σχετιζόμενη με την ηλικία συσσώρευση των κυττάρων με χρώση των πυρηνικών Gli2 σε Mdr2

– /- ποντίκια. Τέτοια Gli2-θετικών κυττάρων που περιλαμβάνονται στρωματικά κύτταρα, όπως επίσης και ηπατοκυτταρικών και κύτταρα σωληνίσκων (Σχήμα 1Β-C). Μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η οδός Hh ενεργοποιείται σε χρονίως τραυματισμένο ήπαρ Mdr2-ανεπαρκή ποντίκια, με αποτέλεσμα την προοδευτική επέκταση των διαφόρων πληθυσμών Hh αποκρίνονται κύτταρο.

A. ανάλυση Western blot για το Sonic Hedgehog (SHh) και του Ινδικού Hedgehog (ΙΗΗ) σε όλο το ήπαρ εκχυλίσματα συγκεντρώνονται από νέους Mdr2

– /- ποντίκια (ηλικίας 2-16 εβδομάδων), παλιά (παλαιό 36-64 εβδομάδες) Mdr2

– /- ποντίκια και ηλικίας μάρτυρες (n = 3-5 ποντικοί /ομάδα /χρονικό σημείο). Ένας εκπρόσωπος κηλίδας Western που αποδεικνύουν τα αποτελέσματα από νεαρά ποντίκια φαίνεται. Τα σημαίνουν δεδομένα ± SEM από τα μεγαλύτερα ποντίκια γράφημα. Β τμήματα Εκπρόσωπος του ήπατος βάφονται για να αποδείξει Gli2 από τους νέους (4 εβδομάδων), μέσης ηλικίας (36 εβδομάδων) και των παλαιών (52 εβδομάδων) Mdr2

– /- ποντίκια. Μικρή έκφραση Gli2 σημειώθηκε σε άγριου τύπου ποντικούς σε οποιαδήποτε ηλικία, έτσι τα αποτελέσματα από ένα αντιπροσωπευτικό 36 εβδομάδων παλιό ποντίκι άγριου τύπου παρουσιάζεται. (10 ×) Γ Ποσοτικά Gli2 ανοσοϊστοχημική δεδομένων. Ο αριθμός των κυττάρων πυρηνικής Gli2 (+) μετρήθηκε σε τουλάχιστον 5 πεδία υψηλής ισχύος (HPF) ανά τμήμα του ήπατος σε Mdr2

– /- ποντίκια και άγριου τύπου μάρτυρες στις 4, 36 και 64 εβδομάδων (η = 3 -4 ποντίκια /ομάδα /χρονικό σημείο) και η μέση τιμή ± SEM απεικονίζονται γραφικά. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0.01 στο Mdr2

– /- ομάδων έναντι των αντίστοιχων ελέγχων

Η

Θεραπεία Mdr2

– /- ποντίκια με την λειαίνονται αναστολέα, GDC-. 0449, είναι ασφαλής και μειώνει Hedgehog μονοπατιού σηματοδότησης

Για να προσδιοριστεί η κατάλληλη δόση της GDC-0449, μια πιλοτική μελέτη έγινε με 16 ετών (παλαιό 57-68 εβδομάδων) Mdr2

– /- ποντίκια. Τα ζώα έλαβαν μια ημερήσια ενδοπεριτοναϊκή ένεση 20 mg /kg GDC-0449 (n = 5), 40 mg /kg GDC-0449 (n = 6), ή ο έλεγχος του οχήματος DMSO (n = 5) για 9 ημέρες και στη συνέχεια θυσιάστηκαν. Δεν υπήρχε στατιστική διαφορά στην θνησιμότητα μεταξύ του ελέγχου και υψηλή δόση (40 mg /kg) GDC-0449 ομάδες. Κατά την θυσία, οι αναλογίες ήπατος /σωματικό βάρος των ποντικών στις τρεις ομάδες ήταν επίσης παρόμοιες, γεγονός που υποδηλώνει ότι ένα σχετικά σύντομο διάρκεια της συστημικής θεραπείας με GDC-0449 στα 40 mg /kg είναι καλά ανεκτή από τα ποντίκια με προχωρημένη ηπατική νόσο και HCC (σχήματα S2A -ΣΙ). Η ανάλυση στυπώματος Western των προϊόντων λύσης ήπατος από αυτή την ομάδα των ζώων έδειξε ότι GDC-0449 αγωγή προκάλεσε μία μείωση στα επίπεδα συνδέτη Shh στην υψηλότερη δόση, και Gli2 εξασθένηση έκφραση σε αμφότερες τις δόσεις (Σχήμα S2C).

Hedgehog αναστολή σηματοδότησης με GDC-0449 καταργεί εφέ σηματοδότησης Hh στην έκφραση του γονιδίου στόχου

με βάση τα δεδομένα που προέκυψαν από τη μελέτη εύρεσης δόσης μας, μια δεύτερη ομάδα της Mdr2

– /- ποντίκια (51-59 εβδομάδων ) αποδόθηκαν σε θεραπεία με όχημα (DMSO? n = 10) ή 40 mg /kg GDC-0449 (n = 10) μέσω ημερήσια ένεση ίρ για 9 ημέρες. Η συνολική επιβίωση μεταξύ των δύο ομάδων στη δεύτερη ομάδα πληθυσμού ήταν ίσα, χωρίς θανάτους στην ομάδα θεραπείας με DMSO και 1 θάνατος στην ομάδα θεραπείας GDC-0449 δευτερογενώς προς ιατρογενή τραυματισμό. Τόσο το παρέγχυμα του ήπατος και όγκους των ποντικών που έλαβαν έδειξαν μειωμένη έκφραση του στόχου μονοπατιού Hh Gli2 (Σχήματα 2Α-Β). Σε πραγματικό χρόνο PCR ανάλυση του εκτομή όγκων αποκάλυψε ότι GDC-0449 αγωγή απελευθερώνονται τα ανασταλτικά αποτελέσματα της σηματοδότησης Hh επί PPARγ και, προκαλώντας μία σημαντική αύξηση στη γονιδιακή έκφραση του (Σχήμα 2C). Η θεραπεία με GDC-0449 προκάλεσε επίσης σημαντική μείωση της έκφρασης του Gli1, άλλου Hh γονιδίου στόχου (Σχήμα 2D).

A. τμήματα ήπατος χρωματίζονται για Gli2 από εκπρόσωπο DMSO-και τα ποντίκια έλαβαν GDC-0449- (40 ×). Ποσοτικά στοιχεία Gli2 ανοσοϊστοχημεία σε συκώτια μη-όγκου των ποντικών που έλαβαν θεραπεία με DMSO ή GDC-0449 (n = 9-10 /ομάδα) απεικονίζονται γραφικά ως μέσος ± SEM (

** ρ & lt?. 0.01

Ο αριθμός των σωληνίσκων κυττάρων με θετική χρώση Gli2 μετρήθηκαν σε κάθε σωλήνα /τμήμα πύλης υπό μεγέθυνση 40 φορές. Β τομές όγκου από το ίδιο ποντίκια επίσης χρωματίστηκαν για να αποδειχθεί Gli2. τα αποτελέσματα από αντιπροσωπευτικά DMSO-και GDC-0449-ποντικούς αγωγής εμφανίζονται. Ποσοτική Gli2 δεδομένα ανοσοϊστοχημείας που προκύπτουν από την καταμέτρηση των πυρηνικών Gli2 θετική σωληνίσκων και ηπατοκυτταρικών κυττάρων σε τομές όγκων κάτω των 40 × μεγέθυνση τα αποτελέσματα απεικονίζονται γραφικά ως μέση τιμή ± SEM κυττάρων πεδίο υψηλής ισχύος Gli2 θετικών /40 × (** p & lt? 0,01). C-D Ποσοτική αντίστροφη ποντίκια μεταγραφή-ΡΟΚ (qRT-PCR) ανάλυση ολόκληρων RNA ήπατος από DMSO-(ανοικτή ράβδος) και GDC-0449 (μαύρη μπάρα) αντιμετωπίζεται. Γ PPAR-γ, ένα γονίδιο το οποίο κανονικά καταστέλλεται από σηματοδότηση Hh. D. Gli1 ., ένα γονίδιο που προκαλείται από σηματοδότηση Hh μέση τιμή ± SEM απεικονίζονται γραφικά (** p & lt? 0,01)

η

Hedgehog αναστολή σηματοδότησης με GDC-0449 μειώνει ηπατική ίνωση

Mdr2

– /- ποντίκια απέδειξαν προοδευτική σχετιζόμενη με την ηλικία αύξηση των ηπατικών έκφραση του άλφα-λείου μυός ακτίνη (α-SMA), ένα δείκτη μυοϊνοβλαστικής ηπατικά αστεροειδή κύτταρα (Σχήμα 3Α, άνω πλαίσιο). Αυτό συνοδεύτηκε από αυξημένη έκφραση των προ-ινογόνων παράγοντες, όπως αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού ΤΟΡ-β και προερχόμενος από αιμοπετάλια αυξητικός παράγοντας PDGF-β (Σχήματα S3A-Β), και προοδευτική ίνωση, όπως αποδεικνύεται από Sirius red χρώση (Σχήμα 3Α, κάτω πάνελ) και ποσοτικοποίηση της ηπατικής περιεκτικότητας σε υδροξυπρολίνη (Σχήμα 3Β). Η θεραπεία με GDC-0449 μειώθηκαν α-SMA-εκφράζουν μυοϊνοβλαστικά κύτταρα, ηπατική έκφραση του ΤΟΡ-β και PDGF-β, κόκκινο χρώση Sirius, και το περιεχόμενο υδροξυπρολίνης, καταδεικνύοντας ότι η αναστολή Hh μονοπάτι μειωμένη ηπατική ίνωση (Εικόνες 3C-D και Σχήματα S3C- D).

Α. Η ανοσοϊστοχημική χρώση για α-SMA (επάνω πάνελ) και κόκκινο Sirius (κάτω πίνακας) σε τμήματα του ήπατος μη-όγκου από αντιπροσωπευτικές ίδιας ηλικίας Mdr2

– /- ποντίκια και άγριου τύπου (10 Χ). Β Συγκεντρωτική Ηπατική περιεκτικότητα σε υδροξυπρολίνη 2-

52 εβδομάδων ηλικίας

άγριου τύπου (WT) και ίδιας ηλικίας Mdr2

– /- ποντίκια (n = 3-5 /ομάδα). Αποτελέσματα σε Mdr2

– /- ποντίκια κανονικοποιήθηκαν με εκείνη της ίδιας ηλικίας ποντίκια WT και γραφικά ως φορές μεταβολής. Τα δεδομένα εμφανίζονται σαν μέση τιμή +/- SD (* ρ & lt? 0,05) Γ Μη όγκου τομές ήπατος χρωματίζονται για α-SMA (άνω πάνελ, 20 ×) και κόκκινο Sirius (κάτω πάνελ, 10 ×) σε αντιπροσωπευτικά DMSO-και GDC – αντιμετωπίζονται Mdr2

– /- ποντίκια. Δ Heptic περιεκτικότητα υδροξυπρολίνης του DMSO-και GDC- ποντίκια με αγωγή (n = 9 /ομάδα). Αποτελέσματα σε ποντικούς GDC-0449-αγωγή κανονικοποιήθηκαν προς εκείνη των ποντικών υπό αγωγή με όχημα DMSO και γραφικά ως φορές μεταβολής. Τα δεδομένα που εμφανίζονται ως μέση τιμή +/- SEM (* p & lt? 0,05)

Η

Hedgehog αναστολή σηματοδότησης με GDC-0449 μειώνει τη συσσώρευση των ηπατικών προγονικών κυττάρων

Σε απάντηση σε τραυματισμό, προγονικών κυττάρων. πληθυσμούς στο ήπαρ πολλαπλασιάζονται. Ως εκ τούτου, ανοσοϊστοχημική ανάλυση για δείκτες προγονικά, όπως κυτοκερατίνη-19 (CK-19) και α-φετοπρωτεΐνης (AFP), έδειξε σχετιζόμενη με την ηλικία αυξήσεις Mdr2

– /- ποντίκια (Σχήμα 4Α). Co-χρώση για CK19 και Gli2 επιβεβαίωσε ότι ο πληθυσμός προγονικών ήταν Hh ανταποκρίνεται (Σχήμα 4Β). Κατά την επεξεργασία με GDC-0449, δείκτες προγονικά μειώθηκαν (Σχήμα 4C), υποδεικνύοντας ότι σηματοδότηση Hh ήταν αναγκαίο για τη διατήρηση των πληθυσμών προγονικών κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης, και ότι η αναστολή Hh ήταν επαρκής για να συρρικνωθεί το μέγεθος των πληθυσμών προγονικών ακόμη και σε ποντικούς με προχωρημένο HCC.

Α. Η ανοσοϊστοχημική χρώση τομών ήπατος από αντιπροσωπευτικές, με σύμπτωση ηλικίας Mdr2

– /- και φυσικού τύπου ποντίκια για δείκτες προγονικά, κυτοκερατίνη-19 (CK-19) (άνω πάνελ) και α-εμβρυϊκής πρωτεΐνης (AFP) (κάτω πάνελ) (20 ×). Β Εκπρόσωπος μικρογραφία ενός portal τριάδα στο ήπαρ ενός Mdr2

– /- ποντίκια, αποδεικνύοντας συν-εντοπισμό της CK-19 (μπλε) και Gli2 (καφέ) στην σωληνίσκων διαμέρισμα (40 ×). Γ Ποσοτική Gli2 και CK19 ανοσοϊστοχημεία σε DMSO-και GDC-0449-θεραπεία Mdr2

– /- ποντίκια (n = 9-10 /ομάδα). Ο αριθμός των Gli2 και CK19 διπλά θετικά κύτταρα σωληνίσκων-εμφανίζονται μετρήθηκαν μέσα σε όγκους κάτω των 20 × μεγέθυνση. Η μέση τιμή ± SEM διπλό κύτταρα (+) t ανά πεδίο υψηλής ισχύος (HPF) απεικονίζονται γραφικά (* p & lt? 0,05) ανάλυση Δ QRT-PCR του AFP στο RNA του όγκου από τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με DMSO (open bar) ή GDC-0449 (κλειστά bar) Αποτελέσματα στα ποντίκια GDC-0449 αγωγή κανονικοποιήθηκαν προς εκείνη των ποντικών που έλαβαν θεραπεία με φορέα DMSO και γραφικά ως μέσες ± SEM (* ρ & lt?. 0.05)

η

Μείωση Hedgehog σηματοδότηση μειώνει την έκφραση του οστεοποντίνη και αποτρέπει τη συσσώρευση των κυττάρων που αποκρίνονται οστεοποντίνης (CD44-θετικό)

στελέχους /πληθυσμούς προγονικών κυττάρων για πολλούς τύπους καρκίνου, περιλαμβανομένων των HCC, πιστεύεται ότι είναι εμπλουτισμένο με κύτταρα που εκφράζουν CD44, έναν υποδοχέα για το στέλεχος αυξητικός παράγοντας κυττάρων, οστεοποντίνη [35], [36]. έκφραση οστεοποντίνη ρυθμίζεται από σηματοδότηση Hh [37]. Ως εκ τούτου, εξετάσαμε τις επιδράσεις της GDC-0449 για οστεοποντίνης και του υποδοχέα του, CD44. Ανοσοϊστοχημεία και ποσοτική μορφομετρία απέδειξαν ότι η αναστολή της οδού Hh με GDC-0449 μειώθηκαν σημαντικά χρώσης οστεοποντίνη εντός πρωτογενείς όγκους ήπατος (Σχήμα 5Α). Παρόμοιες μειώσεις σχετιζόμενες με τη θεραπεία σε καρκινικά κύτταρα CD44 + διαπιστώθηκαν επίσης (Σχήμα 5Β). Ανάλυση γονιδιακής έκφρασης έδειξε ότι η έκφραση των δύο οστεοποντίνης και CD44 mRNA που επίσης έτειναν να μειωθούν στο GDC-0449-ποντίκια με αγωγή (Σχήμα 5C). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι σηματοδότηση Hh μπορεί να ρυθμίζει υποθετικό καρκίνο του ήπατος στελέχους /προγονικών κυττάρων με ρύθμιση διαθεσιμότητα οστεοποντίνης.

A. τομές όγκου από εκπρόσωπο DMSO-και GDC-0449 αντιμετωπίζονται Mdr2

– /- ποντίκια βάφτηκαν να αποδείξει οστεοποντίνη είναι (OPN) Εκπρόσωπος τμήματα εμφανίζονται (

Δικαίωμα

πίνακα). χρώση OPN ποσοτικοποιήθηκε με μορφομετρική ανάλυση των τουλάχιστον 5 HPF ανά τμήμα του όγκου χρησιμοποιώντας 20 × μεγέθυνση (η = 5 ποντικοί /ομάδα). Τα αποτελέσματα στην ομάδα GDC-0449-αγωγή κανονικοποιήθηκαν με εκείνη της ομάδας που έλαβαν θεραπεία με φορέα DMSO και γραφικά ως φορές μεταβολής. Τα δεδομένα εμφανίζονται ως μέσες ± SEM (** ρ & lt? 0,01). χρώση Β Ανοσοϊστοχημική για τον υποδοχέα οστεοποντίνη, CD44, σε περι-καρκινικών ιστών του εκπροσώπου DMSO-και GDC-0449- αντιμετωπίζονται Mdr2

– /- ποντίκια. (

δεξί πάνελ

) χρώση CD44 προσδιορίστηκε ποσοτικά με μορφομετρική ανάλυση, όπως περιγράφεται στο Α Αποτελέσματα σε ποντικούς GDC-0449-αγωγή είχαν κανονικοποιημένη με εκείνες των ελέγχων υποστεί αγωγή με έκδοχο και γραφικά ως μέσες ± SEM (** ρ & lt? 0,01). ανάλυση Γ QRT-PCR του RNA του ήπατος όγκου από DMSO-(open bar) και GDC-0449- (κλειστή ράβδος) αντιμετωπίζονται Mdr2

– /- ποντίκια για OPN (αριστερά) και CD44 (δεξιά). Μετά από κανονικοποίηση με τα αποτελέσματα στην ομάδα DMSO-θεραπεία, μέση τιμή ± SEM απεικονίστηκαν γραφικά (* p & lt? 0,05)

Η

μαγνητική τομογραφία και ιστολογική ένδειξη της υποστροφής του ήπατος όγκου μετά από GDC-0449 θεραπείας

για να αξιολογηθούν οι πιθανές επιπτώσεις των αλλαγών στα κύτταρα της μήτρας και των προγονικών για HCC, πριν και μετά τη θεραπεία όγκων του όγκου αναλύθηκαν με τη χρήση απεικόνισης μαγνητικού συντονισμού (Σχήματα 6Α-Β). Μια ανάλυση των όγκων σε ποντικούς χωρίς εμφανή μετάσταση έδειξαν ότι οι όγκοι του όγκου μειώθηκε σε ποντίκια που έλαβαν 9 ημερών με GDC-0449-θεραπεία, ενώ τα ζώα υπό αγωγή με όχημα αποδεικνύεται επίμονη ανάπτυξη του όγκου (Σχήμα 6C? -6,7% + /- 11,7% vs 22.7% +/- 9.1%, ρ = 0,03). Αυτά τα δεδομένα συσχετίζονται με νεκροψίας: μόνο το 56% των ποντικών GDC-0449 ασθενείς είχαν ορατή οζίδια όγκων του ήπατος, σε σύγκριση με το 80% των ποντικών DMSO (Πίνακας 1). Επιπλέον, τόσο MRI και νεκροψίες έδειξαν μείωση του αριθμού των μεταστάσεων σε GDC-0449-αγωγή ποντικούς σε σύγκριση με ελέγχους που δέχτηκαν φορέα (Πίνακας 1). Η ιστολογική ανάλυση του Η &? Ε-χρωματισμένες τομές ήπατος πραγματοποιήθηκε επίσης σε όλα τα ζώα και από τις δύο ομάδες. Εάν οζίδια όγκου δεν ήταν καταφανώς ορατά ή μεγαλύτερο από 10 mm σε μέγεθος, τα δείγματα εξαιρέθηκαν από την ανάλυση. Μικροσκοπική οζίδια όγκων σε ζώα GDC-0449 αγωγή επέδειξε αυξημένα ποσοστά αιμορραγικού εμφράγματος (20% έναντι 0%? Σχήμα 6D, πάνω πίνακα), microvesicular στεάτωση (40% έναντι 0%, Σχήμα 6D, μεσαίο πάνελ), οξεόφιλα νέκρωση και εκφυλιστικές κυτταροπλασματική μεταβολές (70% έναντι 40%, Σχήμα 6D, κάτω πλαίσιο) σε σύγκριση με τους όγκους από ζώα που έλαβαν φορέα. Έτσι, τα ευρήματα στην MRI, νεκροψία, και ιστολογία του ήπατος ήταν συνεπή και έδειξαν ότι Hh αναστολή της οδού προκάλεσε σημαντική υποχώρηση των πρωτογενών και μεταστατικών HCC.

Α. Αντιπροσωπευτική εικόνα της διατομής του ενδοηπατική όγκου όπως προσδιορίζονται από σκιαγραφικό MRI μετά από GDC-0449 θεραπείας. Β Εκπρόσωπος MRI εικόνες του οβελιαίο, στεφανιαίο και πλάγια προοπτικές που χρησιμοποιούνται για την ογκομετρική ανάλυση. C. Μεταβολή στον όγκο του όγκου ποσοστώθηκαν με μηχανογράφηση δημιουργείται ογκομετρική μετρήσεις και γραφικά ως Μέση ± SD (* ρ & lt? 0,05). Δ Μικρογραφίες του εκπροσώπου ιστολογικές αλλαγές που προκαλούνται από, GDC-0449, θεραπεία. Κορυφαία πάνελ δείχνει νέκρωσης όγκου? μεσαίο πάνελ δείχνει λιπαρών εκφύλιση? κάτω πίνακα δείχνουν κενοτόπια καρκινικών κυττάρων με πυκνωτικούς πυρήνες

Η

Συζήτηση

Μελετήσαμε Mdr2

-. /- ποντίκια για να καθοριστεί εάν ή όχι η ενεργοποίηση των συμβάλλει μονοπατιού Hh να ηπατοκαρκινογένεσης κατά τη διάρκεια χρόνιο τραυματισμό ίνωση του ήπατος. Mdr2-ανεπαρκή ποντίκια στερούνται ένα φωσφολιπίδιο φλιπάση που απαιτείται για τον φυσιολογικό σχηματισμό της χολής, και κατά συνέπεια εμφανίζουν ηπατική βλάβη και σωληνίσκων πολλαπλασιασμό από νεαρή ηλικία. Όλες οι πληγείσες ποντίκια αναπτύσσουν τελικά σημαντική ηπατική ίνωση και μεταστατικό HCC. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι αυτή η παθολογία συνοδεύεται από προοδευτική ενεργοποίηση της οδού Hh. Εισαγωγή ενός ειδικού αναστολέα του κλειδιού Hh σηματοδότησης ενδιάμεσο, λειαίνονται, μειωμένη δραστηριότητα μονοπάτι και απέδειξε ότι υπέστη σηματοδότηση Hh ήταν υποχρεωμένη να διατηρήσει τις επεκταθεί πληθυσμούς των μυοϊνοβλαστών ήπατος και των προγονικών κυττάρων που είχαν συσσωρευτεί στους καταστραφεί το συκώτι. Επιπλέον, η αντιμετώπιση ηλικίας Mdr2-ανεπαρκή ποντίκια (η οποία είχε ήδη προχωρημένη ηπατική ίνωση και HCC) με τον αναστολέα οδού Hh σημαντικά μειωμένη ηπατική ίνωση και το φορτίο του όγκου, καταδεικνύοντας για πρώτη φορά ότι η αναστολή σηματοδότηση Hh έχει κλινικά σχετικές, θεραπευτική αξία τόσο για το ήπαρ ίνωση και HCC. Ακόμη πιο συναρπαστικό είναι απόδειξη ότι η απαγορευτική επίδραση στα ηπατικά ανάπτυξη του όγκου

in vivo

αφορά τόσο ενδο-ηπατική HCC και μακρινή μετάσταση.

Επιπλέον, τα αποτελέσματά μας παρέχουν πληροφορίες για μερικά από τα υποκείμενα μηχανισμούς που εμπλέκονται. Ηπατική παραγωγή συνδέτες Hh αυξήθηκε σε ποντίκια που ανέπτυξαν προοδευτική ίνωση του ήπατος και επεμβατική HCC. Αυτά τα ποντίκια έδειξαν επίσης σταθερά υψηλότερα επίπεδα αμινοτρανσφεράσης ορού, σύμφωνα με άλλα στοιχεία που αποδεικνύουν ότι η ανεπάρκεια Mdr2 προκαλεί χρόνιο τραυματισμό ηπατοκυττάρων [38], [39]. Διάφορες στρεσογόνους παράγοντες που μειώνουν τη βιωσιμότητα των ηπατοκυττάρων έχει αποδειχθεί ότι προκαλούν την παραγωγή και την απελευθέρωση των συνδετήρων Hh με τραυματίες ηπατοκύτταρα [40], [41]. Ετσι, βλάβη των ηπατοκυττάρων είναι πιθανόν ένας από τους παράγοντες που αυξάνει την παραγωγή συνδέτη Hh σε mdr2 ανεπάρκεια ήπατα. Μυοϊνοβλαστικά κύτταρα και πρόγονοι σωληνίσκων τύπου που συσσωρεύονται προοδευτικά σε χρονίως τραυματίστηκαν ήπατα παράγουν επίσης προσδέματα Hh, καθώς και άλλοι παράγοντες, όπως PDGF-β, που διεγείρουν την αυτοκρινή-παρακρινείς σύνθεση συνδετών Hh [20], [42].